專利名稱：基于果膠甲基酯酶Pcpme6基因開發(fā)的檢測辣椒疫霉菌的引物及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于果膠甲基酯酶Pcpme6基因開發(fā)的檢測辣椒疫霉菌的引物及方法。
背景技術：
植物病原卵菌是ー類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導致多種植物毀滅性的病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘重要疫病，嚴重年份乃至絕產。卵菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘體或土壤中度過不良環(huán)境并作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產生孢子囊-釋放游動孢子，借助雨水或氣流傳播、侵染而引起植物病害。因此，對該類病菌引起的病害早期進行適時檢控，利于控制病害的發(fā)生。傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產生明顯危害時實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。近年來，PCR技術及其相關分子檢測技術已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預警，其中利用核糖體rDNA/ITS序列設計特異引物，已針對性的開展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉分子檢測技術研究，但這些技術性研發(fā)成果僅能對病菌活動動態(tài)進行檢測與預警，但不能對病菌致病特性與發(fā)生趨勢進行檢測與預警。研究表明疫霉菌-寄主互作過程中常分泌多種重要的細胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果膠甲基酯酶(Pme)、果膠裂解酶(Pel)，這些重要致病因子主要通過降解或軟化植物細胞壁的主要成分果膠、中膠層及果膠聚合體，而促使病菌的侵入與定植，對寄主產生寄生與致病性。該類致病酶均由多基因編碼，如辣椒疫霉果膠甲基酯酶由9個基因編碼，名稱為 Pcpme 1-9 (GenBank 號分別為EF596784、FJ213426、FJ213427、FJ213428、FJ213429、FJ213430、FJ213431、FJ213432及FJ213433)。其中少數(shù)關鍵基因是重要的致病靶基因，因此分離鑒定這些重要致病酶的靶標基因，利用基因信息學設計并合成靶標基因的特異引物，針對病菌不同時期致病特性進行分子檢測與預警，以便在病菌初侵染期適時采取綜合防控措施，減少藥劑使用次數(shù)及使用量，阻斷病菌的擴展與蔓延，控制病害的發(fā)生與蔓延。因此，開展重要疫霉菌致病酶類靶標基因克隆及其特異引物設計與合成，研制病菌分子檢測、預警技術及其試劑盒，對疫霉病的綜合防控具有重要的理論與實踐意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的ー個技術問題是提供ー種可特異檢測辣椒疫霉的PCR引物對(試劑)。本發(fā)明所提供的特異檢測辣椒疫霉的PCR引物對，是果膠甲基酯酶基因Pcpme 6的特異引物對，其名稱為Pme6F-R，由序列表中序列I所示的單鏈DNA(Pme6F)和序列表中序列2所示的單鏈DNA(Pme6R)組成。其中，序列表中的序列I由20個核苷酸組成，序列2由21個核苷酸組成。含有Pme6F-R的檢測或輔助檢測辣椒疫霉的PCR試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍，該試劑盒還可含有DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP和dGTP等其它PCR試劑。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉的方法。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉的方法，包括如下步驟用Pme6F-R對待測樣品進行PCR，確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉或確定待測樣品中辣椒疫霉菌的含量。所述待測樣品可為土壤或為所述辣椒疫霉的宿主植物組織和/或器官，如辣椒葉片、莖、果實等。