專利名稱：用于檢測eml4-alk融合基因突變的引物、探針及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及融合基因突變的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。每年全世界有超過130萬的患者死于肺癌，近一半發(fā)生在發(fā)展中國家。據(jù)2010年我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計，肺癌死亡率為30. 83/10萬，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤。(Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions (1955-1997). Ann Oncol,2003,14(1) :159-161 ;中華人民共和國衛(wèi)生部，《2010 年中國衛(wèi)生統(tǒng)計》年鑒)。肺癌從組織病理學(xué)上可以分為小細(xì)胞癌(SCLC)和非小細(xì)胞癌(non-small celllung cancer,NSCLC)兩大類，其中非小細(xì)胞癌約占肺癌總病例的85%。在我國肺癌患者5年的生存率僅為13%，其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測和確診技術(shù)，以及與之相匹配科學(xué)的治療方案，從而使患者錯失了治療的最佳時機(jī)。目前化療仍是肺癌主要治療手段，然而多數(shù)化療會產(chǎn)生較大的毒副作用，不同患者間的化療效果會有較大差異。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的分子靶向治療因其特異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫(yī)生首選治療方式。EML4-ALK(EchinodermMicrotubule-associated protein-Like 4-Anaplastic Lymphoma Kinase)基因融合突變的發(fā)現(xiàn)為NSCLC患者提供了新的治療靶點。EML4(棘皮動物微管相關(guān)蛋白4)與微管形成密切相關(guān)；ALK (間變性淋巴瘤激酶)在腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。EML4主要包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)、疏水EMAP蛋白結(jié)構(gòu)域、色氨酸-天冬氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)；EML4和ALK兩個基因分別位于人類2號染色體的p21和P23帶，相隔約12Mb。這兩個基因片段的倒位融合，即inv(2) (p21p23)能夠使得組織表達(dá)新的EML4-ALK融合蛋白。融合后的EML4啟動子位于ALK酪氨酸激酶的上游，從而使融合基因活化，表達(dá)EML4-ALK融合蛋白。通過EML4胞外結(jié)構(gòu)形成的二聚體使ALK受體持續(xù)磷酸化,進(jìn)而激活持續(xù)下游的細(xì)胞信號通路(Soda Μ,et al. Nature 2007 ；448 :561-6 ；Martelli MP, et al. Am. J. Pathol. 174 (2) :661-70 ;KohY, et al.J Thorac Oncol 2011 ；6 :905-912.)。以Crizotinib (克里唑蒂尼，Pfizer)為代表的藥物是針對EML4-ALK基因融合突變開發(fā)的小分子靶向藥物，通過抑制ALK酪氨酸激酶區(qū)域的活性，阻斷其下游異常信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。臨床研究表明Crizotinib對EML4-ALK融合突變患者的有效率可達(dá)61 %以上，而對野生型的患者幾乎沒有療效。因此，檢測EML4-ALK融合突變情況是指導(dǎo)Crizotinib類藥物用藥的前提和基礎(chǔ)，在化療之前通過高靈敏的檢測方法檢測EML4-ALK融合基因突變對于提高肺癌患者的生存率，延長生存期、避免過度化療、提高生存質(zhì)量有著重要意義。目前，EML4-ALK融合突變的檢測方法主要為熒光原位雜交(FISH)法，然而，F(xiàn)ISH法檢測特異性差，靈敏度較低，檢測時間長，而且無法同時檢測EML4-ALK融合產(chǎn)生的多種融合變異體。此外，F(xiàn)ISH檢測需要昂貴的專用儀器設(shè)備，試劑成本較高，操作復(fù)雜，使臨床檢測廣泛使用受到了限制。FISH檢測要求檢測樣本保存的時間不宜太長，采用保存時間長的樣本進(jìn)行檢測會導(dǎo)致假陰性的發(fā)生，影響了檢測的準(zhǔn)確性。因此，F(xiàn)ISH檢測法無法滿足臨床醫(yī)生檢測實際應(yīng)用的需求，臨床迫切需要開發(fā)一種高靈敏度的可以同時檢測EML4-ALK融合基因多種突變的檢測方法，以實現(xiàn)采用快速的檢測方法對EML4-ALK多種融合突變進(jìn)行同時檢測，從而為臨床肺癌個體化治療方案提供科學(xué)參考依據(jù)。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種快速廉價、操作簡便的EML4-ALK融合基因突變檢測試劑盒及檢測方法。本檢測方法設(shè)計運用一種新型特異引物和探針。本檢測方法可以一次同時檢測EML4與ALK基因的9種融合突變，檢測靈敏度高，檢測時間只需90分鐘即可完成，同時具備了靈敏度高，特異性好，廉價快速，操作簡單等優(yōu)點，可以滿足臨床快速檢測的實際需求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于EML4-ALK基因融合突變檢測引物和探針，其特異引物與探針包括如下序列表1EML4-ALK融合突變特異性雙弓I物和探針核苷酸序列EM.4-ALK-反轉(zhuǎn)錄 I :TCAGGTCACTGATGGAGGAGSEQ ID NO 01
