專利名稱：Dna接種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA接種的改進(jìn)，特別是(但不排除其它地)涉及接種哺乳動(dòng)物以防疾病狀態(tài)，涉及疫苗組合物和在藥物生產(chǎn)中使用某些化合物。
DNA疫苗通常由插入強(qiáng)病毒啟動(dòng)子編碼抗原肽的目的基因和聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列的細(xì)菌質(zhì)粒載體構(gòu)成。所述目的基因可以編碼整個(gè)蛋白質(zhì)或僅編碼涉及病原體、腫瘤或所要保護(hù)性對(duì)抗的其它因子的抗原肽序列。所述質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌中生長(zhǎng)，如大腸桿菌，然后根據(jù)想要的給藥途徑在給予宿主之前，在適宜的介質(zhì)中分離制備。在給予之后，質(zhì)粒被宿主細(xì)胞攝入在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生編碼的肽的。為了阻止質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物宿主中復(fù)制和整合到相關(guān)動(dòng)物的染色體DNA中，制備的質(zhì)粒載體最好不含在真核細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)。
相對(duì)于傳統(tǒng)的接種方法，DNA接種具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，人們預(yù)測(cè)因?yàn)橛伤鯠NA序列編碼的蛋白質(zhì)是在宿主中合成的，所以所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象將與疾病狀態(tài)有關(guān)的天然蛋白質(zhì)相似。DNA疫苗也將可能通過(guò)產(chǎn)生識(shí)別保守蛋白質(zhì)中表位的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，而提供保護(hù)以抗病毒的不同毒株。而且，因?yàn)橘|(zhì)粒是由宿主細(xì)胞攝入，在宿主細(xì)胞中可以產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)，所以將誘發(fā)長(zhǎng)久的免疫應(yīng)答。該技術(shù)也提供了將多樣的免疫原結(jié)合為單一制劑以易于同時(shí)進(jìn)行涉及許多疾病狀態(tài)的免疫的可能性。
(1)中提供了涉及DNA接種的有幫助的背景信息。它的內(nèi)容通過(guò)引用全部包括到本文中。
盡管相對(duì)于傳統(tǒng)接種治療，DNA接種具有了許多優(yōu)點(diǎn)，人們?nèi)匀幌胍_(kāi)發(fā)用于增強(qiáng)由給予動(dòng)物的質(zhì)粒DNA編碼的蛋白質(zhì)誘發(fā)的免疫應(yīng)答的佐劑組合物。
其中原因之一是，雖然DNA疫苗在小鼠模型中作用往往很好，但是有證據(jù)說(shuō)明它在較大的物種如非人類的靈長(zhǎng)目動(dòng)物中的潛能略弱(2，3)，人們認(rèn)為可預(yù)測(cè)在人類中的潛能相似。佐劑也可能有助于改正可能伴隨DNA接種的從Th1應(yīng)答至Th2應(yīng)答的免疫應(yīng)答的不適當(dāng)?shù)钠x，特別是當(dāng)直接表皮給予時(shí)(4)。最后，人們已經(jīng)知道DNA本身通過(guò)CpG基元，出可以顯示一些佐劑特性(5，6，7)，這在于肌內(nèi)給予DNA疫苗的小動(dòng)物中很普通，但在較大的物種中或當(dāng)給予小劑量的DNA時(shí)減弱，如通過(guò)“基因槍”給予。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以和DNA接種法結(jié)合使用的佐劑化合物。此外一個(gè)目的是提供改善DNA接種的方法，包括如佐劑，以及包含所涉及的佐劑的組合物。本發(fā)明的其它目的將在詳述中明顯看出。然而，至今已證明達(dá)到這些目是困難的，主要?dú)w因于與傳統(tǒng)疫苗技術(shù)相比，與DNA接種相關(guān)的機(jī)理不同。
文獻(xiàn)報(bào)道了許多動(dòng)物模型中由DNA接種引起的體液免疫應(yīng)答的例子。已經(jīng)表明在給予為此編碼的質(zhì)粒DNA之后，其中產(chǎn)生了針對(duì)人生長(zhǎng)激素和人類α-1抗胰蛋白酶(8)、流感NP(9)、HIV包膜蛋白(10)、牛皰疹病毒糖蛋白(11)和乙肝表面抗原(12)的抗體應(yīng)答。也已經(jīng)在DNA接種動(dòng)物模型中證明了細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。已經(jīng)證明產(chǎn)生對(duì)抗流感A的NP(13)、乙肝表面抗原(HBs Ag)65和核心抗原(14)以及HIVEnv(15，16，17)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，這只是幾個(gè)實(shí)例。然而，有趣的是注意到輔助T細(xì)胞應(yīng)答好象依賴于質(zhì)粒DNA的傳遞方式。肌內(nèi)給予使輔助T細(xì)胞應(yīng)答傾向于Th1類應(yīng)答，而主要表皮給予使免疫應(yīng)答傾向于Th2類應(yīng)答(4)。還注意到已經(jīng)與DNA接種方法結(jié)合試驗(yàn)了許多已知的免疫增強(qiáng)劑，獲得的成功有限，或至多也不多是混合成功。例如，GM-CSF與狂犬病毒糖蛋白(18)和癌胚抗原(CEA(19))共同表達(dá)，以及B7-1和B7-2結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)HSP 65(20)或CEA(19)共同表達(dá)，都誘發(fā)比抗原單獨(dú)表達(dá)更高的抗體效價(jià)，沒(méi)有增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的報(bào)道。同樣有趣的是，當(dāng)狂犬病毒糖蛋白與編碼干擾素-γ的DNA共同給予時(shí)，實(shí)際上對(duì)抗體應(yīng)答有抑制影響(18)。
由于考慮到這一背景，最驚奇地是注明到本發(fā)明人報(bào)道了表現(xiàn)出不僅刺激體液免疫應(yīng)答，而且同時(shí)刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制雙重作用的佐劑化合物。最近已經(jīng)顯示出證明涉及DNA接種的顯著佐劑活性的所述化合物，已在國(guó)際專利說(shuō)明書(shū)WO94/07479中公開(kāi)，涉及它們的免疫增強(qiáng)活性。本發(fā)明人鑒定的一種具有良好的DNA疫苗佐劑活性的特定化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，也稱為妥卡雷瑣，它最初在歐洲0054924中描述。現(xiàn)在，由本發(fā)明人鑒定的適用于作為DNA疫苗佐劑的化合物以前沒(méi)有公開(kāi)或提出它們很適用作DNA疫苗佐劑的體液和細(xì)胞免疫原活性的證明。
優(yōu)選核苷酸序列是DNA序列。
優(yōu)選在給予所述DNA序列之前約14天至之后約14天，特別優(yōu)選在給予所述DNA序列之前約7天至之后約7天，優(yōu)選在給予所述DNA序列之前約1天至之后約1天，給予1至7次所述化合物。最特別優(yōu)選基本上與給予所述DNA序列同時(shí)給予所述化合物，并在給予所述DNA序列之后的數(shù)天內(nèi)還任選地給予所述化合物。
優(yōu)選每次以約0.1mg/kg至約100mg/kg的劑量給予所述化合物。
優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物是人類。
優(yōu)選所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含編碼與疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽且在合適的載體中的DNA序列的疫苗組合物，和增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物中由所述抗原肽引發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的化合物，所述化合物選自4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N，N-二乙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N-異丙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸芐酯；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲酰-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺酰戊酰胺；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲酰-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲酰苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2’，4’-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4’，5，6-三羥基黃酮；4’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內(nèi)酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
優(yōu)選所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
