專利名稱：測定植酸酶活性的方法
專利說明測定植酸酶活性的方法 本發(fā)明涉及分析植酸酶活性的方法，涉及在此方法中一類芳香磷酸酯/鹽化合物的應(yīng)用，涉及實(shí)施此方法的試劑盒，并涉及可用于此方法的全新化合物和組合物。
植酸酯是谷類和豆類中磷的重要儲存形式。然而，單胃動物，如豬、家禽和魚不能代謝或吸收植酸酯(或植酸)，因此將其排泄出來導(dǎo)致高密度家畜生產(chǎn)區(qū)域的磷污染。而且，植酸也通過與如鈣、銅和鋅等金屬螯合成為單胃動物體內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)劑。
為這些動物的生長和健康提供足夠的磷而在其飼料中添加了無機(jī)磷酸鹽。如此添加成本高，并且進(jìn)一步增加了污染問題。
植酸酯被植酸酶轉(zhuǎn)化，該酶通常催化植酸酯水解為低肌醇-磷酸酯和無機(jī)磷酸鹽。植酸酶可用作動物飼養(yǎng)的添加劑來提高有機(jī)磷對動物的可用性并降低對環(huán)境的磷污染(Wodzinski R.J.，Ullah A.H.，Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。
文獻(xiàn)中已對真菌中的一些植酸酶(Wyss M.et al.Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)；Berka R.M.et al.Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.et al.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和細(xì)菌中的一些植酸酶(Greiner R.et al Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo et al.Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.et al.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.et al.Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.et al.Enzyme andmicrobial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.et al.FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))進(jìn)行了描述。
已知的在溶液中分析植酸酶的方法是基于對酶-催化水解反應(yīng)中，從植酸釋放的正磷酸鹽的檢測。磷酸鹽通常在硫酸中與鉬酸鹽反應(yīng)后，通過分光光度檢測(例如Heinonen J.K.，Lahti R.J.Anal.Biochem.113，313-317(1981))。此方法靈敏但需要使用腐蝕性試劑(硫酸)和易燃試劑(丙酮)，也不適用于分析粗植酸酶制品或含游離無機(jī)磷酸鹽的天然樣品中的植酸酶活性。而且，基于磷鉬酸鹽的方法不能用于檢測生長在固體培養(yǎng)基上的活微生物菌落的植酸酶活性。
這樣的“板上”分析對分離和開發(fā)產(chǎn)植酸酶的微生物菌株特別有用?，F(xiàn)有技術(shù)中已有大量開發(fā)用于檢測植酸酶活性的“板上”技術(shù)的嘗試?；谌芙獠蝗苄灾菜猁}的方法(Shieh TR and Ware JH.Appl.Microbiol.16(9)1348-1351(1968)；Bae HD et al.J.Microbiol.Methods.39，17-22(1999))不但不靈敏而且受限于微生物生長期間培養(yǎng)基酸化產(chǎn)生的假陽性信號。基于刺激其中植酸為唯一磷源的營養(yǎng)板上的磷酸依賴性、無植酸酶的報告基因細(xì)菌的生長的方法(Chen JC.Biotechnology techniques 12(10)759-761(1998))緩慢并且分辨率一貫不佳，原因是檢測細(xì)菌生長需要長期培養(yǎng)使得磷酸酯擴(kuò)散。
相反，在含有過量無機(jī)磷酸鹽和/或在固體微生物營養(yǎng)基表面上檢測磷酸酶活性是簡單而高效的?；陲@色磷酸酶底物，如α-萘基磷酸酯、對硝基苯基磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯的方法是本領(lǐng)域已知的，并且這些底物均可購得(例如，購自Sigma-Aldrich)。然而，這些底物與植酸酶的作用均不令人滿意。
仍未解決的問題是提供可用于檢測活微生物菌落和粗植酸酶制品的植酸酶活性的分析方法。
另一個仍未解決的問題是提供可用于檢測植酸酶活性的分析方法，其不使用腐蝕性試劑和/或易燃試劑。
本發(fā)明致力于/減少現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中植酸酶活性的方法，其包括 i)將所述樣品與植酸酶底物結(jié)合，以及 ii)測量所述植酸酶底物的有機(jī)代謝物的水平。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中植酸酶活性的試劑盒，其包括植酸酶底物和顯示試劑。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供了包括芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)的化合物作為植酸酶底物的應(yīng)用。
