專利名稱：：口服接種的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及利用作為疾病防治輔助手段的飲用水或糖漿對健康動物進行口服接種的方法和組合物。
背景技術：
：有多種折磨動物種群的疾病，使得他們衰弱和死亡。以前對這些傳染疾病的成功接種是為了改善或消除感染動物體內疾病的癥狀?？诜臃N是優(yōu)選的方法，因為它使注射變的并非必需。在大量的家畜和家畜，如豬、家禽、牛、綿羊、山羊及馬中進行注射接種是非常耗時的，并且工作量大。此外，肌肉注射會對肉產生破壞，并給動物造成緊張。在家養(yǎng)寵物，如狗和貓中，通過進行有效的口服疫苗來預防普通的感染就可避免接受肌肉注射而造成的緊張。世界上，豬和家禽養(yǎng)殖場的規(guī)模已經有了相當的提高?，F在許多養(yǎng)豬場可容納10,000多頭斷奶小豬，而現在許多家禽養(yǎng)殖場甚至可容納更多的家禽。對每頭豬或每只家禽進行傳統(tǒng)的疫苗接種既耗時又比較困難。在接種過程中，要對每頭豬或家禽捕抓、注射至少一次，在許多情況下還需要兩次，并要對其進行原因分析。由于存在這些挑戰(zhàn)，所以通過飲用水對多組動物給藥(群體給藥)以有效疫苗來保護豬或家禽免于感染將會為養(yǎng)殖者帶來很大的益處，可以節(jié)省勞動力成本，并可避免緊張和由針頭造成的肉的損害。最后，家養(yǎng)充物，如狗和貓，將從口服疫苗給藥受益，可以減輕他們的緊張并避免注射。以前，通過飲用水對大群家禽進行疫苗群體給藥的主要缺點是水消耗上的波動引起疫苗劑量不連續(xù)，以及存在許多動物根本就沒有給藥任何疫苗這種可能。此外，當混合到水中時，疫苗中的細菌或病毒因子的生存能力和穩(wěn)定性都受到影響。隨著時間的推移，這些因子在水中的穩(wěn)定性會大幅度下降。因此，具有誘惑力的是提供一種用于在有限時間內對動物群體給藥的疫苗，這樣就可避免免疫原因子的不穩(wěn)定。提供能夠保證整個動物群體持續(xù)對含有疫苗的飲用水自主給藥的疫苗也是非常有益的。對可預防感染因子引起的疾病的疫苗口服給藥的另一主要缺點是這些因子常常具有令人不舒服的氣味和滋味。對大群動物進行群體給藥的疫苗制劑必須對這些動物具有吸引力，否則，他們就不會對他們進行自主給藥，也即他們自主飲用。同樣的，對那些欄養(yǎng)動物或單獨圈養(yǎng)的動物給藥的疫苗制劑味道可口將是有益的，這樣他們會對這些制劑進行自主給藥。最后，對家養(yǎng)寵物來講，一般是獸醫(yī)或動物健康護理工對這些動物通過嘴來給藥，但這經常遭到動物的拒絕并將疫苗吐出。因此，提供對動物來說是誘人的、并且能夠提高成功給藥的可能性和疫苗攝取的口服給藥疫苗具有很大的益處。WO98/51279中描述了對含有編碼抗原肽段的DNA的口服疫苗進行給藥，其中的抗原肽段是結合到聚合物微粒中的。味道增強因子可結合到此聚合物微粒中。然而，這樣的微粒不是水溶性的，不能提供對引起疾病的細菌或病毒的給藥。Bell等(AustralianVeterinaryjournal68(3)，1991，pp.85-89)描述了通過群體給藥方式對雞給藥雞新城疫疾病V4株疫苗。該疫苗是通過以下三種方式給藥的1)將其與脫脂奶混合并在飲用水中給藥；2)以氣霧劑形式給藥；3)以粗噴霧劑形式給藥。雖然有血清學證據證明產生了抗雞新城疫病毒的抗體，但是沒有對病毒攻擊進行研究。因此就不可能確定這些家禽對抗疾病的疫苗的接種程度。更重要的，沒有進行努力來使這些疫苗制劑進行改進以使其對這些家禽來講更可口些。Grieve描述了對雞進行群體給藥的疫苗進行的評估，此疫苗是通過在雞新城疫疾病疫苗制劑中添加蘭色染料并利用飲用水或噴霧方式進行群體給藥的。選用染料是為了利用他們在這些家禽舌上的暫時染色來監(jiān)測疫苗的消耗。這些染料證明，僅僅有約80％的家禽飲用了疫苗。沒有進行努力來使疫苗制劑對家禽來講更可口一些。因此，制備一種有效的、對動物來說可口的、并節(jié)省勞動力的口服給藥疫苗并對其給藥是令人極其向往的。這樣的疫苗制劑為獸醫(yī)、牛奶和肉生產商提供了一種便利的戰(zhàn)略工具來提高羊或其他動物的健康，而在獸醫(yī)行醫(yī)中，動物不拒絕的、更可口的口服疫苗是更誘人的。發(fā)明簡述本發(fā)明包括為動物提供保護以抵抗疾病的方法，該方法包括(a)將可口的水溶性食用香料與水溶性載體混合以對口服給藥疫苗給藥；(b)進一步將步驟(a)中的混合物與選自細菌和病毒的抗原混合，此抗原是用來作為口服給藥疫苗中的活性成分的，及(c)對動物給藥步驟(b)中的口服給藥疫苗，保護其免于遭受與抗原感染相關的疾病。本發(fā)明也包括提高動物對口服給藥疫苗的攝取的方法，此方法包括(a)將可口的水溶性食用香料與水溶性載體混合以對口服給藥疫苗給藥；(b)進一步將步驟(a)中的混合物與選自細菌和病毒的抗原混合，此抗原是用來作為口服給藥疫苗中的活性成分的，及(c)對動物給藥步驟(b)中的疫苗混合物；(d)通過食用香料來誘導提高動物對口服給藥疫苗的攝取。本發(fā)明進一步包括口服給藥動物疫苗制劑，此制劑含有以選自細菌和病毒組成的組且作為活性成分的抗原、可口的水溶性食用香料及水溶性載體以對口服給藥動物疫苗進行給藥。發(fā)明詳述所有的專利、專利申請、出版物和此處引用的其他文獻在此處全部引用作為參考。在有矛盾的情況下，以本發(fā)明中的描述，包括定義為準。此處所用的名詞“群體給藥”定義為對大型養(yǎng)殖場中聚集在一起的動物群體大規(guī)模給藥水溶性疫苗。一般來講，這樣的養(yǎng)殖場喂養(yǎng)豬和家禽。此處所用的名詞“swine“和“pig”或“pigs”是同義的。此處所用的名詞“家禽”定義包括有雞、火雞和鴨。此處所用的名詞‘可口的食用香料’定義為一種味道增強因子，已經證明，對接受給藥動物或動物群體來說是比較理想的。在將本發(fā)明中的口服給藥疫苗制備成制劑前，需要對添加有可口的食用香料的飲用水或糖漿進行自主給藥以觀察確定其理想程度。