專利名稱：一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法。
背景技術(shù)：
目前在植物轉(zhuǎn)基因育種中所應(yīng)用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來自原核生物，由于原核生物基因自身的特點，如I) AT含量較高，超過60 %，造成基因表達的mRNA在植物體內(nèi)極易被降解；2)存在類似真核基因的內(nèi)含子切點、轉(zhuǎn)錄終止子序列，造成轉(zhuǎn)錄不完整、mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的 PolyA加尾序列，導致基因在植物體內(nèi)往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的0. 001%或者幾乎檢測不到。美國 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A,et al. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol,1997,34 :485-496)在不改變毒蛋白氛基酸序列的前提下，分別對殺蟲蛋白基因和cryIII基因進行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不穩(wěn)定元件序列，使轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達量增加了 30 100倍，高達可溶性蛋白的0. 02 1%，獲得了明顯的抗蟲效果。雜草是農(nóng)作物生產(chǎn)的大害，自1942年出現(xiàn)近代雜草防治技術(shù)以來，化學除草劑有了很大的發(fā)展。草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的一個重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強烈抑制細胞分裂，對許多一年生和多年生雜草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對動物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來，得到了廣泛的應(yīng)用。但是，由于玉米等禾本科作物對草甘膦敏感，使其應(yīng)用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉(zhuǎn)入玉米，不但可以擴大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產(chǎn)成本，保護玉米免受藥害，最終達到增產(chǎn)增收的目的。盡管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被發(fā)現(xiàn)，并在宿主熒光假單胞菌G2及大腸桿菌中都能高效表達,表現(xiàn)高耐草甘膦的特性(Yichen Sun,Min Linand Yiping Wang. Novel AroA with high tolerance to Glyposate, encoded by a geneof Pseudomonas putida 4G—1 isolated from an extremeIypoIluted environment inChina. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物,特別是重要的糧食作物中由于表達量較低而沒有被利用，因此急需對其在植物中的應(yīng)用進行研究，如進行密碼子優(yōu)化，以加速其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法。本發(fā)明所提供的培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法包括將耐草甘膦基因?qū)肽康挠衩?，得到表達所述耐草甘膦基因的轉(zhuǎn)基因玉米的步驟；所述轉(zhuǎn)基因玉米與所述目的玉米相比，對草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因是編碼序列9所示蛋白質(zhì)的基因。其中，所述耐草甘膦基因可先進行如下修飾，再導入宿主中，以達到更好的表達效果I)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持耐草甘膦蛋白的氨基酸序列不變的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物 中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接；5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。本發(fā)明中，所述耐草甘膦基因具體為下述a)或b)的DNA分子a)核苷酸序列為序列表中序列2 ；b)核苷酸序列與序列表中序列2至少具有98%的同一性，且編碼序列9的蛋白質(zhì)(命名為G2-aroA蛋白)。在本發(fā)明的一個實施例中，所述將耐草甘膦基因?qū)肽康挠衩资峭ㄟ^將表達所述耐草甘膦基因的重組DNA片段導入所述目的玉米完成的。所述重組DNA片段通過重組表達載體導入所述目的玉米。本發(fā)明中所述重組DNA片段均指能夠在宿主細胞中表達序列表中序列9所示蛋白質(zhì)的DNA，該DNA不但可包括啟動所述耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止子。進一步，所述重組DNA片段還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導型啟動子。如花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S;西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子；四環(huán)素誘導型啟動子；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128,種子忙存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆betaconglycin的啟動子等?？捎糜诒景l(fā)明的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。