根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供了包括芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)的化合物在檢測酶活性方法中的應(yīng)用。
根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供了如下所述的分子式(I)的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12鹵代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任何一對或多對與其連接的碳原子一起形成飽和、不飽和或芳香的C3-12碳環(huán)或雜環(huán)； 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少兩個是OPO3H2或其鹽形式。
根據(jù)第六方面，提供了包括植酸酶底物和顯示試劑的組合物。
為引用的簡便，本發(fā)明這些和其他方面通過合適的章節(jié)標(biāo)題來討論。然而，在每一章節(jié)內(nèi)所教導(dǎo)的內(nèi)容不必限制在該具體章節(jié)內(nèi)。
植酸酶活性 在此使用的術(shù)語“植酸酶活性”是指樣品催化植酸酯(肌醇六磷酸酯)分解產(chǎn)生無機(jī)磷(例如正磷酸鹽)的能力。在此使用的術(shù)語植酸酶包括根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟的命名委員會分類的3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、4-植酸酶(也指6-植酸酶，E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(E.C.3.1.3.72)。優(yōu)選的植酸酶是3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、4-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(E.C.3.1.3.72)。
在廣泛的意義下，因?yàn)槠浯呋肆姿狨ユI的裂解，所以植酸酶代表了磷酸酶的一種亞型。然而，在此使用的術(shù)語“磷酸酶”是指能夠裂解磷酸酯鍵的酶，其對除植酸外的底物具有選擇性。然而，技術(shù)人員能認(rèn)識到植酸酶具有一定程度的磷酸酶活性；反過來，磷酸酶具有一定程度的植酸酶活性。
樣品 在此使用的術(shù)語“樣品”是指用于確定植酸酶活性存在與否的物質(zhì)。這樣的樣品的實(shí)例包括發(fā)酵肉湯的提取物、純化的酶制品、微生物培養(yǎng)物(包括在板上和在溶液中)等。
植酸酶底物 在此使用的術(shù)語“植酸酶底物”是指能夠被植酸酶催化的反應(yīng)所轉(zhuǎn)化從而產(chǎn)生代謝物的化合物。
優(yōu)選地，植酸酶底物不是植酸酯/鹽。
優(yōu)選地，植酸酶底物能夠被植酸酶催化的反應(yīng)所轉(zhuǎn)化從而產(chǎn)生如下描述的有機(jī)代謝物。
優(yōu)選地，植酸酶底物包括芳香基團(tuán)。
在此使用的“芳香基團(tuán)”是指具有單環(huán)(例如苯基)或多個縮合(稠合)環(huán)(例如萘基或蒽基)的不飽和芳香碳環(huán)或雜環(huán)基團(tuán)，其具有5至14個碳原子，優(yōu)選6至14個碳原子。優(yōu)選的芳基基團(tuán)包括苯基、萘基等。在此使用的“雜芳基”是指單環(huán)或雙環(huán)的芳香基團(tuán)，其具有1至6個碳原子并在至少一個環(huán)(如果多于一個環(huán)的話)內(nèi)具有1至4個選自氧、氮和硫的雜原子。
這樣的雜芳基基團(tuán)可具有單環(huán)，例如吡啶基、吡咯基或呋喃基，或者多個稠環(huán)，例如吲哚基、吲哚嗪基(indolizinyl)、苯并呋喃基或苯并噻嗯基。優(yōu)選的雜芳基包括吡啶基、吡咯基和呋喃基。
優(yōu)選地，芳香基團(tuán)是碳環(huán)芳香基團(tuán)。更優(yōu)選地，芳香基團(tuán)是苯基或萘基。最優(yōu)選地，芳香基團(tuán)是苯基。
優(yōu)選地，植酸酶底物包括含一個或多個含磷基團(tuán)。合適的含磷基團(tuán)是磷酸酯/鹽、亞磷酸酯/鹽、硫代磷酸酯/鹽、膦酸酯及其鹽形式、其鹵代物和烷基衍生物。優(yōu)選的含磷基團(tuán)是磷酸酯-OPO3H2及其鹽形式。合適的鹽形式包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽和銨鹽。
優(yōu)選地，植酸酶底物包括多個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括至少3個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括至少4個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括至少5個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括至少6個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括6個含磷基團(tuán)。