這些食用香料的未限定的實施例包括水果食用香料如草莓、櫻桃、葡萄、西瓜、蘋果等、魚食用香料、肉食用香料及動物或動物群優(yōu)選的其他食用香料。水果食用香料特別優(yōu)選的用于對豬、馬、綿羊、山羊、貓和狗的給藥。肉食用香料特別優(yōu)選的用于對狗和貓的給藥。魚食用香料特別優(yōu)選的用于對貓的給藥。此處所用的名詞“動物處理人”包括農場工人、獸醫(yī)、動物健康專業(yè)人員或其他負責照顧動物并對動物給藥藥物、疫苗和/或食物的人。本發(fā)明包括為動物提供疾病保護和誘導提高動物對口服給藥疫苗攝取的方法和組合物。本發(fā)明中的方法涉及將細菌或病毒抗原與可口的水溶性食用香料混合，并進一步將抗原和食用香料混合物與水溶性載體混合來對動物口服給藥疫苗，這樣就為動物提供保護以免于遭受與混合抗原感染有關的疾病，并可通過食用香料誘導提高動物對疫苗的攝取。因此，本發(fā)明包含通過作為疾病防治輔助手段的飲用水或糖漿來對健康動物進行口服接種的方法和組合物?？煽诘氖秤孟懔匣旌衔餅橐呙缰苿┨峁┝丝煽诘奈兜?，這樣就可提高動物對疫苗制劑的自主給藥，和/或避免當動物處理人對動物進行給藥時動物拒絕服用疫苗制劑。制備到本發(fā)明中的疫苗中的抗原是細菌和病毒疾病引發(fā)因子。尤其優(yōu)選的是活體細菌和病毒。當對活體細菌或病毒為抗原的疫苗制劑給藥時，活體抗原的生存能力是尤其受到關注的。動物或動物組必須在抗原的生存能力嚴重消退前吸收此疫苗，這樣才能保證最大的抗原性和獲得強免疫應答。我們將“無毒性的”或“失活的”細菌或病毒理解為是不能引起動物疾病的，并且本領域中的熟練技術人員認為將這些“無毒性的”或“失活的”細菌或病毒所包括的任何株作為疫苗對動物給藥是安全的。例如，可引起包括發(fā)燒、嚴重的鼻排泄物或眼排泄物在內的輕微臨床癥狀的菌株就在本發(fā)明的范圍之內，因為我們認為這是可以接收的疫苗副作用。一種激活細菌或病毒抗原以使其用于本發(fā)明的方法是在抗原基因組中導入基因突變，例如核苷酸替代、插入和/或缺失，這樣就能廢除抗原的致病能力。重組DNA技術也可用于在細菌或病毒抗原基因組中造成工程缺失、插入和替代以便制備縮短的菌株。這些方法在本領域中是眾所周知的，并在如Sambrooketal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringsLaboratory，ColdSpringsHarbor，NewYork，1989，中有描述。本發(fā)明中，其他弱化或失活細菌或病毒抗原的方法對于本領域中的普通熟練技術人員來說都是眾所周知的。此處所用的“修飾的活體病毒”或“修飾的活體細菌”是已經進行修飾的病毒或細菌抗原，一般是通過在組織培養(yǎng)細胞中進行傳代來弱化其致病能力，但對動物給藥時，其保留了保護動物免于疾病和感染的能力。本發(fā)明中的病毒抗原的“感染單位”定義為TCID50，或感染或殺傷50％組織培養(yǎng)細胞所需的病毒量。給定培養(yǎng)物中的細菌抗原的濃度可通過本領域中熟知的標準方法，如顯微分析、克隆計數或液體培養(yǎng)物的分光光度計分析。細菌毒素抗原濃度可通過在適當動物模型如鼠中確定致死濃度(LD)和LD50來得到。利用本領域中的標準方法可從新鮮收獲的病毒培養(yǎng)物來制備疫苗。利用標準技術(細胞病效觀察、免疫熒光檢驗法或其他基于抗體之上的檢測方法)對病毒的生長進行監(jiān)測，當病毒濃度足夠高時進行收獲。在將其包含入本發(fā)明中的疫苗之前，進一步對這些病毒原料進行濃縮或利用傳統(tǒng)方法進行冷凍干燥。其他方法，如Thomas，etal.，Agri-Practice，V7.No.5，pp26-30中描述的方法都可應用。按照本領域中已知的方法對細菌進行生長培育。用于本發(fā)明中的細菌抗原可以液體形式或也可以冷凍干燥形式通過可口的食用香料和水溶性載體進行重建。一般來說，對一個體動物給藥的一劑疫苗中待給藥的細菌抗原的優(yōu)選量大約為105-1011菌落形成單位(“CFU“)，優(yōu)選約106-1010CFU，最優(yōu)選107-109CFU。在另一優(yōu)選實施方案中，有效劑量為約105-108CFU/劑。一般來說，對一個體動物給藥的一劑疫苗中待給藥的病毒抗原的優(yōu)選量應為約103.0-106.0TCID50/ml，優(yōu)選104-105TCID50/ml。一般來講，制備到本發(fā)明中的疫苗中的特定細菌或病毒抗原的劑量或有效量依賴于動物或待接種動物的年齡大小、健康狀況和免疫狀況(如既往抗原接觸、母體抗體)，以及所用的特定抗原。本領域中的熟練技術人員可按照常規(guī)方法來確定合適的有效劑量，包括待給藥的最低抗原水平和水或糖漿劑量計算。正如上文特別提到的，任何感染性的、弱化的或失活的、活的或死的細菌或病毒因子可制備到本發(fā)明的疫苗中并按照本發(fā)明中的方法給藥。尤其優(yōu)選的抗原的非限制實施例包括那些感染下列動物的抗原豬豬紅斑丹毒絲菌、大葉性肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、大腸桿菌K88、K99、F41和987P、產氣莢膜梭菌C型、豬霍亂沙門氏菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管敗血性博代菌、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、豬流感病毒、Circovirus、PRRS病毒、水痘、輪狀病毒、豬呼吸道冠狀病毒、細小病毒、偽狂犬病、可傳遞腸胃炎因子。馬馬鏈球菌、破傷風梭菌、馬流感病毒A1和A2株、馬鼻肺炎型1、1b和4、東方馬腦脊髓炎病毒、西方馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬輪狀病毒。