上述方法中，可按照如下方法確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉以待測樣品的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的CDNA為模板，用Pme6F-R進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，若所述PCR擴增產物滿足下述I)或2)的條件，則所述待測樣品含有辣椒疫霉或候選含有辣椒疫霉；若所述PCR擴增產物不滿足所述I)或2)的條件，則所述待測樣品不含有辣椒疫霉或候選不含有辣椒疫霉；I)所述PCR擴增產物為173bp的片段；2)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為100bp_200bp的條帶。其中，確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉的PCR擴增的條件可為95°C預變性4min ;94°C變性 lmin，50°C 30s, 72°C lmin，35 個循環(huán)。上述方法中，可采用實時熒光定量PCR確定待測樣品中辣椒疫霉菌的含量。所述實時熒光定量PCR的條件可為95°C預變性2min ;94°C變性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s, 45個循環(huán)。實驗結果顯示，本發(fā)明的果膠甲基酯酶基因Pcpme 6的特異引物對Pme6F_R,可對不同時期的辣椒疫霉及不同辣椒疫病材料(病田土壌、病莖、病果、病葉)進行定性、定量分子檢測，可對辣椒疫霉初侵染源及其侵染過程各個時期病菌消長動態(tài)進行檢測與預警，便于及時確定病害最佳防控時期，特別是在病菌早期活動時期適時進行綜合防控與治理，如根據(jù)對土壌中卵孢子檢測的有無及多少，適時處理土壌，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，降低了病害防控成本。


圖I為9個Pcpme基因于接種辣椒果實中RNA轉錄表達水平qRT-PCR檢測結果示意圖。圖中橫坐標1、2、3、4分別代表辣椒疫霉菌接種辣椒果實天數(shù)ld、3d、5d、7d，A_I分別代表 9 個基因 Pcpmel-9 ;A :Pcpme I, B Pcpme 2, C Pcpme 3, D Pcpme 4, E Pcpme 5, F Pcpme 6, G Pcpme 7, H Pcpme 8, I Pcpme 9。標準誤差來自三次重復實驗。圖2為Pcpme 6基因特異引物對不同參試種菌DNA的PCR檢測結果示意圖。
圖中，A為Pcpme 6基因一對特異引物對Pme6F_R對不同種菌DNA的PCR檢測結果；B為Pcpme I基因一對特異引物對PmelF-R對不同種菌DNA的PCR檢測結果；1 :標準DNA ；2 :陰性對照水；3-7 :辣椒疫霉 SD33, Jul02101, Jul02104, ATCC7858, ATCC7859 ；8 大ii疫霉；9 :寄生疫霉；10 :致病疫霉；11 :棒疫霉；12 :掘氏疫霉；13 :掠桐疫霉；14 :熱帶疫霉；15 :苧麻疫霉；16 :惡疫霉；17 :苜蓿疫霉；18 :芋疫霉；19 :標準DNA;20 :隱地疫霉；21 跳J2 疫霉；22 :早眷疫霉；23 :大雄疫霉；24 :采ii疫霉；25 :蔥疫霉；26 :冬生疫霉；27 :瓜果腐霉；28 :水霉；29 :甘薯根霉；30 :立枯絲核；31 :串珠錸刀菌；32 :腐皮錸孢菌；33 :茄鏈格孢；34 :青霉菌；35 :淡黃曲霉。圖3為Pcpme 6基因特異引物PCR檢測辣椒疫霉菌游動孢子DNA結果示意圖。圖中，A為Pcpme 6 一對 特異引物對Pme6F_R對不同濃度辣椒疫霉菌SD33游動孢子DNA的PCR檢測結果；圖B為參比基因Pcpme I 一對特異引物對PmelF-R對不同濃度游動孢子DNA的PCR檢測結果；1 :標準DNA ；2 :陰性對照水；3 :陽性對照辣椒疫霉菌SD33DNA ；4-18 :對不同體積的游動孢子 DNA (6. 0,5. 5,5. 0,4. 5,4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. 0,1. 5，1.0,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2uL)DNA 檢測效果(7 個游動孢子 / y L)。圖4為Pcpme 6基因特異引物PCR檢測辣椒疫霉菌SD33卵孢子DNA示意中，A為Pcpme 6 —對特異引物Pme6F_R對卵孢子DNA PCR檢測結果；B為Pcpme