在替代的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，植酸酶底物包括2個或3個含磷基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物包括3個含磷基團(tuán)。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，植酸酶底物包括芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)。
在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，植酸酶底物具有分子式(I)
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H、C1-12烷基、C1-12環(huán)烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12鹵代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任何一對或多對與其連接的碳原子一起形成飽和、不飽和或芳香的C3-12碳環(huán)或雜環(huán)； 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少2個是OPO3H2或其鹽形式。
在此使用的烷基是指脂肪烴鏈并且包括例如1至6個碳原子的直鏈和支鏈，如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、n-戊基、異戊基、新戊基、n-己基和異己基。
鹵素、鹵代物或鹵代是指碘、溴、氯、和氟。
在此使用的鹵代烷基是指如上所述烷基的至少一個氫原子被一個鹵素原子取代，并且包括全鹵代烷基(即，所有碳原子被鹵素原子取代的烷基)。優(yōu)選的鹵代烷基是三氟甲基和三氯甲基。
在此使用的雜環(huán)是指包括1至5個獨(dú)立選自N、S、O和P的雜原子的環(huán)結(jié)構(gòu)。
除非對本文中的芳基、雜芳基、碳環(huán)、雜環(huán)或環(huán)烷基另有限定性說明，否則這些基團(tuán)可任意地被1至5個獨(dú)立地選自如下構(gòu)成的組中的取代基所取代羥基、具有1至6個碳的酰氧基、具有1至6個碳的?；⒕哂?至6個碳的烷基、具有1至6個碳的烷氧基、具有2至6個碳的烯基、具有2至6個碳的炔基、具有1至6個碳的取代烷基、具有1至6個碳的取代烷氧基、具有1至6個碳的烯基、具有1至6個碳的取代炔基、氨基、被1個或2個具有1至6個碳的烷基取代的氨基、具有1至6個碳的氨?；?、具有1至6個碳的酰胺基、疊氮基、氰基、鹵素、硝基、具有1至6個碳的硫代烷氧基、具有1至6個碳的取代的硫代烷氧基、和三鹵代甲基。
在上述烷基、烯基、炔基、硫代烷氧基和烷氧基上的取代基包括鹵素、CN、OH和氨基。芳基上優(yōu)選的取代基包括具有1至6個碳的烷基、具有1至6個碳的的烷氧基、鹵素、氰基、硝基、三鹵代甲基和具有1至6個碳的硫代烷氧基。
優(yōu)選地，植酸酶底物不含游離芳香OH基團(tuán)(一個OH基團(tuán)直接連接到芳香基團(tuán)上)。更優(yōu)選地，植酸酶底物不含選自O(shè)H、NH2、SH或烷氧基的芳香取代基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物不含具有電子供體特性的芳香取代基團(tuán)。更優(yōu)選地，植酸酶底物不含具有電子供體特性的取代基團(tuán)。
優(yōu)選地，R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H和OPO3H2，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少兩個是OPO3H2或其鹽形式。
優(yōu)選地，底物選自間苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸酯或其鹽形式。更優(yōu)選地，底物是間苯三酚三磷酸酯。
有機(jī)代謝物 在此使用的術(shù)語“有機(jī)代謝物”是指包括至少一個碳原子的上述植酸酶底物的植酸酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物。在某些例子中，有多于一個有機(jī)代謝物。
有機(jī)代謝物優(yōu)選地包括游離羥基(OH)基團(tuán)。有機(jī)代謝物更優(yōu)選地包括游離芳香OH基團(tuán)(OH基團(tuán)直接連接到芳香基團(tuán)上)。更優(yōu)選地，有機(jī)代謝物包括游離酚羥基(OH基團(tuán)直接連接到苯環(huán)上)。
特別優(yōu)選地，植酸酶底物不含游離芳香OH基團(tuán)，并且有機(jī)代謝物不含游離芳香OH基團(tuán)。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，芳基磷酸酯(II)是植酸酶底物。其可被植酸酶催化的反應(yīng)所轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的具有游離芳香OH的有機(jī)代謝物(III)。這描繪在方案1中。

