專利名稱：：誘導培養(yǎng)基及用其培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種誘導培養(yǎng)基及利用該誘導培養(yǎng)基游離培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法。
背景技術：
：在番茄育種中，利用單倍體培養(yǎng)技術具有極大的優(yōu)勢和潛力1.加快育種材料的純合速度，加速育種進程。用常規(guī)育種手段進行育種材料的純化，需要經(jīng)過68代的自交，才可育出穩(wěn)定的株系，同時還存在植株表現(xiàn)型和基因型不一致的問題。利用花藥或小孢子培養(yǎng)獲得單倍體(haploid)，經(jīng)染色體加倍后得到純合雙倍體(doublehaploid,DH)，從而能夠較快地從雜種中(包括異種間雜種)分離出大量純合、穩(wěn)定的自交系。這樣的自交系植株的基因型和表現(xiàn)型完全一致，極大提高了選擇效率，因此育種年限大大縮短。2.單倍體培養(yǎng)可加速遠緣雜種的穩(wěn)定。遠緣雜種后代會發(fā)生強烈的性狀分離，還經(jīng)常出現(xiàn)大量的非整倍體雜種，通過自交或天然雜交難以保存其遺傳特性。將雜種一代的番茄花藥、小孢子進行離體培養(yǎng)，再對單倍體植株進行染色體人工加倍，可克服性狀分離，迅速獲得穩(wěn)定的新類型。3.DH群體有利于遺傳圖譜的構建、基因定位及依圖譜法克隆基因。將雜種一代的番茄花藥、小孢子進行離體培養(yǎng)，再進行染色體人工加倍就能獲得DH群體，一些在雜種中不能表現(xiàn)的隱性性狀會在雙單倍體(DH)中表現(xiàn)，DH群體的不同株系間存在基因型差異，但株系內(nèi)的基因型相同，自交不分離，通過自交繁殖后代，各個株系的遺傳組成不會改變，并能在很大程度上消除環(huán)境因素的影響，這不僅有利于番茄遺傳圖譜的構建和質(zhì)量基因的定位，更為重要的是可以進行數(shù)量性狀位點QTL的精確定位和克隆。番茄的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等重要農(nóng)藝性狀均為數(shù)量性狀，表現(xiàn)型與基因型之間的關系不明確，易受外界條件的干擾，依據(jù)表現(xiàn)型進行選擇常常不能真實地反映基因型，利用DH群體就能克服利用普通群體進行QTL研究所存在的缺點，獲得與QTL緊密連鎖的分子標記，使番茄育種水平得以提高。4.單倍體培養(yǎng)與誘變育種結合可提高誘變育種的效果。在誘變育種中，由于基因突變的幾率很低，特別是當發(fā)生隱性基因突變時，突變性狀在植株上不能直接表現(xiàn)出來，這就需要種植大量的植株。以單倍體植株作誘變材料，突變隱性基因就可表現(xiàn)出來，獲得突變體的速度可大大加速，育種年限得以縮短。基于以上優(yōu)勢，番茄的單倍體培養(yǎng)受到極大的重視，早期研究多集中在番茄花藥培養(yǎng)方面。1971年，Sharp首先對栽培番茄的花藥進行培養(yǎng)，得到了的愈傷組織。1978年，Cappadocia等培養(yǎng)番茄(L.peruvianum)的雜種番茄花藥從中觀察到球狀胚。20世紀80年代初，Krueget-Lebus等培養(yǎng)番茄品種Nadja和Piccolo的小孢子，得到了球形胚。Khoang等(1986)報道從番茄品種Roma的花藥中再生出單倍體植株，同時還得到二倍體和混倍體植株。Evans和Morrison(1989)也報道利用番茄花藥培養(yǎng)產(chǎn)生了單倍體植株。我國隨后也進行了此方面的研究。高秀云、王紀方等(1979、1980)進行番茄番茄花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有單倍體植株。袁亦楠(1999)以栽培番茄和野生番茄為材料，培養(yǎng)小孢子至球狀胚和類心形胚階段。與番茄花藥培養(yǎng)相比，小孢子已經(jīng)是單倍體細胞，誘導小孢子后經(jīng)過愈傷組織或胚狀體所發(fā)育成的小植株都是單倍體，這可以消除花藥培養(yǎng)時因花藥壁、花絲、藥隔等體細胞組織干擾而出現(xiàn)的混倍現(xiàn)象，對材料的固定和純化效率更高，因此，是當前番茄育種技術研究的一個熱點。培養(yǎng)番茄小孢子形成愈傷組織是關鍵技術環(huán)節(jié)。