EM.4-ALK-逆轉(zhuǎn)錄 2 CAGGAGGAGCAATGATCTTGSEQ ID NO 02I 號M 1、2、3EM^-ALK-M-FiGCCCACACCTGGGMAGGACCTSEQ ID NO :03EM.4-ALK-M-F CAGACAAGCATAAAGATGTCATSEQ ID NO :04EM.4-ALK-M-F ACACCTTGACTGGTCCCCAGACSEQ ID NO :05EM.4-ALK-M-R AGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :06EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :072 號M4、5EM.4-ALK-M-F GCAGAAGGAAAGGCAGATCAATSEQ ID NO :08EM.4-ALK-M-F TCTGTGGGATCATGATCTGAATCSEQ ID NO 09EM.4-ALK-M-R TCAGGTCACTGATGGAGGAGGTCSEQ ID NO :10E14-ALK-M-P :FAM-5-TGTATGAC0GACTACMCCCCMCTACTGGGT-3-BHQlSEQ ID NO :113 號M 6、7EM^-ALK-M-FiCCAGAGATCTAGTTTCTATCCACSEQ ID NO :12EM.4-ALK-M-F ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTCSEQ ID NO :13EM^-ALK-M-RiAGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :14EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :154 號M 8EM^-ALK-M-FiATAGGMCGCACTCAGGCAGAGSEQ ID NO :16EM^-ALK-M-RiAGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :17EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :18
5 號M 9EM.4-ALK-M-F ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTCSEQ ID NO :19EM.4-ALK-M-R GCAGCCTGGCCCTTGAAGCACTSEQ ID NO :20EM.4-ALK-M-P FAM-5-GATCCCTCCCTGGATCTCCATATCCTCCTGGA-3-BHQlSEQ ID NO :216 號ACTB-F CTGGCATTGCOGACAGGASEQ ID NO 22ACTB-R AGGAGCAATGATCTTGATCTTCSEQ ID NO 23·ACTB-P FAM-CAGTAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAAGGG-BHQSEQ ID NO :24本發(fā)明另一方面提供了一種用于檢測EML4-ALK基因融合突變檢測試劑盒，其PCR
反應(yīng)擴(kuò)增體系如下
Takara 10XPCR Buffer 稀釋為 IX模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探針I(yè). O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
總體積25 μL本發(fā)明另一方面提供了一種用于mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的方法，方法包括反轉(zhuǎn)錄體系組成以及如下操作步驟mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA體系包括如下成分
5XM-MLV buffer 5μ 引物終濃度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U
RNA6μ
補DEPC水至25μ (a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液18 μ 1，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，加入無菌離心管中，混勻。(b)加入待測樣品RNA 6 μ I，RNA總量在O. I 5 μ g范圍內(nèi)，補水至25 μ I。(c)42°C保溫I個小時。(d) 950C保溫5分鐘后冰上冷卻，得到cDNA模板.。本發(fā)明再一方面提供一種用于檢測EML4-ALK基因融合突變方法，其方法包括以下步驟
(I)根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類EML4-ALK為野生型基因序列，針對EML4-ALK基因9種融合突變，來設(shè)計特異引物和探針。(2)提取檢測樣本的RNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織或胸腔液。(3)配制實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。(4)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測結(jié)果檢測反應(yīng)體系的FAM和HEX熒光強度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值大于等于30 :陰性；Ct值小于30 :陽性。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用了特異引物和探針技術(shù)，可以特異檢測人類EML4-ALK基因融合突變。此方法(I)建立了實時熒光PCR體系，可同時檢測EML4-ALK基因9種融合突變；(2)靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；(3)操作簡單，檢測廉價，臨床 應(yīng)用范圍廣；(4)樣本檢測范圍廣，樣本可以為新鮮病理組織，石蠟包埋組織或胸腔液；(5)檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。


