專利名稱：：基因表達在植物中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的制作方法基因表達在植物中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)發(fā)明背景本申請要求申請日為2005年5月19日申請的美國臨時專利申請順序號60/682,471的權(quán)益，該申請的全部公開內(nèi)容通過引用具體結(jié)合到本文中。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來講涉及植物分子生物學(xué)，更準確地講涉及基因表達在植物中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方法。2.發(fā)明背景在生物工程領(lǐng)域內(nèi)，主要的焦點一向集中在提高轉(zhuǎn)基因的表達水平以達到例如特殊的商業(yè)目標。減量調(diào)節(jié)基因表達的分子元件很大程度上被忽視了，因為一般認為它們沒有商業(yè)價值。盡管如此，減量調(diào)節(jié)基因表達的元件，尤其是以可預(yù)測的方式減量調(diào)節(jié)基因表達的元件可能是有用的，特別是當需要達到特定的基因表達水平時。例如，給定基因非常高水平的表達并不總是需要的，人們可能希望給定轉(zhuǎn)基因的表達高過某一水平但卻低于另一水平。雖然基因表達的調(diào)節(jié)可以在轉(zhuǎn)錄步驟進行(例如通過選擇合適的啟動子或啟動子元件與給定的轉(zhuǎn)基因一起使用)，但是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達也是可行的。這種基因表達的轉(zhuǎn)錄后控制還提供了仍然允許利用時間、空間或可誘導(dǎo)性特征的優(yōu)勢，這些特征是通過使用合適的啟動子或啟動子元件所獲得的?；虮磉_轉(zhuǎn)錄后控制的一種方法是控制由基因轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定性。包括在轉(zhuǎn)錄RNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)中的去穩(wěn)定序列(destabilizingsequence)顯示4吏煙草(Mc'o"'awato6acww)RNA和動物RNA的mRNA不穩(wěn)、定，減少mRNA的半壽期。例如，植物的SAUR(小分子植物生長素上調(diào)RNA(smallauxinupRNA))基因含有DST元件，該元件為3'非翻譯區(qū)(3，UTR)中的43個堿基對序列，在植物種間高度保守，據(jù)凈艮道它至少在煙草植物中賦予SAURmRNA不穩(wěn)定性。參見例如Newman等(1993)、Green(1993)、Guti6rrez等(1999)和Feldbrugge等(2001),這些文獻都通過引用結(jié)合到本文中。尚不清楚雙子葉農(nóng)作物或單子葉植物的SAUR終止子或DST元件是否對RNA具有相似的作用。另一個保守RNA基序，即多拷貝AUUUA,據(jù)信能使動物的mRNA不穩(wěn)定，在植物中也發(fā)現(xiàn)如此；據(jù)報道AUUUA重復(fù)序列能使煙草的mRNA不穩(wěn)定，而AUUAA重復(fù)序列則不能，這表明這個基序的序列特異性，而不僅僅是AU含量。參見例如Ohme-Takagi等(1993)和Guti6rrez等(1999),逸些文獻都通過引用結(jié)合到本文中。然而，尚不清楚AUUUA重復(fù)序列是否在其它雙子葉植物或單子葉植物中具有類似作用。發(fā)明概述本發(fā)明提供在植物例如雙子葉農(nóng)作物和單子葉農(nóng)作物中轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達的方法。更準確地說，本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)錄后降低植物的信息穩(wěn)定性的方法，該方法包括在植物的目標基因3，非翻譯區(qū)添加去穩(wěn)定序列，從而使目標基因的信息穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄后降低，優(yōu)選導(dǎo)致相對于去穩(wěn)定序列不存在時所觀察到的表達水平，目標基因的表達水平較低。一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3'非翻譯區(qū)具有一個或多個去穩(wěn)定序列，從而相對于在一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物的種子中以較低水平表達。另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含非組成型啟動子及與其操作性連接的編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3，非翻譯區(qū)具有一個或多個去穩(wěn)定序列，從而相對于在一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。