I一對特異引物PmelF-R對卵孢子DNA PCR檢測結果；1 :標準DNA ；2 :陰性對照水；3 :陽性對照辣椒疫霉菌SD33 DNA ；4-14 :對不同體積的卵孢子DNA(4. 0,3. 5,3. 0,2. 5,2. 0，I. 5，
I.0,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2u L)DNA 檢測效果(7 個卵孢子 / y L)。圖5為Pcpme 6基因特異引物對Pme6F-R不同辣椒疫霉菌材料PCR擴增結果示意中，I :標準DNA ；2-3 :無菌水和健康辣椒組織DNA ；4 :辣椒疫霉菌SD33菌絲體DNA ；5 :病莖組織DNA ；6 :病果組織DNA ；7 :病葉組織DNA ；8 :人工接種卵孢子的土壤菌體DNA ；9 :含有卵孢子的病田土壤菌體DNA。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，如Sambrook等分子克隆實驗手冊 (New York GoldSpring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(1988)操作技術規(guī)程或按照制造廠商所建議的實驗條件。下述實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例I、特異檢測辣椒疫霉的引物對Pme6F-R的獲得及其特異性和靈敏度本實施例以辣椒疫霉為參試材料，依據(jù)qRT-PCR技術檢測辣椒疫霉果膠甲基酯酶基因Pcpme 1-9這9個基因成員在辣椒病果實中RNA轉錄表達水平的差異，比較相關數(shù)據(jù)信息，Pcpme 6被界定為祀標致病基因，設計并合成Pcpme 6基因(序列3)的多對特異引物，測試了這些引物對對所有參試菌種的特異性及對辣椒疫霉菌檢測的靈敏性。從中選擇出了一對特異性和靈敏度均較高的引物對Pme6F-R作為特異檢測辣椒疫霉的引物對，上游引物為 Pme6F(20bp)，序列為 5'-CCGAAGTTAGCTGGACCGIT-3' ;下游引物為 Pme6R(21bp)，序列為5'-ACTCCAITGCGAGACTTGAGA-3'，擴增目的基因長度為173bp。具體步驟如下1、9個Pcpme基因在接種辣椒果實中RNA轉錄表達水平qRT-PCR檢測步驟I. I、辣椒疫霉菌 SD33(山東農業(yè)大學)(Yong Jian Jia,Bao Zhen Feng,Wen XiuSun and Xiu Guo Zhang, J. Phytopathol 157 :585-591, 2009)游動抱子接種辣椒果實，具體方法如下I. I. I、將辣椒疫霉菌株SD33移置于10% V8固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，挑取菌落邊緣菌絲塊至10% V8液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，25°C黑暗培養(yǎng)5-6天。I. I. 2、加入滅菌水，剛好浸沒菌絲為宜，每隔I天換水至產生游動孢子，收集游動孢子調節(jié)濃度至I X IO5個/ml，配置游動孢子懸浮液用于辣椒果實接種。I. I. 3、辣椒疫霉菌游動孢子懸浮液接種辣椒果實I)取新鮮幼嫩辣椒果實，經75%無水こ醇消毒處理，置無菌操作臺晾干。2)手木刀將果實表皮組織輕輕劃破，造成深度約1cm，面積約0. 25cm2微創(chuàng)傷。3)將于適宜濃度的游動孢子懸浮液中浸泡30min的無菌脫脂棉球覆蓋于傷ロ處，然后用保鮮膜包扎密封。4)接種果實置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d，按照I、3、5、7d間隔取樣，切取病健交界處保存置_80°C下備用提取RNA。I. 2、提取接種辣椒果實RNA，用微量蛋白核酸測定儀(IMPLEN)測定RNA濃度，反轉錄合成cDNA第一鏈，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測9個基因于接種辣椒病果中RNA轉錄表達水平。具體方法如下I. 2. I、接種辣椒疫霉菌辣椒病果RNA提取I)取辣椒病果0. Ig于液氮中充分研磨，移入Iml Trizol中，混勻后室溫下靜置5min,使核蛋白復合物完全解離(樣品體積不超過所用Trizol體積的10% )。2)加入0. 2mL氯仿，劇烈搖動或用旋潤震蕩器混勻，4°C下12000rpm/min離心15min,吸取上清夜,重復一次或多次該步驟。