牛大腸桿菌O157H7、多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、產氣莢膜梭菌C型、產氣莢膜梭菌D型、肖氏梭菌、Clostridiumsodellii、都柏林沙門菌和鼠傷寒沙門氏菌、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛腹瀉病毒、副流感-3病毒、呼吸道合胞體病毒。家禽鼠傷寒沙門氏菌、Sepullinapilosicoli、馬雷克病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒、土耳其鼻氣管炎、Couidiosis。狗犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、犬布氏疏螺旋體、犬埃里希體、犬支氣管敗血性博代菌、犬蘭伯賈第蟲、犬細小病毒、犬狂犬病毒。貓貓鸚鵡熱衣原體、貓免疫缺陷病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、貓白血病病毒、貓鼻氣管炎病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓狂犬病病毒。在許多情況下，制備和生產用于制備到本發(fā)明的口服給藥疫苗中的細菌和病毒抗原會使得抗原具有對動物來說不可口的味道。因此，當對溶解在飲用水或糖漿中的疫苗口服給藥時，這些動物就會因為不舒服的味道而不飲用足夠的疫苗制劑或拒絕飲用糖漿并吐出飲用了的糖漿。在本發(fā)明中，混合到疫苗制劑中的可口的食用香料促進和提高了動物對口服給藥疫苗的攝取。這些可口的食用香料是以由所用食用香料表示的濃度來進行混合的。優(yōu)選的濃度包括至少約0.01％-1.0％或更高。液體食用香料可利用滴管或其他方式添加到疫苗制劑中。如果使用前是以粉狀形式存在，可對他們進行再水合并混合到疫苗制劑中。當對豬或家禽給藥本發(fā)明中的口服疫苗時，優(yōu)選的給藥方法是通過群體給藥方式對群居在一起的大群動物給藥。將疫苗制備到為動物提供連續(xù)飼料的飲用水或水滴中，動物就可飲用水并通過飲用包含在水中的疫苗進行自主給藥。連續(xù)飼料或水滴裝置的一個實施例是自動化水均衡裝置，稱做DosatronTM(DosatronInternationalInc.，Clearwater，Fla)。在一優(yōu)選實施方案中，此自動化水均衡裝置向一水滴喂食器提供了少量的水溶性疫苗/食用香料連續(xù)飼料，隨后通過群體給藥方式為動物提供水到房屋中的供給設備，例如通過噴嘴以水滴方式給藥。當對永久的單獨圈養(yǎng)或喂養(yǎng)在廄、欄、圈中的牛、馬、綿羊、山羊或其他家禽和家畜給藥本發(fā)明中的口服疫苗時，優(yōu)選的給藥方法是利用桶或通過引水槽來給藥。當對動物或家養(yǎng)寵物如貓或狗給藥本發(fā)明的口服疫苗時，可以利用溶解在飲用水中，或優(yōu)選溶解在糖漿中給藥。這樣的糖漿優(yōu)選的利用裝置如注射器給藥入口中。這樣的給藥方式優(yōu)選的部位是給藥到喉后部。按照本領域中已知的方法可將口服疫苗制備到糖漿中。在下列文獻中可發(fā)現制備糖漿疫苗的非限制性方法。“Preparationofhighconversionsyrupsbyusingthermostableamylasesfromthermoanaerobes”，Saha，B.C.；Zeikus，J.G.，EnzymeAndMicrobialTechnology，Vol.12，No.3，p.229-231(1990)；“ProblemofTheMass-VolumePreparationofMedicinalAndTableSyrups”，Bondarenko，A.I.，Farmatsiya(Moscow)，Vol.33，No.6，p.70-71(1984)；“PharmaceuticaldevelopmentofanewsyrupformulationversuscoughFromtest-sizebatchtopilot-sizebatch.”，Renaudeau，P.；Clair，P..；Caire-Maurisier，F.，TravauxScientifiquesdesChercheursduServicedeSantedesArmees，Vol.O.，No.20.(1999)，pp.113-114；“Formulationandevaluationofsustained-releasedextromethorphanresinatesyrup”，EI-Samaligy，M.S.；Mahmoud，H.A.；Omar，I.M.，EgyptianJournalofPharmaceuticalSciences，Vol.37，No.1-6(1996)，pp.509-519；“Pharmacokinetics，efficacy，toleranceofanewformulationofquinine(syrup)inuncomplicatedmalariainchildren.”，Rey，E.；Pariente-Khayat，A.；D′Athis，P.；Tetanye，E.；Varlan，M.；Olive，G.；Pons，G.，MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology，Vol.18，No.Suppl.B(1996)，pp.125；“Therapeuticbioequivalencebetweendropandsyrupformulationsofa(dextromethorphan-guaifenesin-menglithate)-basedcoughsuppressant.”，Franchi，F.