目前還沒有一套通用的番茄小孢子獲得愈傷組織的培養(yǎng)程序，本發(fā)明綜合小孢子發(fā)育所處時期、供體植株基因型、預處理方法、特別是基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑和添加物組成配比等多方面因素提出一種培養(yǎng)番茄小孢子形成愈傷組織的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種誘導培養(yǎng)基及利用該誘導培養(yǎng)基游離培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種誘導培養(yǎng)基，該誘導培養(yǎng)基包含有基本培養(yǎng)基、碳源、附加物和植物生長調(diào)節(jié)劑，所述基本培養(yǎng)基為MS、PM或HN；所述植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.IA6-BA0.Olmg.I71或NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71；所述碳源為0.3%蔗糖和/或0.3%麥芽糖；所述附加物為500mg.L—1谷氨酰胺和/或3mg.I^AgNCV本發(fā)明還提供了上述誘導培養(yǎng)基的優(yōu)選技術方案所述基本培養(yǎng)基為MS，植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.lmg.L^+B-BAO.2mg.L—1、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71或NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71，附加物為500mg.I71谷氨酰胺+3mg.I^AgNOy碳源為0.3%蔗糖。所述基本培養(yǎng)基為HN，附加物為500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'Agm,,碳源為0.3%蔗糖，植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.Olmg.L^+G-BAO.lmg.L—1；或者基本培養(yǎng)基為PM，附加物為500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'kgm,,碳源為0.3%麥芽糖，植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BAO.Olmg.L-1。本發(fā)明還進一步提供了利用上述誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法，該方法包括以下步驟(1)番茄單核靠邊期花蕾的消毒；(2)番茄小孢子的游離；(3)番茄小孢子的預處理；(4)番茄小孢子的培養(yǎng)，于上述誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，直到獲得愈傷組織。本發(fā)明還提供了上述利用誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織方法的優(yōu)選技術方案步驟(1)中，獲得所述番茄單核靠邊期花蕾的方法為植株現(xiàn)蕾開始，從植株上采取花蕾，醋酸洋紅染色壓片鏡檢，得到番茄單核靠邊期花蕾。步驟(1)中，所述消毒的方法為先用流水沖洗番茄單核靠邊期花蕾1020min，再用70%酒精消毒2040s和5%次氯酸鈉消毒1520min，最后用無菌水沖洗。步驟(2)中，所述游離的方法為番茄單核靠邊期花蕾放于無菌試管中，然后加入0.3mol/L甘露醇溶液6-8mL，碾碎，所得懸浮液過300目的細胞篩，6001200rpm離心25min，去掉上清液，重復24次。最后，倒掉上清液，加入權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基懸浮番茄小孢子，并稀釋所得番茄小孢子到濃度為1.52X105個/mL。步驟(3)中，所述番茄小孢子的預處理是將步驟(2)所得番茄小孢子分裝在培養(yǎng)皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下靜置13天后，再于3040°C下靜置13天。步驟(4)中，所述番茄小孢子的培養(yǎng)是指于2430°C下，在權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，直到有愈傷組織出現(xiàn)，再轉到2430°C下光照1418h進行光培養(yǎng)。所述暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為27°C，有愈傷組織出現(xiàn)時，再轉到27°C下光照16h進行光培養(yǎng)。本發(fā)明綜合考慮了影響番茄小孢子培養(yǎng)的多方面因素，包括供體植株基因型、小孢子發(fā)育所處時期、基本培養(yǎng)基種類、碳源種類、植物生長調(diào)劑種類組合及濃度配比，預處理方法等。通過嘗試多種基礎培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑等的組合，得到了適宜小孢子生長的培養(yǎng)基配方，并利用高、低溫交替處理進行預培養(yǎng)的方法提高了出愈率，并通過液體游離培養(yǎng)小孢子進一步提高了出愈率，為后續(xù)研究工作的順利開展奠定了堅實的基礎。