又一方面，本發(fā)明提供用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，所迷轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在其基因組DNA內(nèi)包舍編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3，非翻譯區(qū)具有一個或多個去穩(wěn)定序列，從而相對于在一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中以較低水平表達。再一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3'非翻譯區(qū)具有一個或多個去穩(wěn)定序列，所述去穩(wěn)定序列包括重疊的ATTTAA重復(fù)序列，從而相對于所述一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述多肽在所述轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。再一方面，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包括編碼鄰氨基笨甲酸合酶的基因，所述基因在其3，非翻譯區(qū)具有一個或多個去穩(wěn)定序列，從而相對于在一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的表達，鄰氨基苯甲酸合酶在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)錄后降低目標基因在用于食物或飼料的農(nóng)作物中的信息穩(wěn)定性的方法。在一個實施方案中，該方法包括在用于食物或飼料的農(nóng)作物的目標基因3，非翻譯區(qū)添加一個或多個去穩(wěn)定序列，從而使目標基因的信息穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄后降低，優(yōu)選導(dǎo)致目標基因表達的水平低于一個或多個去穩(wěn)定序列不存在時的水平。在下面的發(fā)明詳述中將描述本發(fā)明的其它具體實施方案。附圖簡述圖1.用于下面實施例中所述瞬時轉(zhuǎn)化實驗的含有去穩(wěn)定序列的構(gòu)建體的非限制性實例。圖中給出總體設(shè)計并列舉了構(gòu)建體的相關(guān)元件。圖2.如實施例2所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件(destabilizingelement)的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的Lea9啟動子的構(gòu)建體中，與NOS終止子(pMON63691)相比，SAUR終止子(pMON63688)的不同變異體有效地降低基因表達。圖3.如實施例2所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的7Sot，啟動子的構(gòu)建體中，與NOS終止子(pMON13773)相比，SAUR終止子(pMON63688，變異體l)有效地降低基因表達。圖4.如實施例4所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的USP啟動子的構(gòu)建體中，與僅有NOS終止子(pMON58101)相比，2XDST元件與NOS終止子的組合(pMON63687)可以有效地降低基因表達。圖5.如實施例4所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的7Sot'啟動子的構(gòu)建體中，與僅有NOS終止子(pMON13773)相比，2XDST元件與NOS終止子的組合(pMON63698)有效地降低基因表達。圖6.如實施例4所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的Lea9啟動子的構(gòu)建體中，與僅有NOS終止子(pMON63691)相比，2XDST元件與NOS終止子的組合(pMON63697)有效地降低基因表達。圖7.如實施例8所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在使用驅(qū)動GUS基因的Perl啟動子的構(gòu)建體中，與僅有NOS終止子(pMON64316)相比，不同拷貝數(shù)的DST元件與NOS終止子的組合(pMON781B、pMON78116、pMON78117)有效地降低基因表達。DST的拷貝數(shù)與基因表達的水平呈負相關(guān)。圖8.含有去穩(wěn)定序列并用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建體的非限制性實例。圖中給出總體設(shè)計并列舉了實施例9中所述的構(gòu)建體的關(guān)鍵元件。圖9.表示如實施例9所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。DST和富含AU的元件有效地降低瞬時玉米表達系統(tǒng)中的基因表達。SAUR終止子含有IXDST。圖中顯示了標準差。所示表達水平與含有NOS終止子、間隔區(qū)1或間隔區(qū)2的對照載體相關(guān)。圖10.表示如實施例10所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。在轉(zhuǎn)基因大豆中在3'非翻譯區(qū)包括去穩(wěn)定元件(DST基序)，獲得了較低水平的色氨酸(Trp)。圖表采用統(tǒng)計軟件JUMP繪制，表示從多次事件的單粒R1種子值所得出的結(jié)果。橫軸表示Trp水平的平均值，用百萬分之幾(ppm)表示。