方案1 其中“Ar”代表上述的芳香基團(tuán)。
當(dāng)植酸酶底物是間苯三酚三磷酸酯時，有機(jī)代謝物是間苯三酚二磷酸酯。當(dāng)植酸酶底物是苯五酚五磷酸酯時，有機(jī)代謝物是苯五酚四磷酸酯。當(dāng)植酸酶底物是苯六酚六磷酸酯時，有機(jī)代謝物是苯六酚五磷酸酯。
測量 有機(jī)代謝物的水平可通過任何合適的方法確定。這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員都是顯而易見的。
在此使用的術(shù)語“測量水平”包括檢測有機(jī)代謝物存在與否，例如通過觀察顏色變化。
合適測量技術(shù)包括 色譜技術(shù)，例如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層色譜(TLC)； 光譜技術(shù)，例如紅外光譜、紫外光譜、核磁共振譜(NMR)、熒光光譜、分光光度法，光度測定，吸收光譜和比色法； 顯示技術(shù)，例如檢測顏色改變或析出； 其他技術(shù)，例如重量測量。
在一個特別高度優(yōu)選的方法中，測量步驟包括使如上所述的有機(jī)代謝物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物。
在此使用的“有色產(chǎn)物”是指吸收400至800納米范圍內(nèi)電磁輻射的產(chǎn)物。其包括多于一個組分。
有機(jī)代謝物以此方式轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物具有特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠淇梢酝ㄟ^視覺、比色、照相、光度或分光光度確定植酸酶活性的存在和水平。
顯示試劑 在此使用的術(shù)語“顯示試劑”是指能夠與上述有機(jī)代謝物反應(yīng)從而產(chǎn)生如上所述的有色產(chǎn)物的任何試劑或試劑組合物。
優(yōu)選地，顯示試劑能夠與有機(jī)代謝物反應(yīng)從而產(chǎn)生有色產(chǎn)物并且與植酸酶底物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；即是說，在正常條件下其僅與代謝物發(fā)生反應(yīng)。
優(yōu)選地，顯示試劑與含游離OH基團(tuán)的化合物反應(yīng)從而產(chǎn)生有色產(chǎn)物。更優(yōu)選地，顯示試劑與含游離芳香OH基團(tuán)的化合物反應(yīng)從而產(chǎn)生有色產(chǎn)物。最優(yōu)選地，顯示試劑與酚化合物反應(yīng)從而產(chǎn)生有色產(chǎn)物。
在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，顯示試劑能夠參與和酚化合物的親電取代反應(yīng)。更優(yōu)選地，該試劑包括重氮鹽(包含-N≡N+基團(tuán)的化合物)。更加優(yōu)選地，顯示試劑包括選自色鹽(Fast Salts)組的重氮鹽，包括固紫鹽(FastViolet salt，特別是固紫B)、固黑鹽(特別是固黑K)、固藍(lán)鹽(特別是固藍(lán)B)。更加優(yōu)選地，顯示試劑包括固藍(lán)B。最優(yōu)選地，顯示試劑包括固藍(lán)B和醋酸鈉。
在可替代的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，顯示試劑包括氧化還原指示劑。在此使用的術(shù)語“氧化還原指示劑”是指能夠參與酚化合物的氧化還原(還原-氧化)反應(yīng)從而產(chǎn)生有色產(chǎn)物的試劑。特別優(yōu)選的氧化還原指示劑是氯化硝基四氮唑藍(lán)。更優(yōu)選地，氧化還原指示劑包括氯化硝基四氮唑藍(lán)和吩嗪甲基硫酸酯。
方法的實(shí)施 本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚有許多合適的技術(shù)可用于本發(fā)明的方法。以最廣泛的意思，將上述樣品與上述植酸酶底物結(jié)合。在此使用的“聯(lián)合”是指使植酸酶底物和樣品混合、聯(lián)合、雜和、接觸或其他允許反應(yīng)的方式，這樣在植酸酶底物轉(zhuǎn)化為有機(jī)代謝物的過程中，顯示出任何上述植酸酶活性。
本發(fā)明的方法可在溶液中進(jìn)行，例如在微生物反應(yīng)釜或微孔板。在此情況下，將包括樣品的溶液添加到含植酸酶底物的溶液或反之。技術(shù)人員能夠確定是否有必要添加例如緩沖液等的其它組分。
另外，本發(fā)明的方法可在固體支持物上進(jìn)行，例如微生物菌落生長在瓊脂平板上的情況。在此情況下，包括瓊脂平板的微生物菌落是樣品。此種情況下的植酸酶底物有利于通過簡單地用含植酸酶底物的溶液覆蓋平板的方法與樣品結(jié)合。
可在測量有機(jī)代謝物的水平前，將植酸酶底物和樣品聯(lián)合并溫育一定時間。另選地，可使植酸酶底物和樣品聯(lián)合并隨時間測量有機(jī)代謝物水平(即連續(xù)地測量)。
當(dāng)使用顯示試劑時，可在進(jìn)行此方法期間的任何時間點(diǎn)加入顯示試劑。例如，可將包括顯示試劑和植酸酶底物的組合物添加到樣品中。另選地，植酸酶底物可添加到含顯示試劑和樣品的組合物中。另外，可在樣品與植酸酶底物溫育一定時間后添加顯示試劑。