圖1處于單核靠邊期的番茄小孢子。圖2番茄小孢子懸浮培養(yǎng)形成的愈傷組織。具體實施例方式下面用具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。誘導培養(yǎng)基的配制1)基本培養(yǎng)基①MS；②PM；③HN。2)碳源①蔗糖3%；②麥芽糖3%3)附加物500mg.L—1谷氨酰胺；3mg.I^AgNCV4)植物生長調(diào)節(jié)劑①NAAO.Olmg.L-1；②NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.Olmg.I71；③NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71；④6-BAO.Olmg.I71；⑤NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.2mg.I71；⑥NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71。5)基本培養(yǎng)基配方(mg.L—1)(1)MS:NH4N031650，KN031900，CaCl22H20440，MgS047H20370，KH2P04170，H3BO36.2，ZnS044H208.6，MnS044H2022.3，KI0.83，Na2Mo042H200.25，CuS045H200.025,CoC12*6H200.025，F(xiàn)eS047H2027.8，Na2EDTA37.3，泛酸1.0，肌醇100，煙酸1.0，Vb61.0,VbiVb6l.0,Vb0.01,pH5.8。(2)PM:MgS04'7H20185，CaCl2166，KH2P0468，KN03950，NH4N03200，F(xiàn)e_EDTA40，肌醇450，pH5.8。(3)HN:MgS047H20185，CaCl2166，KH2P0468，MnS04H2025，H3B0310，ZnS04'7H2010，NaMo04.2H200.25，F(xiàn)e_EDTA40，煙酸5，鹽酸硫胺素0.5，鹽酸吡哆醇0.5，肌醇100，甘氨酸2，pH5.6。利用本發(fā)明提供的誘導培養(yǎng)基游離培養(yǎng)番茄小孢子主要步驟如下1)番茄單核靠邊期花蕾的消毒普通番茄植株進入花期，及時去掉已開的花，使番茄植株總處于花期狀態(tài)。從可以觀察到花蕾開始，用鑷子從植株上取不同大小的花蕾，常規(guī)醋酸洋紅染色壓片鏡檢確定小孢子發(fā)育時期。選擇小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾，流水沖洗，然后酒精消毒和次氯酸鈉消毒，最后用無菌水沖洗。2)番茄小孢子的游離用鑷子取番茄花蕾放于無菌試管中，加入甘露醇溶液，碾碎；懸浮液通過細胞篩后放入離心管中離心；去掉上清液，再加入甘露醇溶液，過細胞篩、離心，重復24次。然后，倒掉上清液，再向離心管中加入誘導培養(yǎng)基懸浮小孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋小孢子濃度到1.52X105個.mL—1。3)番茄小孢子的預處理將所得的番茄小孢子分裝在培養(yǎng)皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下靜置13天后，再于3040°C靜置13天。4)番茄小孢子的培養(yǎng)于2430°C下在誘導培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，直到有愈傷組織出現(xiàn)，再轉到2430°C下光照1418h于誘導培養(yǎng)基中進行光培養(yǎng)實施例1試驗材料普通番茄、櫻桃番茄、野生番茄及雜種一代番茄在內(nèi)的8種不同基因型的番茄材料。表1.8種不同基因型的番茄品種序號番茄基因型序號番茄基因型1中雜9號(普通番茄)5大圣女(糗桃番茄)2中蔬6號(普通番茄)6醋栗番茄(野生番茄)3多彩番茄(普通番茄)7紅牛心X醋栗番茄453號番茄(普通番茄)853號番茄X津粉701)番茄單核靠邊期花蕾的消毒植株顯蕾開始，及時去掉已開的花，使番茄植株總處于花期狀態(tài)。從可以觀察到花蕾開始，用鑷子從植株上取不同大小的花蕾，醋酸洋紅染色壓片鏡檢，得到單核靠邊期的番茄花蕾。選擇小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的番茄花蕾，流水沖洗1020min，70%酒精消毒2040s，5%的次氯酸鈉消毒1520min，去離子無菌水沖洗25次，每次35min。2)番茄小孢子的游離用鑷子取番茄花蕾放于無菌試管中，加入0.3mol.L—1的甘露醇溶液6-8ml，然后用玻璃棒將番茄花蕾碾碎，懸浮液通過300目的細胞篩后，放入帶刻度的離心管中，于6001200rpm離心25min。