標有"每對斯氏t檢驗(EachPairStudent'st)"—欄中所表示的圓圈代表每粒種子Trp水平的變異性；圓圈大小表示變異性的程度。在沒有一個圓圈與另一個圓圈重疊的情況下，彼此之間的平均值在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。圖11.如實施例9所述用于降低基因或多肽表達水平的去穩(wěn)定元件的非限制性實例。較低水平的色氨酸(Trp)與轉(zhuǎn)基因大豆中RNA水平較不穩(wěn)定相關(guān)，這表明3，非翻譯區(qū)包括2個拷貝的去穩(wěn)定元件(DST基序)足以使轉(zhuǎn)錄物減少。從pMON63680(-DST)的兩次生長植株和pMON66892(+DST)的兩次生長植株中收獲未成熟種子，采用常規(guī)方法提取總RNA，其中一部分RNA用于Taqman定量測定轉(zhuǎn)錄物水平，另一部分用于RNA印跡分析。圖A表示用Taqman測定的轉(zhuǎn)錄物水平。對于-DST，sl-s4是從一次事件所產(chǎn)生的植林，s5-s7是從第二次事件所產(chǎn)生的植林。對于+DST，s8-s9是從一次事件所產(chǎn)生的植抹，sl0-sl5是從第二次事件所產(chǎn)生的植力朱。圖B表示用RNA印跡法所測定的相對轉(zhuǎn)錄物水平。用AgroAS作為探針。Taqman法結(jié)果和RNA印跡法結(jié)果彼此間是一致的。圖B中的最下面表示印跡上RNA的相對上樣量。發(fā)明詳述I.轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3'非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，從而相對于去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物的種子中以較低水平表達。轉(zhuǎn)基因植物可得自任何目標單子葉植物或目標雙子葉植物，包括但不限于商業(yè)目的或農(nóng)業(yè)目的的植物，例如農(nóng)作物(尤其是用于人類食物或動物飼料的農(nóng)作物)、生產(chǎn)木材或紙漿的樹木、蔬菜植物、水果植物和觀賞植物。目標植物的非限制性實例包括谷類作物，例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、小米、高粱、昆諾阿藜、莧屬植物和蕎麥；銅草作物，例如禾本科牧草和苜蓿飼草；油料種子作物，例如棉花、紅花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亞麻、花生和油椰；堅果類木本植物(例如胡桃、腰果、榛子、薄殼山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、海棗、橄欖、糖甜菜、茶和咖啡；生產(chǎn)木材或紙漿的樹木；蔬菜作物，例如豆類作物(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜覆、花生)、萵苣、蘆筍、菊芋、芹菜、胡蘿卜、蘿卜、蕓薹屬(例如甘藍、羽衣甘藍(kale)、芥菜和其它多葉蕓薹屬、青花椰菜、花椰菜、孢子甘藍、蕪菁、球莖甘藍(kohlrabi))、可食用葫,(例如黃瓜、甜瓜、西葫蘆、筍瓜)、可食用蔥蒜類(例如洋蔥、大蒜、韭蔥、火蔥、北蔥)、茄科(Solanaceae)可食用成員(例如番茄、茄子、馬鈴薯、胡椒、酸漿屬(groundcherry))和藜科(Chenopodiaceae)可食用成員(例如甜菜、宭茲菜、菠菜、昆諾阿藜、莧屬植物)；水果作物，例如蘋果、梨、柑桔類水果(例如橙、來檬、檸檬、柚子等)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、獼猴桃、番木瓜、聘梨和漿果；及觀賞植物，包括觀賞花卉植物、觀賞樹木和灌木、觀賞地被植物和觀賞禾草。優(yōu)選的雙子葉植物包括但不限于油菜、棉花、馬鈴薯、昆諾阿藜、莧屬植物、蕎麥、紅花、大豆、糖甜菜和向曰葵，更優(yōu)選大豆、油菜和棉花。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因單子葉植物，更優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因單子葉農(nóng)作物，例如但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、觀賞禾草和禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更優(yōu)選玉米、小麥和水稻。所謂"外源基因"是指以天然正常存在以外的方式存在的任何基因。因此，外源基因可以是非天然的基因，并可作為轉(zhuǎn)基因?qū)氡景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中，或者對本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物而言可以是天然基因，但其位置并不是天然正常存在時的位置(例如與非天然啟動子操作性連接并作為轉(zhuǎn)基因?qū)胫参镏械奶烊换?。術(shù)語"操作性連接(的)"，當用于涉及核酸序列和/或氨基酸序列之間的關(guān)系時，是指連接所述序列使它們執(zhí)行其預(yù)定的功能。例如，將啟動子序列與目標核香酸序列操作性連接，是指啟動子序列與目標核苷酸序列連接的方式使得啟動子序列能夠指導(dǎo)目標核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或由目標核苷酸序列編碼的多肽的合成。