按照本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案，提供了在藥劑生產(chǎn)中化合物的用途，其中給予哺乳動(dòng)物所述化合物增強(qiáng)了由與疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽引發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，所述肽是給予所述哺乳動(dòng)物編碼所述肽的DNA序列表達(dá)的結(jié)果；其中所述化合物選自4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N，N-二乙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N-異丙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸芐酯；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲酰-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺酰戊酰胺；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲酰-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲酰苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2’，4’-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4’，5，6-三羥基黃酮；4’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內(nèi)酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
優(yōu)選所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，并且優(yōu)選每次以約0.1mg/kg至100mg/kg的劑量給予所述化合物。
按照本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供了用于如上所概述方法分開(kāi)、順序或同時(shí)給予的組分的組合物，包含編碼抗原肽的所述核苷酸序列和增強(qiáng)由所述抗原肽引發(fā)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的所述化合物。
淋巴結(jié)T細(xì)胞體外應(yīng)答Ova肽的增殖(在0.5％的小鼠血清存在于)。結(jié)果表明了T細(xì)胞對(duì)于在PBS中的卵清蛋白(不含佐劑)和單獨(dú)的PBS、單獨(dú)的和結(jié)合Ova肽的完全弗氏佐劑(CFA)、單獨(dú)的和結(jié)合Ova肽的細(xì)菌脂多糖(LPS)以及單獨(dú)的和結(jié)合Ova肽的卡介菌(HK-BCG)的應(yīng)答。
圖2淋巴結(jié)T細(xì)胞應(yīng)答單獨(dú)的和結(jié)合了佐劑LPS、CFA、GM-CSF和熱殺傷單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(HKLM)的編碼卵清蛋白的pDNA或DNA(PVAC.Ova)的增殖。
圖3用表達(dá)Mhsp65的pDNA免疫后，妥卡雷瑣對(duì)分枝菌hsp65的特異性抗體應(yīng)答的影響。用20μg pDNA隔三星期分兩次免疫小鼠。兩星期之后，抽取它們的血，并通過(guò)ELISA檢測(cè)特異性IgG(a)、IgG2a(b)和IgG1(c)抗-重組體M.hsp65蛋白。p*≥0.1，特異性抗體應(yīng)答沒(méi)有顯著的不同。在(a)中在p3或p3，T和p3M.65之間以及p3M.65和p3M.65G或p3M.65，T之間比較，在(b)中在p3或p3，T和p3M.65或p3M.65G之間比較，和在(c)中在p3和或p3，T和p3M.65Gub之間比較，p**≤0.05，。在(a)中在p3或p3，T和p3M.65 G或p3M.65，T之間比較，在(b)中在p3和或p3，T和p3M.65，t之間，和p3M.65和p3M.65，t之間比較，在(c)中在p3和或p3，T和p3M.65，T之間比較，p***≤0.003，。分別與p3和p3M.65相比時(shí)，p和h是顯著的。
圖4妥卡雷瑣對(duì)增殖性T細(xì)胞應(yīng)答的影響。pDNA免疫小鼠的脾細(xì)胞在或者有單獨(dú)的S6c-E4或感染表達(dá)EBNA-4的牛痘的S6c-E4 9S6C-VE4)的情況下，或者有單獨(dú)的S6C-gpt對(duì)照腫瘤細(xì)胞或感染牛痘TK對(duì)照牛痘構(gòu)建物9S6C-gptV)的情況下培養(yǎng)。刺激指數(shù)如方法一節(jié)中描述的計(jì)算。
圖5pDNA免疫的小鼠中的IFNγ應(yīng)答和妥卡雷瑣對(duì)它的影響。用p3、E4或E4，T免疫各組小鼠，并在體外用腫瘤S6C-E$、S6C-gpt或不用任何物質(zhì)刺激脾細(xì)胞72小時(shí)。通過(guò)特異性ELISA檢測(cè)IFNγ效價(jià)。
圖6在妥卡雷瑣處理的小鼠中細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答明顯增強(qiáng)。用p3M.65、p3M.65，γ或p3M.65，T免疫各組HLA-A2/kb轉(zhuǎn)基因小鼠兩次。用HLA-A2結(jié)合(biding)肽P$培養(yǎng)脾細(xì)胞5-6天，然后將其作為常規(guī)51Cr釋放分析中的效應(yīng)物。如方法一節(jié)中描述的，采用Jk-A2kb作為目標(biāo)，用P4、用無(wú)關(guān)的肽(Inf)或不用任何物質(zhì)進(jìn)行脈沖處理。
圖7在妥卡雷瑣處理的小鼠中腫瘤生長(zhǎng)物(outgrowth)抑制明顯增強(qiáng)。用p3、E4或E4，T免疫各組ACA小鼠三次，接著用104 S6C腫瘤細(xì)胞攻擊。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到20mm時(shí)處死小鼠。
圖8在基因槍免疫后經(jīng)妥卡雷瑣處理的小鼠中IFNγ產(chǎn)量提加。
用或者單獨(dú)的或與妥卡雷瑣結(jié)合的pVACl.PR(圖8a)或EBNA-4(圖8b)、或者各自的陰性質(zhì)粒，通過(guò)基因槍分別免疫C57BL/6小鼠或ACA小鼠。將脾細(xì)胞與核蛋白肽或表達(dá)EBNA-4抗原的腫瘤細(xì)胞或抗原陰性腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)。通過(guò)特異性ELISPOT分析(圖8b)或特異性ELISA分析(圖8a)確定IFNγ效價(jià)。
圖9妥卡雷瑣增強(qiáng)了由基因槍DNA免疫誘發(fā)的裂解性CTL應(yīng)答用編碼流感病毒核蛋白的質(zhì)粒DNA免疫C57B1/6小鼠，并且皮下給予(圖9a)或口服給予(圖9b)或不給予妥卡雷瑣。用A/PR8/34病毒體外重刺激脾細(xì)胞。采用標(biāo)準(zhǔn)銪釋放技術(shù)測(cè)定用H-2Db限制的NP肽脈沖處理的MHC匹配目標(biāo)細(xì)胞的特異性溶胞作用。
發(fā)明詳述在整個(gè)本說(shuō)明和附加的權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文需要，否則詞語(yǔ)“包含(comprise)”和“包括(include)”或變化如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”、“包括(including)”、“包括(includes)”都將解釋為包括在內(nèi)，也就是說(shuō)，采用這些詞語(yǔ)將意味著可能包括沒(méi)有詳述的整數(shù)或要素。
如上所述，本發(fā)明涉及接種方法，且特別涉及接種方法的改進(jìn)，包括將編碼抗原蛋白或抗原肽的DNA引入哺乳動(dòng)物中，以使所述蛋白或肽在所述哺乳動(dòng)物體中表達(dá)，由此在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)對(duì)抗所述抗原蛋白或抗原肽的免疫應(yīng)答。這種技術(shù)是眾所周知的，并如上面所提到在(1)中全面描述。
可以采用按照本申請(qǐng)的接種方法保護(hù)哺乳動(dòng)物以抵抗各種各樣的疾病狀態(tài)，如病毒感染、細(xì)菌感染或寄生蟲(chóng)感染、癌癥、變應(yīng)性疾病和自身免疫病。采用按照本發(fā)明的方法或組合物可以保護(hù)以防或治療的一些障礙或疾病狀態(tài)的具體例子如下病毒感染甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒，HIV，皰疹病毒1、2、6和7，巨細(xì)胞病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，乳頭瘤病毒，EB病毒，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，柯薩奇病毒，細(xì)小核糖核酸病毒，輪狀病毒，呼吸道合胞病毒，痘病毒，鼻病毒，風(fēng)疹病毒，乳多空病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒。
細(xì)菌感染誘發(fā)TB和麻風(fēng)的分枝菌，肺炎鏈球菌，需氧革蘭氏陰性菌，支原體，葡萄球菌感染，鏈球菌感染，沙門氏菌，衣原體。
寄生的瘧疾，利什曼病，錐蟲(chóng)病，弓形體病，血吸蟲(chóng)病，絲蟲(chóng)病。
癌癥乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，頭部和頸部癌癥，腎癌，惡性黑色素癌，前列腺癌。
變應(yīng)性由室內(nèi)塵螨、花粉和其它環(huán)境變應(yīng)原引起的鼻炎。
自身免疫病全身性紅斑狼瘡。