3)吸取上清夜，每Iml Trizol加入0. 25倍體積異丙醇和0. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放置lOmin，于4°C下12000rpm/min離心lOmin。4)收集RNA沉淀，用75%こ醇洗滌2次，重復上述離心。5) 一次性吸頭吸盡殘存こ醇，打開管蓋的離心管放置實驗臺幾分鐘，使殘余こ醇揮發(fā)棹。6)加50-100 U I DEPC處理的水，將RNA溶液貯存于_70°C。I. 2. 2、RNA 檢測通過RNA甲醛變性電泳鑒定RNA完整性，rRNA占總RNA80-85%，瓊脂糖凝膠可清晰看到28S和18SrRNA。28SrRNA量約是18SrRNA的兩倍，說明RNA完整性較好。取2. 5 ylRNA樣品，用微量蛋白核酸測定儀(MPLEN)測定RNA，結果表明A260/A280比值為I. 9-2. 1，得到純度較高的RNA。I. 2. 3、反轉錄cDNA第一鏈合成I)反應體系為最終為 20 iiL，10 X RT mix 2 y L，2. 5mmol/LdNTP 混合液 2 y L，引物01igo_dT 2 u L, Quant Reverse Transcriptase I U L, RNase Free ddH20 13_xyL,豐莫板RNA第四步加入X iiし
2)將模板RNA在冰上解凍，引物、10 X RT mix、dNTP混合液、RNase Free ddH20在室溫解凍，然后迅速置于冰上。使用前將各種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心收集殘留于管壁上的液體。
3)按照I)反轉錄體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩不超過5秒鐘，簡短離心，置于冰上。4)如需多個反轉錄反應，可將配制好的混合液分裝在單反應管中，置于冰上。5)將模板RNA加入混合液中，徹底混勻，簡短離心收集管壁上殘留液體。6) 37°C孵育60分鐘，后反轉錄產物進行后續(xù)PCR反應。
I. 2. 4、實時熒光定量 PCR (qRT-PCR)所采用的qRT-PCR引物序列如下Pcpme I 的上游引物5'-CAGGTGCTCAITTCCAAGITGAA-3'，Pcpme I 的下游引物5'-TGTTGGCGATGTTGAGGTTGTA-3' ；Pcpme 2 的上游引物5'-ITTACAACGAGCAGGnTTCGIT-3'，Pcpme 2 的下游引物5'-GTACACCTTGACGTTGTCCGA-3' ；Pcpme 3 的上游引物5' -AACGTACCAAGAGCAAGTCACA-3'，Pcpme 3 的下游引物5'-CAGAGTGGTGGTGTAGTCGTT-3' ；Pcpme 4 的上游引物5'-ITTCCAGGGTTGTATCAAGAGCA-3'，Pcpme 4 的下游引物5'-CAAGTCGTTGCGGTTGTTCTT-3' ；Pcpme 5 的上游引物5'-CAGGTGCTCAITTCCAAGITGAA-3'，Pcpme 5 的下游引物5'-TGTGTTGGCGATGTTGAGGTT-3' ；Pcpme 6 的上游引物5'-CCGAAGTTAGCTGGACCGIT-3' (序列 I)，Pcpme 6 的下游引物5'-ACTCCAITGCGAGACTTGAGA-3' (序列 2)；Pcpme 7 的上游引物:5'-ACGACATCGTACGCTTCCAA-3'，Pcpme 7 的下游引物:5'-TGTTGGCGATGTTGAGGTTGTA-3' ；Pcpme 8 的上游引物5'-CGTACGCTGCCAACCAAGT-3'，Pcpme 8 的下游引物5'-CGGTAGGATTGGCGACGTTA-3' ；Pcpme 9 的上游引物5'-CGAGCACACGCTCTTCATGT-3'，Pcpme 9 的下游引物:5'-AAATCCCTTTGAGCCATTGTGT-3' ；以辣椒寄主18S rRNA為內參基因，其上游引物5'-ITTCGGTCCTATTACGITGG-3' ；下游引物5'-ITCGCAGTTGITCGTCTTTC-3'。以不同接種時間辣椒果實總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，利用上述引物進行qRT-PCR, PCR 擴增體系為 20 y L，2. 5 X realMasterMix :8 u L,20X SYBR solution I ii L，正向引物0. 5 ii L，反向引物0. 5 ii L，cDNA模板2 y L，加dd H2O至20 yしPCR參數(shù)95°C預變性2min ;94°C變性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，45個循環(huán)，65_95°C制備溶解曲線。選擇辣椒寄主18S rRNA為內參基因，每個樣品做三個重復，用2_AAGt法對樣本基