圖I為本發(fā)明檢測質(zhì)粒PCR圖。圖2為靈敏度分析試驗結(jié)果PCR圖。圖3為檢測臨床樣本突變陽性PCR圖。圖4為檢測臨床樣本野生型PCR圖。
具體實施例方式本發(fā)明以基因工程構(gòu)建的突變質(zhì)粒為模板，構(gòu)建EML4-ALK實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，以FAM為突變信號檢測通道，針對EML4-ALK融合突變9個位點設(shè)計特異性探針和雙引物，通過引物及檢測體系的優(yōu)化實現(xiàn)高靈敏特異檢測。檢測EML4-ALK基因融合突變的方法包括以下步驟(I)針對突變位點設(shè)計合成引物和探針根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫公布的人類EML4-ALK基因序列為野生型序列，針對EML4-ALK基因9種融合突變來設(shè)計特異性引物和探針。通過特異性引物和探針體系優(yōu)化，實現(xiàn)高靈敏和特異檢測，EML4-ALK基因9個融合突變位點見表2。針對選定的9個融合突變位點,應(yīng)用Premier 6. O引物設(shè)計軟件設(shè)計多對特異引物和多條探針，引物和探針序列如表I所示。(2)樣本處理與RNA的提取樣品處理與RNA的提取樣本適用范圍包括新鮮腫瘤組織和胸腔液。新鮮病理組織，取I克左右，使用TIANGEN的RNA提取試劑盒提取其RNA。胸腔液使用TIANGEN的組織RNA提取試劑盒提取其RNA。石蠟包埋組織，使用Qiagen的組織RNA提取試劑盒提取其RNA。上述具體操作步驟按試劑盒說明書操作。(3)建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系將所提上述RNA溶于O. I % DEPC水中，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，確定其濃度0D260/0D280為I. 9-2. 1，并讀取其含量。取O. I 5 μ g的RNA作為其cDNA合成的模板，采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的試劑盒合成cDNA，cDNA合成體系如下
5XM-MLV buffer5μ
引物終濃度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U
RNA6μ
補DEPC水至25μ 應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄體系按如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 (a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液18 μ 1，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ I，加入無菌離心管中，混勻。(b)加入待測樣品RNA 6 μ I，RNA總量在O. I 5yg范圍內(nèi)，補水至25 μ I。(c)42°C保溫I個小時。(d) 950C保溫5分鐘后冰上冷卻，得到cDNA模板.。將上述所得cDNA模板，用作實時熒光PCR擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR
擴(kuò)增
Takara 10XPCR Buffer 稀釋為 IX 模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探針I(yè). O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
總體積25 μL實時PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘，I個循環(huán)；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個循環(huán)；93 °C變性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環(huán)。后31個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。(4)檢測熒光信號，根據(jù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)檢測FAM熒光信號Ct值，根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果檢測反應(yīng)體系的FAM熒光強度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值大于等于30 :陰性；Ct值小于30 :陽性。以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學(xué)技術(shù)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。實施例I運用本發(fā)明體系檢測質(zhì)粒,實驗用質(zhì)粒模板(含EML4-ALK variant I突變)，利用上述熒光PCR檢測EML4-ALK基因融合突變的方法如下(I)質(zhì)粒處理與提取質(zhì)粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit, DP116)的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取，具體提取操作步驟按試劑盒說明書操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8. O)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，確定其濃度，然后用Tris-HCl (10mmol/L, PH8. O)溶液調(diào)整DNA濃度到2ng/ μ L作為PCR模板，取5 μ L進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。(2)建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系將上述所得cDNA模板，用作實時熒光PCR擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR
擴(kuò)增
Takara 10XPCR Buffer 稀釋為 IX模板5
各引物I. O 4. O pmol
各探針I(yè). O 3. O pmol
Taq 酶0. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
總體積25 μ 實時PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘，I個循環(huán)；95°C變性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15個循環(huán)；93 °C變性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環(huán)。后31個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。(4)檢測熒光信號，根據(jù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)采用MX3000P實時熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，在后31個循環(huán)退火階段檢測FAM和HEX的熒光信號，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值大于等于30 :陰性；Ct值小于30 :陽性靈敏度分析取經(jīng)定量后濃度為1000個拷貝的樣品DNA，進(jìn)行10倍稀釋，然后分別對3個濃度進(jìn)行檢測，每次反應(yīng)加入5μ L DNA。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度高，10拷貝DNA基因組即可檢出，結(jié)果如圖2。重復(fù)性試驗每個反應(yīng)分別加入突變質(zhì)粒DNA1000拷貝、100拷貝，重復(fù)10次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，10次Ct值相差不到0. 5個循環(huán)。檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測體系可以準(zhǔn)確檢測質(zhì)粒檢測EML4-ALK融合突變，檢測的靈敏度可達(dá)到5-10拷貝。實施例2運用本發(fā)明檢測臨床樣本，取送我公司待檢測的臨床肺癌石蠟包埋組織樣本110例，男性65例，女性45例，年齡為34-75歲，平均年齡為54歲，中位年齡50歲。利用本發(fā)明特異引物和探針熒光PCR體系檢測110例臨床樣本的EML4-ALK的基因融合突變步驟如下(I)樣本處理與RNA的提取
(a)取上述各肺癌樣本，分別加入Iml 二甲苯，混勻，室溫下14000RPM離心2min，棄上清液，加入Iml無水乙醇到沉淀中，震蕩混勻(去除二甲苯)，室溫下14000RPM離心2min棄上清液，打開離心管蓋，37°C晾干；(b)在離心管中加150μ I Buffer PKD及10 μ I蛋白酶K，震蕩混勻，56 °C孵育15min,8CTC孵育 15min,待降到室溫后，加入 16ul DNase Booster Buffer 和 IOul DNaseI原液，室溫孵育1511^11，后加入32(^1 Buffer RBC，混勻；(C)往上清液加入720 μ I無水乙醇，混勻，取700 μ I樣品包括前面生成的沉淀轉(zhuǎn)移到帶有2ml收集管的RNA MinElute離心柱里,大于10，OOOrpm離心15s,棄廢液,重復(fù)上一步直到樣品轉(zhuǎn)移到RNA MinElute離心柱里。(d)打開蓋子加入500 μ I Buffer RPE,蓋緊蓋子，大于IOOOOrpm離心2min，將柱子轉(zhuǎn)移到收集管中，向吸附膜中間部位滴加14-30 μ I RNase-free water,離心Imin后收集RNA.(2)建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系將所提上述RNA溶于O. I % DEPC水中，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，確定其濃度0D260/0D280為I. 9-2. 1，并讀取其含量。取O. I 5 μ g的RNA作為其cDNA合成的模板，采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的試劑盒合成cDNA，cDNA合成體系如下
5XM-MLV buffer 5μ 引物終濃度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U■
補DEPC水至25μ 應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄體系按如下步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液18μ 1，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，加入無菌離心管中，混勻。(b)加入待測樣品RNA 6μ 1，RNA總量在O. I 5yg范圍內(nèi)，補水至25μ I。(c)42°C保溫I個小時。(d) 950C保溫5分鐘后冰上冷卻，得到cDNA模板.。將上述所得cDNA模板，用作實時熒光PCR擴(kuò)增的模板，按照如下擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR
擴(kuò)增Takara IOXPCR Buffer 稀釋為 IX模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探針I(yè). O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
總體積25 μL·實時PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性5分鐘，I個循環(huán)；95°C變性25秒，64 °C退火20
秒，72 °C延伸20秒，15個循環(huán)；93 °C變性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31個循環(huán)。
后31個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。(4)檢測熒光信號，根據(jù)Ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)檢測FAM熒光信號Ct值，根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果檢測反應(yīng)
體系的FAM熒光強度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)
準(zhǔn)，Ct值大于等于30 :陰性；Ct值小于30 :陽性檢測結(jié)果表明所檢測110例肺癌樣本中有8例發(fā)生有EML4-ALK融合突變，突變率
為7. 2%，同時對上述所有樣本進(jìn)行FISH對比檢測，F(xiàn)ISH結(jié)果表明突變有8例，兩種檢測方
法的符合率為100%，進(jìn)一步證明了本發(fā)明體系檢測的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表4。表2EML4-ALK基因9種融合突變
權(quán)利要求
1.用于檢測EML4-ALK融合基因突變的引物、探針，其特征在于，包括以下序列SEQIDNO I-SEQ ID NO 24。
2.用于檢測EML4-ALK融合基因突變的試劑盒，其特征在于，包括以下序列的引物和探針SEQ ID NO I-SEQ ID NO 24。
3.如權(quán)利要求2所述的用于檢測EML4-ALK融合基因突變的檢測試劑盒，其特征在于包括如下的熒光PCR的反應(yīng)體系 模板5 μι 各引物I. O 4. O pmol 各探針I(yè). O 3. O pmol Taq 酶O. 5 2. O U dNTPI 2 mmol MgCL22 3 mmol 甲酰胺I 2% 總體積20-40 μL
4.如權(quán)利要求3所述的檢測EML4-ALK融合基因突變的檢測試劑盒，其使用方法包括以下步驟 (I)提取檢測樣本中的RNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織或胸腔液組織中的RNA ； ⑵RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，配制實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系； (3)根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測結(jié)果檢測反應(yīng)體系的FAM和HEX熒光強度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值大于等于30 :陰性；Ct值小于30 :陽性。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測EML4-ALK融合基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的反應(yīng)體系為 5XM-MLV buffer 3~6μ引物終濃度1-3 PM dNTPl-2mM M-MLV100-300U。 RNA4~9μ 補 DEPC 水至20-40μ
6.如權(quán)利要求4所述的檢測EML4-ALK融合基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA包括以下操作步驟 (a)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液18μ 1，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，加入無菌離心管中，混勻。
(b)加入待測樣品RNA6μ I, RNA總量在O. I 5yg范圍內(nèi)，補水至25 μ I。
(c)42 °C保溫I個小時。(d) 95°C保溫 5分鐘后冰上冷卻，得到cDNA模板。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測EML4-ALK融合基因突變的引物、探針及檢測試劑盒。本發(fā)明的引物和探針為SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 24。本發(fā)明的引物和探針可以特異檢測EML4-ALK基因融合突變。本發(fā)明(1)建立了實時熒光PCR體系，可同時檢測EML4-ALK基因9種融合突變；(2)靈敏度高，5-10拷貝的突變可以檢出；(3)操作簡單，檢測廉價，臨床應(yīng)用范圍廣；(4)樣本檢測范圍廣，樣本可以為新鮮的病理組織，石蠟包埋組織或胸腔液；(5)檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。
文檔編號C12Q1/68GK102719525SQ20121010678
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者周細(xì)武, 張海龍, 施偉杰, 羅捷敏, 鄭立謀, 阮力 申請人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司