人們會(huì)認(rèn)識(shí)到這些具體疾病只是通過(guò)舉例提到，并不想限制本本申請(qǐng)?zhí)岬降膶⒃诓溉閯?dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)以誘發(fā)抗原應(yīng)答的所述DNA序列，可以編碼整個(gè)蛋白質(zhì)或僅編碼能夠引發(fā)抗原應(yīng)答的短肽序列。貫穿本說(shuō)明和附加的權(quán)利要求書(shū)中，短語(yǔ)“抗原肽”包括能夠在有關(guān)的動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答的所有肽序列或蛋白質(zhì)序列。然而，最優(yōu)選所述DNA序列將編碼與疾病狀態(tài)相關(guān)的整個(gè)蛋白質(zhì)，因?yàn)樵趧?dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)整個(gè)蛋白質(zhì)更可能模擬天然的抗原呈遞，并因此引起全面的免疫應(yīng)答。涉及具體疾病狀態(tài)的已知抗原肽的一些非限制性例子包括如下HBV-PreS1 PreS2和表面env蛋白、核心和polHIV-gp120 gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpf、vpu、tat、rev、nef乳頭狀瘤-E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1、L2HSV-gL、gH、gM、gB、gC、gK、gE、gD、ICP47、ICP36、ICP4流感-血細(xì)胞凝集素(haemaggluttin)、核蛋白TB-分枝菌超氧化物岐化酶、85A、85B、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP90、PPD 19kDa Ag、PPD38kDa Ag。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得表達(dá)所述抗原肽，編碼所述抗原肽的DNA序列必需存在于合適的載體系統(tǒng)中。例如，選擇的所述載體可以包含細(xì)菌質(zhì)粒以及按正確順序布置的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子和聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列，以獲得所述抗原肽的表達(dá)。包括這些組分和任選的如增強(qiáng)子、限制酶位點(diǎn)和選擇基因如抗生素抗性基因的其它組分的載體的構(gòu)建，是本領(lǐng)域熟練的人員所熟知的，并且在Maniatis等人(21)中詳細(xì)解釋。
因?yàn)樽柚顾鲑|(zhì)粒在哺乳動(dòng)物宿主中復(fù)制并整合入所述動(dòng)物的染色體DNA中是很重要的，所以將優(yōu)選產(chǎn)生不合在真核細(xì)胞中有作用的復(fù)制起點(diǎn)的所述質(zhì)粒。
按照本發(fā)明的方法和組合物可以用于涉及所有哺乳動(dòng)物的預(yù)防或治療過(guò)程的方面，所述哺乳動(dòng)物包括，例如，家禽、家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、捕獲的野生動(dòng)物和最優(yōu)選的人類。
上面所述的由本發(fā)明人鑒定的顯示出增強(qiáng)通過(guò)給予DNA疫苗引發(fā)的體液和細(xì)胞免疫原性活性的良好活性的化合物是已知的化合物，先前在WO94/07479中報(bào)道具有增強(qiáng)劑特性。特別優(yōu)選化合物4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸，它也稱為妥卡雷瑣，它最初在EP0054924中描述，且報(bào)道為具有免疫增強(qiáng)劑活性并且可用于治療各種各樣的疾病，包括HIV、HBV、HCV、腫瘤和鐮狀細(xì)胞貧血。人們認(rèn)為所報(bào)道的妥卡雷瑣的活性可以解釋為它能夠形成希夫堿，并因此替代生理供體或羰基而為CD4 Th-細(xì)胞提供共同刺激信號(hào)。先前已經(jīng)報(bào)道妥卡雷瑣增強(qiáng)CD4-Th細(xì)胞應(yīng)答，與Th2相比，選擇性地有利于Th1-型(22)，而本發(fā)明人已經(jīng)證明它能夠增強(qiáng)了鼠模型中的TH1和TH2兩種同種型。
提及由本發(fā)明的所述化合物引起的由抗原肽激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增加，用來(lái)表達(dá)血清抗體水平和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)水平將由于給予所述化合物而與伴隨單獨(dú)給予編碼抗原肽的DNA序列的水平相比分別提高了?？梢杂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法定量分析這一水平，這將在附加的實(shí)施例中進(jìn)一步解釋。
包含編碼抗原肽的DNA序列的載體可以用各種各樣的方法給予。可將裸露形式(那就是未與脂質(zhì)體制劑、病毒載體或轉(zhuǎn)染促進(jìn)蛋白結(jié)合的裸露DNA)給予的所述載體懸浮于合適的介質(zhì)中，例如緩沖鹽溶液如PBS，然后經(jīng)肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，盡管較早的一些數(shù)據(jù)表明肌內(nèi)或皮下注射是優(yōu)選的(23)，(它的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用包括在本文中)。另外所述載體可以由如脂質(zhì)體包囊或包膠囊于聚交酯co-乙交酯(PLG)的顆粒中(25)，經(jīng)由口腔、鼻或肺的途徑給予。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，同樣可以皮內(nèi)給予所述載體，優(yōu)選借助基因槍(特別是粒子轟擊)給予技術(shù)的使用。這種技術(shù)可以包括凍干包含所述載體的懸浮液，接著將所述載體包被在金珠粒上，然后在高壓下給予金珠粒于表皮中，例如(26)中所述的。傳遞DNA的數(shù)量將大大地不同，這取決于所免疫的哺乳動(dòng)物的種類和重量、所治療/保護(hù)以防的疾病狀態(tài)的性質(zhì)、所采用的接種方案(即單一給予與重復(fù)給藥)、給藥途徑和所選的佐劑化合物的效力和劑量。基于這些變量，開(kāi)業(yè)醫(yī)生或獸醫(yī)專業(yè)人員將易于確定合適的劑量水平。
包括編碼抗原肽的DNA載體可以一次性給予或重復(fù)給予，例如，1至7次，優(yōu)選1至4次，間隔時(shí)間約1天至約18個(gè)月。然而，該治療方案又是根據(jù)有關(guān)動(dòng)物的種類和大小、所治療/保護(hù)以防的疾病、給予DNA的量、給藥途徑、所選擇的佐劑化合物的效力和劑量以及對(duì)于獸醫(yī)或開(kāi)業(yè)醫(yī)生顯而易見(jiàn)的其它因素而大大不同。
這里詳述的佐劑化合物可以相似地經(jīng)由不同的給藥途徑給予，例如，經(jīng)由口腔、鼻、肺、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部途徑。這種給予可以在給予DNA序列之前約14天至之后約14天進(jìn)行，優(yōu)選在給予DNA序列之前約7天至之后約7天進(jìn)行，更優(yōu)選在給予DNA序列之前約24小時(shí)至之后24小時(shí)進(jìn)行，而且特別優(yōu)選是基本上與給予DNA序列同時(shí)進(jìn)行?！盎旧贤瑫r(shí)”的意思是優(yōu)選在給予DNA序列的同時(shí)給予所述化合物，或者如果不是這樣，則至少在給予DNA序列的前后幾小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。在最優(yōu)選的治療方案中，基本上在給予DNA序列的同時(shí)給予所述化合物，然后在給予DNA序列之后至多14天內(nèi)大約天天重復(fù)給予，優(yōu)選初始給予之后3天內(nèi)天天進(jìn)行。明顯地，按照上面提到的變量類型，該方案可根據(jù)需要而改變。根據(jù)這些變量，再次給予的劑量也將很不一樣，但是可以如在約0.1mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)變動(dòng)，其中“每公斤”是指相關(guān)的哺乳動(dòng)物的體重。最好在每次隨后的給予或加強(qiáng)給予DNA序列時(shí)重復(fù)這種佐劑化合物的給予。最優(yōu)選地，所述給予劑量在約0.1mg/kg至約10mg/kg之間，最好在約1mg/kg至約5mg/kg之間。
雖然所述佐劑化合物可以以原化學(xué)狀態(tài)給予，但最好以藥用組合物的形式給予。這就是說(shuō)，所述化合物最好與一種或多種藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體以及任選的其它治療組分結(jié)合。所述載體必須是“可接受的”，它的意思是可與制劑的其它組分相容，且對(duì)其接受者無(wú)害。所述制劑的特性根據(jù)所要用的給藥途徑而自然地改變，且可以通過(guò)制藥領(lǐng)域中眾所周知的方法制備。所有方法都包括將本發(fā)明的化合物(所述佐劑化合物)和合適的一種載體或多種載體結(jié)合在一起。一般地說(shuō)，通過(guò)均勻地且緊密地將所述化合物與液體載體或細(xì)碎的固體載體結(jié)合在一起，或與這兩者結(jié)合在一起，然后，若有必要，使制品成形為所要的制劑。適用于口服給予的本發(fā)明的制劑的存在形式可以為分離的單位如膠囊、扁囊劑或片劑，它們都包含了預(yù)定量的活性組分；粉劑或顆粒劑；水性液體或非水液體中的溶液或懸浮液；或水包油液體乳液或油包水乳液。所述活性組分也可以大丸劑、干糖藥劑或糊劑存在。
片劑可以通過(guò)壓制或模制，任選含有一種或多種附加組分制成。可以通過(guò)在合適的機(jī)器中將任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑、表面活性劑或分配劑混合的自由流動(dòng)形式如粉劑或顆粒劑的所述活性組分壓片，而制備壓制的片劑?？梢酝ㄟ^(guò)在合適的機(jī)器中模制用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉狀化合物制備模制片劑。
所述片劑可以任選地包衣或刻痕并配制以便提供緩慢釋放或控制釋放所述活性組分。