，RivistadiPatologiaeClinica，Vol.48，No.3(1993)，pp.149-166；“ContinuouspreparationoffructosesyrupsfromJerusalemartichoketuberusingimmobilizedintracellularinulinasefromKluyveromycessp.Y-85”，Wei，Wenling；LeHuiying，WanWuguang；Wang，Shiyuan，ProcessBiochem.(Oxford)，Vol.34，No.6，7(1999)，pp.643-646；“Syrupsforpreparationofimpact-modifiedpolymerswithlargeparticlesize”，Doyle，ThomasR.，Oct.26，1999，U.S.PatentNo.5,973,079；“Enzymaticpreparationofglucosesyrupfromstarch”，Norman，BarrieEdmund；Hendriksen，HannaVang，Sept.16，1999，WO99/46399；“Acrylatesyrupcompositionwithgoodweatherresistance”，Makino，Takayuki；Takemoto，Toshio；Yanagase，Akira，Aug.3，1999，JapanesePatentNo.99209431(JapanesePatentApplicationNo.1998-24041-A2)；“Microelementsyrupandmethodofitspreparation”，Sviatko，Peter；，Boda，Koloman，Jul.8，1998，SlovakianPatentNo.279,128；“Monitoringbeetsugarevaporatorsyrupinvertandsucrosecompositionbyionchromatography”，Vercellotti，JohnR.；Desimone，Frank；Clarke，MargaretA.，Proc.SugarProcess.Res.Conf.(1998)，pp.442-448；“Preparationofpowdersfromtrehalosesyrups”，Totsuka，Atsushi；Yamamoto，Takeshi；Umino，Takehiro，May25，1999，JapanesePatentNo.99140094(JapanesePatentApplicationNo.1997-315993/A2filedOct.31，1997)；“HumanIGF-Isyrupcompositionanditsuse”，Shirley，BretA.；Hora，ManinderS.，May20，1999，WO99/24062；“Theeffectofcarbohydratecompositionofstarchsyrupsonthequalityandthestabilityoffoamproducts”，Nebesny，Ewa；Pierzgalski，Tadeusz；Rosicka，Justyna，Zesz.Nauk.-Politech.Lodz.，Chem.Spozyw.Biotechnol.，Vol.58(1998)，pp.69-94；“Preparationofchloralhydratesyrup”，Ishida，Atsuyo；Miyama，Shuho；Mikayama，Hiroki；Teruyama，Shigeo；Takeyasu，Akiko；Ohasi，Atsushi；Okamoto，Kazuaki；Onishi，Toshio；Yasuhara，Akihiro，IgakutoYakugaku，Vol.40，No.2(1998)，pp.329-333；“Propertiesandcompositionofconcentratesandsyrupobtainedbymicrofiltrationofsaccharifiedcomstarchhydrolyzate”，Singh，N.；Cheryan，M.，J.CerealSci.，Vol.27，No.3(1998)，pp.315-320；“Processforthepreparationofcrystallinelactulosefromcommercialsyrups”，Bimbi，Giuseppe，EuropeanPatentNo.622,374-B1；“Maltitolbasedsweeteningsyrup，confectionsproducedusingthissyrupandtheuseofacrystalizationpropagationcontrollingagentinthepreparationoftheseproducts”，Ribadeau-Dumas，Guillaume；Fouache，Catherine；Serpelloni，Michel，EuropeanPatentNo.611,527-B1；“Syrupcomposition”，Kawasaki，Yoshihiko；Suzuki，Yukio，EuropeanPatentNo.441,307-B1；“CarbohydrateSyrupsandMethodsofPreparation”，PATEL，Mansukh，M.；REED，Michael，A.；WOKAS，William，J.；KURES，Vasek，J.；EuropeanPatentNo.241,543-B1；“Methadonesyrupformulationfordiabeticheroindrugaddictpatients”，Gagnaire，L.；Fellous，J.；Dauphin，A.；Bonan，B.，JoumaldePharmacieClinique(France)，Vol.17，No.4(1998)，pp.264-267；“ApplicationofsolubilizersonthepreparationofstablesyrupscontainingExtractumplantaginisfluidum”，Tichy，E.