改善植物抗旱性：果膠酯酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)植物抗旱性的新方法。所述方法包括破壞所述植物中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。與沒有被處理以破壞所述基因的表達(dá)的植物相比，該植物顯示改善的抗旱性。還提供可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物和植物產(chǎn)品。
【專利說明】改善植物抗旱性：果膠酯酶

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)植物抗旱性的方法。所述方法包括破壞所述植物中一個(gè)或多 個(gè)基因的表達(dá)。與沒有被處理以破壞所述一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的植物相比，所述植物顯示 改善的抗旱性。還提供了可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物和植物產(chǎn)品。

【背景技術(shù)】
[0002] 非生物脅迫，例如干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫都是農(nóng)業(yè)的威脅，并 且其是全世界作物損失的主要原因（Wang等，（2003)Planta 218(1)1-14)。
[0003] 本領(lǐng)域中，一些報(bào)道可用于處理非生物脅迫的生物化學(xué)、分子和遺傳學(xué)背景（Wang 等，（2003)Planta 218(1) 1-14 或 Kilian 等（2007)Plant J 50(2)347-363)。用于處理非 生物脅迫的植物改良通常是基于保護(hù)和保持細(xì)胞組分的功能和結(jié)構(gòu)的基因操作。然而，由 于對(duì)非生物脅迫條件的遺傳復(fù)雜反應(yīng)，這樣的植物似乎更難控制和工程化。Wang (Wang等， (2003)Planta 218 (1) 1-14)，特別地提及工程化的策略之一依靠使用一個(gè)或幾個(gè)基因，所 述基因參與信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控途徑、或編碼引起功能和結(jié)構(gòu)性保護(hù)物例如滲透物和抗氧劑的 合成的途徑中存在的酶、或編碼賦予耐逆性的蛋白質(zhì)。
[0004] 盡管已經(jīng)報(bào)道了在提供非生物脅迫抗性植物方面的改善，但是以其為基礎(chǔ)的遺傳 復(fù)雜機(jī)制的性質(zhì)提供了進(jìn)一步改善該領(lǐng)域的持續(xù)的需要。例如，據(jù)報(bào)道由于發(fā)育和生理失 衡，基因轉(zhuǎn)化的抗旱植物通?？赡茱@示更慢的生長(zhǎng)和減少的生物量（Serrano等，（1999) J Exp Bot 50:1023 - 1036)，因此，與沒有轉(zhuǎn)化的植物相比具有顯著的適合度代價(jià)（Kasuga 等，（1999)Nature Biot.Vol.l7;Danby and Gehring(2005)Trends in Biot.Vol.23 No. 11)。
[0005] 為了在脅迫條件下獲得植物生長(zhǎng)，提出了一些生物技術(shù)方法。例如，W003/020015 中公開了對(duì)鹽脅迫的抗性增強(qiáng)的植物。該文件公開了利用9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加雙 氧酶核苷酸和多肽而抗鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因植物。
[0006] 在例如 US2009/0144850、US 2007/0266453 和 W0 2002/083911 中公開 了抗旱 性增強(qiáng)的植物。US2009/0144850描述了由于DR02核酸的表達(dá)改變而顯示耐旱表型的植 物。US 2007/0266453描述了由于DR03核酸的表達(dá)改變而顯示耐旱表型的植物，并且 W02002/083911描述了由于在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性降低而具有對(duì)干旱脅迫 的抗性增強(qiáng)的植物。另一個(gè)實(shí)例是Kasuga和合著者（1999)的工作，其描述了在正常生長(zhǎng) 條件下，轉(zhuǎn)基因植物中編碼DREB1A的cDNA的過表達(dá)活化許多脅迫抗性基因的表達(dá)，導(dǎo)致對(duì) 干旱、鹽負(fù)荷和嚴(yán)寒的抗性改善。然而，DREB1A的表達(dá)也引起在正常生長(zhǎng)條件下嚴(yán)重的生 長(zhǎng)遲緩（Kasuga(1999)Nat Biotechnol 17(3)287-291)。仍然需要用于增強(qiáng)對(duì)非生物脅迫 (尤其是如干旱的非生物脅迫）的抗性的新的、可替代的和/或另外的方法。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增強(qiáng)植物抗旱性的新方法。如果在低的水可利用性/干 旱的條件下生長(zhǎng)，與沒有接受根據(jù)本發(fā)明的方法的植物相比，這樣的植物例如有可能生產(chǎn) 更多生物量和/或更多作物和其衍生的植物產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)具有與對(duì)照植物相比改善的抗旱性的植 物的方法，其包括破壞植物、植物原生質(zhì)體或植物細(xì)胞中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)的 步驟，和可選擇地再生所述植物，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)包括具有與SEQ ID. No. 2 的氨基酸序列至少55%同一性的氨基酸序列。
[0009] 所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)可以是如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠 酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表 達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受 損的植物。
[0010] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)具有與對(duì)照植物相比改善的抗旱性的植 物的方法，所述方法包括破壞植物、植物原生質(zhì)體或植物細(xì)胞中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的 表達(dá)的步驟，和可選擇地再生所述植物，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)是由包含與SEQ ID. No. 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列的核酸序列編碼的。
[0011] 所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)可以是如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠 酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表 達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受 損的植物。
[0012] 所述破壞表達(dá)的步驟可以包括使編碼所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的核酸序列突 變。使所述核酸序列突變的步驟可以包括插入、缺失和/或取代至少一個(gè)核苷酸。
[0013] 所述破壞表達(dá)的步驟可以包括基因沉默。
[0014] 所述方法可以包括破壞兩種或更多種功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)。其可以進(jìn)一 步包括由具有改善的抗旱性的植物生產(chǎn)植物或植物產(chǎn)品的步驟。
[0015] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少55%同一性 的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性 篩選中的用途。
[0016] 另外，本文教導(dǎo)了 SEQ ID N0:2的果膠酯酶氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的果膠酯 酶核酸序列在擬南芥植物抗旱性篩選中的用途。
[0017] 本發(fā)明還涉及具有SEQ ID NO: 1的果膠酯酶核酸序列的至少一部分或SEQ ID N0:2的果膠酯酶氨基酸序列的至少一部分作為培育抗旱性擬南芥植物的標(biāo)記物的用途。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及如本文定義的功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)用于調(diào)節(jié)、優(yōu)選地增強(qiáng)植 物抗旱性的用途。
[0019] 另外，本發(fā)明涉及其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損的植物、植物細(xì)胞或植 物產(chǎn)品用于在干旱脅迫條件下生長(zhǎng)的用途，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白 質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其得到與其 中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥 T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能 性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)未受損的對(duì)照植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品顯示比其中功能性果膠 酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)被破壞的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品更早的干旱脅迫癥狀，比如枯萎癥 狀。