試劑盒 一方面，本發(fā)明涉及測定樣品中植酸酶活性的試劑盒，其包括植酸酶底物和顯示試劑。植酸酶底物和顯示試劑可在同一個組合物中，或者作為同時、依次或單獨(dú)使用的組分用在本發(fā)明的方法中。也可有其他組分，例如穩(wěn)定劑、緩沖液和防腐劑。
本發(fā)明的化合物 可根據(jù)以下反應(yīng)方案或其修改中描述的方法，使用易得的起始材料、試劑和常規(guī)合成步驟，方便地制備本發(fā)明的化合物。也能使用這些方法步驟的變體，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并在其已有技術(shù)范圍內(nèi)。
方案2顯示了從相應(yīng)酚化合物(IV)，通過受保護(hù)的中間產(chǎn)物(V)制備多磷酸酯化合物(VI)的通用方法，其中G代表了保護(hù)基團(tuán)。合適的保護(hù)基團(tuán)G易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，其包括芐基、三烷基硅烷基(trialkylsilyl)(特別是三甲基硅烷基和叔丁基二甲基硅烷基)以及C1-6烷基。

方案2 方案3顯示了從間苯三酚(VII)制備三磷酸間苯三酚(IX)。在這個反應(yīng)中，通過二芐基亞磷酸酯與四氯化碳反應(yīng)在原位產(chǎn)生二芐基氯磷酸酯。氫化受保護(hù)的中間產(chǎn)物(VIII)產(chǎn)生最終產(chǎn)物。

方案3


通過實(shí)施例及

的方式進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明 圖1顯示了使用三磷酸-間苯三酚的顯色反應(yīng)顯示的兩個粗酶制品的pH圖。上板-Citrobacter freundii來源的植酸酶，下板-Stenotropomonas tropophila來源的磷酸酶。兩板相鄰的行含有一系列雙倍稀釋的酶制品。列含有如實(shí)施例5中描述緩沖為不同pH的反應(yīng)混合物(每兩個相鄰列之間的增量是0.5pH值)。
圖2顯示了從土壤微生物混合群落里篩選產(chǎn)植酸酶微生物菌株。左板顯示了在醋酸纖維素濾膜表面上的微生物生長(從營養(yǎng)瓊脂平板移過來)。右板顯示了如實(shí)施例8中描述的用六磷酸-苯六酚染色后，同一平板下面的瓊脂。
圖3顯示了在幾個微生物分離物中，植酸酶/磷酸酶的檢測。14個從土壤來源的不同細(xì)菌分離物在營養(yǎng)瓊脂表面生長，并如實(shí)施例9中描述的用三磷酸-間苯三酚染色。
現(xiàn)在通過下述實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
縮寫 DMAP二甲基氨基吡啶； DIPEA二異丙基乙胺； Bn芐基； TPP三磷酸間苯三酚； OD光密度。
實(shí)施例 實(shí)施例1合成間苯三酚三磷酸酯(IX)
間苯三酚三磷酸酯(IX)使用Silverberg等的磷酸化方法(Tetrahedronletters 37，771-774(1996))從購得的間苯三酚而成得到。在多頸圓底燒杯內(nèi)，將間苯三酚(2.52g)溶解在355ml的無水乙腈中。反應(yīng)期間，通過持續(xù)的氮?dú)饬髋懦鰺恐械目諝?，并使用磁力攪拌儀連續(xù)攪動反應(yīng)混合液。使用冰鹽浴冷卻溶液到低于-10℃。向溶液中以如下順序加入四氯化碳(46g)、N，N-二異丙基乙胺(16.3g)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.75g)。緊接著，緩慢添加二芐基亞磷酸酯(23g)，這樣反應(yīng)混合液的溫度不會升高到-10℃以上。添加完二芐基亞磷酸酯后，反應(yīng)混合物在-10℃溫育1小時。此時，停止氮?dú)饬骱屠鋮s，并向反應(yīng)混合液中添加150ml 0.5M的KH2PO4水溶液。混合液用乙酸乙酯提取(3次，150ml)?；旌系囊宜嵋阴ヌ崛∫河盟?200ml)洗滌2次，用飽和NaCl(200ml)洗滌1次并用無水硫酸鈉干燥。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，所得產(chǎn)物溶解在75ml甲醇-四氫呋喃混合液(1∶1)中。添加1g鈀碳，氫在大氣壓下緩慢通過反應(yīng)混合液起泡，過夜。添加200ml水到反應(yīng)混合液中，并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。在降低的壓力下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除溶劑。根據(jù)HPLC分析，該產(chǎn)物是基本同質(zhì)的，HPLC分析使用了由AS50自動上樣儀、AS50熱外殼、GP50梯度泵和ED50電化學(xué)檢測器構(gòu)成的DionexDX-600系統(tǒng)(Dionex，Sunnyvale，CA)，其使用了lonPac AG11(2×50mm)保護(hù)柱、lonPac AS11-HC(2×250mm)分析柱和ATC-1陰離子捕獲柱，自生成抑制器設(shè)置為50mA。通過混合(A)200mM NaOH和(B)H2O0-5分鐘，40-80mMNaOH；5-40分鐘，80-135mM NaOH；40-42分鐘，135-140mM NaOH實(shí)現(xiàn)梯度譜。用CHROMELEON 6(Dionex)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理。