用于經(jīng)由如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥途徑注射的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑細(xì)菌劑和使所述制劑與接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和可以包含懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無(wú)菌懸浮液。所述制劑可以存在于單劑量或多劑量容器中，如密封安瓿和密封管形瓶中，且可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，只需要在緊接使用之前加入無(wú)菌液體載體如注射用水。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以由先前描述的類型的無(wú)菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。提供適用于經(jīng)由口腔含化或鼻腔肺給予的制劑，以使包含所述活性組分、直徑理想的在0.5至7微米范圍內(nèi)的微粒，傳遞到接受者的支氣管樹(shù)中。該制劑可能為細(xì)碎的粉末形式，可以方便地或者存在于可刺穿的膠囊中，合適的如明膠膠囊，用于吸入設(shè)備；或者作為自噴射(self-propelling)制劑，包含活性組分、一種合適的液體推進(jìn)劑和任選的其它組分如表面活性劑和/或固體稀釋劑。也可以使用其中所述活性組分以溶液或懸浮液的微滴形式分配的自噴射制劑。這種自噴射制劑與本領(lǐng)域所知道的類似，并可由建立的方法制備。它們合適地由具有所要的噴射特性的手動(dòng)操作閥或自動(dòng)操作閥提供；該閥最好是計(jì)量類型的，它的每次操作傳遞固定的體積，如50-100μL。
在另一個(gè)可能性中，所述活性組分可以是溶液的形式用于霧化器或噴霧器中，從而應(yīng)用加速的氣流或超聲波攪拌以產(chǎn)生用于吸入的細(xì)小的霧微滴。
適用于鼻內(nèi)給予的制劑一般包含形式相似于所述的用于肺部給予的制劑，盡管該制劑最好含有的微粒直徑在約10微米至約200微米范圍內(nèi)，使能夠在鼻腔內(nèi)滯留。可以通過(guò)適當(dāng)采用合適粒徑的粉劑或選擇合適的閥來(lái)達(dá)到這一點(diǎn)。其它合適的制劑包括粗粉劑，微粒直徑在約20微米至約500微米，用于通過(guò)緊保持在鼻子之上的容器經(jīng)過(guò)鼻腔快速吸入給予；和滴鼻劑在水性或油性溶液中包含約0.2-5％w/w的所述活性組分。
WO094/07479提供了包含按照本發(fā)明的所述佐劑化合物的合適制劑的例子，它的內(nèi)容通過(guò)引用全部包括在本文中。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含編碼所述抗原肽的DNA序列的所述載體可以在與所述佐劑化合物相同的制劑中給予。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，以適用于基因槍給予的形式制備所述佐劑化合物，且基本上與給予所述DNA序列的同時(shí)經(jīng)所述途徑給予。為制備適合于使用這種方法的制劑，必須將所述佐劑化合物凍干并附著在如適用于基因槍給予的金珠粒上。
即使不配制在一起，在給予所述DNA序列的位點(diǎn)或該位點(diǎn)附近給予所述佐劑化合物也是合適的。
其它藥用制劑的詳細(xì)描述可以在(24)中找到，它的內(nèi)容通過(guò)引用全部包括在本文中。
現(xiàn)在參考以下非限制性實(shí)施例，進(jìn)一步描述本發(fā)明實(shí)施例1與肽免疫對(duì)比，DNA接種中常規(guī)佐劑的活性將表達(dá)卵清蛋白抗原的特異性受體的TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴樣細(xì)胞轉(zhuǎn)移到普通的同源小鼠中。然后用含或不含佐劑的Ova肽皮下免疫這些小鼠。三天之后，取出局部淋巴結(jié)細(xì)胞，并通過(guò)將含氚標(biāo)記胸苷摻入DNA中的方法測(cè)定它們對(duì)卵清肽蛋白的增殖應(yīng)答。這提供了對(duì)體內(nèi)發(fā)生的對(duì)免疫應(yīng)答的特異性T-細(xì)胞誘發(fā)程度的測(cè)定。與模擬免疫(●)對(duì)比，用單獨(dú)的Ova肽免疫(○)導(dǎo)致顯著但水平低的T-細(xì)胞誘發(fā)。細(xì)菌脂多糖(LPS)(△)、完全弗氏佐劑(CFA)(□)和卡介菌(HK-BCG)()都提供了顯著的應(yīng)答增強(qiáng)。在缺少免疫抗原的情況下，給予細(xì)菌脂多糖(LPS)(▲)、完全弗氏佐劑(CFA)(■)和卡介菌(HK-BCG)()，對(duì)隨后Ova肽應(yīng)答而增殖的影響最小。
將表達(dá)卵清蛋白抗原的特異性受體的TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴樣細(xì)胞轉(zhuǎn)移到普通的同源小鼠中。然后用質(zhì)粒DNA(pVACl)或編碼卵清蛋白(pVACl.0va)的質(zhì)粒DNA構(gòu)建物皮下免疫這些小鼠，且皮下給予或不給予佐劑。三天之后，取出局部淋巴結(jié)細(xì)胞，并通過(guò)摻入氚標(biāo)記胸苷到DNA中的方法測(cè)定它們對(duì)Ova肽的增殖應(yīng)答。這提供了體內(nèi)發(fā)生的對(duì)免疫應(yīng)答的特異性T-細(xì)胞誘發(fā)程度的測(cè)定。用完全弗氏佐劑中的Ova肽免疫對(duì)照組而產(chǎn)生基本上的T-細(xì)胞誘發(fā)(◆)。與用空載體(○)免疫對(duì)比，用pVAl.Ova(△)的DNA免疫產(chǎn)生顯著的T-細(xì)胞誘發(fā)。然而，與常規(guī)肽免疫對(duì)比，沒(méi)有一種佐劑能夠增強(qiáng)這種對(duì)DNA免疫的應(yīng)答。LPS(▲)、熱殺傷單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(HKLM)()、GM-CSF(◇)和完全弗氏佐劑(CFA)()都不能增強(qiáng)對(duì)DNA接種的應(yīng)答。[采用HKLM為佐劑，用空載體對(duì)照可以見(jiàn)到反常的高應(yīng)答]。
實(shí)施例2妥卡雷瑣增強(qiáng)抗原特異性抗體的產(chǎn)生分析妥卡雷瑣對(duì)用編碼分枝桿菌熱激蛋白65(M.hsp65)抗原的質(zhì)粒DNA免疫的影響，并將妥卡雷瑣的影響與表達(dá)細(xì)胞因子GM-CSF和IFNγ的質(zhì)粒的影響比較。
用20μg的質(zhì)粒(p3)肌內(nèi)(i.m.)免疫各組各組小鼠?？梢詮膒3M.65免疫的小鼠的血清中檢測(cè)到顯著量的針對(duì)M＞hsp65的抗體，但在用p3免疫的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到(圖3a)。當(dāng)在皮下給予M.hsp質(zhì)粒9p3M.65，T)的同時(shí)皮下給予1mg的妥卡雷瑣時(shí)抗體效價(jià)明顯增加。與此對(duì)比，在用對(duì)照質(zhì)粒和妥卡雷瑣(p3，T)免疫的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到特異性抗體應(yīng)答增加，排除了因?yàn)榕c妥卡雷瑣給予相關(guān)的高程度免疫增強(qiáng)而引起的非特異性交叉反應(yīng)性抗體普通增加導(dǎo)致所觀察的效應(yīng)的可能性，(圖3a)。
我們也在同樣實(shí)驗(yàn)中對(duì)比妥卡雷瑣的影響和注射表達(dá)細(xì)胞因子GM-CSF和IFNγ的質(zhì)粒的影響。p3M.65質(zhì)粒單獨(dú)給予或與GM-CSF表達(dá)質(zhì)粒(p3M.65，G)、IFNγ表達(dá)質(zhì)粒(p3M.65，γ)或GM-CSF和IFNγ表達(dá)質(zhì)粒(p3M.65，Gγ)的混合物等摩爾結(jié)合給予。與p3M65對(duì)比，當(dāng)免疫包含GM-CSF質(zhì)粒時(shí)，抗-M.hsp65效價(jià)明顯增加。與GM-CSF質(zhì)粒對(duì)M.hsp65特異性抗體應(yīng)答的加強(qiáng)影響對(duì)比，跟先前公布的數(shù)據(jù)一致，當(dāng)包含IFNγ表達(dá)質(zhì)粒時(shí)抗體應(yīng)答不明顯。兩種細(xì)胞因子的結(jié)合好象對(duì)抗GM-CSF質(zhì)粒的增強(qiáng)作用，減弱應(yīng)答至基本相似于當(dāng)只用p3M.65免疫時(shí)的水平(沒(méi)有列出數(shù)據(jù))。總起來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果說(shuō)明，妥卡雷瑣具有增強(qiáng)由M.hsp65抗原基因免疫誘發(fā)的抗體應(yīng)答的有效能力，與GM-CSF質(zhì)粒的作用相當(dāng)。
我們已經(jīng)分析了同種型抗-M.hsp65抗體。p3M.65免疫的小鼠產(chǎn)生顯著量的IgG2a抗-M.hsp65抗體。這種效價(jià)在接受妥卡雷瑣的小鼠中顯著(P＝0.003)增加(圖3b)。這種Th1相關(guān)抗體應(yīng)答的明顯增強(qiáng)是用p3M.65，G免疫時(shí)特有的，p3M.65γ或p3M.65，Gγ沒(méi)有這樣的效應(yīng)。在免疫中包括IFNγ表達(dá)質(zhì)粒沒(méi)有增強(qiáng)IgG2a抗-M.hsp65抗體應(yīng)答。
在接受p3M.65，G、p3M.65γ、p3M.65，Gγ的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到顯著量的Th2相關(guān)的抗-M.hsp65 IgG1抗體應(yīng)答。然而，與p3免疫的小鼠對(duì)比，在接受p3M.65，T的小鼠中誘發(fā)顯著量(p＝0.003)的這種應(yīng)答，而在pM.65G免疫的小鼠中誘發(fā)的程度較小(p＝0.027)(圖3c)。
把我們的數(shù)據(jù)收集在一起證明作為基因免疫的結(jié)果，特異性抗體應(yīng)答的顯著增強(qiáng)可以通過(guò)給予妥卡雷瑣達(dá)到。盡管這種給予強(qiáng)烈地增強(qiáng)Th1相關(guān)應(yīng)答，它的確也誘發(fā)Th2相關(guān)的抗體應(yīng)答。這是第一次報(bào)道妥卡雷瑣增強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答的生成物。