[0020] 最后，本發(fā)明提供其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損的番茄（Solanum lycopersicum)、陸地棉（Gossypium hirsutum)、大豆（Glycine max)、小麥屬植物 (Triticum spp.)、大麥(Hordeum vulgare.)、燕麥(Avena sativa)、高梁(Sorghum bicolor)、黑麥（Secale cereale)或甘藍(lán)型油菜（Brassica napus)植物、植物細(xì)胞或植物 產(chǎn)品，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶 基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、 具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損 的植物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品包括被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶 基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1顯示在實(shí)施例1和2中說明的典型的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0022] 圖2顯示與對(duì)照（野生型）植物的干旱敏感性表型相比，果膠酯酶敲除（擬南芥 At5gl9730插入突變體）的抗旱表型。
[0023] 圖3顯示At5gl9730插入突變體（果膠酯酶敲除）的干旱存活率。擬南芥 At5gl9730插入突變體比野生型植物或與補(bǔ)充來自蕪菁、番茄或稻的同系物的At5gl9730 插入突變體抗干旱存活顯著地更好（P < 〇. 05)。該圖表明不僅在該基因中的插入突變產(chǎn)生 抗旱表型，而且來自進(jìn)化不同的單子葉植物和雙子葉植物物質(zhì)的該基因同系物對(duì)于恢復(fù)正 常干旱-敏感性表型有作用。灰色條具有比黑色條顯著更低的值（P < 〇. 05)。
[0024] 定義
[0025] 在下述說明和實(shí)施例中，使用大量術(shù)語。為了提供對(duì)說明書和權(quán)利要求書（包括 給出的這類術(shù)語的范圍）的清楚一致的理解，提供下述定義。除非本文另有定義，否則使用 的所有技術(shù)術(shù)語和科技術(shù)語具有與如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的 含義。將所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過引用合并于此。
[0026] 實(shí)施用于本發(fā)明方法中的常規(guī)技術(shù)的方法將對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見的。本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知分子生物學(xué)、生物化學(xué)、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA、生物信息學(xué)、基因 組學(xué)、序列和相關(guān)領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)的實(shí)踐，并且在例如下述文獻(xiàn)參考中討論：Sambr 〇〇k等， Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 1987 及定期更新；和 the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego。
[0027] 在該文件及其權(quán)利要求書中，動(dòng)詞"包括"及其變化形式以非限定含義使用，意味 著包括該術(shù)語后的項(xiàng)目，但是不排除沒有明確提及的項(xiàng)目。其涵蓋動(dòng)詞"基本上由...組 成"以及〃由...組成〃。
[0028] 除非上下文另有清楚的規(guī)定，如本文使用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包 括復(fù)數(shù)指示。例如，如上述使用的用于分離"一個(gè)" DNA分子的方法包括分離多個(gè)分子（例 如，數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)、數(shù)千個(gè)、數(shù)萬個(gè)、數(shù)十萬個(gè)、數(shù)百萬個(gè)、或更多分子）。
[0029] 對(duì)齊（Aligning)和比對(duì)（alignment):術(shù)語"對(duì)齊"和"比對(duì)"指根據(jù)相同或相似 核苷酸的短或長(zhǎng)的延伸的存在，比較兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列。本領(lǐng)域已知一些核苷酸序 列比對(duì)的方法，如下進(jìn)一步解釋。
[0030] "基因表達(dá)"指可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)區(qū)（尤其是啟動(dòng)子）的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄成 RNA的過程，該RNA有生物活性，即能夠翻譯成生物活性蛋白質(zhì)或肽（或活性肽片段）或其 本身有活性（例如，轉(zhuǎn)錄后的基因沉默或RNAi)。在某些實(shí)施方式中，活性蛋白質(zhì)指具有組 成型活性的蛋白質(zhì)。編碼序列優(yōu)選地位于有義方向，并且編碼期望的、生物活性的蛋白質(zhì)或 肽、或活性肽片段。"異位表達(dá)"指在其中通?；虿槐磉_(dá)的組織中的表達(dá)。
[0031] 與果膠酯酶蛋白質(zhì)（或變體，例如直系同系物或突變體、及片段）有關(guān)的"功能性" 指基因和/或編碼蛋白質(zhì)改良（定量和/或定性）耐旱性的能力，例如通過改良植物中基 因的表達(dá)水平（例如通過過表達(dá)或沉默）。例如，可以通過各種方法檢測(cè)從植物物種X獲得 的果膠酯酶蛋白質(zhì)的功能性。優(yōu)選地，如果蛋白質(zhì)是功能性的，則植物物種X中編碼該果膠 酯酶蛋白質(zhì)的基因的沉默或敲除，例如使用基因沉默載體，將導(dǎo)致抗旱性改善，如通過本文 的詳細(xì)闡述檢測(cè)。而且，用編碼所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的核酸序列互補(bǔ)具有被破壞的 果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系將產(chǎn)生其中正?？购敌曰謴?fù)的植物，S卩補(bǔ)充的植物將 具有與對(duì)照植物類似的抗旱性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用如本文示例的常規(guī)方法測(cè)試果膠 酯酶蛋白質(zhì)的功能性。
[0032] 術(shù)語"基因"指包含區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)）的DNA序列，其被轉(zhuǎn)錄為可操作地連接至合適 的調(diào)控區(qū)（例如啟動(dòng)子）的細(xì)胞中RNA分子（例如mRNA)。因此，基因可以包括幾個(gè)可操作 地連接的序列，例如啟動(dòng)子、5'前導(dǎo)序列（包含例如參與翻譯起始的序列）、（蛋白質(zhì)）編 碼區(qū)（cDNA或基因組DNA)和3'非翻譯序列（也稱為3'未翻譯序列或3' UTR，包含例如轉(zhuǎn) 錄終止序列位點(diǎn)）。
[0033] 術(shù)語"cDNA"指互補(bǔ)DNA?；パa(bǔ)DNA是通過將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA序列制備的。 因此，cDNA序列對(duì)應(yīng)于從基因表達(dá)的RNA序列。由于當(dāng)從基因組表達(dá)時(shí)mRNA序列可能受到 剪切，即在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成蛋白質(zhì)之前，內(nèi)含子被從mRNA剪切掉且外顯子連接在一起，應(yīng) 當(dāng)理解cDNA的表達(dá)指編碼cDNA的mRNA的表達(dá)。因此，cDNA序列可能與其對(duì)應(yīng)的基因組 DNA序列不相同，因?yàn)閏DNA可能僅編碼蛋白質(zhì)的完全開放讀碼框（由連接的外顯子構(gòu)成）， 而基因組DNA編碼被內(nèi)含子序列散布的外顯子，其側(cè)面為5'和3' UTR序列。
[0034] "同一性"是對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的測(cè)量。通常，比對(duì)序列，以便 獲得最高位匹配。"同一性"本身具有領(lǐng)域公知的含義，并且可以使用公開的技術(shù)計(jì)算。 參見，例如 "COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988 ;BI0C0MPUTING:INF0RMATICS and GENOME PROJECTS，Smith, D.W.編 著，Academic Press，New York，1993 ;C0MPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，第 1 部分， Griffin，A.M.和 Griffin, H.G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994;SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G·，Academic Press，1987;和 SEQUENCE ANALYSIS PRIMER ;Gribskov，M.和 Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991)。雖然 有多種測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽序列之間的同一性的方法，但是普通技術(shù)人員所熟知該 術(shù)語"同一性"（Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073)。通 常用于確定兩個(gè)序列之間的同一性或相似性的方法包括，但不限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop 編輯，Academic Press，San Diego, 1994,以及 Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073中公開的方法。計(jì)算機(jī)程序編碼了測(cè)定 同一性和相似性的方法。優(yōu)選的測(cè)定兩個(gè)序列之間的同一性和相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包 括，但不限于 GCS 程序包（Devereux，J.等，Nucleic Acids Research(1984) 12(1):387)， BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.等，J.Molec. Biol. (1990)215:403)。
