專利名稱：具有果膠乙酰酯酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的制作方法
背景技術(shù)：
果膠乙酰酯酶催化線性的同型聚半乳糖醛酸(無毛)區(qū)羧基處的乙?；l(fā)生脫乙酰作用。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶催化高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)區(qū)羥基處的乙?；l(fā)生脫乙酰作用。
已經(jīng)由菊歐文菌(Erwinia chrysanthemi)(Shevchik等人，1997，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)241285-1301)；豇豆(Vigna radiataL)(Breton等人，1996，F(xiàn)EBS通訊(FEBS Letters)388139-142)；和黑曲霉(Aspergillus niger)(Searle-VanLeeuwen等人，1996，生物技術(shù)進展(Progress in Biotechnology)，第793-798頁)分離了果膠乙酰酯酶。
已經(jīng)由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kauppinen等人，1995，生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)27027172-27178；WO 93/20190)分離了鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。
已經(jīng)由菊歐文菌分離了編碼果膠乙酰酯酶的基因(Shevchik等人，1997，見上文)。
已經(jīng)由棘孢曲霉分離了編碼鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的基因(Kauppinen等人，1995，見上文)。
本發(fā)明的一個目的是提供具有果膠乙酰酯酶活性的改進多肽和編碼該多肽的核酸。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及選自下組的具有果膠乙酰酯酶活性的分離多肽(a)具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸的替代、刪除、和/或插入的變體；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)(a)、(b)、或(d)的具有果膠乙酰酯酶活性的片段。
本發(fā)明還涉及編碼多肽的分離核酸序列，包含該核酸序列的核酸構(gòu)建物、載體、和宿主細(xì)胞，以及生成和使用所述多肽的方法。
圖的簡述


圖1顯示枯草芽孢桿菌168果膠乙酰酯酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖2顯示pDG268MCS的限制性圖譜。
圖3顯示pHP13amp-MCS的限制性圖譜。
圖4顯示pHP13amp-SAV的限制性圖譜。
圖5顯示pUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的限制性圖譜。
圖6顯示pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性圖譜。
圖7顯示pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性圖譜。
圖8顯示pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性圖譜。
圖9顯示包含“共有”amyQ啟動子的核酸序列。
圖10顯示pDG268MCS-Pr“短共有”amyQ/SAV的限制性圖譜。
圖11顯示pDG268MCSΔneo-Pr短“共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性圖譜。
圖12顯示pCAsub3Δ-Pr“短共有”amyQ/PrcryIIIA/SAV的限制性圖譜。
發(fā)明詳述具有果膠乙酰酯酶活性的多肽術(shù)語“果膠乙酰酯酶活性”在這里定義為催化果膠GalUA殘基羥基處的乙?；l(fā)生脫乙酰作用的乙酰酯酶活性。為了本發(fā)明的目的，使用對硝基苯乙酸酯作為底物來測定果膠乙酰酯酶活性，即將4.5mM對硝基苯乙酸酯(溶于100mM MOPS/4mM CaCl2，pH7.5)與乙酰酯酶一起于25℃保溫，并于405nM測量對硝基苯酚離子的釋放量，作為時間的函數(shù)。1個單位的果膠乙酰酯酶活性定義為于25℃和pH7.5每分鐘由對硝基苯乙酸酯產(chǎn)生1.0μmol對硝基苯酚離子。
在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及氨基酸序列與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸(即成熟多肽)具有至少大約65％、優(yōu)選至少大約70％、更優(yōu)選至少大約80％、甚至更優(yōu)選至少大約90％、最優(yōu)選至少大約95％、甚至最優(yōu)選至少大約97％同一性且具有果膠乙酰酯酶活性的分離多肽(以下稱為“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的實施方案中，同源多肽具有因5個氨基酸、優(yōu)選4個氨基酸、更優(yōu)選3個氨基酸、甚至更優(yōu)選2個氨基酸、最優(yōu)選1個氨基酸而與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸不同的氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，通過Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)以及同一性表格和如下多重比對參數(shù)來測定兩種氨基酸序列之間的同一程度缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗＝5，對角線＝5。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位基因變體；或其具有果膠乙酰酯酶活性的片段。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽包含SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸或其等位基因變體；或其具有果膠乙酰酯酶活性的片段。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽包含SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位基因變體；或其具有果膠乙酰酯酶活性的片段構(gòu)成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸或其等位基因變體；或其具有果膠乙酰酯酶活性的片段構(gòu)成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成。
SEQ ID NO2的片段是由該氨基酸序列的氨基和/或羧基端刪除了一個或多個氨基酸的多肽。片段優(yōu)選包含至少310個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少325個氨基酸殘基，最優(yōu)選至少350個氨基酸殘基。
等位基因變體指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或多種候選形式。等位基因變異通過突變天然產(chǎn)生，而且可在種群內(nèi)導(dǎo)致多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽沒有變化)，或者可編碼具有改變氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及具有果膠乙酰酯酶活性且由在很低嚴(yán)謹(jǐn)條件、優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件、最優(yōu)選很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針發(fā)生雜交的核酸序列編碼的分離多肽，所述核酸探針在相同條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，紐約)。SEQ ID NO1的亞序列可以是至少100個核苷酸的序列，優(yōu)選至少200個核苷酸。此外，亞序列可編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽片段。多肽還可以是所述多肽的具有果膠乙酰酯酶活性的等位基因變體或片段。
SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段都可用于設(shè)計核酸探針，從而依照本領(lǐng)域眾所周知的方法由不同屬或種的菌株鑒定并克隆編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，這些探針可用于與目的屬或種的基因組或cDNA的雜交，隨后進行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡流程，以鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。這些探針可以顯著比完整序列短，但是長度應(yīng)為至少15個、優(yōu)選至少25個、更優(yōu)選至少35個核苷酸。也可使用更長的探針。DNA和RNA探針都可使用。通常對探針進行標(biāo)記以檢測相應(yīng)基因(例如用32P、3H、35S、生物素、或親和素)。本發(fā)明涵蓋這些探針。
由此，可對由這些不同生物體制備的基因組DNA文庫篩選與上述探針發(fā)生雜交且編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽的DNA。可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或者其它分離技術(shù)將來自這些其它生物體的基因組或其它DNA分開。將來自文庫的DNA或分開的DNA轉(zhuǎn)移至并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或其亞序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。為了本發(fā)明的目的，雜交指在很低至很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下核酸序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1所示核酸序列、其互補鏈、或其亞序列的經(jīng)標(biāo)記核酸探針發(fā)生雜交。使用X射線膠片檢測在這些條件下與核酸探針發(fā)生雜交的分子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸序列或其亞序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是SEQID NO1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是大腸桿菌NRRL B-30151中所含質(zhì)粒pCR2.1-yxiM所含的核酸序列，其中該核酸序列編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是大腸桿菌NRRL B-30151中所含質(zhì)粒pCR2.1-yxiM所含的核酸序列的成熟多肽編碼區(qū)，其中核酸序列編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽。
對于長度為至少100個核苷酸的長探針，很低至很高嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為于42℃在5x SSPE/0.3％ SDS/200μg/ml剪切和變性鮭魚精DNA/不同濃度的甲酰胺中進行預(yù)雜交和雜交，隨后進行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡流程。其中很低和低嚴(yán)謹(jǐn)度用25％甲酰胺，中和中-高嚴(yán)謹(jǐn)度用35％甲酰胺，高和很高嚴(yán)謹(jǐn)度用50％甲酰胺。
對于長度為至少100個核苷酸的長探針，最后于不同溫度用2xSSC/0.2％ SDS將載體材料清洗3次，每次15分鐘。其中清洗溫度優(yōu)選至少45℃(很低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少50℃(低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少55℃(中嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少60℃(中-高嚴(yán)謹(jǐn)度)，甚至更優(yōu)選至少65℃(高嚴(yán)謹(jǐn)度)，最優(yōu)選至少70℃(很高嚴(yán)謹(jǐn)度)。
對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為，在比依照Bolton和McCarthy的計算方法(1962，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings of the National Academy of Scinece USA)481390)計算所得Tm低大約5℃至大約10℃的溫度，在0.9MNaCl/0.09M Tris-HCl pH7.6/6mM EDTA/0.5％ NP-40/1x Denhardt氏液/1mM焦磷酸鈉/1mM磷酸二氫鈉/0.1mM ATP/0.2mg/ml酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交、和雜交后清洗，隨后進行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡流程。
對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，在比計算所得Tm低5℃至10℃的溫度，將載體材料用6x SCC/0.1％ SDS清洗1次15分鐘，用6x SSC清洗2次15分鐘。
在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2的氨基酸序列但包含一個或多個氨基酸的替代、刪除、和/或插入的多肽變體。
變體多肽的氨基酸序列可能因插入或刪除一個或多個氨基酸殘基和/或用不同氨基酸殘基替代一個或多個氨基酸殘基而與SEQ ID NO2的氨基酸序列或其成熟多肽不同。氨基酸變化優(yōu)選較小本質(zhì)，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸替代；小刪除，通常是1個至大約30個氨基酸；氨基或羧基端的小延伸，諸如氨基端的甲硫氨酸；多達大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能有助于純化的小延伸，諸如多組氨酸序列、抗原性表位、或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守替代的范例是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、和甲硫氨酸)組內(nèi)進行的替代。通常不改變比活的氨基酸替代在本領(lǐng)域是已知的，且描述于例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，《蛋白質(zhì)》(Proteins)，Academic出版社，紐約。最普遍發(fā)生的替換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly，以及反向替換。
在第四個實施方案中，本發(fā)明涉及與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化學(xué)同一性或部分免疫化學(xué)同一性的分離多肽。通過使用眾所周知的Ouchterlony雙向免疫擴散流程的免疫學(xué)交叉反應(yīng)同一性測試來測定免疫化學(xué)特性。具體而言，依照Harboe和Ingild(N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks編，《定量免疫電泳手冊》(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章)，或者Johnstone和Thorpe(《免疫化學(xué)實踐》(Immunochemistry in Practice)，Blackwell Scientific Publications，1982，更具體的說是第27-31頁)描述的流程，通過免疫兔子(或其它嚙齒類動物)來制備包含對具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位具有免疫反應(yīng)性或者可與其結(jié)合的多克隆抗體的抗血清。具有免疫化學(xué)同一性的多肽是使用特異免疫化學(xué)技術(shù)以相同的方式(諸如沉淀物的完全融合)、相同的沉淀物形態(tài)學(xué)、和/或相同的電泳遷移率與抗血清發(fā)生反應(yīng)的多肽。Axelsen、Bock、和Kroll在N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks編，《定量免疫電泳手冊》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章中描述了免疫化學(xué)同一性的進一步解釋。具有部分免疫化學(xué)同一性的多肽是使用特異免疫化學(xué)技術(shù)以部分相同的方式(諸如沉淀物的部分融合)、部分相同的沉淀物形態(tài)學(xué)、和/或部分相同的電泳遷移率與抗血清發(fā)生反應(yīng)的多肽。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen、J.Kroll、和B.Weeks編，《定量免疫電泳手冊》(A Manual ofQuantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell ScientificPublications，1973，第11章中描述了部分免疫化學(xué)同一性的進一步解釋。
