專利名稱：木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及產(chǎn)孢方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡桃楸 內(nèi)生真菌高效的產(chǎn)孢方法，特別是木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及產(chǎn)孢方法。
背景技術(shù)：
該內(nèi)生真菌是從胡桃楸樹皮部分離得到的其發(fā)酵產(chǎn)物具有抗癌活性的菌株，進(jìn)行初步鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，木霉菌屬。對(duì)該菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗癌活性檢測(cè)，其發(fā)酵產(chǎn)物能顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)酵液抗癌能力與lmg/L紫杉醇溶液基本相當(dāng)。因此研究該木霉菌的分生孢子對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物抗癌活性和其機(jī)理的研究及其菌種的保藏具有重要的作用。目前，該木霉菌(木霉菌屬長(zhǎng)枝木霉(TrichoderimaIongibrachiatm)保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M208102 ;該菌株已經(jīng)在中國(guó)專利CN101487022中公開。)為受專利保護(hù)的本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)有菌種，因此國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于該種木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)方法的報(bào)道，真菌通用的培養(yǎng)基不能很好的滿足該菌的產(chǎn)孢要求，這極大地限制了對(duì)該種胡桃楸內(nèi)生真菌以及其發(fā)酵產(chǎn)生的抗癌物質(zhì)的進(jìn)一步深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種木霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基及產(chǎn)孢條件。本發(fā)明的胡桃球內(nèi)生真菌木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及產(chǎn)孢條件能很好的滿足該菌種的產(chǎn)孢要求，培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到7. 4 X IO7個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種木霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以下重量百分比的物質(zhì)0. 5 5%果糖，0. 5 5%木糖以及90 99%的基本培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述基本培養(yǎng)基含有以下重量百分比的物質(zhì)0. 025 2. 5%酒石酸銨、0. 005 0. 5%酵母提取物、0. 005 0. 5%硝酸銨、0. 005 0. 5%磷酸二氫鉀、0. 0025 0. 25%七水合硫酸鎂、0. 0005 0. 05%氯化鈉、0. 00065 0. 065% 二水合氯化鈣、0. 01 I %七水合硫酸亞鐵、0. 01205 I. 205%乙二胺四乙酸二鈉、0. 04 4%瓊脂，余量為水。本發(fā)明還涉及一種木霉菌的產(chǎn)孢方法，包括斜面菌種的制備，發(fā)酵種子的制備和產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制及產(chǎn)孢工藝步驟，產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將前述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基中含有的物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在100 140°C，高壓滅菌20 60分鐘；產(chǎn)孢工藝步驟為將前述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基分裝到250ml三角瓶中，每瓶10 25毫升，4°C保藏備用；吸取已保藏的孢子懸液或已培養(yǎng)好的該菌菌球置于產(chǎn)孢培養(yǎng)基中；產(chǎn)孢條件為溫度22 28°C，每天光照時(shí)間0 15小時(shí)。本發(fā)明的有益效果在于I、本發(fā)明產(chǎn)孢培養(yǎng)基中各物質(zhì)性能穩(wěn)定，分別以果糖和木糖為碳源，以酒石酸銨和酵母提取物為氮源，提供了該菌產(chǎn)孢的碳元素和氮元素；加入的無機(jī)鹽具有構(gòu)成微生物細(xì)胞的組成成分，并且具有調(diào)節(jié)酶活性及細(xì)胞的滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位等功能；其中的磷酸氫鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，維持該菌生長(zhǎng)的最適PH值；滿足了該菌的生長(zhǎng)需要。2、本發(fā)明的產(chǎn)孢條件溫和，容易控制。3、本發(fā)明的胡桃球內(nèi)生真菌木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到7. 4X107個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。


圖I為孢子數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間之間關(guān)系的曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下實(shí)施例及對(duì)比例中選用的木霉菌為木霉菌屬長(zhǎng)枝木霉(TrichoderimaIongibrachiatm)，保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M208102 ;該菌株已經(jīng)在中國(guó)專利CN101487022中公開。對(duì)比例I真菌通用培養(yǎng)基-PDA培養(yǎng)基各原料含量關(guān)系如下
原料原料重量比百分率(％)
去皮土豆20
葡萄糖2
瓊脂0.8產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將上述各物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高壓滅囷40分鐘，4 C保減備用；產(chǎn)孢條件200微升孢子懸液或直徑約5毫米左右的菌球接種到含有20毫升固體培養(yǎng)基的三角瓶中，室溫，每天光照時(shí)間10小時(shí)，培養(yǎng)5天。培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到
2.3 X IO6個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。對(duì)比例2產(chǎn)孢培養(yǎng)基各原料含量關(guān)系如下原料原料重量比百分率(％)
葡萄糖3
酒石酸銨0. 5
酵母提取物0. I
硝酸銨0. I
磷酸二氫鉀0. I
七水合硫酸鎂0. 05
氯化鈉0.01
二水合氯化鈣0. 013
七水合硫酸亞鐵0. 2
乙二胺四乙酸二鈉0.241
瓊脂0.8
水94.886產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將上述各物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高壓滅囷40分鐘，4 C保減備用；產(chǎn)孢條件200微升孢子懸液或直徑約5毫米大小的菌球接種到含有20毫升固體培養(yǎng)基的三角瓶中，室溫，每天光照時(shí)間10小時(shí)，培養(yǎng)5天。培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到1.4X105個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。實(shí)施例I—種木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基各原料含量關(guān)系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖1.5木糖I. 5