可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建表達所述耐草甘膦基因的所述重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組DNA片段和所述重組表達載體中啟動所述耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為Ubi啟動子；所述Ubi啟動子的序列為序列表中序列5，或與序列5至少具有80%的同一性，且具有啟動子功能。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組DNA片段和所述重組表達載體中終止所述耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉(zhuǎn)錄終止功能。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組DNA片段和所述重組表達載體中還包括由Ω序列和Kozak序列順次連接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列6所示，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強子功能。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體中還包括葉綠體導肽(CTP)序列；所述葉綠體導肽(CTP)序列如序列表中序列7所示，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號肽功能。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組DNA片段由所述Ubi啟動子、所述OMK序列、所述葉綠體導肽序列、所述耐草甘膦基因和所述轉(zhuǎn)錄終止序列順次連接組成，命名為Ub i -0MK-CTP-mG2aroA-Po I yA-T-NOS，其序列為序列表中序列 IO。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體含有所述重組DNA片段，將該重組表達載體命名為PS3300-UMG2，其序列為序列表中序列11。其中，序列I由1335個核苷酸組成，其末尾處為一個終止密碼子。序列2由1338個核苷酸組成，其末尾處為兩個終止密碼子。序列I和序列2的第1-1335位均為編碼序列，均編碼序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010個和核苷酸組成。序列6由67個核苷酸組成。序列7由141個核苷酸組成。序列8由491個核苷酸組成。序列10由4058個核苷酸組成，其中第1-2010位為Ubi啟動子序列，第2022-2088位為OMK序列，第2089-2229位為葉綠體導肽(CTP)序列，第2230-3567位為mG2_aroA序列，第3568-4058位為轉(zhuǎn)錄終止序列。序列11由10488個核苷酸組成，其中第151-2165位為Ubi啟動子序列，第 2177-2243 位為 OMK 序列，第 2244-2384 位為 CTP 序列，第 2385-3722 位為 mG2_aroA序列，第3723-4213位為轉(zhuǎn)錄終止序列。所述重組表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導入植物細胞。利用本發(fā)明所提供的培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法培育得到的轉(zhuǎn)基因玉米也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述轉(zhuǎn)基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。在本發(fā)明的實施例中，所述玉米具體為玉米品種綜31。本發(fā)明針對原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表達較低的問題，在保持原氨基酸序列不變的前提下，采用玉米偏好性密碼子對其進行優(yōu)化，去除影響RNA穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)(如polyA、重復(fù)序列、AT和GC串聯(lián)重復(fù)、RNA 二級結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點等)，增加GC含量，使G2-aroA蛋白在玉米中高效穩(wěn)定表達。 實驗證實，利用本發(fā)明所提供的培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的方法，培育得到的轉(zhuǎn)入mG2-aroA基因(序列2)的陽性玉米植株，與轉(zhuǎn)入原始G2_aroA基因的玉米植株相比，其G2-aroA蛋白的表達量明顯提高，每克葉片G2_aroA蛋白的表達量中可達15. 057 μ g，遠高于原始G2-aroA基因轉(zhuǎn)基因玉米的3. 735 μ g。同時，與轉(zhuǎn)入原始G2_aroA基因的玉米植株相比，轉(zhuǎn)入mG2-aroA基因的陽性玉米植株對草甘膦的耐受性也明顯提高，轉(zhuǎn)入mG2-aroA基因的T6代植株，在玉米5葉期噴施800ml/畝農(nóng)達后，無明顯的藥害，表現(xiàn)正常，后期的生長期內(nèi)均無藥害反應(yīng)；而轉(zhuǎn)入含有G2-aroA基因的的T6代植株，在800ml/畝農(nóng)達處理后，藥害非常嚴重，植株均表現(xiàn)黃化、畸形，后期植株生長期內(nèi)大部分表現(xiàn)雄穗不分化、雌穗不吐絲或者植株矮小。


圖I為載體pUC19-UG2的質(zhì)粒圖譜。圖2為載體pCAMBIA3300的質(zhì)粒圖譜。圖3為載體pS3300的質(zhì)粒圖譜。圖4為重組表達載體pS3300-UG2的質(zhì)粒圖譜。圖5為重組表達載體pS3300-UMG2的質(zhì)粒圖譜。圖6為重組載體pS3300-UG0的質(zhì)粒圖譜圖7為T6代G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-15為11株轉(zhuǎn)入G2-aroA基因的T6代轉(zhuǎn)基因玉米植株。圖8為T6代mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-24為20株轉(zhuǎn)入mG2-aroA基因的T6代轉(zhuǎn)基因玉米植株。圖9為T6代G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株和T6代mG2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株的草甘膦耐性田間鑒定圖。其中，A為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株、空載體轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株；B為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株和G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株；2所示一行玉米為G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株；3所示一行玉米為空載體轉(zhuǎn)基因玉米植株；4所示一行玉米為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株。圖10為雙抗夾心ELISA檢測G2_aroA蛋白濃度的標準曲線。