實(shí)施例2.苯六酚六磷酸酯(X)的合成
苯六酚通過Fatiadi等的方法合成(J.Res.Natl.Bur.Std.67A，153-62(1963))。1200g 30％水合乙二醛與6L含800g Na2SO3和300g NaHCO3的水溶液混合。向混合物通空氣，并對其緩慢加熱到約90℃。此時停止通風(fēng)，但繼續(xù)加熱直到開始沸騰。使反應(yīng)混合物緩慢冷卻到室溫。在冷卻中形成的結(jié)晶沉淀用100ml甲醇-水(1∶1)洗滌1次，100ml甲醇洗滌1次，并溶解在500ml熱的2.5M鹽酸內(nèi)。使用冰浴將溶液緩慢冷卻到室溫。四羥基對-苯醌的結(jié)晶沉淀用少量的冰冷水洗滌并重溶在500ml熱的2.5M鹽酸內(nèi)。向溶液中添加200g SnCl2*2H2O，再使其沸騰。向溶液中添加500ml濃鹽酸，溶液再次加熱到沸騰后再加1L濃鹽酸。冷卻時形成的粗苯六酚沉淀從1L含5g SnCl2的2.5M HCl中重結(jié)晶。制劑保存在真空脫氣器中的固體NaOH上。苯六酚基本如實(shí)施例1中描述的用二芐基氯磷酸磷酸化，不同在于使用了1.7g苯六酚并且在-10℃反應(yīng)1h后，另外進(jìn)行1h室溫溫育。使用在分析TPP中使用的同樣的HPLC方法確認(rèn)苯六酚六磷酸酯(X)的純度。
實(shí)施例3.其他多羥基苯的其他磷酸酯的合成 使用如在實(shí)施例1和2中描述的相同磷酸化方法可以合成芳香多酚的其他磷酸酯衍生物。合成苯五酚(Chem.Commun.(London)9，441(1967))、多種苯四酚和苯三酚(Dressier H.，and Hotter S.Poiyhydroxybenzenes.InEncyclopaedia of chemical technology(3rd edition)，Mark H.F.et al.，eds.JohnWiley&sons.Vol 18，pp.670-704(1982))的方法是已知的。幾種多羥基酚也可以購得。
實(shí)施例4.磷酸化的多羥基苯可作為植酸酶的底物 在微孔板中，在100μl反應(yīng)混合液中進(jìn)行酶學(xué)分析。酸性植酸酶和磷酸酶的反應(yīng)混合液包括10mM底物溶解在含0.8mM CaCl2的、pH5.5的200mM醋酸鈉緩沖液中。對堿性植酸酶和磷酸酶，使用同樣的條件，不同在于用pH7.5的200mM Tris*HCI緩沖液替換醋酸鈉緩沖液。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行1h，用已知方法的變型測定釋放出的磷酸鹽/酯(Heinonen J.K.，Lahti R.J.AnalBiochem.113(2)，313-317(1981))。簡單說，在每個微孔板的孔中，向100μl反應(yīng)混合液中添加200μl新鮮制備的AMM溶液(7.5N H2SO4、15mM鉬酸銨和丙酮-1∶1∶2)。在添加AMM試劑后的不早于10分鐘且不晚于30分鐘時間內(nèi)測量390nm處的吸收值。通過建立已知濃度磷酸酯/鹽溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定磷酸酯/鹽的量。
植酸酶和磷酸酶都催化磷酸酯的水解。這樣，這兩組酶之間的差別就是定量的，而非定性的，并且可以定義為對植酸酯和簡單的單磷酸酯(例如葡萄糖6-磷酸酯或果糖6-磷酸酯)水解的相對效率。磷酸酶水解植酸酯時趨于相對無效率，相反，大多數(shù)植酸酶水解單-取代糖磷酸酯時無效率。為測試多磷酸化的多羥基苯是否能用作植酸酯的模擬物，我們測試了幾種不同植酸酶和磷酸酶作用于六磷酸-苯六酚和果糖6-磷酸酯的磷酸酯釋放。Aspergillusniger(NatuphosR)、Escherichia coli(Phyzyme XPR)和Peniophoralycii(RonozymeR)來源的植酸酶以及土豆酸性磷酸酶在pH5.5進(jìn)行分析，而堿性細(xì)菌磷酸酶、小牛腸磷酸酶和蝦磷酸酶在pH7.5進(jìn)行分析。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(表1)證明苯六酚六磷酸酯對所有測試過的植酸酶來說是比果糖6-磷酸更好的底物，而對典型的磷酸酶，結(jié)果相反。相似地，間苯三酚三磷酸酯對于所有測試過的植酸酶是好的底物。然而，它不像苯六酚六磷酸酯那樣具有選擇性，因?yàn)樗鼘τ谒袦y試過的典型磷酸酶也是好的底物。
表1.以果糖6-磷酸酯和苯六酚六磷酸酯或間苯三酚三磷酸酯作為底物，不同酶的磷酸酯-釋放活性的比率 實(shí)施例5.使用間苯三酚三磷酸酯檢測液體分析中植酸酶或磷酸酶的活性 為在pH3-5.5范圍內(nèi)分析，100μl反應(yīng)混合液含2mM間苯三酚三磷酸酯，其溶于含0.8mM CaCl2的200mM醋酸鈉緩沖液中，將其添加到微孔板的孔中，并添加20μl的適當(dāng)稀釋的植酸酶或磷酸酶溶液?；旌弦涸?7℃溫育60分鐘，再添加50μl新鮮制備的含3mg/ml固藍(lán)B的、pH5.3的5M醋酸鈉溶液。在添加固藍(lán)B后10分鐘至20分鐘內(nèi)，分光光度(570nm)或照相記錄顏色發(fā)展。此檢測植酸酶/磷酸酶的方法也可用于比3-5.5更低或更高的pH值。在這種情況下，用其他合適的緩沖液替換醋酸鈉緩沖液。例如，甘氨酸*HCl可用于pH1.5-3的范圍，Tris-馬來酸鹽可用于pH6-9的范圍。圖3顯示了此方法如何用于植酸酶或磷酸酶的pH圖的快速評估。