抗體還可以是單克隆抗體。如可依照E.Harlow和D.Lane編，1988，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約的方法來制備和使用單克隆抗體。
本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO2的成熟多肽的至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少60％、甚至更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少100％的果膠乙酰酯酶活性。
可由任何屬的微生物獲得本發(fā)明的多肽。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“由…獲得”在這里與指定來源一起使用時將指由核酸序列編碼的多肽是由該來源或插入了來自該來源的核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生的。在優(yōu)選的實施方案中，多肽被分泌到細(xì)胞外。
本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽，諸如芽孢桿菌多肽，或鏈霉菌多肽，如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Srtreptomyces murinus)的多肽；或者革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)的多肽。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽是由Fergus G.Priest定義的芽孢桿菌屬的菌株獲得的(Abraham L.Sonenshein、James A.Hoch、和Richard Losick編，《枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌》(Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria)，美國微生物學(xué)學(xué)會(American Society For Microbiology)，華盛頓特區(qū)，1993，第3-16頁)。
在更優(yōu)選的實施方案中，多肽是由嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)獲得的。
在最優(yōu)選的實施方案中，多肽是枯草芽孢桿菌多肽，最優(yōu)選枯草芽孢桿菌168的多肽，如具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
公眾可很容易由許多培養(yǎng)物收藏中心獲得這些物種的菌株，諸如美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、CentraalbureauVoor Schimmelcultures(CBS)、和北方地區(qū)研究中心的農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物收藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection，Northern Region Research Center)(NRRL)。
此外，可使用上述探針由其它來源，包括由自然界(如土壤、堆肥、水等)分離的微生物，鑒定并獲得這些多肽。用于由天然棲息地分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。然后可通過類似的篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫來衍生核酸序列。一旦用探針檢測到編碼多肽的核酸序列，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的技術(shù)來分離或克隆該序列(參閱如Sambrook等人，1989，見上文)。
“分離”多肽在這里定義為通過SDS-PAGE測定基本上不含其它非果膠乙酰酯酶多肽的多肽，如至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選大約60％純，甚至更優(yōu)選大約80％純，最優(yōu)選大約90％純，甚至最優(yōu)選大約95％純。
由本發(fā)明核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可切割融合多肽，其中多肽或其片段的N端或C端融合了另一種多肽。融合多肽是通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其片段)融合本發(fā)明的核酸序列(或其片段)而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列使其處于相同讀碼框，并得以在相同啟動子和終止子的控制下表達融合多肽。核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列列于SEQ ID NO1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是包含于大腸桿菌NRRL B-30151所含質(zhì)粒pCR2.1-yxiM中的序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是大腸桿菌NRRLB-30151中所含質(zhì)粒pCR2.1-yxiM所含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還涵蓋編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，且因遺傳密碼簡并性而與SEQ ID NO1不同的核酸序列。本發(fā)明還涉及編碼SEQ ID NO2的具有果膠乙酰酯酶活性的多肽片段的SEQ ID NO1亞序列。
SEQ ID NO1的亞序列是SEQ ID NO1涵蓋的但由5’和/或3’端刪除了一個或多個核苷酸的核酸序列。亞序列優(yōu)選包含至少930個核苷酸，更優(yōu)選至少975個核苷酸，最優(yōu)選至少1050個核苷酸。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽編序列中包含至少一處突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是知道的，包括由基因組DNA進行分離、由cDNA進行制備、或其聯(lián)合。如通過使用眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，可實現(xiàn)由這些基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列。參閱如Innis等人，1990，《PCR方法和應(yīng)用指南》(PCRA Guide to Methods and Application)，Academic出版社，紐約。還可使用其它核酸擴增流程，諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)、和基于核酸序列的擴增(NASBA)。可由芽孢桿菌菌株或者另一種或相關(guān)生物體克隆核酸序列，因而例如可能是核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因或物種變體。
術(shù)語“分離核酸序列”在這里指通過瓊脂糖電泳測定基本上不含其它核酸序列的核酸序列，如至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選至少大約60％純，甚至更優(yōu)選至少大約80％純，最優(yōu)選至少大約90％純。例如，可通過用于遺傳工程的標(biāo)準(zhǔn)克隆流程來獲得分離核酸序列，從而將核酸序列由其天然位置重新置于不同位點(在此它將進行復(fù)制)?？寺×鞒炭赡馨ㄇ谐⒎蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段、將片段插入載體分子、并將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(在此核酸序列將復(fù)制多個拷貝或克隆)。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或其任意聯(lián)合。
本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列(即第76-1146位核苷酸)具有至少大約65％、優(yōu)選大約70％、優(yōu)選大約80％、更優(yōu)選大約90％、甚至更優(yōu)選大約95％、最優(yōu)選大約97％同源性且編碼活性多肽的核酸序列。為了本發(fā)明的目的，通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings of the NationalAcademy of Science USA)80726-730)，使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)以及同一性表格和如下多重比對參數(shù)來測定兩種核酸序列之間的同源性程度缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)是Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗＝20。
為了合成與多肽基本上相似的多肽，對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進行修飾可能是必需的。術(shù)語與多肽“基本上相似”指多肽的非天然發(fā)生形式。這些多肽可能因某些改造方法而與由天然來源分離的多肽不同，如比活、熱穩(wěn)定性、最佳pH、等等不同的變體?？筛鶕?jù)SEQ IDNO1的多肽編碼部分的核酸序列來構(gòu)建變體序列，如其亞序列，和/或通過引入不產(chǎn)生與該核酸序列編碼的多肽不同的氨基酸序列、但符合意欲用于生產(chǎn)酶的宿主生物體的密碼子使用率的核苷酸替代，或者通過引入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸替代。有關(guān)核苷酸替代的一般性描述參閱如Ford等人，1991，蛋白質(zhì)的表達和純化(ProteinExpression and Purification)295-107)。
對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯而易見的是，可在對分子功能至關(guān)重要的區(qū)域以外進行這些替代而仍然產(chǎn)生有活性的多肽?？梢勒毡绢I(lǐng)域已知流程，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參閱如Cunningham和Wells，1989，科學(xué)(Science)2441081-1085)來鑒定對由本發(fā)明分離核酸序列編碼的多肽活性至關(guān)重要因而優(yōu)選不進行替代的氨基酸殘基。在后一種技術(shù)中，在分子中帶正電荷的每一個殘基處引入突變，并對產(chǎn)生的突變體分子測試果膠乙酰酯酶活性，以鑒定對分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還可通過諸如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)、或光親和標(biāo)記(參閱如de Vos等人，1982，科學(xué)(Science)255306-312；Smith等人，1992，分子生物學(xué)雜志(Journal of MolecularBiology)224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS通訊(FEBSLetters)30959-64)等技術(shù)測定的三維結(jié)構(gòu)分析來確定底物-酶作用位點。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽，且在很低嚴(yán)謹(jǐn)條件、優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中嚴(yán)謹(jǐn)條件、更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件、最優(yōu)選很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針發(fā)生雜交的分離核酸序列，所述核酸探針在相同條件下與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補鏈；或其等位基因變體和亞序列(見上文定義)可發(fā)生雜交(Sambrook等人，1989，見上文)。
本發(fā)明還涉及如下產(chǎn)生的分離核酸序列(a)在很低、低、中、中-高、高、或很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQ ID N01的第76-1146位核苷酸，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離核酸序列。亞序列優(yōu)選至少100個核苷酸的序列，更優(yōu)選200個核苷酸，諸如編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽片段的序列。用于生成突變型核酸序列的方法本發(fā)明還涉及用于生成突變型核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列或其亞序列中引入至少一處突變，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽或其具有果膠乙酰酯酶活性的片段。
通過定點誘變，使用本領(lǐng)域任何已知方法，可實現(xiàn)將突變引入核酸序列，即用一種核苷酸替換另一種核苷酸。特別有用的是利用包含目的插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和包含期望突變的兩種合成引物的流程。各自與載體相對鏈互補的寡核苷酸引物在變溫循環(huán)中通過PfuDNA聚合酶獲得延伸。在摻入引物后，產(chǎn)生了包含交錯缺刻的突變型質(zhì)粒。變溫循環(huán)后，用對甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物，以消化親本DNA模板并選擇包含突變的合成DNA。也可使用其它本領(lǐng)域已知流程。核酸構(gòu)建物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列并可操作連接一種或多種控制序列的核酸構(gòu)建物，所述控制序列在合適表達宿主中在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達。表達應(yīng)理解為包括多肽生成中涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
“核酸構(gòu)建物”在這里定義為由天然發(fā)生的基因分離的，或經(jīng)修飾以自然界中不存在的聯(lián)合和并列方式包含核酸區(qū)段的單鏈或雙鏈核酸分子。當(dāng)核酸構(gòu)建物包含表達本發(fā)明編碼序列所需要的所有控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建物”與術(shù)語“表達盒”是同義的。術(shù)語“編碼序列”在這里定義為直接確定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列。通常通過mRNA 5’末端緊挨著位于開放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(原核生物)和mRNA 3’末端緊挨著位于開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止亞序列來確定基因組編碼序列的邊界。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA、和重組核酸序列。
可以多種方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列以提供多肽表達。在插入載體前，可能需要或必需對核酸序列進行操作，這取決于表達載體。利用重組DNA方法來修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。