圖11為純化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖。其中，泳道I為蛋白Marker，自上到下依次為72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均為原核重組表達載體pET-28a-G2_aroA中表達后純化所得的G2-aroA蛋白，上樣量分別為5 ill、10 ill、15 ill。圖12為SDS-PAGE檢測純化后單克隆抗體的純度。其中，泳道I為蛋白Marker ；泳道2為純化后的單克隆抗體，較大的目的條帶為重鏈，較小的目的條帶為輕鏈。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、密碼子優(yōu)化型耐草甘膦基因的獲得本實施例根據(jù)G2_aroA基因(中國專利，申請?zhí)?3826892. 2，授權(quán)公告號CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子對G2-aroA基因進行人工優(yōu)化改造。盡量避免使用玉米稀有密碼子，并調(diào)整了密碼子的使用頻率(表I)，使G2-aroA蛋白的密碼子使用頻率與玉米中的使用頻率接近(表I)。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列，并去除了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到的新的核苷酸序列為序列表中序列
2。序列2與G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原來的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即為密碼子優(yōu)化型耐草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA。密碼子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用頻率見表I。為方便克隆，發(fā)明人在序列2的5’端引入BamH I酶切位點，在3’端引入KpnI酶切酶切位點，最終序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即為序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均編碼序列，均編碼序列表中序列9所示蛋白，將該蛋白命名為G2-aroA蛋白。表I玉米優(yōu)選密碼子標準權(quán)利要求
1.一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法，包括將耐草甘膦基因?qū)肽康挠衩?，得到表達所述耐草甘膦基因的轉(zhuǎn)基因玉米的步驟；所述轉(zhuǎn)基因玉米與所述目的玉米相比，對草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因為下述a)或b)的DNA分子 a)核苷酸序列為序列表中序列2； b)核苷酸序列與序列表中序列2至少具有98%的同一性且編碼序列9的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述將耐草甘膦基因?qū)肽康挠衩资峭ㄟ^將表達所述耐草甘膦基因的重組DNA片段導入所述目的玉米完成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段通過重組表達載體導入所述目的玉米。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段和所述重組表達載體中啟動所述耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為Ubi啟動子；所述Ubi啟動子的序列為序列表中序列5，或與序列5至少具有80%的同一性，且具有啟動子功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段和所述重組表達載體中終止所述耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉(zhuǎn)錄終止功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段和所述重組表達載體中還包括由Ω序列和Kozak序列順次連接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列6所示，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強子功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段和所述重組表達載體中還包括葉綠體導肽序列；所述葉綠體導肽序列如序列表中序列7所示，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號肽功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述重組DNA片段的序列為序列表中序列10。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達載體的序列為序列表中序列11。
10.利用權(quán)利要求1-9所述方法培育得到的轉(zhuǎn)基因玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米的方法。本發(fā)明所提供的方法包括將耐草甘膦基因?qū)肽康挠衩祝玫奖磉_所述耐草甘膦基因的轉(zhuǎn)基因玉米的步驟；所述轉(zhuǎn)基因玉米與所述目的玉米相比，對草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因為下述a)或b)的DNA分子a)核苷酸序列為序列表中序列2；b)核苷酸序列與序列表中序列2至少具有98％的同一性且編碼序列9的蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明所提供的方法培育得到的、轉(zhuǎn)入所述耐草甘膦基因的轉(zhuǎn)基因玉米，與轉(zhuǎn)入所述原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的轉(zhuǎn)基因玉米相比，其G2-aroA蛋白的表達量明顯提高；同時對草甘膦的耐受性也明顯提高。
文檔編號C12N15/63GK102643804SQ201210107400
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者劉素霞, 李雪峰, 王長成, 鄧德芝, 韓寶柱, 韓庚辰 申請人:北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司