實(shí)施例3妥卡雷瑣增強(qiáng)特異性T-細(xì)胞增殖應(yīng)答。
接下來(lái)我們分析妥卡雷瑣對(duì)通過(guò)用表達(dá)EB病毒(EBV)核抗原4號(hào)(EBNA4)的pDNA接種誘發(fā)的T細(xì)胞增殖應(yīng)答的影響。用對(duì)照質(zhì)粒p3或用EBNA-4表達(dá)質(zhì)粒(E4)或用加上妥卡雷瑣處理的E4(E4，T)肌內(nèi)免疫各組小鼠。在用同源EBNA-4轉(zhuǎn)染的癌系(S6C-E4)刺激時(shí)，從E4免疫小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)出最小增殖應(yīng)答。有趣的是，在用E4肌內(nèi)免疫并用妥卡雷瑣皮下處理的小鼠的脾細(xì)胞中獲得對(duì)S6C-E4的強(qiáng)烈得多的增殖應(yīng)答(圖4)。EBNA-4牛痘感染刺激物(S6C-VE4)同樣誘發(fā)了比如先前報(bào)道的經(jīng)E4免疫和E4，T免疫的小鼠的脾細(xì)胞中的S6C-E4更高的增殖應(yīng)答。采用以下公式以模擬指數(shù)(SI)計(jì)算增殖SI＝對(duì)應(yīng)S6C-EBNA-4轉(zhuǎn)染子(EBNA-4牛痘感染的)的脾細(xì)胞增殖/對(duì)應(yīng)S6C-gpt(TK-牛痘感染的)對(duì)照感染子的脾細(xì)胞增殖。再一次，這種應(yīng)答是抗原調(diào)節(jié)的(focus)，因?yàn)樵诜謩e對(duì)應(yīng)S6C-gpt或?qū)φ誘K-牛痘感染的S6c-gptV的S6C-E4或EBNA-4牛痘感染細(xì)胞的對(duì)照免疫小鼠(p3)的脾細(xì)胞中沒(méi)有可檢測(cè)到的增殖(圖4)。
實(shí)施例4妥卡雷瑣顯著增強(qiáng)Th-1細(xì)胞因子的產(chǎn)生pDNA免疫與以包括IFNγ在內(nèi)的Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生為特征的占優(yōu)勢(shì)的Th-1應(yīng)答有關(guān)。為評(píng)價(jià)妥卡雷瑣增強(qiáng)Th-1應(yīng)答的能力，用p3、E4或E4且同時(shí)皮下給予妥卡雷瑣來(lái)肌內(nèi)免疫小鼠。與p3免疫小鼠的對(duì)照脾細(xì)胞的產(chǎn)生或?qū)6C-gpt應(yīng)答的產(chǎn)生相比，用E4免疫的小鼠產(chǎn)生的IFNγ如果有也是很少的，僅對(duì)用S6C-E4特異性刺激應(yīng)答而產(chǎn)生IFNγ。有趣的是，用e4免疫并用妥卡雷瑣處理的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)用S6C-E4特異性體外刺激應(yīng)答產(chǎn)生最高量的IFNγ，而對(duì)用S6C-gpt的對(duì)照刺激不應(yīng)答。我們?cè)谌魏谓M別的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中不能檢測(cè)對(duì)特異性刺激應(yīng)答的Th2細(xì)胞因子IL-4的產(chǎn)生(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。因此，我們推斷，與pDNA接種一起給予妥卡雷瑣是促進(jìn)特異性Th1占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞因子應(yīng)答的很有效的方法。
通過(guò)妥卡雷瑣加強(qiáng)特異性CTL應(yīng)答為了研究妥卡雷瑣對(duì)通過(guò)pDNA接種誘發(fā)的特異性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的影響，我們用p3M.65、p3M.65γ或p3M.65，T免疫HLAA2轉(zhuǎn)基因小鼠兩次。在最后一次免疫的兩星期之后，用從分枝桿菌hsp65分子衍生的HLA-A2限制肽表位刺激免疫小鼠脾細(xì)胞一次，測(cè)試培養(yǎng)物對(duì)抗用或不用所述相關(guān)肽或?qū)φ誋LA A2限制流感肽脈沖處理的HLA-A2/kb Jurkal(Jk-A2/kbds)細(xì)胞系的特異性CTL活性。用p3M.65和妥卡雷瑣(p3M.65，T)免疫的小鼠脾細(xì)胞發(fā)展了高的對(duì)抗用相關(guān)M.hsp65表位脈沖處理的目標(biāo)細(xì)胞的CLT活性，而它們對(duì)抗用或不用對(duì)照流感肽脈沖處理的Jk-A2/kb細(xì)胞的裂解活性低得多(圖6)。相反，用p3M.65而沒(méi)有任何共同刺激劑免疫的小鼠的脾細(xì)胞幾乎完全沒(méi)有活性。與從只用p3M.65免疫的小鼠得來(lái)的脾細(xì)胞的活性對(duì)比，IFNγ質(zhì)粒(p3M.65γ)與p3M.65疫苗一起包括增強(qiáng)了脾細(xì)胞的CTL活性，但這種細(xì)胞毒性只占用妥卡雷瑣處理的小鼠脾細(xì)胞所觀測(cè)到的30-50％。因此我們推斷當(dāng)與pDNA接種一起給予時(shí)，妥卡雷瑣是增強(qiáng)特異性CTL產(chǎn)生的很有效的藥劑。
實(shí)施例6妥卡雷瑣在用表達(dá)EB病毒核抗原4(EBNA-4)的質(zhì)粒免疫之后，對(duì)體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)物的影響EB病毒已經(jīng)牽連一些癌癥。我們分析了妥卡雷瑣對(duì)用表達(dá)EBNA-4的質(zhì)粒進(jìn)行pDNA接種導(dǎo)致的體內(nèi)腫瘤生成物抑制的影響(圖7)?；蛘哂?0μg的對(duì)照模擬質(zhì)粒pCDNA3(P3)、表達(dá)EBNA-4的質(zhì)粒(E4)經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠，或者用40μg表達(dá)EBNA-4的質(zhì)粒經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠，接著在1、2、3和4天之后皮下給予妥卡雷瑣200μg-即每只小鼠總共給予800μg妥卡雷瑣(E4T)。這一免疫方案在初始免疫之后一個(gè)月和兩個(gè)月重復(fù)。在最后一次免疫的兩星期之后，用104S6C-E4腫瘤細(xì)胞皮下攻擊小鼠。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到20mm時(shí)處死小鼠。圖7表明了妥卡雷瑣顯著增強(qiáng)了EBNA-4抑制腫瘤生成物的能力。
實(shí)施例7妥卡雷瑣在小鼠中對(duì)通過(guò)基因槍免疫誘發(fā)的CTL細(xì)胞因子應(yīng)答的影響。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生干擾素γ(IFNγ)是在消除病毒感染中重要的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的主要度量。
采用流感NP抗原(圖8a)用編碼A/PR8/34流感病毒核蛋白的DNA質(zhì)粒(pVACl.PR)通過(guò)基因槍以兩個(gè)劑量水平(10ng和100ng)或用空載體通過(guò)基因槍免疫C57BL/6小鼠。免疫14天之后收集脾臟，并且用NP肽(10μM)體外重刺激脾細(xì)胞，只通過(guò)CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞與重組人IL-2(50ng/ml)一起來(lái)識(shí)別。通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生細(xì)胞因子的個(gè)別細(xì)胞的數(shù)目的ELISPOT檢定法，檢測(cè)每10e6個(gè)脾細(xì)胞的IFNγ陽(yáng)性細(xì)胞(平均±S.E.M.；n＝3只小鼠)。在免疫時(shí)或者在DNA表皮內(nèi)接種的位點(diǎn)皮下(s.c.)(2×1mg)給予小鼠妥卡雷瑣，或者通過(guò)經(jīng)口管飼法(15mg/kg)從免疫當(dāng)天開(kāi)始的5天內(nèi)天天給予妥卡雷瑣。皮下給予妥卡雷瑣對(duì)免疫產(chǎn)生小的但顯著的CTL細(xì)胞因子應(yīng)答的增強(qiáng)，而經(jīng)口給予的妥卡雷瑣產(chǎn)生雙倍應(yīng)答。
采用EB病毒核抗原4(EBNA-4)(圖8b)用編碼EBNA-4的DNA質(zhì)粒(E4)或空載體(P3)通過(guò)基因槍免疫小鼠。每次注射給予2μg DNA，每只小鼠給予兩次不重疊的注射。在第1、2、3和4天皮下給予小鼠妥卡雷瑣(E4T)200μg。小鼠兩個(gè)月之后用同樣的免疫和處理方案加強(qiáng)。兩星期后，用表達(dá)EBNA-4抗原的腫瘤細(xì)胞(S6C-E4)或用抗原陰性腫瘤細(xì)胞(S6C-gpt)體外刺激脾細(xì)胞72小時(shí)。然后收集上清夜液，并通過(guò)特異性ELISA檢測(cè)IFNγ效價(jià)。妥卡雷瑣顯著地增強(qiáng)IFNγ的產(chǎn)生。
實(shí)施例8妥卡雷瑣對(duì)通過(guò)基因槍DNA免疫誘發(fā)的裂解性CTL應(yīng)答的影響CD8CTL裂解目標(biāo)細(xì)胞是通過(guò)免疫系統(tǒng)消除病毒感染的主要機(jī)制?？梢圆捎脭y帶病毒肽并用銪標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞檢測(cè)裂解性CTL。
皮下給予妥卡雷瑣(圖9a)用編碼流感病毒核蛋白(NP)的DNA質(zhì)粒(10ng)免疫C57BI/6小鼠，皮下(sc)給予或不給予妥卡雷瑣。在免疫之后14天處死小鼠，并用由病毒(A/PR8/34)脈沖處理的經(jīng)輻射的脾細(xì)胞體外重刺激(5天)。采用標(biāo)準(zhǔn)銪釋放技術(shù)測(cè)定用H-2Db-限制NP肽脈沖處理的MHC-匹配的目標(biāo)細(xì)胞(EL4細(xì)胞)的特異性裂解。對(duì)于所有對(duì)照非特異性裂解小于15％。在表皮內(nèi)基因槍免疫位點(diǎn)皮下給予妥卡雷瑣。