術(shù)語“控制序列”在這里定義為包括對表達本發(fā)明多肽必需或有利的所有成份。每一種控制序列對于編碼多肽的核酸序列而言可以是天然的或外來的。這些控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，控制序列包括啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。為了引入特定的限制性位點以便于連接控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)，可與控制序列一起提供接頭。術(shù)語“可操作連接”在這里定義為控制序列相對于DNA序列編碼區(qū)位于適當(dāng)位置使得控制序列可指導(dǎo)多肽表達的結(jié)構(gòu)。
控制序列可以是合適的啟動亞序列，即由用于表達核酸序列的宿主細(xì)胞識別的核酸序列。啟動亞序列包含介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選定的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型、和雜合型啟動子，而且可以由編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因(對于宿主細(xì)胞而言，或是同源的或是異源的)獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的范例，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子，是由大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amvL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核生物β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA)753727-3731)獲得的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)8021-25)?！皝碜灾亟M細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”(Useful proteins fromrecombinant bacteria)(科學(xué)美國人(Scientific American)24274-94，1980)和Sambrook等人(1989，見上文)描述了其它啟動子。
控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止亞序列，即由宿主細(xì)胞識別來終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止亞序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’端。在選定的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
控制序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的5’端。在選定的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。
控制序列還可以是編碼連接在多肽氨基末端并指導(dǎo)編碼的多肽進入細(xì)胞分泌途經(jīng)的氨基酸序列的信號肽編碼區(qū)。核酸序列編碼區(qū)的5’端可固有的包含天然與編碼分泌多肽的編碼區(qū)在翻譯讀碼框中相連的信號肽編碼區(qū)?；蛘撸幋a序列的5’端可包含對于編碼序列而言是外來的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列天然不包含信號肽編碼區(qū)時，可能需要外源信號肽編碼區(qū)?；蛘?，可簡單的用外源信號肽編碼區(qū)取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，在選定的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達的多肽進入分泌途經(jīng)的任何信號肽編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
對細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是由編碼芽孢桿菌NCIB11837的麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌PrsA(prsA)的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。Simonen和Palva(1993，微生物學(xué)回顧(Microbiological Reviews)57109-137)描述了其它信號肽。
在優(yōu)選的實施方案中，信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO2的第1-25位氨基酸的SEQ ID NO1的第1-75位核苷酸。
控制序列還可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。產(chǎn)生的多肽稱為酶原或多肽原。多肽原通常沒有活性，而且可通過催化或由多肽原產(chǎn)生的前肽的自身催化切割轉(zhuǎn)變成成熟的有活性的多肽?？捎删幋a枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶(aprE)和枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶(nprT)的基因獲得前肽編碼區(qū)。
當(dāng)多肽的氨基端同時存在信號肽和前肽區(qū)時，前肽區(qū)位于多肽的氨基端，而信號肽區(qū)位于前肽區(qū)的氨基端。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建物還可包含編碼有利于指導(dǎo)多肽表達的一種或多種因子的一種或多種核酸序列，如轉(zhuǎn)錄激活劑(如反式作用因子)、伴侶分子、和加工蛋白酶。在選定的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何因子都可用于本發(fā)明。編碼一種或多種這些因子的核酸與編碼多肽的核酸序列不必前后串聯(lián)。
轉(zhuǎn)錄激活劑是激活編碼多肽的核酸序列轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)(Kudla等人，1990，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO Journal)91355-1364；Jarai和Buxton，1994，現(xiàn)行遺傳學(xué)(Current Genetics)262238-244；Verdier，1990，酵母(Yeast)6271-297)?？捎删幋a嗜熱脂肪芽孢桿菌NprA的基因(nprA)獲得編碼激活劑的核酸序列。
伴侶分子是輔助另一種多肽正確折疊的蛋白質(zhì)(Hartl等人，1994，TIBS 1920-25；Bergeron等人，1994，TIBS 19124-128；Demolder等人，1994，生物技術(shù)雜志(Journal of Biotechnology)32179-189；Craig，1993，科學(xué)(Science)2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然(Nature)35533-45；Puig和Gilbert，1994，生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)2697764-7771；Wang和Tsou，1993，F(xiàn)ASEB雜志(The FASEB Journal)71515-11157；Robinson等人，1994，生物/技術(shù)(Bio/Technology)1381-384；Jacobs等人，1993，分子微生物學(xué)(MolecularMicrobiology)8957-966)?？捎删幋a枯草芽孢桿菌GroE蛋白質(zhì)和枯草芽孢桿菌PrsA的基因獲得編碼伴侶分子的核酸序列。對于其它范例，參閱Gething和Sambrook，1992，見上文；和Hartl等人，1994，見上文。
加工蛋白酶是切割前肽而產(chǎn)生成熟的有生物化學(xué)活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母(Yeast)1067-69；Fuller等人，1989，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings of the NationalAcademy of Scineces USA)861434-1438；Julius等人，1984，細(xì)胞(Cell)371075-1089；Julius等人，1983，細(xì)胞(Cell)32839-852；美國專利號5,702,934)。可由編碼釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的二肽氨肽酶、釀酒酵母的KexZ、Yarrowia lipolytica的二堿性加工內(nèi)切蛋白酶(xpr6)、和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)金屬蛋白酶(p45基因)的基因獲得編碼加工蛋白酶的核酸序列。
可能還希望添加相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)控多肽表達的調(diào)控序列。調(diào)控系統(tǒng)的范例是引起基因應(yīng)答化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而打開或關(guān)閉表達的調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱基因系統(tǒng)。表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⑸鲜龆喾N核酸和控制序列連接在一起以產(chǎn)生重組表達載體，它可包含一個或多個便利的限制性位點從而能夠在這些位點處插入或替代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建物插入用于表達的適當(dāng)載體來表達本發(fā)明的核酸序列。在生成表達載體時，編碼序列位于載體中從而編碼序列可操作連接用于表達的適當(dāng)控制序列。
重組表達載體可以是可方便的進行重組DNA流程且能夠表達核酸序列的任何載體(如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與載體將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，它的復(fù)制不依賴染色體復(fù)制，如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包括用于確保自身復(fù)制的任何手段?；蛘撸d體可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用(一起)包含待導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的總DNA的單個載體或質(zhì)?；蛘邇蓚€或多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一種或多種能夠容易的選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、向營養(yǎng)缺陷型提供原養(yǎng)等等的基因。細(xì)菌選擇標(biāo)記的范例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性的標(biāo)記，諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四環(huán)素抗性。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含能夠使載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者使細(xì)胞中的載體不依賴基因組而自主復(fù)制的元件。
為了整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可依賴編碼多肽的核酸序列或載體的任何其它元件，通過同源或非同源重組使載體整合到基因組中。或者，載體可包含額外核酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中。額外核酸序列使得載體能夠以精確的染色體定位整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了提高精確定位整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與對應(yīng)靶序列高度同源的核酸，諸如100-10,000bp，優(yōu)選400-10,000bp，最優(yōu)選800-10,000bp，由此增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，可通過非同源重組使載體整合到宿主細(xì)胞基因組中。
為了自主復(fù)制，載體還可包含使載體能夠在目的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。細(xì)菌復(fù)制起點的范例是能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的復(fù)制起點，能夠在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是包含突變因而使其在宿主細(xì)胞中的功能具有溫度敏感性的載體(參閱如Ehrlich，1978，美國國家科學(xué)院進展(Proceedings of theNational Academy of Scinece USA)751433)。
可以將超過一個拷貝的本發(fā)明核酸序列插入宿主細(xì)胞以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量?？赏ㄟ^將至少一個額外拷貝的序列整合到宿主細(xì)胞基因組中，或者通過使核酸序列包含可擴增選擇標(biāo)記基因(可通過在存在適當(dāng)選擇劑的情況中培養(yǎng)細(xì)胞來選擇包含擴增拷貝的選擇標(biāo)記基因因而包含額外拷貝的核酸序列的細(xì)胞)，由此獲得核酸序列拷貝數(shù)的增加。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達載體的流程對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的(參閱如Sambrook等人，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，可有利的用于重組生產(chǎn)多肽。可將包含本發(fā)明核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而以上文所述染色體整合體或自身復(fù)制的染色體外載體的形式維持載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，如原核生物，或者是非單細(xì)胞微生物，如真核生物。
有用的單細(xì)胞細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，諸如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)胞，如嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，或者鏈霉菌屬(Streptomyces)的細(xì)胞，如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)；革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如大腸桿菌(E.coli)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)。在一個優(yōu)選的實施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草芽孢桿菌的細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性的芽孢桿菌。
例如可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參閱如Chang和Cohen，1979，分子和普通遺傳學(xué)(Molecular and General Genetics)168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參閱如Young和Spizizin，1961，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)81823-829；或Dubnau和Dayidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志(Journal of MolecularBiology)56209-221)、電穿孔(參閱如Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6742-751)、或綴合(參閱如Koehler和Thorne，1987，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)1695771-5778)實現(xiàn)將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞。生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及用于生成本發(fā)明多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)野生型形式能夠生成多肽的菌株以產(chǎn)生包含多肽的上清液；并(b)回收多肽。菌株優(yōu)選芽孢桿菌屬，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明還涉及用于生成本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；并(b)回收多肽。