棄上清液，再加入0.3mol.L—1甘露醇溶液6-8ml,6001200rpm離心25min。然后，倒掉上清液，再向離心管中加入誘導培養(yǎng)基懸浮小孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋小孢子濃度到1.52X105個.ml/1。3)番茄小孢子的預處理最后以3mL的量分裝在60X15mm的培養(yǎng)皿中，用6Paraflim封口，然后在黑暗中，于4°C下靜置2天后，再于36°C靜置2天。4)番茄小孢子的培養(yǎng)于27°C下在誘導培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，直到有愈傷組織出現(xiàn)，再轉到27°C下光照16h于誘導培養(yǎng)基中進行光培養(yǎng)誘導培養(yǎng)基的組成基本培養(yǎng)基為MS，植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.lmg.L-1+6-BAO.2mg.L-1附加物為500mg.L-1谷氨酰胺+3mg.L-1AgNCV碳源為0.3%蔗糖。實施例2試驗材料同實施例1.1)番茄單核靠邊期花蕾的消毒植株顯蕾開始，每天上午8:00-10:00用鑷子從植株上取不同大小的花蕾，用冰盒帶回實驗室，醋酸洋紅染色壓片鏡檢，確定小孢子發(fā)育時期。選擇小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾，流水沖洗15min，70%酒精消毒30s，5%的次氯酸鈉消毒1520min，去離子無菌水沖洗3次，每次35min。2)番茄小孢子的游離用鑷子取番茄花蕾放于無菌試管中，加入0.3mol.L—1的甘露醇溶液68mL；用玻璃棒將番茄花蕾碾碎，所得懸浮液通過300目的細胞篩，放入帶刻度的離心管中，600rpm離心5min；棄上清液，加入68mL甘露醇溶液，600rpm離心5min，重復3次。最后，棄上清液，加入誘導培養(yǎng)基懸浮小孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，稀釋小孢子濃度到1.5ZXK^f.mL—1。3)番茄小孢子的預處理將小孢子懸浮液以3mL的量分裝在60X15mm的培養(yǎng)皿中，用Paraflim封口。黑暗條件下，于4°C下靜置2天，然后于36°C下靜置2天。4)番茄小孢子的培養(yǎng)于27°C下進行暗培養(yǎng)，直到有愈傷組織出現(xiàn)，再轉到27°C光照16h進行光培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)基的組成同實施例1。實驗結果不同基因型的番茄品種的小孢子在實施例1和實施例2中均獲得了大量的愈傷組織。實施例3實驗的各步驟同實施例2，實驗材料為普通番茄，各實驗所用的誘導培養(yǎng)基見表2。表2.各實驗所用的誘導培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結果不同基因型的番茄品種的小孢子在以下誘導培養(yǎng)基中獲得了大量愈傷組織，見表3。表3.獲得了大量愈傷組織的實驗列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>不同基因型的番茄品種的小孢子在以下誘導培養(yǎng)基中獲得了少量愈傷組織，見表4。表4.獲得了少量愈傷組織的實驗列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其他的誘導培養(yǎng)基沒有獲得愈傷組織。以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準。權利要求一種誘導培養(yǎng)基，包含有基本培養(yǎng)基、碳源、附加物和植物生長調(diào)節(jié)劑，其特征在于所述基本培養(yǎng)基為MS、PM或HN；所述植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA0.1mg.L-1+6-BA0.2mg.L-1、NAA0.01mg.L-1+6-BA0.1mg.L-1、NAA0.01mg.L-1+6-BA0.1mg.L-1、6-BA0.01mg.L-1或NAA0.01mg.L-1+6-BA0.2mg.L-1；所述碳源為0.3％蔗糖和/或0.3％麥芽糖；所述附加物為500mg.L-1谷氨酰胺和/或3mg.L-1AgNO3。2.根據(jù)權利要求1所述的誘導培養(yǎng)基，其特征在于所述誘導培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基為MS,植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.lmg.L_1+6-BA0.2mg.I71、NAAO.Olmg.L_1+6-BA0.lmg.I71或NAAO.Olmg.L^+B-BAO.2mg.L—1，附加物為500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.U'AgNO,,碳源為0.3%蔗糖。