專利名稱：蘋果MdMYB1基因中與著色相關(guān)的兩處突變及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蘋果MdMYBl基因中的兩處突變與蘋果果實著色性狀的關(guān)系及突變檢測方法。
背景技術(shù)：
蘋果(Malus domestica Borkh.)是我國果樹產(chǎn)業(yè)中重要的大宗水果，其著色問題是影響我國許多產(chǎn)區(qū)蘋果質(zhì)量的一個重要因素，培育著色好的品種是生產(chǎn)中急需的。通過研究利用蘋果著色相關(guān)基因的序列變異，開發(fā)果實著色性狀的分子標(biāo)記，提早鑒定雜交后代植株果實著色性狀，對雜交后代植株提早進行篩選，將有助于降低早期試驗費用和工作量，以低成本盡快培育出著色好的蘋果新品種，增強我國蘋果的質(zhì)量和市場競爭力。蘋果的著色與果皮中的花色苷有關(guān)，花色苷的合成涉及查爾酮合成酶(OB)、類黃酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、UDP-葡萄糖類黃酮-3-0-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 (UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的積累與這些基因、特別是UFGT基因的表達水平有關(guān)，這些基因的表達受到MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，MdMYBl基因是一個與果實著色有關(guān)的功能基因(Takos 等，2006)。Takos 等 Q006)通過分析MdMYBl-I (GenBank登錄號 DQ886414) 等基因序列，找到了一個與果實著色性狀有關(guān)的堿基突變位點，開發(fā)出一個dCAPS標(biāo)記。 dCAPS標(biāo)記是一種改進的CAPS標(biāo)記(derived CAPS)，而CAPS標(biāo)記是指切割擴增的多態(tài)性序列標(biāo)記(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos 等(2006)開發(fā)的 dCAPS 標(biāo)記雖然不能將澳洲青蘋等品種與一些著色品種區(qū)分開，但可以區(qū)分其它一些著色與非著色品種，可以完全區(qū)分雜交親本植株(粉紅女士姊妹株、金帥)及其后代植株，在雜交后代植株的早期選擇中利用價值高。該dCAPS標(biāo)記的缺點是酶切后的片段長度僅有^bp的差異， 利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測，需要用價格約為7000元/125g的昂貴NuSieve GTG瓊脂糖進行電泳檢測。本發(fā)明的目的是通過進一步分析MdMYBl基因序列，尋找其它與蘋果果實著色性狀相關(guān)的突變位點，開發(fā)可用普通瓊脂糖電泳檢測的分子標(biāo)記(例如CAPS標(biāo)記) 用來鑒定蘋果植株果實著色性狀。參考文獻[1]苑克俊，張毅，孫瑞紅，張振成.蘋果、葡萄花色苷生物合成研究進展.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998,6 :46-49.[2]張學(xué)英，張上隆，駱軍，葉正文，李世誠.果實花色素苷合成研究進展.果樹學(xué)報，2004，21 (5) :456-460.[3] Takos, Α. M.，Jaffe, F. W.，Jacob, S. R.，Bogs, J.，Robinson, S. P.，Walker, A. R. Light-Induced Expression of a MYB Gene Regulates Anthocyanin Biosynthesis inRed Apples. Plant Physiology,2006,142(3) :1216-1232.[4] Ban, Y. , Honda, C. , Hatsuyama, Y. , Igarashi, Μ. , Bessho, H. and Moriguchi, T.Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that isa key regulator for the development of red coloration in apple skin. PlantCellPhysiology,2007,48(7) :958-970