酒石酸銨0. 5
酵母提取物0. I
硝酸銨0. I
磷酸二氫鉀0. I
七水合硫酸鎂0. 05
氯化鈉0.01
二水合氯化鈣0. 013
七水合硫酸亞鐵0. 2
乙二胺四乙酸二鈉0.241
瓊脂0.8
水94.886產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將上述各物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高壓滅囷40分鐘，4 C保減備用；產(chǎn)孢條件200微升孢子懸液或直徑約5毫米大小的菌球接種到含有20毫升產(chǎn)孢培養(yǎng)基的三角瓶中，室溫，每天光照時(shí)間10小時(shí)，培養(yǎng)5天。該木霉菌的孢子數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間之間關(guān)系的曲線圖如圖I所示，由圖I可知培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到7. 4X107個(gè)孢子/毫
升培養(yǎng)基。由實(shí)施例I與對(duì)比例2的比較可知，實(shí)施例I的采用果糖和木糖作為碳源的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到7. 4 X IO7個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基，其效果遠(yuǎn)高于對(duì)比例2的 采用葡萄糖作為碳源的產(chǎn)孢培養(yǎng)基(培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量為I. 4X IO5個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基)。由實(shí)施例I與對(duì)比例I的比較可知，本發(fā)明的產(chǎn)孢培養(yǎng)基的產(chǎn)孢效果高于真菌通用培養(yǎng)基-PDA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢效果(培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量為2. 3 X IO6個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基)。實(shí)施例2產(chǎn)孢培養(yǎng)基各原料含量關(guān)系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖0.5
木糖0. 5
酒石酸銨0. 025
酵母提取物0. 005 硝酸銨0.005
磷酸二氫鉀0. 005
七水合硫酸鎂0. 0025
氯化鈉0.0005
二水合氯化鈣0. 00065
七水合硫酸亞鐵0. 01
乙二胺四乙酸二鈉0.01205
瓊脂0.04
水98.8943產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將上述各物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在100°C、高壓滅囷60分鐘，4 C保減備用；產(chǎn)孢條件200微升孢子懸液或直徑約5毫米大小的菌球接種到含有20毫升固體培養(yǎng)基的三角瓶中，22°C，培養(yǎng)5天。培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到I. 2 X IO7個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。實(shí)施例3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基各原料含量關(guān)系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖5.0
木糖5.0
酒石酸銨2. 5
酵母提取物0. 5
硝酸銨0. 5
磷酸二氫鉀0. 5
七水合硫酸鎂0. 25
氯化鈉0.05
二水合氯化鈣0. 065
七水合硫酸亞鐵I. 0
乙二胺四乙酸二鈉1.205
瓊脂4
水79.43產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將上述各物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在140°C、高壓滅囷20分鐘，4 C保減備用；
產(chǎn)孢條件200微升孢子懸液或直徑約5毫米大小的木霉菌菌球接種到含有20毫 升固體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C，每天光照時(shí)間15小時(shí)，培養(yǎng)5天。培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到5. 2 X IO6個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種木霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基含有以下重量百分比的物質(zhì)O.5 5%果糖，O. 5 5%木糖以及90 99%的基本培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的木霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，其特征在于，所述基本培養(yǎng)基含有以下重量百分比的物質(zhì)0. 025 2. 5 %酒石酸銨、O. 005 O. 5 %酵母提取物、O. 005 O. 5%硝酸銨、O. 005 O. 5%磷酸二氫鉀、O. 0025 O. 25%七水合硫酸鎂、O. 0005 O. 05%氯化鈉、O. 00065 O. 065 %二水合氯化鈣、O. 01 I %七水合硫酸亞鐵、O. 01205 I. 205 %乙二胺四乙酸二鈉、O. 04 4%瓊脂，余量為水。
3.—種木霉菌的產(chǎn)孢方法，包括斜面菌種的制備，發(fā)酵種子的制備和產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制及產(chǎn)孢工藝步驟，其特征在于，產(chǎn)孢培養(yǎng)基配制時(shí)，將權(quán)利要求I所述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基中含有的物質(zhì)按重量百分比含量混合溶解后在100 140°C、高壓滅菌20 60分鐘，保藏備用 ’產(chǎn)孢工藝步驟為吸取已保藏的孢子懸液或已培養(yǎng)好的木霉菌菌球置于所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，其中產(chǎn)孢條件為溫度22 28°C，每天光照時(shí)間O 15小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及產(chǎn)孢方法。該木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基由果糖、木糖和一種基本培養(yǎng)基(酵母提取物、酒石酸銨、硝酸銨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、氯化鈉、二水合氯化鈣、七水合硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉和水)組成。分別以果糖和木糖為碳源，以酒石酸銨和酵母提取物為氮源；加入的無機(jī)鹽具有構(gòu)成微生物細(xì)胞的組成成分，并具有調(diào)節(jié)酶活性及細(xì)胞的滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位等功能；其中的磷酸氫鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，維持該菌生長(zhǎng)的最適pH值；滿足了該菌的生長(zhǎng)需要。本發(fā)明的產(chǎn)孢方法為22～28℃，光照培養(yǎng)。本發(fā)明的胡桃球內(nèi)生真菌木霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)五天產(chǎn)孢量可達(dá)到7.4×107個(gè)孢子/毫升培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N3/00GK102660493SQ20121010670
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者張星星, 苗志奇, 陳榕華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)