本發(fā)明還涉及用于生成本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一處突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽；并(b)回收多肽。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，使用本領(lǐng)域已知方法，在適合于生成多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可通過搖瓶培養(yǎng)、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料-分批、或固相發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基中且在能夠表達和/或分離多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知流程，在包含碳源、氮源、和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由商業(yè)供應(yīng)商處購買，或者可以依照公開的配方進行配制(如美國典型培養(yǎng)物收藏中心的目錄)。若多肽分泌進入營養(yǎng)培養(yǎng)基，則可直接由培養(yǎng)基回收多肽。如多肽不是分泌型的，則可由細(xì)胞裂解物回收多肽。
可使用對多肽特異的本領(lǐng)域已知方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成、或酶底物的消失。例如，本文所述酶測定法可用于測定多肽的活性。
可通過本領(lǐng)域已知方法來回收產(chǎn)生的多肽。例如，可通過常規(guī)流程由營養(yǎng)培養(yǎng)基回收多肽，包括但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。
可通過多種本領(lǐng)域已知流程來純化本發(fā)明多肽，包括但不限于層析(如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳(如制備性等電聚焦)、差異溶解(如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(參閱如《蛋白質(zhì)純化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。植物本發(fā)明還涉及用編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽的本發(fā)明核酸序列轉(zhuǎn)化因而以可回收的數(shù)量表達并生成多肽的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞?？梢杂芍参锘蛑参锊糠只厥斩嚯摹；蛘?，可以同樣的使用包含重組多肽的植物或植物部分來改進食品或飼料的品質(zhì)，如改進營養(yǎng)價值、美味性、和流變學(xué)特性，或者破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的范例是草，諸如草地草(藍草、早熟禾)、草料草(諸如羊茅)、黑麥草、溫帶草(諸如剪股穎)、和谷類(如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉米)。
雙子葉植物的范例是煙草、豆類(諸如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、蠶豆、和大豆)、和十字花科植物(諸如花椰菜、油菜籽、和密切相關(guān)的模型生物擬南芥)。
植物部分的范例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖。特定的植物組織，諸如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細(xì)胞質(zhì)，也認(rèn)為是植物部分。此外，認(rèn)為任何植物細(xì)胞(不管組織起源如何)都是植物部分。
本發(fā)明的范圍還包括這些植物、植物部分、和植物細(xì)胞的后代。
可依照本領(lǐng)域已知方法來構(gòu)建表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡而言之，將編碼本發(fā)明多肽的一種或多種表達構(gòu)建物引入植物宿主基因組，并將產(chǎn)生的經(jīng)修飾植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，可構(gòu)建成這樣的植物或植物細(xì)胞。
便利的是，表達構(gòu)建物是包含編碼本發(fā)明多肽的核酸序列并可操作連接在選定植物或植物部分中表達核酸序列所需要的適當(dāng)調(diào)控序列的核酸構(gòu)建物。此外，表達構(gòu)建物可包含可用于鑒定其中整合了表達構(gòu)建物的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，和將構(gòu)建物引入目的植物所必需的DNA序列(后者取決于將使用的DNA引入方法)。
例如根據(jù)希望何時、何處、如何表達多肽來確定調(diào)控序列的選擇，諸如啟動子和終止亞序列，任選信號或運輸序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或者可以具有發(fā)育、階段、或組織特異性，而且基因產(chǎn)物可以靶向特定組織或植物部分(諸如種子或葉)。例如Tague等人(1988，植物生理學(xué)(Plant Physiology)86506)描述了調(diào)控序列。
對于組成型表達，可使用35S-CaMV啟動子(Franck等人，1980，細(xì)胞(Cell)21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏組織(諸如種子、馬鈴薯塊莖、和果實)的啟動子(Edwards和Coruzzi，1990，遺傳學(xué)年鑒(Ann.Rev.Genet.)24275-303)、或來自代謝組織(諸如分生組織)的啟動子(Ito等人，植物分子生物學(xué)(PlantMolecular Biology)24863-878)、種子特異性啟動子諸如來自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白啟動子(Wu等人，1998，植物和細(xì)胞生理學(xué)(Plant and Cell Physiology)39885-889)、來自蠶豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知種子蛋白質(zhì)基因的蠶豆啟動子(Conrad等人，1998，植物生理學(xué)雜志(Journal of PlantPhysiology)152708-711)、來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等人，1998，植物和細(xì)胞生理學(xué)(Plant and Cell Physiology)39935-941)、來自蕓苔(Brassica napus)的貯藏蛋白napA啟動子、或本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動子(如WO 91/14772中所述)。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，諸如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人，1993，植物生理學(xué)(Plant Physiology)102991-1000)、綠藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)2685-93)、或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等人，1995，分子和普通遺傳學(xué)(Molecular and General Genetics)248668-674)，或者是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，諸如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)22573-588)。
還可使用啟動子增強子元件，從而在植物中實現(xiàn)更高水平的酶表達。例如，啟動子增強子元件可以是位于啟動子與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等人(1993，見上文)公開了水稻肌動蛋白1基因的第一個內(nèi)含子用于增強表達的用途。
選擇標(biāo)記基因和表達構(gòu)建物的任何其它部分可選自本領(lǐng)域可獲得的。
依照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，包括由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、由病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、微粒轟擊、biolisic轉(zhuǎn)化、和電穿孔(Gasser等人，1990，科學(xué)(Science)2441293；Potrykus，1990，生物/技術(shù)(Bio/Technology)8535；Shimamoto等人，1989，自然(Nature)338274)，將核酸構(gòu)建物導(dǎo)入植物基因組。
目前，由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的首選方法(回顧參閱Hooykas和Schilperoort，1992，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)1915-38)。但是，它也可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然這些植物通常優(yōu)選其它轉(zhuǎn)化方法。目前，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的首選方法是胚性愈傷組織或發(fā)育中胚的微粒轟擊(涂抹了轉(zhuǎn)化DNA的金或鎢微顆粒)(Christou，1992，植物雜志(Plant Journal)2275-281；Shimamoto，1994，生物技術(shù)現(xiàn)行觀點(Current Opinion Biotechnology)5158-162；Vasil等人，1992，生物/技術(shù)(Bio/Technology)10667-674)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的其它方法主要是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等人，1993，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)21415-428)。
轉(zhuǎn)化之后，依照本領(lǐng)域眾所周知的方法，選擇其中摻入了表達構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化體并再生成完整植株。
本發(fā)明還涉及用于生成本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼具有果膠乙酰酯酶活性的多肽的本發(fā)明核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；并(b)回收多肽。消除或降低果膠乙酰酯酶活性本發(fā)明還涉及用于生成親本細(xì)胞的突變型細(xì)胞的方法，包括破壞或刪除編碼多肽的核酸序列或其控制序列，導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時生成的多肽比親本細(xì)胞少的突變型細(xì)胞。
通過修飾或滅活在細(xì)胞中表達具有果膠乙酰酯酶活性的多肽所必需的核酸序列，可方便的實現(xiàn)果膠乙酰酯酶活性降低的菌株的構(gòu)建。待修飾或滅活的核酸序列可以是例如編碼該多肽或其展示果膠乙酰酯酶活性所必需的部分的核酸序列，或者核酸序列可具有由該核酸序列的編碼序列表達多肽所需要的調(diào)控功能。這種調(diào)控或控制序列的范例可以是啟動亞序列或其功能部分，即足以影響多肽表達的部分。上文描述了可能修飾的其它控制序列。
通過對細(xì)胞進行誘變，并選擇或篩選果膠乙酰酯酶生成能力降低的細(xì)胞，可進行核酸序列的修飾或滅活?？蛇M行特異或隨機的誘變，例如通過使用合適的物理或化學(xué)誘變劑，通過使用合適的寡核苷酸，或者通過對DNA序列進行PCR誘變。此外，可通過使用這些誘變劑的任意聯(lián)合來進行誘變。
適用于該目的的物理或化學(xué)誘變劑的范例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N＇-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。
在使用這些試劑時，通常在存在選定誘變劑的情況中在合適條件下將待誘變細(xì)胞保溫，并選擇展示果膠乙酰酯酶活性或產(chǎn)量降低的細(xì)胞，由此進行誘變。
通過在編碼多肽的核酸序列或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需要的調(diào)控元件中導(dǎo)入、替代、或刪除一個或多個核苷酸，可實現(xiàn)本發(fā)明多肽生產(chǎn)的修飾或滅活。例如，可插入或刪除核苷酸從而導(dǎo)入終止密碼子、消除起始密碼子、或改變開放讀碼框。依照本領(lǐng)域已知方法，通過定點誘變或PCR誘變，可實現(xiàn)這些修飾或滅活。雖然原則上可在體內(nèi)(即直接在表達待修飾核酸序列的細(xì)胞上)進行修飾，但是優(yōu)選如下文例示在體外進行修飾。
消除或降低選定宿主細(xì)胞的生成的簡便方法的范例是通過基因取代或基因中斷。在基因中斷法中，在體外誘變對應(yīng)于目的內(nèi)源基因或基因片段的核酸序列以產(chǎn)生缺陷型核酸序列，然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷型基因。缺陷型核酸序列通過同源重組取代內(nèi)源基因或基因片段?？赡芟Ｍ毕菪突蚧蚧蚱芜€編碼標(biāo)記，可用于選擇其中編碼多肽的基因遭到修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。
或者，通過已建立的反義技術(shù)，使用與多肽編碼序列互補的核苷酸序列，可實現(xiàn)核酸序列的修飾或滅活。更具體的說，導(dǎo)入與編碼多肽的核酸序列互補的核苷酸序列，它可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并能與細(xì)胞中生成的多肽mRNA發(fā)生雜交，由此可降低或消除細(xì)胞的多肽生成。在互補反義核苷酸序列能夠與多肽mRNA發(fā)生雜交的條件下，可降低或消除多肽的翻譯量。
優(yōu)選的是，按照本發(fā)明方法修飾的細(xì)胞是微生物起源，例如適用于生產(chǎn)期望蛋白質(zhì)產(chǎn)物(對于細(xì)胞而言，或是同源的或是異源的)的真菌菌株。
本發(fā)明還涉及親本細(xì)胞的突變型細(xì)胞，其中包括破壞或刪除編碼多肽的核酸序列或其控制序列，導(dǎo)致突變型細(xì)胞生成的多肽比親本細(xì)胞少。
如此產(chǎn)生的多肽缺陷的突變型細(xì)胞作為宿主細(xì)胞用于表達同源和/或異源多肽特別有用。因此，本發(fā)明還涉及用于生成同源或異源多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)突變型細(xì)胞；并(b)回收多肽。術(shù)語“異源多肽”在這里定義為對于宿主細(xì)胞而言不是天然的多肽、其中進行了修飾以改變天然序列的天然蛋白、或通過重組DNA技術(shù)對宿主細(xì)胞的操作而改變了表達量的天然蛋白。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于生成基本上沒有果膠乙酰酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，包括將生成本發(fā)明多肽以及目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物二者的細(xì)胞進行發(fā)酵，在發(fā)酵之前、之中、或之后向發(fā)酵肉湯中加入有效量的能夠抑制果膠乙酰酯酶活性的試劑，由發(fā)酵肉湯回收目的產(chǎn)物，并任選對回收的產(chǎn)物進行進一步純化。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于生成基本上沒有果膠乙酰酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，包括在允許產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，對產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯進行pH與溫度的聯(lián)合處理以充分降低果膠乙酰酯酶活性，并由培養(yǎng)肉湯回收產(chǎn)物?；蛘?，可對由培養(yǎng)肉湯回收的酶制劑進行pH與溫度的聯(lián)合處理。pH與溫度的聯(lián)合處理可任選與果膠乙酰酯酶抑制劑處理聯(lián)合使用。