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明找出蘋果MdMYBl基因中兩處突變與蘋果果實著色性狀相關(guān)，提供檢測這些突變、進而鑒定蘋果果實著色性狀的分子標(biāo)記方法和測序方法。本發(fā)明解決問題所采用的技術(shù)方案是根據(jù)蘋果MdMYBl基因(GenBank登錄號 DQ886414)序列設(shè)計引物，利用設(shè)計的引物對8個不同蘋果品種的基因組DNA進行PCR擴增，通過對這些蘋果品種的PCR擴增產(chǎn)物測序與序列比對尋找突變，然后分析這些蘋果品種的基因突變與果實著色性狀的關(guān)系，找出與蘋果果實著色性狀相關(guān)的兩處突變，開發(fā)用普通瓊脂糖電泳檢測突變的分子標(biāo)記方法(例如CAPS標(biāo)記方法)用來鑒定蘋果果實著色性狀，也可通過測序方法獲得突變位點堿基信息鑒定蘋果果實著色性狀。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明通過實驗新找出蘋果MdMYBl基因中兩處突變與蘋果果實著色性狀相關(guān)，可用來開發(fā)新的方法鑒定蘋果果實著色性狀。(2)與現(xiàn)有的利用另外一處突變鑒定蘋果果實著色性狀的dCAPS標(biāo)記相比，本發(fā)明新開發(fā)的CAPS標(biāo)記鑒定方法簡單實用?，F(xiàn)有dCAPS標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物酶切后，片段長度僅有^bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無法檢測；本發(fā)明CAPS標(biāo)記PCR擴增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物，通過設(shè)計引物可將酶切產(chǎn)物的片段長度差異控制在70 200bp，可利用普通的瓊脂糖電泳檢測，而且由于片段差異大，電泳時間可縮短。( 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明CAPS標(biāo)記方法節(jié)省實驗成本效果突出?，F(xiàn)有dCAPS標(biāo)記實驗在3%的NuSieve GTG瓊脂糖上進行電泳檢測，NuSieve GTG瓊脂糖價格昂貴為6900元/125g ；本發(fā)明CAPS標(biāo)記實驗在1. 2%的普通瓊脂糖上電泳檢測，價格僅220元/100g。一次實驗按IOOml凝膠溶液計算，則現(xiàn)有dCAPS標(biāo)記實驗瓊脂糖費用 165. 6元，本發(fā)明CAPS標(biāo)記實驗瓊脂糖費用僅2. 64元，實驗成本顯著降低。(4)利用本發(fā)明可鑒定蘋果品種和雜交后代植株果實著色性狀后，進而對蘋果雜交后代植株進行早期選擇，舍棄一部分植株，節(jié)省雜交后代植株的管理與篩選成本?？傊?，本發(fā)明為蘋果的果實著色性狀改良提供了一種簡單易用的低成本分子標(biāo)記育種手段。這里需要說明的是本發(fā)明所用8個蘋果品種富士、國光、嘎拉、紅星、紅玉、印度、 金帥、青香蕉全部為生產(chǎn)上栽培的品種，公眾能得到；本發(fā)明涉及基因序列為已知MdMYBl 基因序列，不涉及核苷酸或氨基酸序列表；本發(fā)明設(shè)計人曾在2009年11月21-22日于廣州召開的“慶祝中國園藝學(xué)會創(chuàng)立80周年暨第十一次會員代表大會”發(fā)表“蘋果著色相關(guān)基因的分子標(biāo)記及其利用研究”論文摘要，但該論文是研究另一突變，本發(fā)明權(quán)利要求中與蘋果果實著色性狀有關(guān)的兩處MdMYBl基因突變及其檢測方法未發(fā)表。為慎重起見，我們還是填寫了發(fā)明專利請求書(19)不喪失新穎性寬限聲明。


圖1是8個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。圖中M. DNA分子量標(biāo)記，數(shù)字和bp
為標(biāo)記大小與單位，1.富士，2.國光，3.嘎拉，4.紅星，5.紅玉，6.印度，7.金帥，8.青香 >、、、 圖2是已知位點227的堿基信息、本發(fā)明新找出的206與280兩處突變位點的堿基信息與果實著色性狀；
圖3是本發(fā)明第一個實施例8個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物酶切后的電泳圖，圖中 M. DNA分子量標(biāo)記，數(shù)字和bp為標(biāo)記大小與單位，1.富士，2.國光，3.嘎拉，4.紅星，5.紅玉，6.印度，7.金帥，8.青香蕉；
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。本發(fā)明測序方法檢測突變實施步驟步驟1，試材富士和嘎拉蘋果及其雜交后代植株的葉或花，以及金帥、國光、紅星、紅玉、印度、青香蕉六個蘋果品種的葉或花。步驟2，基因組DNA提取試材研磨后立即加入預(yù)熱至65°C的0.6mL 2% CTAB提取緩沖液[2 % CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl,2 % PVP-40,2% β -巰基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，這期間輕輕倒置樣品試管3次。取出加入0. 6mL氯仿異戊醇04 1)，輕輕翻轉(zhuǎn)，充分混勻，12000rpm離心lOmin。將上清液轉(zhuǎn)入另一個新試管，加入等體積經(jīng)-20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，在12000rpm離心IOmin 后將上清液移去。