，Pharmazie(Germany)，Vol.52，Feb.1997，pp.167-168；“Double-blind，placebo-controlled，pharmacokineticand-dynamicstudie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(jié)到可在每加侖水中傳遞1盎司疫苗至待接種豬的速度。自動化分配器同時驅動兩個水噴嘴(每個噴嘴供應10頭豬用水)，并同時向兩噴嘴傳遞疫苗。在接種期間要將疫苗貯存液置于攪拌平板上攪拌混合。在疫苗開始傳遞后，每小時對此兩噴嘴進行采樣。在含有5％羊血的TSAII瓊脂平板上進行活細菌計數。每個樣品進行5個平行。第二次接種時，疫苗水合方法、分配器及樣品采集與第一次接種相同。疫苗劑量的計算飲用水中疫苗濃度和劑量的確定如附錄4所示。第一次接種時，兩個噴嘴的平均活菌數為3.50×105CFU/ml，每頭豬的水消耗量估計值是173ml，這是通過豬群體重和已公布的水消耗率來確定的。因此，對每頭豬實際給藥的CFU/劑為3.50×105CFU/ml×173ml＝6.06×107CFU。同樣的，第二次接種時，兩個噴嘴的平均活菌數為1.42×105CFU/ml，每頭豬水的消耗量估計值是336ml，這是通過豬群體重和已公布的水消耗率來確定的。因此，對每頭豬實際給藥的CFU/劑為1.42×105CFU/ml×336ml＝4.77×107CFU。附錄4飲用水中的疫苗生存能力的證明和劑量確定*946ml是基于一頭100lb.豬在24小時內飲用1加侖(3785.4ml)水的計算之上的，因此，一頭100lb.豬在6小時的接種期內將會飲用946毫升水。貯存液和噴嘴水樣中疫苗活體計數的比較對貯存液和噴嘴水樣中疫苗活體計數進行了比較。第一次和第二次接種的結果分別如表1和表2所示。第一次接種時，貯存液的平均活體計數是1.36×108CFU/ml。兩噴嘴樣品的平均CFU/ml為3.49×105CFU/ml，其平均理論CFU/ml是(貯存液的平均CFU/ml/128)1.06×106CFU/ml。噴嘴樣品平均值的對數值和其理論濃度的對數值相差0.48。類似的，第二次接種時，貯存液的平均活體計數是3.51×107CFU/ml。兩噴嘴樣品的平均CFU/ml為1.42×105CFU/ml，其平均理論CFU/ml是(貯存液的平均CFU/ml/128)2.74×105CFU/ml。噴嘴樣品平均值的對數值和其理論濃度的對數值相差0.29。此研究得到的數據表明，噴嘴樣品和貯存液間的平均傳遞濃度沒有超出預期值(也即小于0.5個對數值)，在CFU測定的正常范圍之內。表1第一次接種貯存液和噴嘴樣品中疫苗的活細菌計數的比較分配器調節(jié)為1∶128的傳送比率理論CFU/ml是按照貯存液/128來計算的。表2第二次接種貯存液和噴嘴樣品中疫苗的活細菌計數的比較分配器調節(jié)為1∶128的傳送比率理論CFU/ml是按照貯存液/128來計算的。接種后觀察在每次接種后對接種豬進行與丹毒相關的臨床癥狀的觀察，持續(xù)8天以保證疫苗的安全性。在觀察期內每天也要測量直腸溫度。觀察和病毒攻擊方法第二次接種3周后，利用毒性菌株豬紅斑丹毒絲菌對接種過的豬和對照組豬進行攻擊。如SOP#a11-015-02(豬紅斑丹毒絲菌血清型1，用于對SPF豬進行攻擊)中所述來制備攻擊用菌株(E1-6P，IRPERCSerial4，USDA，APHIS，CVB-L，9-97攻擊)。簡單來講，此培養(yǎng)物得自CVB-L，Ames，Iowa，在變動了的Friest培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對CFU/ml進行確定，隨后將培養(yǎng)物冰凍保存。進行病毒攻擊時，要快速溶解冰凍的貯存液，對每頭豬頸部肌肉注射1ml攻擊培養(yǎng)物。在攻擊前和攻擊后，在TSAII血瓊脂平板上對攻擊物質進行CFU計數以確定攻擊劑量(5.74×104CFU/ml)。按照9CRF113.67所述，在攻擊前兩天和攻擊后7天，對所有豬的與丹毒相關的臨床癥狀進行觀察并測量直腸溫度。攻擊實驗的詳細規(guī)程如下所示A.材料1.防護設備(手套、外套及安全眼鏡)2.一株活的豬紅斑丹毒絲菌菌株E1-6PIRPERCSerial4-9/97，NVSL攻擊培養(yǎng)基上的第一代培養(yǎng)物.3.無菌胰蛋白酶大豆肉湯4.取自SPF群的易感染豬5.注射器6.針頭7.直腸溫度計8.無菌移液管9.無菌稀釋試管10.血瓊脂平板11.無菌接種環(huán)12.200ul移液管13.無菌移液管管頭B.方法1.穿上防護性衣服和其他東西(手套、外套及安全眼鏡)來保護管理者免于潛在的危險。豬紅斑丹毒絲菌為一已知的人類病原體，可引起敗血癥、皮膚病損、關節(jié)炎、和/或死亡。它是通過體液和裸露的傷口傳播的。任何值得懷疑的暴露都要及時報告。2.在攻擊前-2、-1和0天時，測定直腸體溫(將他們作為每頭豬的基線溫度)并記錄這些溫度。3.正好在對攻擊物質給藥前，在無菌條件下制備攻擊物質(豬紅斑丹毒絲菌菌株E1-6PIRPERCSerial4-9/97)。通過在手中摩擦來快速溶解盛有攻擊物質的小瓶。在AttachmentII中記錄種子溶解的時間。輕輕晃動種子小瓶，利用下列方法，在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中將種子稀釋到最終濃度6.5×104CFU/ml(種子濃度約為2.15×107CFU/ml)。在無菌條件下，將0.5ml攻擊種子添加到4.5ml無菌TSB中(試管1-2.15×106CFU/ml)。試管1在室溫下放置15分鐘，然后將試管1完全混勻，無菌條件下從試管1取3.0ml添加到7mlTSB中(試管2-6.5×105CFU/ml)。