[0035] 作為示例，具有與編碼某個(gè)序列的多肽的參考核苷酸序列至少例如95%"同一性" 的核苷酸序列多核苷酸，表示該多核苷酸序列除了可以相對(duì)于每1〇〇個(gè)參考多肽序列的核 苷酸包括至多5點(diǎn)突變之外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。因此，將在參考核 苷酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算核苷酸序列與參考核苷酸序列的同一性百分比。換句話說，為了獲 得與參考核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5% 的核苷酸可以缺失和/或被另外的核苷酸取代，和/或參考序列中總核苷酸的至多5%的數(shù) 目核苷酸可以插入到參考序列中。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5'或 3'末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個(gè)散布在參考序列的核苷酸之 間或參考序列的一個(gè)或多個(gè)鄰接組內(nèi)。
[0036] 類似地，具有與SEQ ID N0 :2的參考核苷酸序列至少例如95% "同一性"的氨基 酸序列的多肽，表示該多肽序列除了可以相對(duì)于SEQ ID N0 :2的參考氨基酸的每100個(gè)氨 基酸包括至多5個(gè)氨基酸改變之外，該多肽的氨基酸序列與參考序列相同。因此，將在參考 氨基酸序列的全長(zhǎng)上計(jì)算氨基酸序列與參考氨基酸序列的同一性百分比。換句話說，為了 獲得與參考氨基酸序列具有至少95 %同一性的氨基酸序列的多肽，參考序列中至多5 %的 氣基酸殘基可以缺失和/或被另外的氣基酸殘基取代，和/或參考序列中總氣基酸殘基的 至多5 %的數(shù)目的氨基酸可以插入到參考序列中。參考序列的這些改變可發(fā)生在參考核苷 酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者這兩種末端位置之間的任何位置上，單個(gè)散布在參 考序列的殘基之間或參考序列的一個(gè)或多個(gè)鄰接組內(nèi)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤堿基，分別優(yōu)選胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿 嘧啶、及腺嘌呤和鳥嘌呤的任何聚合物或低聚物（參見其全部?jī)?nèi)容為所有目的通過引 用合并于此的 Albert L.Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800(Worth Pub. 1982))。本發(fā)明涵蓋任何脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸組分、及其任何化學(xué)變 體，例如這些堿基的甲基化、羥甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或低聚物組成上可以是 異質(zhì)的或同質(zhì)的，并且可以從天然存在來源分離，或人工或合成生成。另外，核苷酸可以是 DNA或RNA、或其混合物，并且可以以單鏈或雙鏈形式永久或短時(shí)存在，包括同源雙鏈體、異 源雙鏈體和雜交體。
[0038] 如本文使用的術(shù)語"可操作地連接的"指功能上相關(guān)的多核苷酸元件的連接。當(dāng) 核酸置于與另一個(gè)核酸序列功能相關(guān)時(shí)，其是"可操作地連接的"。例如，如果其影響編碼序 列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或更確切地轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與編碼序列可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意 思是連接的DNA序列通常是鄰接的，并且當(dāng)必要時(shí)結(jié)合鄰接的和讀碼框中的兩個(gè)或多個(gè)蛋 白質(zhì)編碼區(qū)。
[0039] "植物"指完整植物或可從植物獲得的植物的一部分，例如細(xì)胞、組織或器官（例如 花粉、種子、配子、根、葉、花、花蕾、花粉囊、果實(shí)等），以及這些的任何衍生物及通過自交或 雜交衍生自這類植物的后代。"植物細(xì)胞"包括分離物中或組織、器官或生物體之內(nèi)的原生 質(zhì)體、配子、懸浮培養(yǎng)物、小孢子、花粉粒等。
[0040] 如本文使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"指核酸序列，其起控制一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄的作 用，相對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向位于上游，并且從結(jié)構(gòu)上識(shí)別為存在DNA-依賴 性RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其它DNA序列，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 位點(diǎn)、遏制子或激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知直接或間接地調(diào)節(jié)從該啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄的量的任何其它核苷酸序列?？蛇x擇地，術(shù)語"啟動(dòng)子"在本文中也包括5'UTR區(qū)（5' 非翻譯區(qū)）（例如啟動(dòng)子在本文中可包括基因的翻譯起始密碼子的一個(gè)或多個(gè)上游部分 (5'），因?yàn)樵搮^(qū)域可在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯方面有作用。"組成型"啟動(dòng)子是在大部分生理 和發(fā)育條件下在大部分組織中有活性的啟動(dòng)子。"可誘導(dǎo)的"啟動(dòng)子是生理地（例如通過外 部應(yīng)用某些化合物）或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。"組織特異性"啟動(dòng)子僅僅在特定類型的組織或 細(xì)胞中有活性。"植物或植物細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性"指啟動(dòng)子在植物或植物細(xì)胞內(nèi)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄 的啟動(dòng)子的一般能力。其沒做出有關(guān)于啟動(dòng)子的時(shí)空活性的任何暗示。
[0041] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"多肽"可互換地使用，并且指由氨基酸鏈組成的分子，與具體作 用方式、尺寸、3維結(jié)構(gòu)或來源無關(guān)。因此，蛋白質(zhì)的"片段"或"部分"仍然可以稱為"蛋白 質(zhì)"。"分離蛋白"用于指不再位于其自然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如位于體外或重組的細(xì)菌或植 物宿主細(xì)胞中。
[0042] "轉(zhuǎn)基因植物"或"轉(zhuǎn)化植物"在本文中指例如通過將非沉默突變引入內(nèi)源基因或 其部分中而已經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞。這樣的植物已經(jīng)遺傳修飾，以例如在基因中引入 一個(gè)或多個(gè)突變、插入和/或缺失和/或在基因組中引入基因沉默構(gòu)建物。轉(zhuǎn)基因的植物 細(xì)胞可以指處于分離物或組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞，或者包含在植物或分化的器官或組織中 的植物細(xì)胞，這兩種都可能性都明確地包括在本文中。因此，在說明書或權(quán)利要求書中提及 植物細(xì)胞不是僅指培養(yǎng)物中分離的細(xì)胞或原生質(zhì)體，而且指任何植物細(xì)胞，無論其位于任 何位置，或在任何類型的植物組織或器官中。
[0043] 靶核苷酸交換（TNE)是一種方法，通過該方法一條與染色體或附加體基因中的位 點(diǎn)部分互補(bǔ)的合成寡核苷酸在特定位點(diǎn)引導(dǎo)單個(gè)核苷酸的逆轉(zhuǎn)。已經(jīng)描述了 TNE使用多種 寡核苷酸和祀標(biāo)。一些報(bào)道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合體，含有末端修飾以賦予核酸酶耐 受性。
[0044] 如本文使用的術(shù)語"干旱脅迫"或"干旱"指與植物對(duì)水可獲得性受限有關(guān)的次佳 (sub-optimal)環(huán)境條件。當(dāng)例如不下雨或下雨少和/或當(dāng)植物的灌溉常常比所需更少時(shí)， 可能出現(xiàn)水可獲得性受限。當(dāng)例如土壤中存在水但植物不能有效地吸取時(shí)，也可能出現(xiàn)植 物對(duì)水的可獲得性受限。例如，當(dāng)土壤強(qiáng)結(jié)合水時(shí)或水具有高含鹽量時(shí)，植物可能更難從土 壤吸取水。因此，許多因素可能有助于導(dǎo)致植物的水可獲得性受限，即干旱。植物經(jīng)歷"干 旱"或"干旱脅迫"的影響可能是植物不能具有最佳生長(zhǎng)和/或發(fā)育。經(jīng)歷干旱的植物可具 有枯萎癥狀。例如，植物可以在其中不提供水（例如，沒有降雨和/或灌溉植物）的特定控 制條件經(jīng)歷至少15天的時(shí)期。