試管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙醇(_20°C )漂洗2次，將試管置于室溫下晾干，加入30 50 μ L滅菌無離子水或0. 2Χ的ΤΕ，再加入1 μ LRNase A (2. 5mg/ ml)處理除去RNA，在4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫瑫簳r不用的DNA則冷凍保存。步驟3，PCR擴增利用MdMYBl基因序列在突變兩側(cè)設(shè)計正向引物Mb2f (序列為 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)和反向引物 Mb2R(序列為 TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，也可設(shè)計其它正向和反向引物。PCR反應(yīng)液(20 μ L)含有0. 5yU25ng)基因組DNA和19. 5 μ L反應(yīng)混合物，一份混合物由0. 4 μ L dNTPs (10mmol/L)、2 μ L IOx Taq緩沖液、0. 5 μ L正向引物 (10ymol/L)、0.5yL 反向引物(10 μ mol/L)、0· 25 μ L(5U)的 Taq DNA 聚合酶禾口 15. 85 μ L 水組成。PCR反應(yīng)35個循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、56°C退火Imin和72°C引物延伸 2min。步驟4，電泳檢查將3 μ L PCR產(chǎn)物、6 μ L /K和1 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示。步驟5，PCR產(chǎn)物測序由專門的生物技術(shù)公司進行。測序后通過對獲得的各蘋果品種序列進行比對分析找出突變位點，然后分析這些突變位點與前人開發(fā)的dCAPS標(biāo)記突變位點的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示，新找出位點206和位點280兩個突變位點(也就是 MdMYBl-I基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-16Mbp處和-1550bp處)，能提供與前人蘋果著色性狀 dCAPS分子標(biāo)記突變位點227相同的信息(即在每一突變位點前6個蘋果品種都含有一個相同的堿基，后6個蘋果品種都含有一個相同的堿基)，表明PCR產(chǎn)物測序新獲得的突變位點堿基信息可直接用來鑒定蘋果果實著色性狀，也可用來開發(fā)可鑒定蘋果果實著色性狀的分子標(biāo)記。本發(fā)明CAPS標(biāo)記方法檢測突變實施步驟步驟1，試材同上述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同上述測序方法。步驟3，PCR擴增同上述測序方法。步驟4，電泳檢查PCR產(chǎn)物同上述測序方法。
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步驟5，酶切實驗取5μ LPCR產(chǎn)物加入試管中，再加入2μ L反應(yīng)緩沖液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內(nèi)切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。步驟6，電泳檢查酶切產(chǎn)物20 μ L酶切產(chǎn)物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色， 在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示。有2個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條與蘋果果實著色性狀有關(guān)的495bp帶，有2個蘋果品種 PCR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條與蘋果果實非紅色性狀有關(guān)的698bp帶，有4個蘋果品種 PCR擴增產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)一條與蘋果果實著色性狀有關(guān)的495bp帶和一條與蘋果果實非紅色性狀有關(guān)的698bp帶。^MM 1 :CAPSt示iPi去撒_突奪、鑒定蘋果品種棺株著盧,t牛狀步驟1，試材富士、嘎拉、金帥、國光、紅星、紅玉、印度、青香蕉8個常見蘋果品種的葉或花。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，酶切實驗取5μ LPCR產(chǎn)物加入試管中，再加入2μ L反應(yīng)緩沖液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內(nèi)切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。