該術(shù)語還指氨基酸序列連接的方式使得能產(chǎn)生功能性蛋白。編碼多肽的外源基因可以是任何轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄物，RNA轉(zhuǎn)錄物中至少一部分可翻譯成多肽的外源目標基因，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以經(jīng)改造含有3，非翻譯區(qū)(3，UTR),并且去穩(wěn)定序列可位于3，UTR中。外源基因可包括天然存在的序列或該天然存在序列的衍生物或同源物。天然存在序列的衍生物或同源物可包括但不限于序列的缺失、單點突變、多點突變、特殊限制性內(nèi)切酶位點的改變、功能性元件的添加或天然存在序列的其它方式的分子修飾。用于獲得這些衍生物的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Sambrook和Russell(2001)所介紹的方法(通過引用結(jié)合到本文中)。合適外源基因的非限制性實例包括編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因和編碼酶的基因，該酶參與目標分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖基因具體的非限制性實例包括編碼鄰氨基苯甲酸合酶的基因；參與多步驟生物合成途徑(可能對調(diào)節(jié)一種或多種中間產(chǎn)物的水平是有益的)的基因，例如編碼用于聚羥基鏈烷酸生物合成的酶的基因(參見例如美國專利第5,750,848號，該專利文獻通過引用具體結(jié)合到本文中)；編碼細胞周期控制蛋白(例如具有細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑樣活性的蛋白質(zhì))的基因(參見例如WO05007829所公開的基因，該專利文獻通過引用具體結(jié)合到本文中)；當在轉(zhuǎn)基因植物中表達時，使得轉(zhuǎn)基因植物具有抗病蟲害或病原體抗性的蛋白質(zhì)編碼基因基因(參見例如美國專利第5,763,245號所公開的膽固醇氧化酶的基因，該專利文獻通過引用具體結(jié)合到本文中)；編碼具有選擇性性狀(例如抗生素抗性，尤其是如果需要表達這種基因的水平足以能篩選攜帶該基因的細胞，但又不至于高到使相鄰沒有攜帶該基因的細胞"逃逸"或篩選后仍存活)的蛋白質(zhì)的基因；當表達優(yōu)選為瞬時表達的基因(例如參與抗病蟲害或抗病原體的基因，尤其是當表達是病蟲害或病原體誘導(dǎo)的基因)和可以誘導(dǎo)或恢復(fù)能育性的基因(參見例如美國專利第6,759,575號所公開的芽孢桿菌RNA酶抑制劑(barstar)/芽孢桿菌RNA酶(barnase)基因，該專利文獻通過引用具體結(jié)合到本文中)。例如，去穩(wěn)定序列可包括賦予外源基因的轉(zhuǎn)錄RNA不穩(wěn)定性(例如通過降低從內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性或半壽期)的任何序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列為至少一個選自以下元件的序列3，SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。ATTTADNA基序或序。更優(yōu)選去穩(wěn)定序列的存在導(dǎo)致相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達?？梢允褂貌恢灰粋€去穩(wěn)定序列或者多拷貝的一個或多個去穩(wěn)定序列。在一個非限制性的實例中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)可包括外源基因，該外源基因在其3，非翻譯區(qū)具有至少一個SAUR終止子、或多拷貝的DST元件、或SAUR終止子、DST元件的組合、或ATTTA與ATTTAA基序的組合。3，SAUR終止子可以為已知序列的3，SAUR終止子，其非限制性的實例包括使用基于已公布的SAUR基因SAUR-AC1(參見Gil等(1994),該文獻通過引用結(jié)合到本文中)的引物，從擬南芥0ra/)wfc^w)基因組DNA通過PCR擴增的3，SAUR終止子變異體，在此作為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4予以7^開。3'SAUR終止子還可以是新的3，SAUR終止子同源物，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過例如鑒定已知SAUR基因的同源物并對這些基因的3，UTR區(qū)進行測序，或者通過直接鑒定已知3，SAUR終止子的同源物，從而鑒定出新的3'SAUR終止子同源物。同樣，DST元件可以是已知的DST元件或新的DST元件同源物。DST元件的非限制性實例包括來自大豆基因15A的DST元件，例如在此作為SEQIDNO:5("IXDST")、SEQIDNO:6("2XDST")、SEQIDNO:7("3XDST")、SEQIDNO:8("4XDST")、SEQIDNO:9("5XDST，,)和SEQIDNO:10("6XDST")予以公開。合適的ATTTA基序包括含有ATTTA重復(fù)序列的序列。合適的ATTTAA基序包括含有ATTTAA重復(fù)序列的序列。優(yōu)選在重復(fù)序列中存在至少3個拷貝的ATTTA基序或ATTTAA基序。