依照本發(fā)明的這個方面，有可能消除至少60％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，仍然更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％的果膠乙酰酯酶活性。使用這種方法可達到果膠乙酰酯酶活性的完全消除。
pH與溫度的聯(lián)合處理優(yōu)選在pH范圍6.5-7和溫度范圍55-75℃進行足夠時間以獲得預(yù)期效果，通常30-60分鐘是足夠的。
可通過本領(lǐng)域已知方法來進行用于培養(yǎng)和純化目的產(chǎn)物的方法。
用于生成基本上沒有果膠乙酰酯酶活性的產(chǎn)物的本發(fā)明方法在酶生產(chǎn)中是特別感興趣的。酶可選自如淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulytic enzyme)、氧化還原酶、或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的范例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、蔗糖酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠溶酶、過氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。果膠乙酰酯酶缺陷細(xì)胞還可用于表達制藥學(xué)感興趣的異源蛋白，諸如激素、生長因子、受體、等等。
應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，還包括通過氨基酸替代、刪除、或添加，或者其它修飾而增強了活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受等等特性的多肽(如酶)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的、基本上沒有果膠乙酰酯酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。組合物在還有一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽和合適載體的組合物。優(yōu)選的是，組合物富集了本發(fā)明的多肽。在本文中，術(shù)語“富集”指組合物的果膠乙酰酯酶活性得到了提高，如富集因子為1.1。合適載體在本領(lǐng)域是眾所周知的。
組合物可包含本發(fā)明多肽作為主要酶成份，如單組分組合物?；蛘撸M合物可包含多種酶活性，諸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹵素過氧化物酶、蔗糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、另一種果膠溶酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。另外的酶可由任何微生物產(chǎn)生。
可依照本領(lǐng)域已知方法制備多肽組合物，而且可以是液體或干燥形式的組合物。例如，多肽組合物可以是顆?；蛭⒘５男问??？梢勒毡绢I(lǐng)域已知方法穩(wěn)定組合物中將包含的多肽。
下文給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的范例?？梢勒毡绢I(lǐng)域已知方法測定本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件。用途本發(fā)明還涉及用于降解果膠物質(zhì)的方法，包括在適合于降解果膠物質(zhì)的條件下使果膠物質(zhì)接觸有效量的一種或多種本發(fā)明多肽。如上所述，一種或多種多肽可以包含于包含多肽與合適載體的組合物中。組合物還可包含對降解果膠物質(zhì)有用的其它酶，諸如其它果膠溶酶、纖維素酶、和半纖維素酶。其它果膠溶酶可包括內(nèi)切和外切果膠裂解酶、內(nèi)切和外切甲基半乳糖醛酸聚糖酶、內(nèi)切和外切果膠酸(酯)裂解酶、內(nèi)切和外切半乳糖醛酸聚糖酶、果膠甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、和/或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶，或者已知降解果膠物質(zhì)的任何其它酶。
使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，本發(fā)明的多肽及其組合物可用于降解具有不同酯化程度的可溶性和不溶性的果膠，從而使植物組織粘度降低、澄清、脫果膠、和泡軟。
在一個優(yōu)選的實施方案中，多肽作為試劑，單獨或與其它酶聯(lián)合用于降解或修飾乙?；z。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽作為試劑，單獨或與其它酶一起用于降解或修飾植物細(xì)胞壁。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽與對乙?；虿糠忠阴；z特異的其它酶一起使用。這些其它酶包括以高于對脫乙酰果膠作用的特異性攻擊乙?；筒糠忠阴；z的所有酶，包括通過內(nèi)切和/或外切方式攻擊果膠主鏈的酶，或者攻擊果膠側(cè)鏈的酶。這樣的一種酶是鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。參閱例如W0 93/20190。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽與對脫乙酰或部分脫乙酰果膠特異的其它酶一起使用。這些其它酶包括以高于對乙酰化果膠作用的特異性攻擊脫乙酰和部分脫乙酰果膠的所有酶，包括通過內(nèi)切和/或外切方式攻擊果膠主鏈的酶，或者攻擊果膠側(cè)鏈的酶。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽與對乙?；虿糠忠阴；z特異的其它酶和對脫乙?；虿糠置撘阴９z特異的其它酶一起使用。
可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來測定降解含果膠物質(zhì)必需的多肽劑量和條件。通常，本發(fā)明多肽的加入量相當(dāng)于0.01-100mg酶蛋白質(zhì)/kg含果膠物質(zhì)。信號肽本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因以及與之可操作連接的編碼由SEQ ID NO2的第1-25位氨基酸構(gòu)成的信號肽、由SEQ ID NO1的第1-75位核苷酸構(gòu)成的核酸序列的核酸構(gòu)建物，其中所述基因?qū)τ谒龊怂嵝蛄卸允峭鈦淼摹?br> 本發(fā)明還涉及包含這種核酸構(gòu)建物的重組表達載體和重組宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及用于生成蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；并(b)回收蛋白質(zhì)。
核酸序列可以可操作連接其它控制序列和外源基因。上文描述了這些其它控制相同。
蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞而言可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在這里的用意不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，因而涵蓋肽、寡肽、和蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還涵蓋聯(lián)合形成編碼產(chǎn)物的兩種或多種多肽。蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，它包含由至少兩種不同蛋白質(zhì)獲得的部分或完整多肽序列的聯(lián)合，其中一種或多種蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞而言可以是異源的或天然的。蛋白質(zhì)還包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白的天然發(fā)生的等位基因和工程變異。
蛋白質(zhì)優(yōu)選激素、激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道分子。在更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)化糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果膠溶酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
可由任何原核、真核、或其它來源獲得基因。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“由…獲得”在這里與指定來源一起使用時指蛋白質(zhì)是由該來源或插入了來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的。
通過下列實施例進一步描述本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)當(dāng)理解為對實施例用作緩沖劑和底物的化學(xué)藥品是至少試劑級的商品。細(xì)菌菌株大腸桿菌DH5α，大腸桿菌JMl0l，枯草芽孢桿菌A164(ATCC6051A)，枯草芽孢桿菌168(Bacillus Stock Center，Columbus，OH)，和枯草芽孢桿菌PLl801 spoIIE∷Tn917(amyE、apr、npr)。引物和寡聚物所有引物和寡聚物都是在Applied Biosystems 394型合成儀(Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)上依照制造商的指示合成的。實施例1來自枯草芽孢桿菌168的果膠乙酰酯酶基因的分離和鑒定使用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA分離方案(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，由枯草芽孢桿菌168分離基因組DNA。
將下文所示寡核苷酸引物1和2用于由枯草芽孢桿菌168基因組DNA通過PCR擴增果膠乙酰酯酶編碼區(qū)。引物1在果膠乙酰酯酶編碼區(qū)的上游引入了SacI位點和芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶(SAVINASETM，NovoNordisk A/S，Bagsvrd，丹麥，以下稱為SAVINASETM基因)的核糖體結(jié)合位點，而引物2在果膠乙酰酯酶編碼區(qū)的下游引入了NotI位點。
擴增反應(yīng)(50μl)包含大約200ng枯草芽孢桿菌168基因組DNA、0.5μM每種引物、200μM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP、1x PCR緩沖液、3mM MgCl2、和0.625U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)。將反應(yīng)在RoboCycler 40溫度循環(huán)儀(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)中進行循環(huán)，編程如下第一個循環(huán)95℃ 9min；30個循環(huán)95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min；最后一個循環(huán)72℃ 3min。引物15＇-CGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGGAACCGAATGAAAAAATGGATGGCAGCG-3＇(SEQ ID NO.3)引物25＇-GCGGCCGCTTAAAAGCCAGCGATTCCCTG-3＇(SEQ ID NO.4)使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，依照制造商的指示，克隆PCR產(chǎn)物。使用QIAprep8質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，由大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。通過使用酶EcoRI、BglI、DraI、PuvI、NotI、和SacI的限制性分析鑒定包含預(yù)期插入片段的質(zhì)粒，并命名為pCR2.1-yxiM。分離包含pCR2.1-yxiM質(zhì)粒的大腸桿菌TOP10菌落，并使用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒依照制造商的指示制備質(zhì)粒DNA以供測序。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE細(xì)胞(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，將一個轉(zhuǎn)化體命名為MDT28并保藏于NRRL培養(yǎng)物收藏中心。
使用Applied Biosystems 377 XL型自動化DNA測序儀，使用染料-終止物化學(xué)和基于公開的yxiM基因序列(Shevchik等人，1997，見上文)的合成寡核苷酸，進行DNA測序。
DNA序列分析確認(rèn)了果膠乙酰酯酶基因的序列，相對于發(fā)表的yxiM基因序列(Shevehik等人，1997，見上文)存在兩處差異報道位于yxiM編碼序列第247位的G殘基變成了C殘基，報道位于yxiM編碼序列第447位的C殘基變成了G殘基。使用與上述相同方法、使用引物1和2、由枯草芽孢桿菌168基因組DNA產(chǎn)生的5份獨立PCR產(chǎn)物的DNA序列分析確認(rèn)了第247位為C殘基，指出發(fā)表的G殘基是錯誤的。該序列變化導(dǎo)致氨基酸變化，發(fā)表位于第83位的谷氨酸殘基變成了谷氨酰胺殘基。第447位的核苷酸變化不影響所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
果膠乙酰酯酶克隆具有編碼382個氨基酸的多肽的1146bp開放讀碼框。核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO2)顯示于
圖1。使用SignalP程序(Nielsen等人，1997，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)101-6)，預(yù)測了對應(yīng)于SEQ ID NO1的第1-75位核苷酸的25個殘基的信號肽。
使用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以及同一性表格和下列多重比對參數(shù)進行了果膠乙酰酯酶氨基酸序列的比較性比對缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗＝5，對角線＝5。
比較性比對顯示，枯草芽孢桿菌的果膠乙酰酯酶與來自菊歐文菌的果膠乙酰酯酶(EMBL Y09828)享有14.9％同一性的區(qū)域，與來自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(EMBL X89714)享有14.4％同一性的區(qū)域。實施例2pDG268MCS的構(gòu)建用Tth111I和EcoRI消化pDG268(Antoniewski等人，1990，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)17286-93)。使用QiaquickDNA純化試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)，依照制造商的指示，凝膠純化大約6020bp的最大質(zhì)粒片段。然后將回收的DNA與下文所示合成多接頭相連接，在質(zhì)粒中引入唯一的SfiI和BamHI位點。