20 μ L酶切產(chǎn)物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示。步驟5，蘋果品種植株著色性狀分析鑒于新找出的兩個突變位點能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記突變位點相同的信息，表明利用新獲得的突變位點堿基信息開發(fā)的蘋果果實著色性狀分子標(biāo)記，同前人的蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記一樣可鑒定蘋果雜交后代植株果實著色性狀。根據(jù)前人的dCAPS分子標(biāo)記分析蘋果著色性狀結(jié)果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條495bp帶，蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條698bp帶，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR擴增產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)一條698bp帶和一條495bp帶，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。實施例2 :CAPS標(biāo)記法檢測突變、鑒定蘋果雜交后代植株著餼性狀步驟1，試材利用富士和嘎拉蘋果作為親本進行雜交獲得種子，種子播種后獲得的蘋果雜交后代植株葉作為試材。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，酶切實驗取5μ LPCR產(chǎn)物加入試管中，再加入2μ L反應(yīng)緩沖液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性內(nèi)切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h進行酶切。20 μ L酶切產(chǎn)物加5 μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1. 2%瓊脂糖膠上進行電泳檢查酶切產(chǎn)物。步驟5，蘋果雜交后代植株著色性狀分析鑒于新找出的兩個突變位點能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記突變位點相同的信息，表明利用新獲得的突變位點堿基信息開發(fā)的蘋果果實著色性狀分子標(biāo)記，同前人的蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記一樣可鑒定蘋果雜交后代植株果實著色性狀。根據(jù)前人的dCAPS分子標(biāo)記分析蘋果著色性狀結(jié)果，
6本發(fā)明實施例蘋果雜交后代植株中，有些植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條495bp帶，其果實為紅色；有些植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物酶切后僅出現(xiàn)一條698bp帶，其果實為非紅色；有些植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)一條698bp帶和一條495bp帶，其果實為紅色(包括桔紅色)。 如果研究的目的是篩選非紅色品種，可保留僅出現(xiàn)一條698bp帶的雜交后代植株，舍棄其它雜交后代植株，因此可節(jié)約后期管理和篩選費用。如果研究的目的是篩選紅色品種，可舍棄僅出現(xiàn)698bp帶的雜交后代植株，保留其它雜交后代植株，節(jié)約后期管理和篩選費用。^MM 3 禾丨用突奪位點206鑒定蘋果品禾料首株著盧/丨牛狀步驟1，試材同前述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，電泳檢查同前述測序方法。步驟5，PCR產(chǎn)物測序同前述測序方法。步驟6，蘋果品種植株著色性狀分析鑒于新找出的突變位點206(也就是 MdMYBl-I基因轉(zhuǎn)錄起始點上游_1624bp處)能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記突變位點相同的信息，表明新獲得的突變位點206的堿基信息，同前人的蘋果著色性狀dCAPS 分子標(biāo)記一樣可鑒定蘋果雜交后代植株果實著色性狀。根據(jù)前人的dCAPS分子標(biāo)記分析蘋果著色性狀結(jié)果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點206含有G， 蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點206含有A，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點206 含有G和A，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。