非限制性的實施方案包括在重疊的重復(fù)序列中包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和甚至15個拷貝以上的ATTTA基序或ATTTAA基序的去穩(wěn)定序列。因此，非限制性的實例包括3xATTTA(ATTTATTTATTTA(SEQIDNO:27》、5xATTTA(ATTTATTTATTTATTTATTTA(SEQIDNO:28》、llxATTTAAATTTAATTTAA(SEQIDNO:29》和7xATTTA/ATTTAA組合(例如ATTTATTTATTTAATTTAATTTAATTTATTTAA(SEQIDNO:30)和類似的組合)。所提供的這些實例是用來說明重復(fù)序列的重疊性質(zhì)，不得解釋為以任何方式進行限制?？梢詫ν葱蛄羞M行鑒定，例如運用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的比較工具，例如但不限于BLAST(Altschul等(1997),該文獻通過引用結(jié)合到本文中)。因此，可以對目標植物種、尤其是目標農(nóng)作物的基因組DNA序列的SAIIR同源物、已知3，SAUR終止子的同源物或已知DST元件的同源物進行檢索。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解的是，可以應(yīng)用合適的方法例如本說明書所提供的方法，采用已知的SAUR序列、已知的3，SAUR終止子序列或已知的DST元件(例如Newman等(1993)、McClure等(1989)和Yamamoto等(1992)和Gil等(1994)提供的序列，以及本文以SEQIDNO:1至SEQIDNO:104是供的序列)，設(shè)計出各種各樣的引物，以擴增并分離DNA，用于測序和測定使mRNA轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的能力，從而提供用于本發(fā)明額外的新的SAUR序列、新的3，SAUR終止子序列或新的DST元件。此外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可對已知的或新的去穩(wěn)定序列進行修飾。修飾可以包括但不限于序列的缺失、單點突變、多點突變、特殊限制性內(nèi)切酶位點的改變、功能性元件的添加、元件的重復(fù)或可能保持去穩(wěn)定序列使mRNA轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的能力不變化或甚至提高的其它分子修飾方法。用于獲得這些衍生物的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Sambrook和Russell(2001)所介紹的方法(通過引用域技術(shù)人員所熟知，詳見例如美國專利第6,583,338號，該專利文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。在本發(fā)明的一個非限制性實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉農(nóng)作物(例如大豆)或單子葉農(nóng)作物(例如玉米)，其中需要提供轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物或轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子中改良的氨基酸含量，外源基因是用于氨基酸(例如賴氨酸、色氨酸或甲疏氨酸)生物合成的基因；相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，一個或多個去穩(wěn)定序列可以用來在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物或其種子中以較低水平表達氨基酸生物合成基因，從而為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物或其種子中的氨基酸組成提供各種選擇。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含與編碼多肽的外源基因操作性連接的非組成型啟動子，該外源基因在其3，非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，從而在相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。轉(zhuǎn)基因植物可以得自任何目標單子葉植物或目標雙子葉植物；在某些優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為農(nóng)作物。在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下描述了適用于本發(fā)明的植物。適于與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物一起使用的非組成型啟動子包括空間特異性啟動子、時間特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。空間特異性啟動子可以包括細胞器特異性啟動子、細胞特異性啟動子、組織特異性啟動子或器官特異性啟動子(例如質(zhì)體特異性啟動子、根特異性啟動子或種子特異性啟動子，分別用于抑制質(zhì)體、根或種子中靶RNA的表達)。