實(shí)施例6.使用間苯三酚三磷酸酯檢測飼料樣品中添加的植酸酶的活性 飼料樣品以10-25％(w/v)懸浮于50mM甘氨酸/HCI，pH2.5，并在室溫攪動30分鐘。固體物質(zhì)澄清后，去除上清液，置于Eppendorf管內(nèi)并用1％(w/v)活性碳(Norit)處理。懸浮液在室溫下攪動10分鐘，并用10,000rpm離心1分鐘。去除100μl上清液，并在微孔板的孔內(nèi)與100μl含20mM間苯三酚三磷酸酯的250mM甘氨酸/HCl，pH2.5溶液混合。微孔板在37℃溫育60分鐘，再添加25μl含2.5mg/ml固藍(lán)B(Sigma D9805)的、pH5.3的5M醋酸鈉溶液。15-20分鐘后，光度測定或照相記錄顏色強(qiáng)度。
實(shí)施例7.使用苯六酚六磷酸酯檢測液體分析中植酸酶的活性 將100μl存在于200mM醋酸鈉緩沖液(含0.8mM CaCl2)中的反應(yīng)混合液(含2mM苯六酚六磷酸酯、1mg/ml氯化硝基四氮唑藍(lán)和0.02mg/ml吩嗪甲基硫酸酯)添加到微孔板的孔中，并添加20μl適當(dāng)稀釋的植酸酶或磷酸酶溶液?？煽吹疆a(chǎn)生了顏色，如果需要，則通過測量在570nm的OD來定量。
實(shí)施例8.使用苯六酚六磷酸酯檢測固體支持介質(zhì)上的植酸酶的活性 微生物菌落生長在覆蓋醋酸纖維素濾膜(type OE 67，Shleicher-Schüll)的營養(yǎng)平板表面。除去表面的濾膜，瓊脂用含2mM苯六酚六磷酸酯、1mg/ml氯化硝基四氮唑藍(lán)和0.02mg/ml吩嗪甲基硫酸酯的瓊脂糖溶液(0.7％)覆蓋。覆蓋染色瓊脂糖的平板在37℃下溫育直到產(chǎn)生顏色，最多1-2小時。營養(yǎng)瓊脂表面出現(xiàn)的暗斑對應(yīng)于分泌植酸酶活性的微生物菌落(圖2)。
實(shí)施例9.使用苯六酚六磷酸酯檢測固體支持介質(zhì)上的植酸酶和/或磷酸酶的活性 微生物菌落生長在營養(yǎng)平板的表面。一條濾紙(Whatman NO1)浸在其中含2mM間苯三酚三磷酸酯和1mg/ml固藍(lán)B的、pH5.5的200mM醋酸鈉緩沖液中，在紙巾上輕擦，置于皮式平板(Petri plate)的表面與微生物菌落接觸。在2-5分鐘內(nèi)，分泌植酸酶或磷酸酶的菌落周圍出現(xiàn)藍(lán)紫色，并在約30-60分鐘到達(dá)最高值。
所有在以上說明書中提到的文獻(xiàn)通過引用包括在本文內(nèi)。本發(fā)明方法和系統(tǒng)的多種修改和變體在不脫離本發(fā)明精神的情況下，對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。盡管本發(fā)明用特定的優(yōu)選具體實(shí)施方式
來描述，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)限制在這些特定的具體實(shí)施方式
中。實(shí)際上，對化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的實(shí)施本發(fā)明的所述方式的多種變體包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.檢測樣品中植酸酶的方法，其包括
i)將所述樣品與植酸酶底物結(jié)合，以及
ii)測量所述植酸酶底物的有機(jī)代謝物的水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植酸酶底物包括芳香基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述芳香基團(tuán)是苯基。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括至少一個含磷基團(tuán)。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括多個含磷基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含磷基團(tuán)是磷酸酯/鹽基團(tuán)。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物具有分子式(I)；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12鹵代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任意一對或多對與其所連接的碳原子一起形成飽和、不飽和或芳香的C3-122碳環(huán)或雜環(huán)；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少兩個是OPO3H2；