[0045] 術(shù)語"改善的抗旱性"指當(dāng)具有改善的抗旱性的植物經(jīng)歷干旱或干旱脅迫時(shí)，不會(huì) 顯示如沒有具有改善的抗旱性的對(duì)照植物中觀察到的影響或顯示減輕的影響。正常植物具 有一定水平的抗旱性。通過在所選控制條件下比較對(duì)照植物與具有改善的抗旱性的植物， 可容易地確定植物是否具有改善的抗旱性，因此，在一定時(shí)期之后，即當(dāng)植物經(jīng)歷干旱或干 旱脅迫時(shí)，可以觀察到對(duì)照植物干旱癥狀。與對(duì)照植物相比，具有改善的抗旱性的植物將 顯示較少和/或減少的已經(jīng)歷干旱的癥狀，例如枯萎。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適 的條件，例如像實(shí)施例中的控制條件。當(dāng)植物具有"改善的抗旱性"時(shí)，經(jīng)干旱或干旱脅迫 時(shí)能夠持續(xù)正常生長(zhǎng)和/或正常發(fā)育，否則將導(dǎo)致正常植物的生長(zhǎng)減慢和/或發(fā)育減慢。 因此，"改善的抗旱性"是通過比較植物而確定的相對(duì)術(shù)語，其中在干旱脅迫下最能夠持續(xù) (正常）生長(zhǎng)的植物是具有"改善的抗旱性"的植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知如何選擇用于測(cè) 定植物抗旱性的合適條件和如何測(cè)量干旱癥狀，例如在例如如下提供的手冊(cè)描述的：IRRI， Breeding rice for drought prone environments,Fischer等，2003,和CIMMYT,Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize ：from theory to practice, Banzinger 等，2000。Snow 和 Tingey，1985,Plant Physiol, 77,602-7,和 Harb 等，Analysis of drought stress in Arabidopsis，AOP 2010，Plant Physiology Review 中提供了用于 測(cè)定植物改善的抗旱性的方法的實(shí)例，并且如下述實(shí)施例部分中描述的。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明涉及一種通過修飾（例如破壞）植物中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)，例 如使用遺傳修飾或靶核苷酸交換，調(diào)節(jié)（例如改善）所述植物的抗旱性的方法。調(diào)節(jié)（比如 改善）是相對(duì)于其中沒有修飾功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)的對(duì)照植物而言。換句話說， 與未修飾的植物相比，根據(jù)本發(fā)明修飾的植物能夠在水可獲得性減少、（暫時(shí)性）缺水或干 旱條件下較好地生長(zhǎng)和存活。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明修飾（例如破壞）功能性果膠酯酶蛋 白質(zhì)的表達(dá)可包括遺傳修飾（例如遺傳修飾果膠酯酶基因表達(dá)）或靶核苷酸交換。
[0047] 在實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種通過破壞植物中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)， 例如使用遺傳修飾或靶核苷酸交換，改善所述植物的抗旱性的方法。
[0048] 遺傳修飾包括在核酸序列中引入突變、插入、缺失和/或?qū)⒒虺聊瑯?gòu)造插入靶 向核酸序列的植物或植物細(xì)胞的基因組中。遺傳修飾編碼mRNA的核酸序列（例如基因） 不僅涉及修飾對(duì)應(yīng)于mRNA序列的外顯子序列，而且涉及使基因組DNA的內(nèi)含子序列和/或 核酸序列的（其它）基因調(diào)節(jié)序列（例如基因）的突變。
[0049] 在實(shí)施方式中，功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)可以是如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞 的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系，比如本文列舉的At5gl9730敲除系，例 如 SALK_136556C(http://www. arabidopsis. org/servlets/SeedSearcher ? action = detail&stock_number = SALK_136556C)中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白 質(zhì)未表達(dá)的、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系（例如At5gl9730 敲除系，例如SALK_136556C)的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
[0050] 如本文使用的術(shù)語"被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因"指被破壞（例如切斷（例如利 用T-DNA插入所述果膠酯酶基因中的方式））植物基因組中天然存在的果膠酯酶基因。破 壞所述內(nèi)源性果膠酯酶基因可以導(dǎo)致所述內(nèi)源性果膠酯酶基因不表達(dá)。
[0051] 如本文使用的術(shù)語"對(duì)照植物"指相同種類的植物，優(yōu)選相同種類，優(yōu)選相同遺傳 學(xué)背景的植物。然而，優(yōu)選不存在向所述對(duì)照植物中引入修飾或修飾被引入所述對(duì)照植物 中。
[0052] 本發(fā)明還涉及通過修飾所述植物中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)而調(diào)節(jié)所述植 物的抗旱性。調(diào)節(jié)是相對(duì)于其中這種修飾沒有被引入或不存在的對(duì)照植物（優(yōu)選地相同遺 傳學(xué)背景的植物）而言的。
[0053] 如本文使用的"使功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損"可以指果膠酯酶基因的表 達(dá)受損，和/或果膠酯酶基因的表達(dá)正常但是得到的mRNA的翻譯被抑制或阻止（例如，通 過RNA干擾），和/或果膠酯酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變使得優(yōu)選地在生理?xiàng)l件下，尤其是 在相同的生理?xiàng)l件下，與包含如SEQ ID N0:2所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的果膠酯酶比活性 相比，其果膠酯酶比活性降低。備選地，可通過使用（例如抗體或果膠酯酶抑制劑）清除 (scavenging)所述蛋白質(zhì)而使果膠酯酶蛋白質(zhì)變得功能很低或無功能。例如，特異性結(jié)合 所述果膠酯酶蛋白質(zhì)的抗體可以同時(shí)表達(dá)，從而減小果膠酯酶蛋白質(zhì)的比活性。如本文使 用的短語"功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損"進(jìn)一步涵蓋通過提高果膠酯酶抑制劑（例 如，中止、阻止或降低果膠酯酶蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)）的表達(dá)而清除功能性果膠酯酶蛋 白質(zhì)。這樣的果膠酯酶抑制劑的非限制性實(shí)例是基因 Atlg48020。備選地，可以使用化學(xué)果 膠酯酶抑制劑，例如可以被清除的離子、或金屬、或果膠酯酶的輔因子，從而降低果膠酯酶 活性的可利用性。因此，該短語包括如下情形：其中果膠酯酶蛋白質(zhì)以正常水平表達(dá)，但是 由于（可選地功能性）果膠酯酶蛋白質(zhì)的清除的氨基酸序列的突變，與包含如SEQ ID N0:2 所示的氨基酸序列的果膠酯酶蛋白質(zhì)相比，所述果膠酯酶蛋白質(zhì)沒有活性或活性降低。
[0054] 果膠酯酶催化果膠脫酯化為果膠酸鹽和甲醇。果膠是植物細(xì)胞壁的主要組分之 一。如果相對(duì)于這樣的果膠酯酶的果膠的脫酯化而言的比活性統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地低于如SEQ ID N0:2所述果膠酯酶的比活性，則可以認(rèn)為該果膠酯酶蛋白質(zhì)的比活性"降低"。果膠酯酶蛋 白質(zhì)的比活性可以降低，例如至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或更多?？梢酝ㄟ^例如使用靶核苷酸交換來改變啟動(dòng)子序列，實(shí)現(xiàn)植物的內(nèi)源性果膠酯酶 基因的表達(dá)減少。
[0055] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定果膠酯酶的比活性。例如，可以通過如Tucker等 (Tucker GA，等人（1982). J Sci Food Agric 33 396 - 400)所述的滴定確定 PE 酶活性。
[0056] 本發(fā)明人相信由于低表達(dá)，例如用RNA干擾，或者由于果膠酯酶蛋白質(zhì)的活性/功 能性降低的結(jié)果，或上述一種或多種，破壞功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)（例如，通過表達(dá) 和/或活性的降低、抑制或缺失）導(dǎo)致功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)不存在或水平降低，并且所述 功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)不存在或水平降低導(dǎo)致所述植物對(duì)水的需要減少或抗旱性的改善。 [0057] 擬南芥的果膠酯酶蛋白質(zhì)由383個(gè)氨基酸（氨基酸序列在SEQ ID N0:2中描述）。 由擬南芥的果膠酯酶基因衍生的cDNA包含1149個(gè)核苷酸，并且在SEQ ID NO: 1中描述其 核酸序列。