將試管2混合完全，無菌條件下，在TSB中將試管2做1∶10稀釋(試管3-6.5×104CFU/ml)。制備足夠的稀釋液來攻擊適當數目的豬(也即，如果需要利用1.0ml劑量、濃度為6.5×104CFU/ml的攻擊物質來攻擊25頭豬，那就至少要制備30ml6.5×104CFU/ml攻擊物質。這就需要在無菌條件下從試管2中取3ml添加到27.0ml無菌TSB中)。攻擊前，在冰上放置所有的攻擊物質并對各試管進行稀釋。4.確定攻擊物質的濃度。將試管3完全混勻，并在無菌條件下從中取出0.5ml添加到4.5ml無菌TSB中(試管4-6.5×103CFU/ml)。將試管4完全混勻，并在無菌條件下從中取出0.5ml添加到7.0ml無菌TSB中(試管5-4.3×102CFU/ml)。5.在三個綿羊血瓊脂(SBA)平板上標記上“試管5-攻擊前豬紅斑丹毒絲菌”、時間及首字母。將試管5完全混勻，無菌條件下從中分別取3個0.1ml等份并置于3個SBA平板上。利用無菌接種環(huán)將樣品涂布于SBA平板表面，但不要太靠近邊緣。在37℃下對這些平板進行20-48小時的培育。記錄攻擊前CFU在平板上的生長時間。將所有稀釋試管置于冰上。6.從步驟IV.B.3中制備的試管3中取1.0ml、1M攻擊物質從頸部肌肉對所有的豬進行攻擊。記錄從哪一側頸部對豬進行的攻擊。在攻擊期間，所有的攻擊物質都置于冰上。7.對豬進行攻擊之后，將試管5完全混勻。在SBA平板上標記上“試管5-攻擊后豬紅斑丹毒絲菌”及日期。無菌條件下，從試管5中分別取3個0.1ml等份并置于3個SBA平板上。利用無菌接種環(huán)將樣品涂布于SBA平板表面，但不要太靠近邊緣。在37℃下對這些平板進行20-48小時的培育。記錄攻擊后CFU在平板上的生長時間并計算攻擊物質開始融化到攻擊后CFU操作結束所需的時間。8.連續(xù)7天測量并記錄每頭豬的體溫。檢查每頭豬的丹毒臨床癥狀(伴有食欲缺乏的抑郁癥、僵硬、和/或關節(jié)受累、伴有或未伴有轉移性皮膚損傷的垂死)并記錄觀察結果。另外，檢查并記錄注射位點反應、全身皮膚紅疹、無胃口或蒼白病。9.獸醫(yī)應對那些在研究期間死亡但沒有表現丹毒臨床癥狀的豬進行尸體解剖以確定其死因。10.利用焚燒或高壓消毒方式來處理殘存的攻擊物質。11.對SBA平板上的菌落進行計數并做平均，記錄。C.計算/說明1.如果對照組豬連續(xù)兩天(攻擊前幾天除外)具有臨床癥狀和/或體溫為105.6°F，則此豬為丹毒陽性(見9CRF§113.67)。在現場管理人員或參與的獸醫(yī)的決定下，利用青霉素對滿足此標準并認為是丹毒陽性的豬進行治療以減輕其痛苦。2.如果此攻擊有效，在觀察期內就必須至少有80％的對照組豬表現丹毒陽性(見9CRF§113.67)。3.增加在最終稀釋平板上計數得到的平均菌落數。將攻擊前和攻擊后CFU的濃度進行平均。對于一有效攻擊來講，攻擊物質的平均濃度應為5×104-9×104CFU/ml。第一次接種后的臨床癥狀和體溫在第一次接種后連續(xù)7天對接種的豬進行觀察，沒有表現任何與丹毒相關的臨床癥狀。在接種后的觀察期內，除兩頭豬分別在4DPV1和5DPV1各有一天體溫為104.6°F外，絕大多數豬體溫正常。上述兩頭豬沒有表現出任何臨床癥狀。在觀察期內，一些接種的豬表現出體溫高出基線溫度1°F，這可能是在對豬進行處理時使豬興奮的原因。同樣的，一些未接種的對照組豬(例如具有1或2天高溫的豬)沒有表現任何臨床癥狀。第二次接種后的臨床癥狀和體溫在第二次接種后連續(xù)8天內，接種組豬未表現任何與丹毒相關的臨床癥狀。在觀察期內，除一頭豬在6DPV2的一天時間內體溫為104.2°F及另一頭豬分別在5DPV2和6DPV2兩天時間內體溫為104.1°F外，絕大多數豬具有體溫正常。上述兩頭豬在觀察期內沒有表現出任何臨床癥狀。類似的，一頭對照組豬在7DPV2的一天時間內體溫為104.3°F，但沒有表現任何臨床癥狀。這些個別時間高溫可能是在對豬進行處理時使豬興奮的原因。從每次接種后的臨床觀察和體溫測定得到的數據表明，對豬來講，此疫苗菌株是安全的，接種后不會引起與丹毒相關的臨床癥狀。攻擊后臨床觀察在第二次接種后的第21天，利用豬紅斑丹毒絲菌對20頭接種豬和10頭對照豬進行攻擊。在攻擊前兩天和攻擊后7天，對所有的豬觀察與丹毒相關的臨床癥狀并測定直腸體溫。攻擊后對照組豬的臨床癥狀所有未接種的對照組豬(100％)顯現出嚴重的丹毒臨床癥狀，包括關節(jié)炎、全身紅疹(鉆石型皮膚損傷)、昏睡、無胃口、抑郁、和突然死亡。攻擊后第四天，四頭對照組豬O404、O417、O421和O432死亡。攻擊后第7天，10頭對照組豬中的7頭(70％)死亡。在SDPC死亡前，O403號豬體溫為105.7°F。O404和O406在死亡前體溫分別為103.1°F和102.4°F。豬O407、O421、O432和R73死亡前的體溫分別為105.2°F、104.9°F、99.5°F和105.6°F。三頭對照組豬O411、O426和O429活了下來，但顯現出嚴重的臨床癥狀。攻擊后接種組豬的臨床癥狀在觀察期內，百分之百(20頭中的全部20頭)的接種豬沒有表現丹毒的典型臨床癥狀。在2DPC時豬O409的注射點發(fā)紅。在攻擊后觀察期內，接種組豬的體溫沒有超過104°F的。從接種組豬收集的數據表明，100％的接種組豬獲得了保護而對豬紅斑丹毒絲菌免疫。這些結果很好的滿足了9CFR的要求，說明此疫苗可有效保護豬免于遭受豬紅斑丹毒絲菌感染。從攻擊后豬中分離豬紅斑丹毒絲菌從攻擊后對照組豬中或在尸體解剖時采集血液、脾、肝和腸系膜淋巴結，從中分離豬紅斑丹毒絲菌。正如所觀察到的，豬紅斑丹毒絲菌是從對照組豬O403、O406、O411、O426、O429和R73采集的樣品中分離的。豬O404、O417、O421和O432是在4DPC發(fā)現死亡的，當時沒有進行樣品采集。在7DPC時也從接種組豬中采集血樣，但沒有進行豬紅斑丹毒絲菌分離。從對照組豬中分離豬紅斑丹毒絲菌的結果滿足9CRF中對合格豬紅斑丹毒絲菌攻擊的要求。