口腔給予妥卡雷瑣(圖9b)用編碼流感病毒核蛋白(NP)的質(zhì)粒DNA(10ng)免疫C57B1/6小鼠，經(jīng)口給予或不給予妥卡雷瑣。免疫14天之后處死小鼠，用由病毒(A/PR8/34)脈沖處理的經(jīng)輻射的脾細(xì)胞體外重刺激(5天)。采用標(biāo)準(zhǔn)銪釋放技術(shù)測(cè)定用H-2Db-限制NP肽脈沖處理的EL4細(xì)胞的特異性裂解。對(duì)于所有對(duì)照非特異性裂解小于15％。從免疫當(dāng)天開(kāi)始5天內(nèi)天天通過(guò)經(jīng)口管飼法給予妥卡雷瑣(15mg/kg)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論在這里，我們介紹了簡(jiǎn)單而很有效的增強(qiáng)pDNA免疫的方法，所述方法基于通過(guò)形成希夫堿為T細(xì)胞提供共同刺激信號(hào)。我們的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明這個(gè)方法能夠回避pDNA接種導(dǎo)致的通常遇到的效率限制問(wèn)題。這些包括觀察到在大多數(shù)免疫動(dòng)物中誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，而采用編碼細(xì)胞因子的載體的方法在那方面的效率小得多(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。與單獨(dú)給予pDNA接種或結(jié)合表達(dá)細(xì)胞因子基因的pDNA給予pDNA接種對(duì)比，所述增強(qiáng)也與所述應(yīng)答的大量增加有關(guān)，并且觀察到特異性抗體效價(jià)增加和增殖性及細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。
誘發(fā)充分的免疫應(yīng)答需要免疫系統(tǒng)的多種組分的參與，而pDNA免疫因誘發(fā)體液應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答(包括CTL應(yīng)答)而滿足這一需要，發(fā)現(xiàn)妥卡雷瑣增強(qiáng)了所有這些應(yīng)答。此外，盡管增強(qiáng)pDNA免疫的其它模式將導(dǎo)致偏T細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗體，但共同注射妥卡雷瑣的結(jié)果是全面增強(qiáng)包括增強(qiáng)Th1和Th2相關(guān)抗體應(yīng)答的的兩種形式的特異性免疫。因此可以考慮在基于細(xì)胞的免疫應(yīng)答或基于抗體的免疫應(yīng)答對(duì)宿主有益的情況下將pDNA接種與妥卡雷瑣結(jié)合。
也通過(guò)IgG∶IgM最高比，與其它免疫方法對(duì)比進(jìn)行檢測(cè)，特異性抗體產(chǎn)物的產(chǎn)生顯著增加(數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。這指出了在生產(chǎn)單克隆抗體時(shí)采用這種方法的潛在優(yōu)勢(shì)。
通過(guò)增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性檢測(cè)，妥卡雷瑣增強(qiáng)pDNA誘發(fā)的對(duì)hsp65、流感NP和EBNA-4的特異性T細(xì)胞應(yīng)答的顯著能力是特別重要的。抗分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫依賴于能夠分泌巨噬細(xì)胞活化細(xì)胞因子(包括IFNγ)的CD4+T細(xì)胞和能夠消滅感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性CD8+細(xì)胞。對(duì)EBV感染的保護(hù)性免疫依賴于CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，且已經(jīng)證明抵抗移植后移植性淋巴組織增生性疾病的基于T細(xì)胞的免疫治療是有效的。因?yàn)榻Y(jié)合妥卡雷瑣的pDNA接種有利于CD4和CD8介導(dǎo)的應(yīng)答，如本文所示，這是用于對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的新型T細(xì)胞疫苗的有吸引力的接種方式。
妥卡雷瑣是已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)的在化學(xué)上充分確定的分子。這應(yīng)當(dāng)在基于pDNA的接種方法中，簡(jiǎn)化這種藥劑的批準(zhǔn)程序。而且，由于表明它是系統(tǒng)性活性的，不需要局部共同給予pDNA和妥卡雷瑣，如本文通過(guò)結(jié)合肌內(nèi)pDNA免疫和皮下注射妥卡雷瑣所表明的?？梢宰C明將皮內(nèi)“彈道”傳遞pDNA疫苗接種與經(jīng)口給予妥卡雷瑣結(jié)合是很有吸引力的免疫方法，特別是在因?yàn)榘殡S注射的血液傳播感染或培養(yǎng)的小斑(stigmata)的危險(xiǎn)而應(yīng)避免腸胃外免疫的情況下。
總之，在這里我們提出數(shù)據(jù)第一次表明采用希夫堿形成的藥劑作為增強(qiáng)由pDNA接種誘發(fā)的特異性免疫應(yīng)答的簡(jiǎn)單有效的方法。這些數(shù)據(jù)可用于臨床和工業(yè)設(shè)置。
實(shí)驗(yàn)方法質(zhì)粒構(gòu)建和試驗(yàn)將所有的基因都插入到pCDNA3載體(Invitrogen BV，NV Leek，荷蘭)中。采用Eco RI和Sal I從質(zhì)粒pRIB1300(由Dr.R.v d Zee誠(chéng)懇地提供，Utrecht大學(xué)，Utrecht，荷蘭)切下牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)hsp65 cDNA，并將其亞克隆到pCDNA3 MCS的Eco RI和Xho I位點(diǎn)中。用限制性作圖確定所得到的質(zhì)粒(p3M.65)的基因的識(shí)別和定向。在通過(guò)采用Lipofectine(Life technologies，Paisley，蘇格蘭)經(jīng)脂轉(zhuǎn)染法用p3M.65轉(zhuǎn)染的COS-7溶胞產(chǎn)物中檢測(cè)hsp蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生。溶胞產(chǎn)物在12％的SDS-PAGE凝膠中電泳，之后在PVDF膜(BioRad，CA)上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，并用抗分枝桿菌hsp65特異性單克隆抗體DC-16(由Juraj Ivanyi博士友好地提供，倫敦，英國(guó))進(jìn)行免疫檢測(cè)。然后用結(jié)合山羊抗-小鼠Ig的二級(jí)堿性磷酸酶(Southern Biotech，AL)檢測(cè)，采用wester藍(lán)色底物系統(tǒng)(Promega，Madison，Wisconsin)進(jìn)行顯色。
ELISA方法收集免疫小鼠的血清，并如較早前描述的那樣用于直接ELISA。重組分枝桿菌hsp65(由R.v d Zee博士友好地提供)以濃度為4μg/ml碳酸鹽緩沖液使用，于4℃下過(guò)夜包被96孔板(Msxisorp，Nunc，丹麥)。血清以1∶100稀釋液雙份加入，在4℃下溫育過(guò)夜。采用結(jié)合山羊抗-小鼠血清的IgG(小鼠IgM預(yù)吸附的)、IgG2a和IgG1特異性堿性磷酸酶(Southern Biotech)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
小鼠已經(jīng)描述了用于本研究的HLA-A2*0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(由L.Sherman博士友好地提供，Scripps實(shí)驗(yàn)室，San Diengo，Ca)。這些小鼠表達(dá)嵌合的MHC II類I分子，所述分子的α1和α2結(jié)構(gòu)域是HLA-A*0201分子的結(jié)構(gòu)域，而α3跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是小鼠H2 Kb分子的結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)允許T細(xì)胞上的小鼠CD8分子的結(jié)合位點(diǎn)與嵌合分子的α3結(jié)構(gòu)域相互作用。采用HLA-A*0201特異性FITC-結(jié)合的單克隆抗體(One Lambda，Ca)確認(rèn)HLA-A*0201/Kb的表面表達(dá)并采用FACSCAN(Becton Dickinson&Co.，Mountain View，Ca)通過(guò)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。已經(jīng)描述了C575BI/6小鼠。這些小鼠具有確定的流感病毒核蛋白CTL表位。從Jackson(Jackson實(shí)驗(yàn)室，Bar Harbor，Main)購(gòu)買ACA(H-2f)小鼠。在Karonlinska研究所MTC動(dòng)物房中在我們的SP環(huán)境下繁殖并保持小鼠。
免疫通過(guò)肌內(nèi)免疫完成基因免疫。從采用Qiagen質(zhì)粒giga試劑盒(Qiagen GmbH，Hilden，德國(guó))的LB氨芐青霉素大腸桿菌培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒。采用分光光度計(jì)和分析型凝膠電泳確定濃度和純度。按照Davis等人的方法，采用20μg pDNA/100ul/肌肉的對(duì)照質(zhì)粒(P3)、EBNA-4表達(dá)質(zhì)粒附加對(duì)照質(zhì)粒p3(E4)、p3M.65表達(dá)質(zhì)粒附加對(duì)照質(zhì)粒p3(p3M.65)、p3M.65附加GM-CSF表達(dá)質(zhì)粒(p3M.65G)或p3M.65附加IFNγ表達(dá)質(zhì)粒(9p3M.65γ)在可再生脛骨前肌注射小鼠。以等摩爾量混合質(zhì)粒。或者按照Fynan等人(27)的方法，采用10ng或100ng的編碼A/PR8/34流感病毒核蛋白的DNA質(zhì)粒(pVACl.PR)或空載體、或2ng的編碼EBNA-4的質(zhì)粒(E4)或?qū)φ蛰d體p3，通過(guò)基因槍進(jìn)行免疫。妥卡雷瑣處理的小鼠用E4、p3M.65或pVACl.PR(E4，T、p3M.65，t和pVACl.NP PR(Tuc sc)分別地免疫，或者同時(shí)每次皮下注射妥卡雷瑣1mg，或者在4天中每只小鼠每天皮下注射200μg的妥卡雷瑣。小鼠在誘發(fā)兩星期后以同樣劑量接受加強(qiáng)。