時間特異性啟動子可以包括往往會在植物生長周期的特定發(fā)育階段或者在白天或夜間不同時間或者在一年的不同季節(jié)促進表達的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子包括由化學(xué)品或環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動子，例如但不限于生物性脅迫或非生物性脅迫(例如缺水或干旱、熱、寒冷、養(yǎng)分或鹽分水平、光照水平強弱或者病蟲害侵染或病原體感染)。表達特異性啟動子還可以包括一般為組成型表達但是表達程度或者"強度，，不同的啟動子，包括通常一支視為"強啟動子"或"弱啟動子"的啟動子。為本領(lǐng)域所知。例如美國專利5,837,848、美國專利6，437,217和美國專利6,426,446公開了根特異性啟動子；美國專利6,433,252公開了玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子；美國專利申請公告2004/0216189公開了編碼質(zhì)體定位趁縮酶(plastid-localizedaldolase)的植物核基因的啟動子；美國專利6,084,089公開了寒冷誘導(dǎo)型啟動子；美國專利6,140,078公開了鹽誘導(dǎo)型啟動子；美國專利6,294,714公開了光誘導(dǎo)型啟動子；美國專利6,252,138公開了病原體誘導(dǎo)型啟動子；和美國專利申請公告2004/0123347公開了缺水誘導(dǎo)型啟動子。每一個專利和出版物都公開了啟動子及其用途，尤其是在^i物中起作用的重組DNA構(gòu)建體中的啟動子及其用途，所有這些文獻都通過引用具體結(jié)合到本文中。因表達的核酸序列，還可以用于與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物一起使用。"不依賴基因的，，調(diào)節(jié)序列的實例包括天然存在的或人工設(shè)計的RNA序列，包括配體結(jié)合區(qū)或適體(aptamer)和調(diào)節(jié)區(qū)(可能是順式作用的)。參見例如Isaacs等(2004)、Bayer和Smolke(2005)、Mandal和Breaker(2004)、Davidson和Ellington(2005)、Wmkler等(2002)、Sudarsan等(2003)及Mandal和Breaker(2004)，所述各文獻都通過引用具體結(jié)合到本文中。例如，可以根據(jù)特定的空間或時間特異性，來選擇或設(shè)計這種"核糖核酸調(diào)節(jié)物，，，用于僅在規(guī)定濃度的合適配體存在(或不存在)下，調(diào)節(jié)外源基因的翻譯。編碼多肽的外源基因可以是任何轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄物，RNA轉(zhuǎn)錄物中至少一部分可翻譯成多肽的外源目標基因，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以經(jīng)改造含有3，非翻譯區(qū)(3'UTR),并且去穩(wěn)定序列可位于3'UTR中。在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下描述了合適外源基因的實例。去穩(wěn)定序列可以包括賦予外源基因的轉(zhuǎn)錄RNA不穩(wěn)定性(例如通過降低從內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性或半壽期)的任何序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列為至少一個選自以下元件的序列3，SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合，還可參見"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下的內(nèi)容。本發(fā)明還提供用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，該轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在其基因組DNA內(nèi)包括編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3，非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，從而相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在用于食物或祠料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中以較低水平表達。用于食物或祠料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物可以是任何用于食物或飼料的單子葉農(nóng)作物或雙子葉農(nóng)作物，在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下描述了其合適的實例。優(yōu)選的用于食物或飼料的雙子葉農(nóng)作物包括但不限于油菜、棉花、馬鈴薯、昆諾阿藜、莧屬植物、蕎麥、紅花、大豆、糖甜菜和向日葵，更優(yōu)選大豆、油菜和棉花。優(yōu)選的用于食物或伺料的單子葉農(nóng)作物包括但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更優(yōu)選玉米、小麥和水稻。