或其鹽形式。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H和OPO3H2，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少兩個是OPO3H2或其鹽形式。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一個是H。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述底物選自間苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸酯或其鹽形式。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述底物是苯六酚六磷酸酯或其鹽形式。
13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物不含游離羥基。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述有機(jī)代謝物具有游離羥基。
15.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述測量步驟ii)包括將代謝物與顯示試劑反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述顯示試劑選自氧化劑、還原劑和親電子試劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述顯示試劑包括重氮鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述重氮鹽是色鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述色鹽選自固紫B、固黑K和固藍(lán)B。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述顯示試劑包括氯化硝基四氮唑藍(lán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述顯示試劑進(jìn)一步包括吩嗪甲基硫酸酯。
22.測定樣品中植酸酶活性的試劑盒，其包括植酸酶底物和顯示試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的特征。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其包括苯六酚六磷酸酯、氯化硝基四氮唑藍(lán)和任選的吩嗪甲基硫酸酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其包括色鹽和如權(quán)利要求10所定義的化合物。
26.含有芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)的化合物作為植酸酶底物的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)所述的特征。
28.含有芳香基團(tuán)和多個磷酸酯/鹽基團(tuán)的化合物在檢測酶活性的方法中的應(yīng)用。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其中所述酶活性是磷酸酶或植酸酶活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的特征。
31.分子式(I)的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地選自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12鹵代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任意一對或多對與其所連接的碳原子一起形成飽和、不飽和或芳香的C3-12碳環(huán)或雜環(huán)；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少2個是OPO3H2；
或其鹽形式。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的化合物，其為間苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸或其鹽形式中的一種。
33.包括植酸酶底物和顯示試劑的組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的特征。
35.通過引用任一實(shí)施例而在此之前充分描述的方法。
36.通過引用任一實(shí)施例而在此之前充分描述的試劑盒。
37.通過引用任一實(shí)施例而在此之前充分描述的應(yīng)用。
38.通過引用任一實(shí)施例而在此之前充分描述的化合物。
39.通過引用任一實(shí)施例而在此之前充分描述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測樣品中植酸酶活性的方法，其包括將植酸酶底物與所述樣品聯(lián)合，并測量所述植酸酶底物的有機(jī)代謝水平。
文檔編號C12Q1/42GK101175861SQ200680017005
公開日2008年5月7日 申請日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月16日
發(fā)明者維賈伊·庫馬爾, 安德烈·米亞斯尼科夫 申請人:丹尼斯科有限公司