細(xì)胞系Jurkat A*0201/kb(Jk-A2/kb)是一種用HLA-A80201/Kb嵌合基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人類T細(xì)胞白血病0HLA-A*0201陰性細(xì)胞系(由W.M.Kast博士友好地提供，Loyola大學(xué)，Maywood III)。從源于ACA小鼠中的自發(fā)的乳腺癌中得到S6C細(xì)胞系。S6C-gpt和S6C-E4分別是對(duì)照質(zhì)粒和EBNA-4轉(zhuǎn)染子(由George Klein博士友好地提供，MTC，Karolinska研究所，斯德哥爾摩)。通過(guò)體內(nèi)在同源ACA小鼠中和體外在補(bǔ)充以10％的牛胎血清(FBS)、100U/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素、50μM 2-巰基乙醇和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中傳代維持所有的細(xì)胞系。
增殖試驗(yàn)從免疫的小鼠中收獲脾細(xì)胞。制備單細(xì)胞懸浮液，并且將細(xì)胞在補(bǔ)充以10％的FBS和L-glu和抗生素的IMDM中重懸浮。通過(guò)每毫升混合3×106個(gè)腫瘤細(xì)胞制備脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的混合培養(yǎng)物(MSTC)。培養(yǎng)物在7.5％的CO2中于37℃下培養(yǎng)5天。將1μCi氚標(biāo)記的胸苷加入到U-型底96孔板的每個(gè)孔中。細(xì)胞在與上面一樣的條件下培養(yǎng)18小時(shí)并收獲，并采用β讀板儀(Wallac，Turku，芬蘭)測(cè)定氚標(biāo)記的胸苷的摻入量。所述試驗(yàn)以一式三份進(jìn)行，并采用公式計(jì)算刺激指數(shù)(SI)SI＝對(duì)應(yīng)S6C-EBNA-4轉(zhuǎn)染子(或EBNA-4牛痘感染的)的脾細(xì)胞增殖/對(duì)應(yīng)S6C-gpt(或TK-牛痘感染的)對(duì)照轉(zhuǎn)染子的脾細(xì)胞增殖。
細(xì)胞因子分析通過(guò)每毫升混合3×106個(gè)脾細(xì)胞與3×105個(gè)腫瘤細(xì)胞制備脾細(xì)胞(來(lái)自E4免疫的小鼠)和腫瘤細(xì)胞的混合培養(yǎng)物(MSTC)。在培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清夜，并采用市場(chǎng)上可購(gòu)得的用于小鼠細(xì)胞因子ELISA的匹配抗體對(duì)(Immunokontact，Bioggio，瑞士)，按照廠家說(shuō)明測(cè)試γ干擾素(IFNγ)和IL-4的存在。
特異性CTL系的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性分析如下在12孔板中制備肽特異性CTL系。將來(lái)自免疫或?qū)φ辗敲庖咝∈蟮钠⒓?xì)胞以每孔6×106個(gè)接種，并與3×106個(gè)肽脈沖處理(5μg/ml的P4)的同源脾細(xì)胞共同培養(yǎng)。6-8天之后，通過(guò)如下的51Cr釋放檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。1百萬(wàn)個(gè)目標(biāo)細(xì)胞在有200μCi51Cr鉻酸鈉(Amersham，英國(guó))的情況下培養(yǎng)1小時(shí)，在完全培養(yǎng)基中清洗3次并以105個(gè)細(xì)胞/ml在有或缺少10μg有關(guān)(P4)或無(wú)關(guān)(流感NP 58-66)肽的情況下在完全培養(yǎng)基中重懸浮。通過(guò)在V型底96孔板中以最終體積200μl一式三份以不同的效應(yīng)物與目標(biāo)之比培養(yǎng)5×103個(gè)目標(biāo)細(xì)胞。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)4小時(shí)，之后收獲上清夜并用于采用以下公式確定特異性裂解特異性釋放百分率＝100×(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。
應(yīng)當(dāng)理解，僅通過(guò)實(shí)施例的方法描述了本發(fā)明，我們認(rèn)為，根據(jù)本文的公開(kāi)內(nèi)容對(duì)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的各種修改和/或改變也屬于所附權(quán)利要求書(shū)所確定的本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。
參考文獻(xiàn)1.Donnelly J.等人，“DNA疫苗”Annu.Rev.Immunol.1997，15617-48。
2.Donnelly，J.J.，F(xiàn)riedman A.，Martinez D.，Montogomery，D.L.，Shiver，J，W.，Motzel，S.L.，Ulmer，J.B.，Liu，M.A.1995.原型DNA疫苗增強(qiáng)的抗流感病毒抗原遺傳漂變保護(hù)的臨床前效力。Nature Med.1583-87。
3.Lu，S.，Arthos，J.，Montefiori，D.C.，Yasutomi，Y.，Manson，K，.Mustafa，F(xiàn).，Johnson，E.，Santoro，J.C.Wissink，J.，Mullins，J，I.，Haynes，J.R.，Letvin，N，L.，Wyand，M.，Robinson，H.L.1996.在獼猴中試驗(yàn)猿猴免疫缺陷病毒DNA疫苗。J.Virol.703978-91。
4.Fuller，D.H.Haynes，J.R.，1994.接受基于DNA糖蛋白120疫苗的小鼠中1型HIV糖蛋白120-特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的定性增進(jìn)。AIDS Res.Hum.Retrovir.101433-41。
5.Krieg，A.M.，Yi，A-K.，Matson，S.，Waldschmidt，T.J.，Bishop.G.A.，Teasdale，R.，Koretsky，G.A.Klinman，D.M.，1995.細(xì)菌DNA中的CpG基元誘發(fā)直接B-細(xì)胞活化。Nature 374546-48。
6.Messina，J.P.，Gilkeson，G.S.，Pisetsky，D.S.，1991.通過(guò)細(xì)菌DNA體外刺激鼠淋巴細(xì)胞增殖。J.Immunol.1471759-64。
7.Yamamoto，S.，Yamamoto，T.，Kataoka，T.，Kuramoto，E.，Yano，O.，Tokunaga，T.，1992.誘發(fā)TNF和增強(qiáng)TNF-介導(dǎo)的天然殺傷活性需要在合成的寡核苷酸中的單一回文序列。J.Immunol.1484072-76。
8.Tang，D.C.，Devit，M.，Johnston，S.A.，1992.基因免疫是誘發(fā)免疫應(yīng)答的簡(jiǎn)單方法。Nature 356152-54。
9.Yankauckas，M.A.，Morrow，J.E.，Parker S.E.，Abai，A.，Rhodes，G.H.，Dwarki，V.J.，Gromkowski，S.H.1993.通過(guò)肌內(nèi)注射包含NP基因的質(zhì)粒DNA誘發(fā)長(zhǎng)期抗核蛋白細(xì)胞免疫和體液免疫。DNACell Riol 12771-76。
10.Wang，B.，Boyer，J.，Srikantan，V.，Coney，L.，Carrano，R.，Phan，C.，Merva，M.，Dang，K.，Agadjanyan，M.，Gilbert L.，Ugen，K.E.，Williamson，W.V.，Weiner，D.B.1993.DNA接種在小鼠和非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物中誘發(fā)抗1型人類免疫缺陷病毒的中和免疫應(yīng)答。DNA CellBiol.12799-805.
11.Cox，G.，Zamb，T.J.，Babiuk，L.A.1993.注射質(zhì)粒DNA的小鼠和牛中牛皰疹病毒-1-免疫應(yīng)答。J.Virol.675664-67。
12.Davis，H.L.，Michel，M.L.，Whalen，R.G.，1993.基于DNA的免疫誘發(fā)乙肝表面抗原的連續(xù)分泌和高水平的循環(huán)抗體。Human Mol.Genet.21847-51。
13.Ulmer，J.B.，Donnelly，J.J.Parker，S.E.，Rhodes，G.H，F(xiàn)elgner，P.L.，Dwarki，V.J.，Gromokowski，S.H.，Deck，R.R.，Dewitt，C.M.，F(xiàn)riedman，A.，Hawe，L.A.，Leander，K.R.，Martinez，D.，Perry，H.C.，Shiver，J.W.，Montgomery，D.L.，Liu，M.A.，1993.通過(guò)注射編碼病毒蛋白的DNA提供抗流感的異源保護(hù)。Science 2591745-49.
14.Kuhober，A.，Pudollek，H-P，Reifenberg，K.，Chisari，F(xiàn).V.，Schlicht，H-J，Reimann，J.，Schirmbeck，R.，1996.在H-2b小鼠中DNA免疫誘發(fā)抗乙肝核心抗原的抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。J.Immunol.1563687-95.