[0058] 如本文使用的"果膠酯酶蛋白質(zhì)"指包含SEQ ID N0:2中所述的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)、及其片段和變體。果膠酯酶蛋白質(zhì)的變體包括，例如（優(yōu)選地在全長(zhǎng)上）與SEQ ID N0:2 的氨基酸序列具有至少 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高，比如100%的氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)。使用如上定義的Needleman 和Wunsch算法及GAP缺省參數(shù)，通過雙序列比對(duì)確定氨基酸序列的同一性?？墒褂萌缟?定義的Needleman和ffunsch算法及GAP缺省參數(shù)，通過雙序列比對(duì)確定氨基酸序列的同一 性。
[0059] 在另一個(gè)方面，提供一種用于增強(qiáng)植物抗旱性的方法，所述方法包括破壞所述植 物中編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)的步驟。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明"基本表達(dá)受損"指功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)不存在或存在減少。本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知本領(lǐng)域其可獲得許多機(jī)制以（例如轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平）破壞基因的表達(dá)。
[0061] 轉(zhuǎn)錄水平的破壞可能是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、起始子、終止子或 內(nèi)含子剪切序列）中引入一個(gè)或多個(gè)突變的結(jié)果。這些序列通常位于根據(jù)本發(fā)明的果膠酯 酶基因的編碼序列的5'、3'或該編碼序列內(nèi)。也可以通過基因編碼區(qū)中核苷酸的缺失、取 代、重排或插入獨(dú)立地或同時(shí)地提供表達(dá)的破壞。
[0062] 例如，在編碼區(qū)中，核苷酸可以被取代、插入或缺失，導(dǎo)致引入一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè) 過早（premature)終止密碼子。而且，插入、缺失、重排或取代可以導(dǎo)致編碼的氨基酸序列 中的修飾，從而提供功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的受損表達(dá)。甚至更大部分的基因可以被移除， 例如至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者甚至100%的基因（編碼 區(qū)）被從植物中存在的DNA中移除，從而破壞功能性果|父醋酶蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0063] 備選地，可以將一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)核苷酸引入編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的一個(gè) 或多個(gè)基因中，其導(dǎo)致例如移碼，或?qū)е乱刖幋a另外的氨基酸的序列，或引入不編碼氨基 酸的序列，或引入大的插入片段，從而破壞功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的提供/表達(dá)。
[0064] 換句話說，如上所述編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的核苷酸序列中核苷酸的缺失、取代或 插入可導(dǎo)致例如移碼、引入終止密碼子、或引入無義密碼子。特別地，通常接受引入終止密 碼子和引入移碼突變作為有效的方式，以產(chǎn)生敲除種植，即具有特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或 活性降低、被抑制或缺失的敲除植物的有效方式。
[0065] 移碼突變（也稱為框架錯(cuò)誤或閱讀框移位）是一種由核苷酸序列中不能被3可整 除的大量核苷酸的indel (插入或缺失）導(dǎo)致的遺傳突變。由于基因表達(dá)利用密碼子的三 聯(lián)體性質(zhì)，插入或缺失可改變讀碼框（密碼子組），導(dǎo)致與原始完全不同的翻譯。序列中缺 失或插入發(fā)生的越早，生成蛋白質(zhì)的改變?cè)蕉?。移碼突變通常將導(dǎo)致對(duì)突變之后密碼子的 閱讀，以編碼不同的氨基酸，但是可能存在由遺傳密碼冗余造成的例外。此外，原始序列中 終止密碼子（"UAA"、"UGA"或"UAG"）不會(huì)被閱讀，替代的終止密碼子可產(chǎn)生較早或更遲 的終止位點(diǎn)。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可異常短或異常長(zhǎng)。
[0066] 在編碼如本文定義的果膠酯酶蛋白質(zhì)的核苷酸序列中引入終止密碼子可導(dǎo)致轉(zhuǎn) 錄過早終止，其通常產(chǎn)生縮短的、不完整的或無功能的果膠酯酶蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，最初在轉(zhuǎn) 錄方向引入終止密碼子。在核苷酸序列中引入終止密碼子越早，生成蛋白質(zhì)越短，并且改變 越多。在編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的核苷酸序列中引入無義密碼子可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄mRNA，其中，例如 一個(gè)密碼子不再編碼果膠酯酶中天然存在的氨基酸，例如通常編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的功能 必要的氨基酸的密碼子。因此，這樣的果膠酯酶蛋白質(zhì)可能沒有功能。
[0067] 換句話說，破壞可包括使本文公開的基因或核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸突 變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物較少或甚至完全不存在（即，不存在當(dāng)沒有如上述修飾的根據(jù)本 發(fā)明的基因時(shí)將獲得蛋白質(zhì)），或?qū)е麓嬖跓o功能的蛋白質(zhì)。
[0068] 因此，在本文公開的方法的實(shí)施方式中，破壞是所述果膠酯酶基因中一個(gè)或多個(gè) 突變的結(jié)果，導(dǎo)致與對(duì)照植物相比較少的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的存在或不存在蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn) 物。
[0069] 如本文使用的術(shù)語較少的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的抑制/存在指與其中表達(dá)未受損的 對(duì)照植物相比，蛋白質(zhì)表達(dá)降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 甚至99%。術(shù)語"蛋白質(zhì)表達(dá)不存在"指實(shí)際上不存在任何表達(dá)產(chǎn)物，例如與對(duì)照相比少于 5%、4%、3%、2%或甚至少于1%。
[0070] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，通過使用誘變化合物（例如甲磺酸乙酯（EMS)或能夠在 核苷酸序列中（隨機(jī)）引入突變的其它化合物）也可以在編碼如本文定義的果膠酯酶的核 苷酸序列中引入突變。所述誘變化合物或所述其它化合物可用作產(chǎn)生具有在編碼果膠酯酶 蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的突變的植物的工具。
[0071] 備選地，在編碼根據(jù)本發(fā)明的果膠酯酶蛋白質(zhì)的核苷酸序列中引入的突變可受 在編碼這樣的蛋白質(zhì)的核苷酸序列中引入的轉(zhuǎn)移-DNA(T-DNA)的影響，例如某些細(xì)菌 種屬（例如根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens))的腫瘤-誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)粒的 T-DNA。T-DNA元件可以被引入所述核苷酸序列中，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的表達(dá)缺 失，因此減小了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物對(duì)水的需要（參見例如Krysan等，1999The Plant Cell, Vol 11. 2283?2290)。使用轉(zhuǎn)座因子插入可以獲得同樣的優(yōu)點(diǎn)（參見，例 如 Kunze 等，（1997)Advances in Botanical Research 27 341-370 or Chandlee(1990) PhysiologiaPlanta79(l)105?115)。
[0072] 實(shí)施方式中，可通過TNE進(jìn)行在編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列中突變的 引入，例如像W02007073170中所述。通過使用TNE，可以改變編碼果膠酯酶的核苷酸序列中 的特定核苷酸，由此，例如可以引入終止密碼子，其可例如產(chǎn)生編碼具有果膠酯酶活性降低 或消失的縮短的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0073] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種如上面公開的方法，其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì) 的表達(dá)破壞是通過無功能的蛋白質(zhì)或具有減小的功能的蛋白質(zhì)表達(dá)引起的。如上述，本領(lǐng) 域技術(shù)人員在確定根據(jù)本發(fā)明的基因的功能性方面沒有問題。例如，可以通過將沒有任何 修飾的對(duì)照基因引入其中根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)受損植物中進(jìn)行補(bǔ)充研究，并且 研究抗旱性。
[0074] 備選地，可以進(jìn)行類似于如下實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)，并通過與合適的對(duì)照/ 野生型植物相比較，測(cè)定其中將一個(gè)或多個(gè)突變引入根據(jù)本發(fā)明的基因中的植物的抗旱 性。