SfiI ApaI SmaI AatII HindIII ClaI BamHI NotI5＇-AATTGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCAAGCTTATCGATGCGGATCCGCGGCCGC3＇-CCGGAATTCCCGGGCCCTGCAGTTCGAATAGCTACGCCTAGGCGCCGGCGC(分別為SEQ ID NO5和6)用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板(每升含16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl、和15g瓊脂)上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。依照Sambrook等人，1989，見上文，純化質(zhì)粒DNA，并用SfiI和NotI消化以鑒定包含這些位點(暗指上文所示多接頭)的質(zhì)粒(pDG268不含這兩種限制性位點)。鑒定了包含這兩種限制性位點且比pDG268小大約3.0kb(這是用合成多接頭取代pDG268中l(wèi)acZ基因的結(jié)果)的幾個質(zhì)粒。選擇這樣的一個質(zhì)粒，命名為pDG268MCS(圖2)。實施例3pHP13ampMCS的構(gòu)建如下構(gòu)建pHP13-amp，pHP13(Haima等人，1987，分子和普通遺傳學(xué)(Molecular and General Genetics)209335-342)的變體。用AatII消化pUC9，用Klenow片段和dNTP補平末端，并用HindIII消化。使用Qiaex試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)，凝膠純化較大的2.2kb片段。用HpaI(它切割紅霉素抗性基因的內(nèi)部)消化pHP13，補平末端，并用HindIII消化。然后將由pHP13釋放的較大的3.0kb片段與含pUC9的復(fù)制起點和氨芐青霉素抗性基因的2.1kb片段相連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。如實施例1所述，由幾個轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA。由其中一個轉(zhuǎn)化體回收命名為pHP13amp的質(zhì)粒。
用EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pHP13amp，并用將100pmol下列多接頭在50mM NaCl、10mM Tris pH7.5、和1mM EDTA中退火(煮沸5分鐘，然后在超過2個小時的時間里慢慢冷卻至室溫)產(chǎn)生的新MCS取代pUC9MCSSfiI ApaI SmaI AatII sacI HindIII NotI NcoI SalI5＇-AGCTAGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCGAGCTCAAGCTTGCGGCCGCCATGGTCGACG3＇-TCCGGAATTCCCGGGCCCTGCAGCTCGAGTTCGAACGCCGGCGGTACCAGCTGCTTAA(分別為SEQ ID NO7和8)用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由幾個轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA，并用NotI和SacI消化。這些酶可切割的質(zhì)粒包含合成多接頭。鑒定這樣的一個質(zhì)粒，命名為pHP13amp-MCS(圖3)。通過經(jīng)由多接頭區(qū)的DNA測序進一步確認(rèn)了該質(zhì)粒。實施例4SAVINASETM絲氨酸蛋白酶基因的分離使用質(zhì)粒pSX222(美國專利號5,621,089)作為模板以及下列兩種引物(限制性位點標(biāo)有下劃線)，PCR擴增稱為SAVINASETM(Novo NordiskA/S，Bagsvrd，丹麥)的芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的編碼基因ApAI SacI5＇-CTCCGGGCCCATCTGAGCTCTATAAAAATGAGGAGGG-3＇(SEQ ID NO.9)BamHI5＇-CCTCGGATCCATACACAAAAAAACGCT-3＇(SEQ ID NO.10)擴增反應(yīng)(100μl)由下列成份組成50ng pSX222、50pmol每種引物、1x Taq DNA聚合酶緩沖液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、200μM每種dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。擴增條件是第一個循環(huán)95℃ 3min；30個循環(huán)95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一個循環(huán)72℃ 5min。
依照制造商的指示，將大約1230bp的PCR產(chǎn)物直接亞克隆到pCRII載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用基因特異引物通過DNA測序確認(rèn)了基因的序列。一旦確認(rèn)，用BamHI消化質(zhì)粒，用Klenow片段補平，用ApaI進行消化，并將包含SAVINASETM基因的片段連接到pHP13ampMCS的ApaI/Ecl136II位點中。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一個轉(zhuǎn)化體分離出命名為pHP13amp-SAV(圖4)的質(zhì)粒，并使用構(gòu)建物特異引物通過DNA測序進行確認(rèn)。因連接重新產(chǎn)生了BamHI位點。實施例5pUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的構(gòu)建由依照Pitcher等人的方法(1989，應(yīng)用微生物學(xué)通訊(Letters inApplied Microbiology)8151-156)由WO 95/02695中所述蘇云金芽孢桿菌粉蟲亞種(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)菌株NB125分離的染色體DNA，使用下列引物，通過PCR擴增編碼蘇云金芽孢桿菌粉蟲亞種晶體蛋白CryIIIA的cryIIIA基因的啟動子SmaI5＇-GAGACCCGGGAGCTTTCAGTGAAGTACGTG-3＇(SEQ ID NO.11)5＇-GGGGCGTTACAATTCAAAG-3＇(SEQ ID NO.12)擴增反應(yīng)(100μl)由下列成份組成50ng蘇云金芽孢桿菌粉蟲亞種NB125染色體DNA、50pmol每種引物、1x Pfu聚合酶緩沖液(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)、200μM每種dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Pfu聚合酶(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。擴增條件是第一個循環(huán)95℃ 3min；30個循環(huán)95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一個循環(huán)72℃ 5min。用SmaI和HindIII消化大約1000bp的PCR產(chǎn)物，并連接到pUC18的SmaI/HindIII位點中。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一個氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離出命名為pUC18-PrcryIIIA的質(zhì)粒。
用HindIII消化質(zhì)粒pUC118-cryIIIA(WO 95/02695)，并使用Qiaquick DNA純化試劑盒依照制造商的指示凝膠純化包含cryIIIA基因和mRNA穩(wěn)定序列的大約3000bp的HindIII片段。將該片段連接到pUC18-PrcryIIIA的HindIII位點中。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一個氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離出命名為pUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA(圖5)的質(zhì)粒。通過用EcoRI消化質(zhì)粒確認(rèn)了片段的正確取向。實施例6cryIIIA啟動子-cryIIIA mRNA穩(wěn)定序列-SAVINASETM基因表達盒的構(gòu)建使用質(zhì)粒pUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA作為DNA模板以及下文所述兩種引物(限制性位點標(biāo)有下劃線)，PCR擴增cryIIIA基因的啟動子和mRNA穩(wěn)定序列ApaI5＇-GGGCCCTCGAAACGTAAGATGAAACCT-3＇(SEQ ID NO.13)SacI5＇-GAGCTCCATAATACATAATTTTCAAACTG-3＇(SEQ ID NO.14)擴增反應(yīng)(100μl)由下列成份組成50ngpUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab、50pmol每種引物、1x Taq聚合酶緩沖液、200μM每種dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Taq聚合酶。擴增條件是第一個循環(huán)95℃ 3min；30個循環(huán)95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一個循環(huán)72℃ 5min。
依照制造商的指示，將大約630bp的PCR產(chǎn)物克隆到pCRII載體中，以產(chǎn)生pCRII-PrcryIIIA/cryIIIAstab，使用M13測序引物和cryIIIA特異引物通過DNA測序進行確認(rèn)。
凝膠純化pCRII-PrcryIIIA/cryIIIAstab的包含cryIIIA啟動子以及mRNA穩(wěn)定序列的大約630bp的SfiI-SacI片段，并連接經(jīng)SfiI/SacI消化的pHP13amp-SAV。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一個氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體純化命名為pHP13amp-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的質(zhì)粒。
使用Qiaquick DNA純化試劑盒依照制造商的指示凝膠純化pHP 13amp-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的包含PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV盒的大約1850bp的SfiI-BamHI片段，并連接經(jīng)SfiI/BamHI消化的pDG268MCS。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一個氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體純化命名為pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(圖6)的質(zhì)粒。實施例7pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的構(gòu)建用SnaBI和NruI(兩種限制性位點都位于載體SacI位點的側(cè)翼)消化pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV，連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由幾個轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA。用SacI消化質(zhì)粒DNA，以鑒定刪除了位于載體序列中的SacI位點因而切割只發(fā)生于cryIIIA啟動子下游的SacI位點的質(zhì)粒。鑒定了這樣的一個質(zhì)粒，命名為pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(圖7)。實施例8pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的構(gòu)建用BalI消化pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并用小牛腸堿性磷酸酶進行處理。用PstI和NotI消化質(zhì)粒pBEST501(Itaya等人，1989，核酸研究(Nucleic Acids Research)174410)，用T4 DNA聚合酶I進行處理以產(chǎn)生平端，并進行瓊脂糖凝膠純化以分離包含新霉素抗性標(biāo)記的片段。將經(jīng)凝膠純化的片段與經(jīng)BalI消化的質(zhì)粒連接在一起，并轉(zhuǎn)化到DH5α中。在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。將選擇的轉(zhuǎn)化體點接到添加50μg/ml新霉素的LB平板上，以鑒定新霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由一些新霉素抗性轉(zhuǎn)化體純化質(zhì)粒DNA，并用BglI進行消化(因新霉素抗性基因引入了額外的BglI位點而切割兩次)，在4kb范圍內(nèi)產(chǎn)生兩種片段，并用BamHI進行消化(預(yù)測只在SAVINASETM蛋白酶基因下游切割一次)，產(chǎn)生大約8kb的片段。鑒定了這樣的一個質(zhì)粒，命名為pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(圖8)。實施例9“共有”amyQ啟動子的構(gòu)建將下面兩種寡核苷酸在一起退火，并用Klenow片段延伸產(chǎn)生在amyQ啟動子的-10和-35區(qū)(以粗體字母標(biāo)明)中包含突變(*)的68bp雙鏈片段SOE ** *5＇-GGAATAAAGGGGGGTTGACATTATTTTACTGATATGTATAATAT-3＇(SEQ IDNO.15)SacI3＇-AATAAAATGACTATACATATTATATTAAACATATTCTTTTACCTCGAG-5＇(SEQ ID NO.16)使用下面兩種引物通過PCR產(chǎn)生包含amyQ啟動子上游區(qū)137bp的第二種雙鏈片段SfiI5＇-GGCCTTAAGGGCCTGCA-3＇(SEQ ID NO.17)SOE5＇-TGTCAACCCCCCTTTATTCCTT-3＇(SEQ ID NO.18)然后通過傳統(tǒng)的SOE(交疊延伸剪接)PCR法將這兩種雙鏈DNA片段融合在一起，產(chǎn)生命名為“共有”amyQ的突變型amyQ啟動子。SOE交疊區(qū)標(biāo)有下劃線。在SOE反應(yīng)中用于獲得全長片段的引物如下SfiI5＇-GGCCTTAAGGGCCTGCA-3＇(SEQ ID NO.17)SacI5＇-GAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATAT-3＇(SEQ ID NO.19).
SOE反應(yīng)(50μl)由下列成份組成50ng 68bp SOE片段和50ng137bp SOE片段、1x Taq聚合酶緩沖液、200μM每種dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和2.5U Taq DNA聚合酶。條件是第一個循環(huán)95℃ 3min；30個循環(huán)95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min；第3個循環(huán)后加入上述兩種引物每種各50pmol，在剩余27個循環(huán)中擴增185bp的啟動子片段；最后一個循環(huán)72℃ 5min。
依照制造商的指示，將大約185bp的PCR產(chǎn)物直接亞克隆到pCRII載體中，并使用正向和反向M13測序引物通過DNA測序確認(rèn)產(chǎn)生了pCRII-Pr“共有”amyQ。
amyQ啟動子的完整序列(包括側(cè)翼限制性位點)顯示于圖9(SEQ IDNO20)。將下列突變引入含野生型amyQ啟動子(SEQ ID NO20)的核酸序列，以產(chǎn)生“共有”amyQ啟動子(SEQ ID NO21)SEQ ID NO20中位于-35區(qū)第135和136位(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點)的T和T分別變成A和C，位于-10區(qū)第156位的A變成T。如圖9(SEQ ID NO22)所示，在-35區(qū)上游大約20bp，位于第116位的T無意中變成了A。該變化顯然對啟動子功能沒有有害影響，因為它可以由關(guān)鍵的-10和-35區(qū)除去。實施例10短“共有”amyQ啟動子-SAVINASETM基因表達盒的構(gòu)建使用如下寡核苷酸引物由pCRII-Pr“共有”amyQ通過PCR擴增短“共有”amyQ啟動子5＇-GGCCTTAAGGGCCTGCTGTCCAGACTGTCCGCT-3＇(SEQ ID NO.23)5＇-GAGCTCCATTTTCTTATACAAATTATAT-3＇(SEQ ID NO.19)擴增反應(yīng)(100μl)由下列成份組成50ng pCRII-Pr“共有”amyQ、50pmol每種引物、1x Taq聚合酶緩沖液、200μM每種dATP、dTTP、dGTP、和dCTP、和1.0U Taq聚合酶。擴增條件是第一個循環(huán)95℃3min；30個循環(huán)95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min；最后一個循環(huán)72℃ 5min。
依照制造商的指示，將大約100bp的PCR產(chǎn)物克隆到pCRII載體中，產(chǎn)生pCRII-Pr短“共有”amyQ，并使用正向和反向M13測序引物通過DNA測序進行確認(rèn)。