15.Okuda，K.，Bukawa，H.，Hamajima，K.，Kawamoto，S.，Sekigawa，K.I.，Yamada，Y.，Tanaka，S.I.，Ishii，N，Aoki，I.，Nakamura，M.，Yamamoto，H.，Cullen，BR.，F(xiàn)ukushima，J.，1995.在直接注射編碼1型HIV env和rev基因產(chǎn)物的DNA之后誘發(fā)強(qiáng)有力的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Aids Res.Human Retrovir.11933-43。
16.Liu，M.A.，Davies，M.E.，Yasutomi，Y.，Perry，HC.，Letvin，N.L.，Shiver，J.W.，1994.通過(guò)DNA疫苗產(chǎn)生的抗HIV的免疫應(yīng)答。Retroviruses of Human AIDS and Related Animal Diseases，M.Girard，B.Dodet編輯，第197-200頁(yè).LyonFond.Mercel-Merieux。
17.Shiver，J.W.，Perry，H.C.，Davies，M.E.，F(xiàn)reed，D.C.，Liu，M.A.，1995.在HIV多核苷酸接種后的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞和輔助T細(xì)胞應(yīng)答。Ann.N.Y.Acad.Sic.772198-208。
18.Xiang，Z.Q.，Ertl，H.，1995.通過(guò)與表達(dá)細(xì)胞因子的質(zhì)粒共同接種操縱質(zhì)粒編碼的病毒抗原的免疫應(yīng)答。Immunity 2129-35。
19.Conry，R.M.，Widera，G.，Lobuglio，A.F.，F(xiàn)uller，J.T.，Moore，S.E.，Barlow，D.L.，Turner，J.，Curiel，D.T.，1996.增強(qiáng)多核苷酸免疫的選擇的策略。Gene Therapy 367-74。
20.Tascon，R.，Stavropoulos，E.，Colston，M.J.，Lowrie，D.B.1996.多核苷酸接種誘發(fā)顯著的抗分枝桿菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。Vaccines 96，F(xiàn).Brown，R.M.Chanock，M.S.Ginsbert，R.A.Lerner編輯，第45-49頁(yè).Cold Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Lab.Press。
21.Maniatis，T.，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour Press，第1-3卷，第二版，1989。
22.Rhodes等人，“用共同刺激性希夫堿生成藥物治療性增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，”Nature，377，第71-75頁(yè)，1995。
23. Brohm W等人，“誘發(fā)小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的質(zhì)粒DNA接種途徑，”Vaccine，第16卷，第9/10期，第949-954頁(yè)，1998。
24.Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pennysylvania(1985)。
25.Vordermeier，H.M.，Coombs，A.G.A.，Jenkins，P.McGee，J.P.，O’Haga，D.T.Davis，S.S.和Singh，M.用于結(jié)核病疫苗的合成的傳遞系統(tǒng)捕捉于可生物降解的PLG微粒中的結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白的免疫評(píng)價(jià)。Vaccine 131576-1582 1995。
26.Haynes JR.McCabe DE.Swain WF.Wedera G.Fuller JT.微粒介導(dǎo)的核酸免疫。Journal of Biotechnology.4437-42，1996。
27.Fynan，E.F.，Webster，R.G.，F(xiàn)uller，D.H.，Haynes J.T.，Santoro，J.C.，和Rohinson，H.L.，(1993)DNA疫苗通過(guò)胃腸外、粘膜和基因槍接種的保護(hù)性免疫。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011478。
權(quán)利要求
1.接種哺乳動(dòng)物以防疾病狀態(tài)的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物在合適載體中的編碼與所述疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽的核苷酸序列；另外給予所述哺乳動(dòng)物增強(qiáng)由抗原肽激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的化合物，所述化合物選自4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N，N-二乙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N-異丙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸芐酯；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲酰-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺酰戊酰胺；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲酰-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛(proponionaldeyde)；4-硝基苯甲醛；4-甲酰苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2’，4’-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4’，5，6-三羥基黃酮(flavonone)；4’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內(nèi)酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約14天至之后14天給予所述化合物1至7次。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約7天至之后約7天給予所述化合物1至7次。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中在給予所述核苷酸序列之前約24小時(shí)至之后約24小時(shí)給予所述化合物。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中基本上與給予所述核苷酸序列的同時(shí)給予所述化合物。
6.按照權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的方法，所述方法以約1天至約18個(gè)月的間隔重復(fù)1至4次。
7.按照權(quán)利要求1至6的任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)由口、肺、肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑給予所述核苷酸序列。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中采用基因槍傳遞技術(shù)給予所述核苷酸序列。
9.按照權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)由口、鼻、肺、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部途徑給予所述化合物。
10.按照權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的方法，其中采用基因槍傳遞技術(shù)給予所述化合物。
11.按照權(quán)利要求9或10的方法，其中每次以約0.1mg/kg至約100mg/kg的劑量給予所述化合物。
12.按照權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
13.按照權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
14.包含核苷酸序列和化合物的疫苗組合物，所述核苷酸序列編碼與疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽且在合適的載體中，所述化合物將增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中由所述抗原肽激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，所述化合物選自4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N，N-二乙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N-異丙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸芐酯；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲酰-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺酰戊酰胺；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲酰-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲酰苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2’，4’-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4’，5，6-三羥基黃酮；4’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內(nèi)酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；那就是及其合適的生理可接受鹽。
15.按照權(quán)利要求14的所述疫苗組合物，它為適宜于經(jīng)由口、鼻、肺、肌內(nèi)、皮下和皮內(nèi)途徑給予的形式。
16.按照權(quán)利要求14的所述疫苗化合物，它為適宜于采用基因槍傳遞技術(shù)給予的形式。
17.按照權(quán)利要求14至16的任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
18.化合物在藥物生產(chǎn)中的用途，其中給予哺乳動(dòng)物所述化合物增強(qiáng)由與疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽激發(fā)的體液和細(xì)胞應(yīng)答，給予所述哺乳動(dòng)物編碼所述肽的核苷酸序列導(dǎo)致所述肽的表達(dá)；其中所述化合物選自4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N，N-二乙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；N-異丙基5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酰胺；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸乙酯；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊腈；(±)-5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2-甲基戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-2，2-二甲基戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸甲酯；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)甲基苯甲酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸芐酯；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-丁基]四唑；7-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)庚酸；5-(2-甲酰-3-羥基-4-正丙氧基苯氧基)戊酸；5-(4，6-二氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)-N-甲基磺酰戊酰胺；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸乙酯；5-(4-氯-2-甲酰-3-羥基苯氧基)戊酸；5-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧基)戊酸；氨基胍；4-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丁酸；6-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)己酸；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸乙酯；4-(3-乙酰氨基-2-甲酰苯氧甲基)苯甲酸；2-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸；5-[4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯基]四唑；5-(2-甲酰-3-羥基-4-甲氧基苯氧基)戊酸；3-(2-甲酰-3-羥基苯氧基)丙腈；4-羥基苯乙醛；苯乙醛；4-甲氧基苯乙醛；1-羥基-2-苯基丙烷；3-苯基丙醛；4-硝基苯甲醛；4-甲酰苯甲酸甲酯；4-氯苯甲醛；4-甲氧基苯甲醛；4-甲基苯甲醛；8，10-二氧代十一酸；4，6-二氧代庚酸；戊二酮；5-甲氧基-1-四氫萘酮；6-甲氧基-1-四氫萘酮；7-甲氧基-1-四氫萘酮；2-四氫萘酮；3-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-丁酮；2’，4’-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；2-羥基-1-(4-甲氧基苯基)-戊2烯-4酮；柚配基4’，5，6-三羥基黃酮；4’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰苯；6，7-二羥基香豆素；7-甲氧基-2-四氫萘酮；6，7-二甲氧基-2-四氫萘酮；6-羥基-4-甲基香豆素；尿黑酸γ-內(nèi)酯；6-羥基-1，2-萘醌；8-甲氧基-2-四氫萘酮；及其合適的生理可接受鹽。
19.按照權(quán)利要求18的用途，其中所述藥物為適宜于經(jīng)由口、鼻、肺、肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑給予的形式。
20.按照權(quán)利要求19的用途，其中所述藥物為適用于采用基因槍傳遞技術(shù)給予的形式。
21.按照權(quán)利要求18至20的任一項(xiàng)的用途，其中所述化合物是4-(2-甲酰-3-羥基苯氧甲基)苯甲酸。
22.按照權(quán)利要求18至21的任一項(xiàng)的用途，其中所述化合物以每次約0.1mg/kg至100mg/kg的劑量給予。
23.按照權(quán)利要求18至22的任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物還包含所述核苷酸序列。
24.在按照權(quán)利要求1的方法中用于分開(kāi)、按序或同時(shí)給予的組分的組合物，它包含編碼抗原肽的核苷酸序列和增強(qiáng)由所述抗原肽激發(fā)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的所述化合物。
全文摘要
接種哺乳動(dòng)物以防疾病狀態(tài)的方法,它包括給予所述哺乳動(dòng)物在合適的載體中的編碼與所述疾病狀態(tài)相關(guān)的抗原肽的核苷酸序列;另外給予所述哺乳動(dòng)物增強(qiáng)由所述抗原肽激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),所述化合物選自本文所包含的名單中,其中所述化合物最好是妥卡雷瑣或其適宜的生理可接受鹽或酯。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1326358SQ99812463
公開(kāi)日2001年12月12日 申請(qǐng)日期1999年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月26日
發(fā)明者J·查羅, R·基斯林 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司