[0075] 也可以在翻譯水平提供破壞，例如通過引入過早終止密碼子或通過影響（例如蛋 白質(zhì)折疊的）的翻譯后修飾。
[0076] 與機(jī)制無關(guān)，通過功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)不存在或存在減少而表示根據(jù)本發(fā)明的 破壞，包括存在正常水平的無功能的（dysfunctional)果膠酯酶。
[0077] 如上面解釋，如本文使用的術(shù)語表達(dá)抑制或存在減少指與其中表達(dá)未受損的對(duì)照 植物相比，蛋白質(zhì)表達(dá)降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至 99%。術(shù)語"蛋白質(zhì)表達(dá)不存在"指實(shí)際上不存在任何表達(dá)產(chǎn)物，例如與對(duì)照相比少于5%、 4%、3%、2%或甚至少于1%。
[0078] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述破壞是由基因沉默引起的，例如RNA干擾或RNA沉默。
[0079] 借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的分子生物學(xué)方法，基因的破壞也可以通過基 因沉默實(shí)現(xiàn)，例如使用RNA干擾技術(shù)、dsRNA或其它表達(dá)沉默技術(shù)（參見例如，Kusaba等， (2004)Current Opinion in Biotechnology 15:139 - 143,或Preuss and Pikaard(2003) in RNA Interference (RNAi)?Nuts&Bolts of siRNA Technology (pp. 23-36)，?2003 by DNA Press，LLC Edited by:David Engelke，Ph.D.)或，如上已經(jīng)討論的敲除。
[0080] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中。且如上已經(jīng)討論的，提供一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其 中所述破壞是由至少一個(gè)核苷酸的插入、缺失和/或取代引起的。例如，在根據(jù)本發(fā)明的基 因中可以插入、缺失或取代1、2、3...10、40、50、100、200、300、1000或甚至更多的核苷酸。還 預(yù)期所述基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)中插入、缺失和/或取代的組合。
[0081] 在本文公開的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括破壞所述植物中編碼果膠 酯酶蛋白質(zhì)的超過1個(gè)、例如2、3、4、5或所有基因的表達(dá)的步驟。
[0082] 在該實(shí)施方式中，如上所述存在于具體植物中超過一個(gè)基因的表達(dá)受損。例如，存 在于植物中的編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或所有基因的表達(dá)受損。通過 同時(shí)破壞上述多個(gè)基因（當(dāng)植物中存在時(shí)）的表達(dá)，可以獲得更加改善的抗旱性。
[0083] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法提供的植物可用于生產(chǎn)其它植物和/或 由其衍生的植物產(chǎn)品。術(shù)語"植物產(chǎn)品"指可以從生長(zhǎng)的植物獲得的那些材料，并且包括壓 碎的、磨碎的或仍完整的、與其它材料混合的、干燥的、冷凍等的果實(shí)、葉子、植物器官、植物 脂肪、植物油、植物淀粉、植物蛋白質(zhì)級(jí)分。通常，如上述，可通過例如本文所公開的修飾為 使功能蛋白的表達(dá)受損的基因的存在識(shí)別這樣的植物產(chǎn)品。
[0084] 優(yōu)選地，在屬于十字花科（包括甘藍(lán)型油菜（油菜籽）、茄科（包括番茄）、或葫蘆 科（包括甜瓜和黃瓜）、或禾本科（包括稻屬（包括稻）或玉米屬（包括玉蜀黍（玉米）））、 或豆科（包括豆類、豌豆或菜豆）的植物中，根據(jù)本發(fā)明的果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活 性受損（例如降低、抑制或缺失）。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用于番茄、稻、玉蜀黍、甜瓜 或黃瓜，從而提供與相應(yīng)的對(duì)照植物相比具有對(duì)水的需求減小或抗旱性改善的植物。
[0085] 還提供通過根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的植物細(xì)胞、植物或其衍生的植物產(chǎn)品，其 中所述植物細(xì)胞、植物或植物產(chǎn)品顯示與沒有經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法的對(duì)照植物相比功能性 果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。
[0086] 還提供植物細(xì)胞、植物或其衍生的植物產(chǎn)品，特征在于在所述植物細(xì)胞、植物或 其衍生的植物產(chǎn)品中，編碼果膠酯酶蛋白質(zhì)的至少一個(gè)（優(yōu)選所有）基因的表達(dá)受損，例 如對(duì)應(yīng)于從所述至少一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列的cDNA序列包括SEQ ID NO: 1所示序列， 和與SEQ ID N0:1的核苷酸序列具有超過40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一 性的cDNA序列，和/或其中由所述至少一個(gè)基因編碼的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2所 示序列或其變體。優(yōu)選地，所述植物不是如下實(shí)施例中所述的擬南芥突變體或短柄草屬 (Brachypodium) T-DNA 插入突變體。
[0087] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及如下基因用于向植物提供增強(qiáng)抗旱性的用途：其中對(duì) 應(yīng)于從所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列的cDNA序列包含SEQ ID NO: 1所示的序列，和與其具有 超過40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一性的〇0嫩序列和/或其中由所述基因編 碼的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2所示序列，和與其具有超過40%、50%、60%、70%、80%、 90^^95%同一性的氨基酸序列。
[0088] 在該實(shí)施方式中，根據(jù)本文公開的內(nèi)容，所述基因可用作改善植物抗旱性的靶標(biāo)， 或者所述基因可用于鑒別參與干旱敏感性和抗性的新的蛋白質(zhì)。
[0089] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供具有擬南芥種屬的SEQ ID No. 1或2的果膠酯酶序列 在擬南芥植物抗旱性篩選中的用途。另外，提供其中果膠酯酶序列為與其它植物種屬的SEQ ID No. 1或2類似的序列并且其中在其它植物種屬的植物中篩選的用途。此外，提供用于篩 選具有改善的抗旱性的植物或植物細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟：
[0090] -提供擬南芥種屬的植物細(xì)胞或植物的異質(zhì)種群；
[0091] -提供具有SEQ ID No. 1或2的果膠酯酶序列；
[0092] -測(cè)定所述植物細(xì)胞或植物的果膠酯酶基因的至少一部分的序列；
[0093] -比較由所述植物細(xì)胞或植物測(cè)定的果膠酯酶序列與提供的果膠酯酶序列；
[0094] -鑒別其中果膠酯酶序列包括突變的植物細(xì)胞或植物。
[0095] 備選地，在該方法中，提供的植物細(xì)胞或植物屬于其它種屬，并且其中提供的果膠 酯酶基因序列為其它種屬的相似序列。
[0096] 因此，通過使用擬南芥物種的果膠酯酶序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2或來自其 它物種的相似序列，可以鑒別可提供改善的抗旱性的植物物種中突變的物種序列。在其它 物種中與物種擬南芥的果膠酯酶序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的相似序列定義為與其 具有至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%序列同一性的序 列。相似的果膠酯酶蛋白質(zhì)可以具有與SEQ ID No. 2基本上相同的功能。在序列表的SEQ ID N0 :3?10中描述相似序列，并且分別來源于蕪菁、番茄和水稻。它們與SEQ ID N0:2相 比較的序列同一性列在下表2中說明。
[0097] 在該方法中，提供所述種屬的植物細(xì)胞或植物的異質(zhì)種群。所述異質(zhì)種群可以例 如通過如下提供：使植物細(xì)胞接受引入隨機(jī)突變的誘變劑，從而提供植物細(xì)胞的異質(zhì)種群。 因此，所述異質(zhì)種群可以來源于單個(gè)植物品種，其接受隨機(jī)誘變以便后代獲得多種突變，從 而提供異質(zhì)種群。許多誘變劑是本領(lǐng)域已知的，例如離子輻射、UV-射線、和誘變化學(xué)物（例 如疊氮化物、溴化乙錠或甲磺酸乙酯（EMS))。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何提供植物或植 物細(xì)胞的異質(zhì)種群。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可提供多種植物作為異質(zhì)種群，即來自多個(gè)種 屬的非單一品種。多種植物顯示遺傳多樣性，它們遺傳上是不同的，但是因?yàn)橹参飦碜酝?種屬，所以它們是基本上相同的。在任何情況下，植物細(xì)胞或植物的異質(zhì)種群可以具有至少 95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或至少 99. 9%的序列同一性。