實施例4 利用突變位點280鑒定蘋果品種植株著餼性狀步驟1，試材同前述測序方法。步驟2，基因組DNA提取同前述測序方法。步驟3，PCR擴增同前述測序方法。步驟4，電泳檢查同前述測序方法。步驟5，PCR產(chǎn)物測序同前述測序方法。步驟6，蘋果品種植株著色性狀分析鑒于新找出的突變位點觀0(也就是 MdMYBl-I基因轉(zhuǎn)錄起始點上游_1550bp處)能提供與前人蘋果著色性狀dCAPS分子標(biāo)記突變位點相同的信息，表明新獲得的突變位點280的堿基信息，同前人的蘋果著色性狀dCAPS 分子標(biāo)記一樣可鑒定蘋果雜交后代植株果實著色性狀。根據(jù)前人的dCAPS分子標(biāo)記分析蘋果著色性狀結(jié)果，8個蘋果品種中，國光和紅玉2個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點280含有T， 蘋果果實著色性狀為紅色；金帥和青香蕉2個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點280含有C，蘋果果實著色性狀為非紅色性狀；富士、嘎拉、紅星和印度4個蘋果品種PCR產(chǎn)物序列位點280 含有T和C，蘋果果實著色性狀可能為紅色(包括桔紅色，如富士、嘎拉和紅星)，也可能為非紅色(如印度)。
權(quán)利要求
1.蘋果MdMYBl基因的一處突變，其特征是在MdMYBl-I基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-1624bp 處的堿基發(fā)生與蘋果果實著色性狀相關(guān)的突變或者雜合突變G — A、G — G/A、G — Α/Τ ；基于該處突變可開發(fā)檢測方法鑒定蘋果果實著色性狀。
2.蘋果MdMYBl基因的一處突變，其特征是在MdMYBl-I基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-1550bp 處的堿基發(fā)生與蘋果果實著色性狀相關(guān)的突變或者雜合突變T — C、T — T/C、T — C/A ；基于該處突變可開發(fā)檢測方法鑒定蘋果果實著色性狀。
3.—種檢測上述權(quán)利1所述突變的CAPS分子標(biāo)記方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1 提取DNA樣本；步驟2 在上述權(quán)利1所述突變兩側(cè)利用MdMYBl基因設(shè)計引物； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4 電泳檢查PCR產(chǎn)物； 步驟5 用RnlI酶酶切PCR產(chǎn)物；步驟6 普通瓊脂糖電泳檢測酶切產(chǎn)物，與前人需要在昂貴NuSieve GTG瓊脂糖上電泳檢測的dCAPS分子標(biāo)記相比，其實驗成本顯著降低。
4.一種檢測上述權(quán)利1或2所述突變的測序方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1 提取DNA樣本；步驟2 在上述權(quán)利1或2所述突變兩側(cè)利用MdMYBl基因設(shè)計引物； 步驟3:進行PCR擴增； 步驟4 普通瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物； 步驟5:PCR產(chǎn)物測序檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變，其特征是可以用來鑒定蘋果品種及雜交后代植株果實著色性狀，對蘋果雜交后代植株著色性狀進行早期選擇，舍棄一部分植株，節(jié)省雜交后代植株的管理與篩選成本，為蘋果果實著色性狀改良提供一種有效的低成本分子育種手段。
全文摘要
蘋果MdMYB1基因中與著色相關(guān)的兩處突變及其檢測方法。本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，為蘋果著色性狀改良提供一種低成本分子育種手段。利用蘋果著色相關(guān)基因MdMYB1設(shè)計一對引物，以蘋果基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得PCR擴增片段。對8個蘋果品種的PCR擴增片段進行測序和分析，找出兩處與蘋果著色性狀有關(guān)的基因突變，其中一處為Pml I酶切位點。利用該酶切位點開發(fā)出一個檢測突變的CAPS標(biāo)記Mb2P，其顯著進步是它能用普通瓊脂糖電泳檢測，實驗成本顯著降低，不象前人的dCAPS標(biāo)記需用昂貴的NuSieve GTG瓊脂糖電泳檢測。通過CAPS標(biāo)記或測序方法檢測突變，可鑒定蘋果品種及雜交后代果實著色性狀，對蘋果雜交后代果實著色性狀進行早期選擇，舍棄部分植株，節(jié)省后代植株的管理與篩選成本。
文檔編號C12Q1/68GK102242186SQ201010168149
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者劉慶忠, 苑克俊, 魏海蓉, 黃立香 申請人:山東省果樹研究所