結論本研究得到的數據表明，本發(fā)明的添加有食用香料的疫苗制劑，在本研究中是含有無毒活體培養(yǎng)物豬紅斑丹毒絲菌疫苗，是安全的，并可有效保護豬免于遭受豬紅斑丹毒絲菌感染引起的疾病，按照本發(fā)明中的方法，此疫苗是利用分配器，通過飲用水，以約6.06×107CFU/劑的速度進行群體給藥的。本研究的結果很好的滿足了9CRF113.67中的要求，證明無毒活體培養(yǎng)物豬紅斑丹毒絲菌疫苗是合格的，并可發(fā)給許可證。實施例2對口服給藥添加有食用香料的疫苗與口服給藥未添加食用香料的疫苗進行比較為了證明相對于沒有添加食用香料的疫苗，口服給藥本發(fā)明中添加有食用香料的疫苗可提供免于感染的更大保護，選用以冷凍干燥的豬紅斑丹毒絲菌做抗原并添加有草莓味的疫苗制劑、以冷凍干燥的豬紅斑丹毒絲菌做抗原但不添加食用香料的疫苗制劑，以不添加任何食用香料或不添加抗原的制劑做對照，執(zhí)行了一個與實施例1中所描述的接種規(guī)程類似的接種規(guī)程。如實施例1中所描述來制備所有的疫苗和對照制劑。如實施例1中所描述進行攻擊實驗。實驗和數據在下表中有描述表4給藥添加有食用香料的疫苗制劑-研究I表5給藥添加有食用香料的疫苗制劑-研究II表6給藥未添加食用香料的疫苗制劑實施例3為了證明在沒有添加食用香料的疫苗制劑中的抗原是具有活性的，對豬注射給藥單劑量的未添加有食用香料的疫苗制劑。數據在下表7中給出，這些數據表明抗原是具有活性的，并提供證據證明了食用香料使豬更大量的攝取通過飲用水口服給藥的、添加有食用香料的疫苗。表7未添加有食用香料的疫苗的注射器傳遞參考文獻M.L.Augenstein，L.J.Johnston，G.C.Shurson，J.D.HawtonandJ.E.Pettigrew.FormulatingFarm-SpecificSwineDiets；UniversityofMinnesotaExtensionService.1994。權利要求1.為動物提供保護抵抗疾病的方法，包括(a)將可口的水溶性食用香料與水溶性載體混合以用于對口服給藥疫苗給藥；(b)進一步將步驟(a)中的混合物與選自細菌和病毒的抗原混合，此抗原是用來作為口服給藥疫苗中的活性成分的，及(c)對動物給藥步驟(b)中的口服給藥疫苗，來保護其免于遭受與抗原感染相關的疾病。2.權利要求1中的方法，其中此抗原可在選自豬、家禽、牛、綿羊、山羊、馬、貓和狗的動物中引起疾病。3.權利要求2中的方法，其中抗原選自豬紅斑丹毒絲菌、大葉性肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、大腸桿菌K88、K99、F41和987P、產氣莢膜梭菌C型、豬霍亂沙門氏菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管敗血性博代菌、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、豬流感病毒、Circovirus、PRRS病毒、水痘、輪狀病毒、豬呼吸道冠狀病毒、細小病毒、偽狂犬病、可傳遞腸胃炎因子、馬鏈球菌、破傷風梭菌、馬流感病毒A1和A2株、馬鼻肺炎型1、1b和4、東方馬腦脊髓炎病毒、西方馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬輪狀病毒、大腸桿菌O157:H7、多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、產氣莢膜梭菌D型、肖氏梭菌、諾氏梭菌、敗血梭菌、溶血梭菌、Clostridiumsodellii、都柏林沙門菌和鼠傷寒沙門氏菌、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛腹瀉病毒、副流感-3病毒、呼吸道合胞體病毒、Sepullinapilosicoli、馬雷克病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒、土耳其鼻氣管炎、Couidiosis、犬布氏疏螺旋體、犬埃里希體、犬支氣管敗血性博代菌、犬蘭伯賈第蟲、犬瘟熱病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒、犬狂犬病毒、貓鸚鵡熱衣原體、貓免疫缺陷病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、貓白血病病毒、貓鼻氣管炎病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓狂犬病病毒。4.權利要求1中的方法，其中的疫苗是通過飲用水給藥的。5.權利要求1中的方法，其中的動物選自豬、家禽、牛、綿羊、山羊、馬、貓和狗。6.權利要求1中的方法，其中的動物選自豬和家禽。7.權利要求6中的方法，其中口服給藥疫苗的給藥是利用飲用水進行的群體給藥。8.權利要求7中的方法，其中的動物是豬而抗原是豬紅斑丹毒絲菌。9.權利要求1中的方法，其中動物選自狗和貓。10.權利要求7中的方法，其中的口服給藥疫苗是利用注射器給藥入口中的。11.誘導提高動物對口服給藥疫苗攝取的方法，包括；(a)將可口的水溶性食用香料與水溶性載體混合以用于對口服給藥疫苗的給藥；(b)進一步將步驟(a)中的混合物與選自細菌和病毒的抗原混合，此抗原是用來作為口服給藥疫苗中的活性成分的，及(c)對動物給藥步驟(b)中的疫苗混合物；(d)通過食用香料來誘導提高動物對口服給藥疫苗的攝取。12.權利要求11中的方法，其中此抗原可在選自豬、家禽、牛、綿羊、山羊、馬、貓和狗的動物中引起疾病。13.