[0098] 通過測(cè)定含有來自異質(zhì)種群的植物或植物細(xì)胞的序列的果膠酯酶基因序列的至 少一部分序列，然后比較這些序列與提供的果膠酯酶基因序列（對(duì)照），可以鑒別包括果膠 酯酶基因序列突變的植物細(xì)胞或植物。應(yīng)理解，可以通過序列的比對(duì)進(jìn)行這樣的比較，并且 突變?yōu)樵谥参锓N屬的相似（對(duì)照）果膠酯酶序列中至少一個(gè)核酸或氨基酸位置的不同。這 樣，鑒別具有可以提供改善的抗旱性的果膠酯酶基因突變（例如，插入、缺失、取代）的植物 或植物細(xì)胞。
[0099] 優(yōu)選地，選擇具有將導(dǎo)致功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)破壞的突變的植物，例如 上述已經(jīng)列舉的。將破壞功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)表達(dá)的突變可以是如下突變：破壞開放讀 碼框（引入移碼或終止密碼子），或通過改變編碼蛋白質(zhì)的正常功能必需的氨基酸的密碼 子中核苷酸來破壞或以其它方式改變編碼蛋白質(zhì)功能，從而導(dǎo)致與非改變的蛋白質(zhì)相比對(duì) 干旱的抗性改善（例如增強(qiáng)）。該方法也可用于例如篩選和選擇已經(jīng)經(jīng)靶向上述果膠酯酶 基因序列的遺傳修飾的植物。而且，所述果膠酯酶序列也可用于篩選檢測(cè)其中經(jīng)歷干旱的 植物的（異基因）種群。
[0100] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供具有擬南芥種屬的SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的果 膠酯酶序列的至少一部分作為培育抗旱擬南芥植物的標(biāo)記物的用途。而且，所述果膠酯酶 序列可以是其它種屬的相似序列，其中所述標(biāo)記物用于培育其它種屬的抗旱植物。
[0101] 本發(fā)明還涉及其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn) 品用于在干旱脅迫條件下生長(zhǎng)的用途，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng) 在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其得到與其中所述 功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插 入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能性果膠酯 酶蛋白質(zhì)的表達(dá)未受損的對(duì)照植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品比其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的 表達(dá)被破壞的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品更早地顯示干旱脅迫癥狀，例如枯萎癥狀。
[0102] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過本文教導(dǎo)的方法可獲得的或獲得的植物、植物細(xì)胞 或植物產(chǎn)品。另外，本發(fā)明提供來源于這樣的植物的種子。
[0103] 本發(fā)明還涉及其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)被破壞的植物、植物細(xì)胞或植物 產(chǎn)品，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶 基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)。所述植物、 植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品可以包括例如被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因。
[0104] 所述植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品可以是任何植物或植物細(xì)胞，或者可以來源 于任何植物，例如單子葉植物或雙子葉植物，但是所述植物最優(yōu)選屬于茄科。例如， 植物可以屬于爺屬（包括番爺屬（lycopersicum))、煙草屬、辣椒屬、碧冬爺屬及其它 屬。可合適地使用下述宿主：煙草（煙草種，例如本生煙草（N. Benthamiana)、皺葉煙草 (N.Plumbaginifolia)、普通煙草（N.Tabacum)等）、蔬菜種（例如番爺（例如，如搜桃番 爺變種cerasiforme或醋栗番爺變種pimpinellifolium、或樹番爺（S. betaceum，同種異 名 Cyphomandra betaceae))、馬鈴暮（Solanum tuberosum)、爺子（Solanum melongena)、 爺瓜（Solanum muricatum)、可可果(Solanum sessiliflorum)和奎東爺(Solanum quitoense)、辣椒類（甜椒（Capsicum annuum)、小米椒（Capsicum frutescens)、風(fēng)鈴辣椒 (Capsicum baccatum))、觀賞物種（例如，矮牽牛（Petunia hybrida)、肢花矮牽牛（Petunia axillaries)、匍匍性青紫矮牽牛（P. integrifolia))。
[0105] 備選地，所述植物可以屬于任何其它科，例如葫蘆科或禾本科。合適的宿主植物包 括例如玉米/谷類（玉蜀黍種（Zea species))、小麥（小麥種（Triticum species))、大麥 (例如大麥（Hordeum vulgare))、燕麥（例如燕麥）、高粱（高粱（Sorghum bicolor))、黑 麥（黑麥（Secale cereale))、大豆（野生大豆屬種（Glycine spp)，例如大豆（G.max))、棉 花（棉屬種（Gossypium species),例如陸地棉（G.hirsutum)、海島棉（G.barbadense))、 蕓苔屬種（Brassica spp.)(例如，甘藍(lán)型油菜（Β· napus)、芥菜（Β· Juncea)、甘藍(lán) (B. Oleracea)、蕪菁（B. Rapa)等）、向日葵（Helianthus annus)、紅花、山藥、木薯、紫花苜 猜（Medicago sativa)、稻（稻屬種（Oryza species)，例如秈稻栽培種（O.sativa indica (31111：；^31-81'0即）或粳稻栽培種（]_3口011；[0301111：；^31-81'0即)）、飼料草、珍珠稗（狼尾草 屬種（Pennisetum spp·)，例如珍珠栗（P.glaucum))，樹種（松屬（Pinus)、楊樹、冷杉、車 前草（plantain)等）、茶樹、咖啡樹、油棕、椰樹，蔬菜種例如豌豆、西葫蘆、豆類（例如菜豆 屬種（Phaseolus species))、黃瓜、朝鮮薊、蘆筍、西蘭花、大蒜、韭菜、萵苣、洋蔥、蘿卜、蕪 菁、抱子甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、菊苣、茴香、甜菜）、結(jié)肉質(zhì)果植物（葡萄、 桃子、李類（plums)、草莓、芒果、蘋果、李樹（plum)、搜桃、杏、香蕉樹、黑莓、越橘、柑橘、獼 猴桃、無花果、檸檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙子、葡萄柚等）、觀賞物種（例如，玫瑰花、 矮牽?；?、菊花、百合、大丁草屬種）、草本類（薄荷、歐芹、羅勒、百里香、等）、木本樹（例 如，楊屬種、柳屬種、櫟屬種、桉屬種）、纖維物種例如亞麻（Linum usitatissimum)和大麻 (Cannabis sativa)、或者模式生物（例如擬南芥）。
[0106] 優(yōu)選的宿主是"作物植物"，即人類種植和培育的植物物種?？梢苑N植作物植物用 于食物目的（例如田間作物）、或用于觀賞目的（例如，產(chǎn)生用于切枝的花、用于草坪的草 等）。如本文定義的作物植物也包括從其中收獲非食用產(chǎn)物的植物，例如用于燃料的油、塑 料聚合物、藥物制品、軟木等。
[0107] 優(yōu)選地，本發(fā)明的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品不是擬南芥或蕪菁植物、植物細(xì)胞或 植物產(chǎn)品。
[0108] 本發(fā)明的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品可以為例如番茄或蕪菁植物、植物細(xì)胞或植 物產(chǎn)品。
[0109] 例如，本發(fā)明涉及其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損的番茄、陸地棉、大豆、 小麥屬植物、大麥、燕麥、高粱、黑麥或甘藍(lán)型油菜植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品，其中所述 功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥 T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi) 源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。所述番 茄、陸地棉、大豆、小麥屬植物、大麥、燕麥、高粱、黑麥或甘藍(lán)型油菜植物、植物細(xì)胞或植物 產(chǎn)品可以包含被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因。
[0110] 文中列舉的所有文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容均通過引用合并于此。
[0111] 實(shí)施例
[0112] 實(shí)施例1干旱實(shí)騎
[0113] 從諾 丁漢擬南芥種子中心（NASC ;School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD United Kingdom)獲得用 根癌土壤桿菌載體PR0K2轉(zhuǎn)化擬南芥（At)種子產(chǎn)生的功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)缺失的（NASC ID:N664100, AGI代碼At5gl9730和SALK_136556C ;下文稱為突變體種子或突變體植物）。 使用At Col-0 (Columbia, N60000)作為對(duì)照；下文稱為對(duì)照種子或植物。
[0114] 生長(zhǎng)培養(yǎng)基：
[0115] 使用包含一份沙和蛭石與兩份堆肥的土壤混合物（沙：蛭石：堆肥=1:1:2)。該 混合物增加水滲透，因此促進(jìn)每個(gè)盆均勻的水吸收和更好的排水。在播種之前，將種子在黑 暗濕潤(rùn)的條件下于4°C下保持3天，進(jìn)行層積處理。