因進行表達差異相對定量分析。A A Ct = (CT target_CT 18S rENA)待_本 ~~ (Ct target_CT 18s ノ 校準樣
ホ，選擇每個基因在接種第一天的表達為校準樣本，第3、5、7天為待測樣本，例如
權利要求
1.果膠甲基酯酶基因Pcpme6的特異引物對，其特征在于所述引物對由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成。
2.檢測或輔助檢測辣椒疫霉的PCR試劑，其特征在于所述試劑含有權利要求I所述的特異引物對。
3.檢測或輔助檢測辣椒疫霉的PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有為權利要求I所述的特異引物對。
4.權利要求I所述的特異引物對在制備檢測或輔助檢測辣椒疫霉的試劑或試劑盒中的應用。
5.權利要求I所述特異性引物對在檢測或輔助檢測辣椒疫霉中的應用。
6.檢測或輔助檢測辣椒疫霉的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟用權利要求I所述特異性引物對對待測樣品進行PCR，確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉或確定待測樣品中辣椒疫霉的含量。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于按照如下方法確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉以所述待測樣品的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用權利要求I所述特異性引物對進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，若所述PCR擴增產物滿足下述I)或2)的條件，則所述待測樣品含有辣椒疫霉或候選含有辣椒疫霉；若所述PCR擴增產物不滿足所述I)或2)的條件，則所述待測樣品不含有辣椒疫霉或候選不含有辣椒疫霉； 1)所述PCR擴增產物為173bp的片段； 2)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為100bp-200bp的條帶。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中采用如下條件的PCR擴增確定待測樣品中是否含有辣椒疫霉95°C預變性4min ;94°C變性lmin，50°C 30s, 72°C lmin，35個循環(huán)。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中采用實時熒光定量PCR確定待測樣品中辣椒疫霉的含量。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR的條件為95°C預變性2min ;94°C變性15s，55。。退火15s，68。。延伸30s，45個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于果膠甲基酯酶Pcpme6基因開發(fā)的檢測辣椒疫霉菌的引物及方法。本發(fā)明基于果膠甲基酯酶Pcpme6基因開發(fā)的檢測辣椒疫霉菌的引物，由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成。該引物可對不同時期的辣椒疫霉以及不同辣椒疫病材料進行定性、定量分子檢測，可對辣椒疫霉初侵染源及其侵染過程各個時期病菌消長動態(tài)進行檢測與預警，便于及時確定病害最佳防控時期，特別是在病菌早期活動時期適時進行綜合防控與治理，如根據(jù)對土壤中卵孢子檢測的有無及多少，適時處理土壤，阻斷源頭病菌的繁殖與蔓延，降低了病害防控成本。
文檔編號C12N15/11GK102628084SQ201210106669
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權日2012年4月12日
發(fā)明者張修國 申請人:山東農業(yè)大學