用SfiI和SacI消化pCRII-Pr短“共有”amyQ，并通過凝膠電泳分離包含啟動子的大約100bp片段。用SfiI和SacI消化pHP13amp-SAV，并通過凝膠電泳分離大約6430bp的載體片段。將經(jīng)純化片段連接在一起，用該連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL1801 spoIIE∷Tn9l7，并在添加5μg/ml氯霉素的胰蛋白示血瓊脂基(TBAB)平板上選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由在添加1％脫脂奶粉的TBAB平板上產(chǎn)生透明圈的氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體純化命名為pHP13amp-Pr短“共有”amyQ/SAV的質(zhì)粒。通過SfiI和BamHI消化確認(rèn)質(zhì)粒。
用SfiI和BamHI消化pHP13amp-Pr短“共有”amyQ/SAV，并通過凝膠電泳分離包含Pr短“共有”amyQ/SAV盒的大約1330pb片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCS，并通過凝膠電泳分離大約6040pb的載體片段。將經(jīng)純化片段連接在一起，用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體之一純化命名為pDG268MCS-Pr短“共有”amyQ/SAV(
圖10)的質(zhì)粒。通過SfiI和BamHI消化及隨后的凝膠電泳進行確認(rèn)。實施例11串聯(lián)短“共有”amyQ-cryIIIA啟動子-cryIIIA mRNA穩(wěn)定序列-SAVINASETM基因表達盒的構(gòu)建用SfiI和BamHI消化pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并通過凝膠電泳分離大約6780pb的載體片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCS-Pr短“共有”amyQ/SAV，并通過凝膠電泳分離大約1300pb的表達盒片段。將經(jīng)純化片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體之一純化出命名為pDG268MCSΔneo-Pr短“共有”amyQ/SAV(
圖10)的質(zhì)粒，并通過NcoI消化及隨后的凝膠電泳進行確認(rèn)。
用SfiI消化pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV，用Klenow片段處理以產(chǎn)生平端，并用DraIII進行消化。通過凝膠電泳分離大約7060bp的載體片段。用Ecl136II和DraIII消化pDG268MCSΔneo-Pr短“共有”amyQ/SAV，并通過凝膠電泳分離包含短“共有”amyQ啟動子的大約1540bp片段。將經(jīng)純化片段連接在一起，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體之一純化出命名為pDG268MCSΔneo-Pr短”共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(
圖11)的質(zhì)粒，并通過NcoI消化及隨后的凝膠電泳進行確認(rèn)。實施例12pCAsub3Δ-Pr短“共有”amyQ/cryIIIA/SAV的構(gòu)建用SacI和SalI消化質(zhì)粒p2419MCS5-cat(98/22598)，并用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段和dNTP處理以產(chǎn)生平端。使用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)凝膠純化大約4240bp的載體片段，并用T4 DNA連接酶進行處理。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。由氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體之一純化出命名為p2419catΔ的質(zhì)粒，并使用實施例1中所述相同方法通過DNA測序進行確認(rèn)。
使用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA分離方案，由枯草芽孢桿菌A164分離基因組DNA。將下文所示寡核苷酸引物3和4用于由枯草芽孢桿菌A164基因組DNA通過PCR擴增amyE基因的片段。引物3引入了NotI位點，而引物4引入了Asp718位點。引物35＇-GCGGCCGCGATTTCCAATGAG-3＇(SEQ ID NO.24)引物45＇-GGTACCTGCATTTGCCAGCAC-3＇(SEQ ID NO.25)如實施例1所述進行PCR。使用TOPO TA克隆試劑盒，依照制造商的指示，克隆PCR產(chǎn)物。使用QIAprep8質(zhì)粒試劑盒，依照制造商的指示，由大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。通過使用酶EcoRI的限制性分析鑒定包含預(yù)期插入片段的質(zhì)粒，并命名為pCR2.1-amyE。
用NotI和Asp718消化p2419catΔ，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化大約4240bp的載體片段。用NotI和Asp718消化pCR2.1-amyE，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化大約805bp的amyE片段。使用快速DNA連接試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)連接經(jīng)純化片段。用該連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。使用QIAprep8質(zhì)粒試劑盒，依照制造商的指示，由大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。通過使用酶NotI的限制性分析鑒定包含預(yù)期插入片段的質(zhì)粒，并命名為pCAsub3。
用BaHI和SphI消化pCAsub3以除去amyE片段，并用T4 DNA聚合酶及dNTP處理以產(chǎn)生平端。使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化大約4140bp的載體片段，并用T4 DNA連接酶進行處理(恢復(fù)BamHI位點)。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。使用QIAprep8質(zhì)粒試劑盒，依照制造商的指示，由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。鑒定缺乏amyE片段的質(zhì)粒，并命名為pCAsub3Δ。
用SfiI和BaHI消化pCAsub3Δ，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化大約4110bp的載體片段。用SfiI和BamHI消化pDG268MCSΔneo-Pr短“共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化包含Pr短“共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的大約1950bp片段。使用快速DNA連接試劑盒連接經(jīng)純化片段。用該連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并在添加100μg/ml氨芐青霉素的2x YT平板上選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。使用QIAprep8質(zhì)粒試劑盒，依照制造商的指示，由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。通過使用酶EcoRI的限制性分析鑒定包含預(yù)期插入片段的質(zhì)粒，并命名為pCAsub3Δ-Pr“短共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV(
圖12)。實施例13Pr“短共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/yxiM整合體的構(gòu)建用SacI和NotI消化pCAsub3Δ-Pr“短共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV以除去大部分SAVINASETM基因編碼區(qū)，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化大約5030bp的載體片段。用SacI和NotI消化pCR2.1-yxiM，并使用QIAquick凝膠純化試劑盒凝膠純化包含果膠乙酰酯酶基因的大約1180bp片段。使用快速DNA連接試劑盒連接經(jīng)純化片段。用該連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌PL1801 spoIIE∷Tn917，并在添加5μg/ml氯霉素的TBAB平板上選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體(Pr短“共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/yxiM盒大概整合于果膠乙酰酯酶基因座)。選擇這樣的一個整合體，并通過將整合體在添加漸高濃度至最大值60μg/ml氯霉素的TBAB平板上劃線來誘導(dǎo)整合DNA的串聯(lián)復(fù)制。該菌株命名為枯草芽孢桿菌MDT25。
使用實施例1中所述相同方法，由枯草芽孢桿菌MDT25分離基因組DNA。用枯草芽孢桿菌MDT25基因組DNA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌A164Δ5(WO98/22598)，并在添加5μg/ml氯霉素的TBAB平板上選擇氯霉素抗性整合體。分離這樣的一個整合體，命名為枯草芽孢桿菌MDT26。實施例14果膠乙酰酯酶的生產(chǎn)將枯草芽孢桿菌菌株MDT25和MDT26在裝有50ml乳桿菌MRS肉湯(Difco Laboratories，Detroit，MI)的250ml搖瓶中于37℃、250rpm培養(yǎng)28小時。通過于7000rpm離心5分鐘回收上清液。將上清液樣品在Novex SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA)上進行電泳，并通過考馬斯藍染色使蛋白質(zhì)條帶顯影。在兩份樣品中都看見對應(yīng)于成熟果膠乙酰酯酶預(yù)期大小(39kDal；第26-382位氨基酸)的蛋白質(zhì)的強帶。
將大約4.2μl粗制酶(10μg/ml)與0.5ml甜菜果膠(10mg/ml)或三醋精(50mM)(溶于Tris-HCl pH8.0緩沖液)在熱混儀中于30℃保溫15小時。使用Boehringer Mannheim酶聯(lián)醋酸測定試劑盒(Boehringer Mannheim GMbH，Mannheim，德國)，依照制造商建議的條件，測量醋酸釋放。結(jié)果顯示，酶制劑對甜菜果膠和三醋精有活性。實施例15重組果膠乙酰酯酶的純化和鑒定使用合適的碳源、氮源、和鹽類，將芽孢桿菌菌株MDT25在3升發(fā)酵罐(1300rpm)中于pH6.8-7.2、37℃培養(yǎng)48小時。使用GS-3轉(zhuǎn)頭和Sorvall RC-5B離心機(Dupont，Wilmington，Delaware)，將1.5升體積的全培養(yǎng)肉湯以6000rev/min離心30分鐘?；厥丈锨逡?，并再次離心30分鐘以除去任何沉淀物。首先將上清液濾過1.0μm GF/B Whatman濾紙(Whatman公司，F(xiàn)airfield，NJ)，隨后是Whatman 0.45μm PVDF注射濾器(Whatman公司，F(xiàn)airfield，NJ)，時時更換濾器?；厥樟丝傮w積1.0升的濾出上清液。將用水1∶2預(yù)稀釋使電導(dǎo)率達到6.0mS的20ml體積的上清液，進一步用120ml水稀釋使電導(dǎo)率達到1.47mS。將稀釋上清液濾過Millipore快速0.22μm濾器(Millipore，貝德福德，MA)。
使用大約60ml樹脂，在XK-26柱中制備Q-Sepharose Big Beads(Pharmacia Biotech公司，Piscataway，NJ)。用500ml 20mM Tris-HCl緩沖液pH8.0預(yù)先平衡柱子。然后將上清液樣品上樣到柱子上，隨后用20mM Tris-HCl緩沖液pH8.0清洗直至達到基線。進行0-0.50MNaCl/20mM Tris-HCl pH8.0的600ml梯度，流速5ml/min，120min。收集10ml級分和130ml流過液，并使用4.5mM醋酸對硝基苯酯(溶于100mMMOPS/4mM CaCl2，pH7.5)于25℃和405nm進行測定。在流過液中檢測到超過85％的總活性。還使用8-16％ Tris-甘氨酸凝膠(Novex，SanDiego，CA)通過SDS-PAGE電泳分析了活性級分和流過液。通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，流過液中純化蛋白質(zhì)的純度超過98％。根據(jù)NovexMark12 SDS-PAGE分子量標(biāo)準(zhǔn)(Novex，San Diego，CA)，純化果膠乙酰酯酶的SDS-PAGE揭示了大約40kDal分子量的主帶。
使用100mM三醋精(Sigma Chemical公司，St Louis，M0)(溶于20mM Tris-HCl pH8.0)于30℃ 10min測定活性，發(fā)現(xiàn)純化果膠乙酰酯酶也顯示對三醋精有活性。使用Boehringer Mannheim醋酸測定試劑盒，依照制造商建議的條件，改用96孔板，測量醋酸釋放。實施例16純化果膠乙酰酯酶的N末端測序在Applied Biosystems 476A型蛋白質(zhì)測序儀(PerkinElmer/Applied Biosystems Division，F(xiàn)oster City，CA)上，使用聯(lián)機HPLC和液相三氟乙酸(TFA)輸送，對如實施例15所述獲得的純化果膠乙酰酯酶進行N末端測序。使用Novex 8-16％ Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠，依照制造商建議的條件，對果膠乙酰酯酶制劑進行SDS-PAGE。在10％甲醇(溶于10mM CAPS pH11.0緩沖液)中于25伏2小時，將凝膠轉(zhuǎn)印跡至PVDF膜(Novex，San Diego，CA)。在0.1％考馬斯藍R250(溶于40％甲醇/1％醋酸)中將PVDF膜染色，并切下觀察到的條帶。使用測序試劑(Perkin Elmer/Applied BiosystemsDivision，F(xiàn)oster City，CA)，將由印跡筒切下的條帶測序。使用含3.5％四氫呋喃(溶于水與18ml含醋酸、醋酸鈉、和己烷磺酸鈉的預(yù)混濃縮液(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，F(xiàn)osterCity，CA))的緩沖液A和含乙腈的緩沖液B，通過聯(lián)機HPLC進行乙內(nèi)酰苯硫脲-氨基酸的檢測。收集數(shù)據(jù)，并在Macintosh IIsi計算機上使用Applied Biosystems 610數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。由操作員通過對光源比較層析圖來進行氨基酸鑒定。
40kDa切下條帶的N末端測序確定如下AEPKVYQFDFGSGSMEPGYIGVRASD(SEQ ID NO.2)生物學(xué)材料的保藏根據(jù)布達佩斯條約的條款，下列生物學(xué)材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物收藏中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection)，北方地區(qū)研究中心(Northern RegionalResearch Center)，大學(xué)街1815號(1815 University Street)，Peoria，伊利諾斯州(Illinois)，61604，并給予下列編號保藏物編號保藏日期大腸桿菌MDT28(pCR2.1-yxiM) NRRL B-30151 1999年6月30日該菌株已經(jīng)進行了保藏，在該專利申請的待審期內(nèi)，保證根據(jù)37C.F.R. §1.14和35 U.S.C. §122授權(quán)的專利和商標(biāo)委員會所確定的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物代表了保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本或其后續(xù)申請的國家中，可以按照該國專利法的要求提供該保藏物。但是，應(yīng)當(dāng)明白保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對以侵犯由政府行為授予的專利權(quán)來實施本發(fā)明的許可。
本文描述和要求的發(fā)明不應(yīng)限制于此處公開的具體實施方案的范圍之內(nèi)，因為這些實施方案意欲作為本發(fā)明幾個方面的例示。任何等同的實施方案意欲屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言，除了本文所示和所述以外對本發(fā)明的多種更改是顯而易見的。這些更改也意欲屬于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。若有抵觸，以本公開書(包括定義)為準(zhǔn)。
本文引用了多處參考文獻，完整收入作為參考。
序列表<110>Thomas，Michael D.