[0116] 將突變體和對(duì)照種子都種在含有?4cm直徑的8X5 = 40個(gè)盆的長(zhǎng)方形盤中，每 個(gè)盆的密度為5株植物。在發(fā)芽（DAG)之后10天，從盤中盆的底部向所有植物提供營(yíng)養(yǎng)液 (EC = 1. 5)，并且在15DAG，通過將盆轉(zhuǎn)移到干的盤中而使植物經(jīng)歷干旱（15、16、17或18 天）。然后，給植物加水，1周后觀察植物恢復(fù)。
[0117] 在預(yù)干旱篩選中，包括每個(gè)基因型三個(gè)盆平行測(cè)定。完成實(shí)驗(yàn)所需的總時(shí)間約為 36?39天。
[0118] 干旱測(cè)定檢查
[0119] 一旦植物達(dá)到2個(gè)真葉階段，將其間苗保持嚴(yán)格每個(gè)盆5株植物。在10DAG，植物 接受營(yíng)養(yǎng)物（EC = 1. 5)，并且在15DAG，將每個(gè)盆轉(zhuǎn)移到干的盤。從這一天起，植物不再接 受任何水。每天，觀察植物，尤其是對(duì)照（或野生型）（Col-Ο)的枯萎癥狀。在干旱（D0D) 第15天時(shí)，Col-Ο完全枯萎，并且加水時(shí)不能恢復(fù)。將這一天確定為其永久枯萎點(diǎn)（PWP)。 從這一天起，向突變體的一個(gè)平行測(cè)定加水，觀察恢復(fù)癥狀，并照相。與對(duì)照相比，突變體顯 示在干旱下多存活至少2天，并使其經(jīng)進(jìn)一步嚴(yán)格的篩選。
[0120] 實(shí)施例2干旱實(shí)騎
[0121] 生長(zhǎng)培養(yǎng)基：
[0122] 在預(yù)篩選實(shí)驗(yàn)中，將與實(shí)施例1中相同的突變體和對(duì)照植物種植在如上所述類似 的盤裝置中。通過從15DAG中斷供水而使植物受脅迫，直到對(duì)照植物達(dá)到其PWP。在該期 間，每隔一天，將各盆在盤內(nèi)隨機(jī)擺放（shuffled)，以減少位置效應(yīng)且允許均勻蒸發(fā)。在第 1OT0D天，對(duì)照植物達(dá)到PWP，并且當(dāng)加水時(shí)沒有恢復(fù)。從15D0D開始，每天給來自突變體的 一個(gè)盆平行測(cè)定加水，并檢查干旱脅迫恢復(fù)。照相，并對(duì)恢復(fù)情況評(píng)分。突變體顯示在對(duì)照 達(dá)到其PWP之后至少3天以上才從干旱脅迫恢復(fù)。
[0123] 圖1顯示比較突變體和對(duì)照的圖片，表明與對(duì)照相比，突變體關(guān)于對(duì)干旱脅迫的 抗性的優(yōu)異效果。
[0124] 實(shí)施例3干旱實(shí)騎
[0125] 材料和方法
[0126] 植物材料.從諾丁漢擬南芥種子中心（NASC)獲得具有被破壞的AT5G19730(果 膠酯酶）基因（SALK_136556C)的TDNA插入系。通過使用浸花法轉(zhuǎn)化（floral dip transformation)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化擬南芥產(chǎn)生互補(bǔ)系（Bent等人，2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103)。由包括蕪菁（甘藍(lán)）、番爺（tomato)和水稻（Oryza sativa，rice)和 模型種擬南芥的幾種作物種類鑒別擬南芥（AT5G19730)果膠酯酶基因的同系物。
[0127]

【權(quán)利要求】
1. 用于生產(chǎn)具有與對(duì)照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞植 物、植物原生質(zhì)體或植物細(xì)胞中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟，和可選擇地再生所述 植物，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)包含與SEQ ID. No. 2的氨基酸序列具有至少55%同 一性的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在 具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功 能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入 系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
3. 用于生產(chǎn)具有與對(duì)照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破壞植 物、植物原生質(zhì)體或植物細(xì)胞中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟，和可選擇地再生所述 植物，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)由包括具有與SEQ ID NO: 1的核酸序列至少60%同 一性的核酸序列的核酸序列編碼。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在 具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功 能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入 系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述破壞表達(dá)的步驟包括使編碼所 述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的核酸序列突變。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中使所述核酸序列突變包括至少一個(gè)核苷酸的插入、缺 失和/或取代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述破壞表達(dá)的步驟包括基因沉默。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一所述的方法，其中，所述方法包括破壞兩種或更多種功能 性果膠酯酶蛋白質(zhì)表達(dá)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括由具有改善的抗旱 性的植物生產(chǎn)植物或植物產(chǎn)品的步驟。
10. 與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少55%同一性的氨基酸序列或與SEQ ID N0:1 的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性篩選中的用途。 11. SEQ ID NO: 2的果膠酯酶氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的果膠酯酶核酸序列在擬南芥 植物抗旱性篩選中的用途。
12. 具有SEQ ID NO: 1的果膠酯酶核酸序列的至少一部分或SEQ ID NO:2的果膠酯酶 氨基酸序列的至少一部分作為培育抗旱性擬南芥植物的標(biāo)記物的用途。
13. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所定義的功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)用于調(diào)節(jié)、優(yōu)選地增強(qiáng) 植物抗旱性的用途。
14. 其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)受損的植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品用于在干旱 脅迫條件下生長(zhǎng)的用途，其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞 的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯 酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性 相比抗旱性受損的植物，其中所述干旱脅迫條件引起其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表 達(dá)未受損的對(duì)照植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品比其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)被破壞的 植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品更早地顯示的干旱脅迫癥狀，例如枯萎癥狀。
15. 其中功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)的表達(dá)被破壞的番茄、陸地棉、大豆、小麥屬植物、大 麥、燕麥、高粱、黑麥或甘藍(lán)型油菜植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品，其中所述功能性果膠酯酶蛋 白質(zhì)為如下蛋白質(zhì)：當(dāng)在具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因的擬南芥T-DNA插入系中表達(dá) 時(shí)，其產(chǎn)生與其中所述功能性果膠酯酶蛋白質(zhì)未表達(dá)、具有被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因 的所述擬南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受損的植物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的番爺、陸地棉、大豆、小麥屬植物、大麥、燕麥、高粱、黑麥或 甘藍(lán)型油菜植物、植物細(xì)胞或植物產(chǎn)品，包含被破壞的內(nèi)源性果膠酯酶基因。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104204208SQ201380009865
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月17日
【發(fā)明者】安妮·德斯萊特斯·梅斯, 瑪麗克·海倫娜·阿德里安娜·范·赫爾滕, 希塔爾·阿尼爾庫馬爾·迪克西特, 馬丁·德·福斯, 杰斯·大衛(wèi)·蒙克沃爾德, 馬修·維塔比萊·迪萊奧 申請(qǐng)人:凱金公司