3.根據(jù)權利要求1所述的誘導培養(yǎng)基，其特征在于所述誘導培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基為HN，附加物為500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.I^AgNC^，碳源為0.3%蔗糖，植物生長調(diào)節(jié)劑為NAAO.Olmg.L^+B-BAO.lmg.L—1；或者基本培養(yǎng)基為PM，附加物為500mg.L—1谷氨酰胺+3mg.I^AgNOy碳源為0.3%麥芽糖，植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BAO.Olmg.I71。4.利用權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法，其特征在于包括以下步驟(1)番茄單核靠邊期花蕾的消毒；(2)番茄小孢子的游離；(3)番茄小孢子的預處理；(4)番茄小孢子的培養(yǎng)，于權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到獲得愈傷組織。5.根據(jù)權利要求4所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于步驟(1)中，獲得所述番茄單核靠邊期花蕾的方法為植株現(xiàn)蕾開始，從植株上采取花蕾，醋酸洋紅染色壓片鏡檢，得到番茄單核靠邊期花蕾。6.根據(jù)權利要求4所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于步驟(1)中，所述消毒的方法為先用流水沖洗番茄單核靠邊期花蕾1020min，再用70%酒精消毒2040s和5%次氯酸鈉消毒1520min，最后用無菌水沖洗。7.根據(jù)權利要求4所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于步驟(2)中，所述游離的方法為番茄單核靠邊期花蕾放于無菌試管中，然后加入0.3mol/L甘露醇溶液68mL，碾碎，所得懸浮液過300目的細胞篩，6001200rpm離心25min，去掉上清液，重復24次。最后，倒掉上清液，加入權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基懸浮番茄小孢子，并稀釋所得番茄小孢子到濃度為1.52X105個/mL。8.根據(jù)權利要求4所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于步驟(3)中，所述番茄小孢子的預處理是將步驟(2)所得番茄小孢子分裝在培養(yǎng)皿中，封口，然后在黑暗中，于35°C下靜置13天后，再于3040°C下靜置13天。9.根據(jù)權利要求48任一項所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于步驟(4)中，所述番茄小孢子的培養(yǎng)是指于2430°C下，在權利要求13任一項所述的誘導培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，直到有愈傷組織出現(xiàn)，再轉到2430°C下光照1418h進行光培養(yǎng)。10.根據(jù)權利要求9所述的獲得愈傷組織的方法，其特征在于所述暗培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為27°C，有愈傷組織出現(xiàn)時，再轉到27°C下光照16h進行光培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種誘導培養(yǎng)基及利用該誘導培養(yǎng)基游離培養(yǎng)番茄小孢子獲得愈傷組織的方法。上述誘導培養(yǎng)基包含有基本培養(yǎng)基(MS、PM或HN)、碳源(蔗糖或麥芽糖)、附加物(谷氨酰胺和/或AgNO3)和植物生長調(diào)節(jié)劑(NAA+6-BA)。本發(fā)明綜合考慮了影響番茄小孢子培養(yǎng)的多方面因素，通過嘗試多種培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑的組合，得到了適宜小孢子生長的培養(yǎng)基配方，高、低溫交替處理預培養(yǎng)的方法提高了出愈率，通過液體游離培養(yǎng)進一步提高了出愈率，為后續(xù)研究工作的順利開展奠定了堅實的基礎。文檔編號C12N5/04GK101824396SQ20101016847公開日2010年9月8日申請日期2010年5月11日優(yōu)先權日2010年5月11日發(fā)明者孫亞東,徐加新,李繼綱,梁燕,王曉靜申請人:西北農(nóng)林科技大學