Brown，Kimberly M.<120>具有果膠乙酰酯酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸<130>5952.204-WO<140>PCT/US00/23521<141>2000-08-25<150>09/384,305<151>1999-08-26<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1149<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>1atgaaaaaat ggatggcagc ggtttttgtg atgatgctga tgctgtgttt tggcgggatt 60gagaatgtga aggcggcgga gccgaaggtg tatcagtttg actttggaag cggttcgatg120gagcctggtt atattggtgt cagggcgtct gatcggtatg accggtcaaa gggctacggt180tttcaaacac cggagaatat gagggatgtg gcggcatccg gggctggtgt gaagagtgat240gcggttcagt ttttagcgta tgggacgaaa agcaataaca cgtttaatgt tgatctcccg300aatggccttt atgaggtgaa ggtgacgctt ggcaatacgg caagggccag tgtggcagcg360gagggcgtgt ttcaggtcat caatatgaca ggggatggcg cggaggatac gttccaaatt420cccgtcaccg acgggcagct gaatctcctg gtgacagagg gaaaggcagg caccgctttt480acgctcagcg ccttgaaaat aaagaaattg tctgatcagc cggtaacgaa tcgaaccatt540tatgtcggcg gcgactcgac ggtgtgcaat tattatccgc tcaacagcag caagcaggcg600ggctgggggc agatgctgcc tcactatatc gataaacaca cctttcaagt gagaaacatg660gcgtctggcg ggcagatcgc gagagggttc agaaatgatg gacagcttga ggcgattctg720aagtatatta aacccggaga ttattttatg ttgcagcttg gcattaatga cacaaatccg780aagcataaag aatctgaagc ggagtttaaa gaggtgatgc gtgatatgat tcgtcaggta840aaagcgaaag gagcggacgt catcctatca acgcctcagg gccgggcaac cgattttact900tctgaaggca tccattcgtc tgtaaacaga tggtacaggg cctctatttt agctttggcc960gaagaggaaa aaacatatct cattgactta aatgtcctca gctcggcata ctttacatcg1020atcggtccgg aaagaacact cgggctttat atggatggag atacgctgca cccgaatcgc1080gcgggggccg acgcactggc gcgattggct gttcaggagc taaaacgcca gggaatcgct1140ggcttttaa1149<210>2<211>382<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>2Met Lys Lys Trp Met Ala Ala Val Phe Val Met Met Leu Met Leu Cys15 10 15Phe Gly Gly Ile Glu Asn Val Lys Ala Ala Glu Pro Lys Val Tyr Gln20 25 30Phe Asp Phe Gly Ser Gly Ser Met Glu Pro Gly Tyr Ile Gly Val Arg35 40 45Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Ser Lys Gly Tyr Gly Phe Gln Thr Pro50 55 60Glu Asn Met Arg Asp Val Ala Ala Ser Gly Ala Gly Val Lys Ser Asp65 70 75 80Ala Val Gln Phe Leu Ala Tyr Gly Thr Lys Ser Asn Asn Thr Phe Asn85 9095Val Asp Leu Pro Asn Gly Leu Tyr Glu Val Lys Val Thr Leu Gly Asn100 105 110Thr Ala Arg Ala Ser Val Ala Ala Glu Gly Val Phe Gln Val Ile Asn115 120 125Met Thr Gly Asp Gly Ala Glu Asp Thr Phe Gln Ile Pro Val Thr Asp130 135 140Gly Gln Leu Asn Leu Leu Val Thr Glu Gly Lys Ala Gly Thr Ala Phe145 150 155 160Thr Leu Ser Ala Leu Lys Ile Lys Lys Leu Ser Asp Gln Pro Val Thr165 170 175Asn Arg Thr Ile Tyr Val Gly Gly Asp Ser Thr Val Cys Asn Tyr Tyr180 185 190Pro Leu Asn Ser Ser Lys Gln Ala Gly Trp Gly Gln Met Leu Pro His195 200 205Tyr Ile Asp Lys His Thr Phe Gln Val Arg Asn Met Ala Ser Gly Gly210 215 220Gln Ile Ala Arg Gly Phe Arg Asn Asp Gly Gln Leu Glu Ala Ile Leu225 230 235 240Lys Tyr Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Phe Met Leu Gln Leu Gly Ile Asn245 250 255Asp Thr Asn Pro Lys His Lys Glu Ser Glu Ala Glu Phe Lys Glu Val260 265 270Met Arg Asp Met Ile Arg Gln Val Lys Ala Lys Gly Ala Asp Val Ile275 280 285Leu Ser Thr Pro Gln Gly Arg Ala Thr Asp Phe Thr Ser Glu Gly Ile290 295 300His Ser Ser Val Asn Arg Trp Tyr Arg Ala Ser Ile Leu Ala Leu Ala305 310 315 320Glu Glu Glu Lys Thr Tyr Leu Ile Asp Leu Asn Val Leu Ser Ser Ala325 330 335Tyr Phe Thr Ser Ile Gly Pro Glu Arg Thr Leu Gly Leu Tyr Met Asp340 345 350Gly Asp Thr Leu His Pro Asn Arg Ala Gly Ala Asp Ala Leu Ala Arg355 360 365Leu Ala Val Gln Glu Leu Lys Arg Gln Gly Ile Ala Gly Phe370 375 380<210>3<211>51<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>3cgagctctat aaaaatgagg agggaaccga atgaaaaaat ggatggcagc g51<210>4<211>29<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>4gcggccgctt aaaagccagc gattccctg 29<210>5<211>54<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>5aattggcctt aagggcccgg gacgtcaagc ttatcgatgc ggatccgcgg ccgc 54<210>6<211>51<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>6ccggaattcc cgggccctgc agttcgaata gctacgccta ggcgccggcg c 51<210>7<211>58<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>7agctaggcct taagggcccg ggacgtcgag ctcaagcttg cggccgccat ggtcgacg 58<210>8<211>58<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>8tccggaattc ccgggccctg cagctcgagt tcgaacgccg gcggtaccag ctgcttaa 58<210>9<211>37<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>9ctccgggccc atctgagctc tataaaaatg aggaggg 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1.選自下組的具有果膠乙酰酯酶活性的分離多肽(a)具有與SEQ ID NO2成熟多肽的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸的替代、刪除、和/或插入的變體；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)(a)、(b)、或(d)的具有果膠乙酰酯酶活性的片段。
2.權(quán)利要求1的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少80％同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少90％同一性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6任一項的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-7任一項的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段構(gòu)成。
9.權(quán)利要求8的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成。
10.權(quán)利要求9的多肽，其由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成。
11.權(quán)利要求1的多肽，其由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
12.權(quán)利要求11的多肽，其由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
13.權(quán)利要求1的多肽，其由在中嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
14.權(quán)利要求13的多肽，其由在中嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
15.權(quán)利要求1的多肽，其由在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
16.權(quán)利要求15的多肽，其由在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，或(ii)(i)的互補鏈發(fā)生雜交的核酸序列編碼。
17.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽是具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸的替代、刪除、和/或插入的變體。
18.權(quán)利要求1的多肽，其由大腸桿菌NRRL B-30151中所含質(zhì)粒pCR2.1-yxiM所含核酸序列編碼。
19.權(quán)利要求1-18任一項的多肽，其具有SEQ ID NO2的果膠乙酰酯酶活性的至少20％。
20.與權(quán)利要求1-19任一項的多肽具有相同果膠乙酰酯酶活性的多肽。
21.包含編碼權(quán)利要求1-20任一項所述多肽的核酸序列的分離核酸序列。
22.包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一處突變的核酸序列的分離核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽。
23.如下產(chǎn)生的分離核酸序列(a)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離核酸序列。
24.如下產(chǎn)生的權(quán)利要求23的分離核酸序列(a)在中嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離核酸序列。
25.如下產(chǎn)生的權(quán)利要求24的分離核酸序列(a)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100個核苷酸的(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離核酸序列。
26.包含權(quán)利要求21的核酸序列以及與之可操作連接的在合適表達宿主中指導(dǎo)多肽生成的一種或多種控制序列的核酸構(gòu)建物。
27.包含權(quán)利要求26的核酸構(gòu)建物的重組表達載體。
28.包含權(quán)利要求26的核酸構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞。
29.用于生成突變型核酸序列的方法，包括(a)在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中引入至少一處突變，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽；并(b)回收突變型核酸序列。
30.由權(quán)利要求29的方法產(chǎn)生的突變型核酸序列。
31.用于生成多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)包含權(quán)利要求30的編碼多肽的突變型核酸序列的菌株以產(chǎn)生包含該多肽的上清液；并(b)回收多肽。
32.用于生成權(quán)利要求1-20任一項的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)菌株以產(chǎn)生包含多肽的上清液；并(b)回收多肽。
33.用于生成權(quán)利要求1-20任一項的多肽的方法，包括(a)在適合于生成多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建物的宿主細(xì)胞，其中核酸構(gòu)建物包含編碼多肽的核酸序列；并(b)回收多肽。
34.用于生成多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一處突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸構(gòu)成的多肽；并(b)回收多肽。
35.用于生成突變型細(xì)胞的方法，包括破壞或刪除編碼權(quán)利要求1-20任一項的多肽的核酸序列或其控制序列，導(dǎo)致突變體生成的多肽比親本細(xì)胞少。
36.由權(quán)利要求35的方法產(chǎn)生的突變體。
37.權(quán)利要求36的突變體，其中還包含編碼異源蛋白的核酸序列。
38.用于生成異源多肽的方法，包括(a)在有益于生成多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求37的突變體；并(b)回收多肽。
39.包含編碼蛋白質(zhì)的基因并可操作連接編碼信號肽、由SEQ IDNO1的第1-75位核苷酸構(gòu)成的核酸序列的核酸構(gòu)建物，其中所述基因?qū)τ谠摵怂嵝蛄卸允峭鈦淼摹?br> 40.包含權(quán)利要求39的核酸構(gòu)建物的重組表達載體。
41.包含權(quán)利要求39的核酸構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞。
42.用于生成蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于蛋白質(zhì)生成的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求41的重組宿主細(xì)胞；并(b)回收蛋白質(zhì)。
43.用于降解果膠物質(zhì)的方法，包括在適合于降解果膠物質(zhì)的條件下使果膠物質(zhì)接觸有效量的包含合適載體和權(quán)利要求1-20任一項的一種或多種多肽的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有果膠乙酰酯酶活性的分離多肽，和編碼多肽的分離核酸序列。本發(fā)明還涉及包含核酸序列的核酸構(gòu)建物、載體、和宿主細(xì)胞，以及生成和使用多肽的方法。
文檔編號C12N9/18GK1399683SQ00813396
公開日2003年2月26日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月26日
發(fā)明者M·D·托馬斯, K·M·布朗 申請人:諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司