權利要求12中的方法，其中抗原選自豬紅斑丹毒絲菌、大葉性肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、大腸桿菌K88、K99、F41和987P、產氣莢膜梭菌C型、豬霍亂沙門氏菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管敗血性博代菌、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、豬流感病毒、Circovirus、PRRS病毒、水痘、輪狀病毒、豬呼吸道冠狀病毒、細小病毒、偽狂犬病、可傳遞腸胃炎因子、馬鏈球菌、破傷風梭菌、馬流感病毒A1和A2株、馬鼻肺炎型1、1b和4、東方馬腦脊髓炎病毒、西方馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬輪狀病毒、大腸桿菌O157:H7、多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、產氣莢膜梭菌D型、肖氏梭菌、諾氏梭菌、敗血梭菌、溶血梭菌、Clostridiumsodellii、都柏林沙門菌和鼠傷寒沙門氏菌、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛腹瀉病毒、副流感-3病毒、呼吸道合胞體病毒、Sepullinapilosicoli、馬雷克病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒、土耳其鼻氣管炎、Couidiosis、犬布氏疏螺旋體、犬埃里希體、犬支氣管敗血性博代菌、犬蘭伯賈第蟲、犬瘟熱病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒、犬狂犬病毒、貓鸚鵡熱衣原體、貓免疫缺陷病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、貓白血病病毒、貓鼻氣管炎病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓狂犬病病毒。14.權利要求11中的方法，其中的疫苗是通過飲用水給藥的。15.權利要求11中的方法，其中的動物選自豬、家禽、牛、綿羊、山羊、馬、貓和狗。16.權利要求15中的方法，其中的動物選自豬和家禽。17.權利要求16中的方法，其中口服給藥疫苗的給藥是利用飲用水進行的群體給藥。18.權利要求17中的方法，其中的動物是豬而抗原是豬紅斑丹毒絲菌。19.權利要求11中的方法，其中動物選自狗和貓。20.權利要求19中的方法，其中的口服給藥疫苗是利用注射器給藥入口后部的。21.口服給藥動物疫苗制劑，包含有選自細菌和病毒的抗原作為活性成分、可口的水溶性食用香料、以及用于對口服給藥動物疫苗給藥的水溶性載體。22.權利要求21中的疫苗制劑，其中此抗原可在選自豬、家禽、牛、綿羊、山羊、馬、貓和狗的動物中引起疾病。23.權利要求22中的疫苗制劑，其中抗原選自豬紅斑丹毒絲菌、大葉性肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、大腸桿菌K88、K99、F41和987P、產氣莢膜梭菌C型、豬霍亂沙門氏菌、多殺巴斯德氏菌、支氣管敗血性博代菌、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、哈德焦鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、黃疸鉤端螺旋體、豬流感病毒、Circovirus、PRRS病毒、水痘、輪狀病毒、豬呼吸道冠狀病毒、細小病毒、偽狂犬病、可傳遞腸胃炎因子、馬鏈球菌、破傷風梭菌、馬流感病毒A1和A2株、馬鼻肺炎型1、1b和4、東方馬腦脊髓炎病毒、西方馬腦脊髓炎病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒、馬輪狀病毒、大腸桿菌O157:H7、多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、產氣莢膜梭菌D型、肖氏梭菌、諾氏梭菌、敗血梭菌、溶血梭菌、Clostridiumsodellii、都柏林沙門菌和鼠傷寒沙門氏菌、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛腹瀉病毒、副流感-3病毒、呼吸道合胞體病毒、Sepullinapilosicoli、馬雷克病病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒、土耳其鼻氣管炎、Couidiosis、犬布氏疏螺旋體、犬埃里希體、犬支氣管敗血性博代菌、犬蘭伯賈第蟲、犬瘟熱病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒、犬狂犬病毒、貓鸚鵡熱衣原體、貓免疫缺陷病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、貓白血病病毒、貓鼻氣管炎病毒、貓泛白細胞減少癥病毒、貓狂犬病病毒。24.權利要求21中的疫苗制劑，其中的給藥載體是飲用水。25.權利要求21中的疫苗制劑，其中的動物是豬而抗原是豬紅斑丹毒絲菌。26.權利要求21中的疫苗制劑，其中動物選自狗和貓，而給藥載體是糖漿。全文摘要本發(fā)明包括為動物疾病提供保護和誘導提高動物對口服疫苗的攝取的方法和組合物。本發(fā)明中的方法涉及將細菌或病毒抗原與美味的水溶性食用香料混合，進而將抗原和食用香料混合物與水溶性載體混合來對疫苗進行口服給藥，以便為動物提供對與混合抗原感染有關的疾病的保護，以及利用食用香料來提高動物對疫苗的攝取。因此，本發(fā)明包括利用作為疾病防治輔助手段的飲用水或糖漿對健康動物進行口服接種的方法和組合物。美味的食用香料混合物為疫苗制劑提供了誘人的味道，這樣就可以促進疫苗制劑的自主給藥和/或避免動物管理者對動物給藥時動物產生的排斥。文檔編號A61K39/00GK1529615SQ01812150公開日2004年9月15日申請日期2001年6月22日優(yōu)先權日2000年6月30日發(fā)明者H·J·楚,HJ楚,W·李申請人:惠氏公司