在某些具體實施方案中，特別優(yōu)選的植物為大豆和玉米。編碼多肽的外源基因可以是任何轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄物，RNA轉(zhuǎn)錄物中至少一部分可翻譯成多肽的外源目標基因，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以經(jīng)改造含有3，非翻譯區(qū)(3'UTR),并且去穩(wěn)定序列可位于3，UTR中。在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下描述了合適外源基因的實例。去穩(wěn)定序列可以包括賦予外源基因的轉(zhuǎn)錄RNA不穩(wěn)定性(例如通過降低從內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性或半壽期)的任何序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列為至少一個選自以下元件的序列3'SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合，還可參見"轉(zhuǎn)基因植物r標題下的內(nèi)容。II.ATTTAA重復(fù)序列另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3'非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，該去穩(wěn)定序列包括重疊的ATTTAA重復(fù)序列，從而相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述多肽在所述轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。轉(zhuǎn)基因植物可以得自任何目標單子葉植物或目標雙子葉植物；在某些優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物為農(nóng)作物。在"轉(zhuǎn)基因植物r標題下提供了適于本發(fā)明這一方面的植物的內(nèi)容。編碼多肽的外源基因可以是任何轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄物，RNA轉(zhuǎn)錄物中至少一部分可翻譯成多肽的外源目標基因，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以經(jīng)改造含有3'非翻譯區(qū)(3，UTR),并且去穩(wěn)定序列可位于3'UTR中。在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下描述了合適外源基因的實例。去穩(wěn)定序列包括重疊的ATTTAA重復(fù)序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列包括至少3個重疊的ATTTAA重復(fù)序列，并在重疊重復(fù)序列中可以包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和甚至15個拷貝以上的ATTTAA基序。因此，非限制性實例包括3xATTTAA(ATTTAATTTAATTTAA;SEQIDNO:31)，5xATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA;SEQIDNO:32)和llxATTTAAATTTAATTTAA;SEQIDN〇:29)。在另一個實施方案中，重疊的ATTTAA重復(fù)序列可與ATTTA重復(fù)序列組合，例如在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下的所述組合。III.具有適度鄰氨基苯甲酸合酶表達的轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包括編碼鄰氨基苯甲酸合酶的基因，該基因在其3，非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，從而相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，鄰氨基苯甲酸合酶在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。轉(zhuǎn)基因植物可以得自任何目標單子葉植物或目標雙子葉植物，例如在"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下提供的植物。在某些優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可以是農(nóng)作物，例如需要在整株植物或在具體的植物組織或細胞中提高色氨酸水平的農(nóng)作物。非限制性的實例包括轉(zhuǎn)基因植物為大豆或玉米的實施方案。編碼鄰氨基苯甲酸合酶的基因可以是任何用于鄰氨基苯曱酸合酶序列的天然存在的基因或這些基因的同源物，可以通過例如運用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的比較工具例如但不限于BLAST(Altschul等(1997)，該文獻通過引用結(jié)合到本文中)，用序列數(shù)據(jù)庫來鑒定。編碼鄰氨基苯曱酸合酶的基因可以包括基于天然存在的鄰氨基苯曱酸合酶但卻具有一個或多個修飾的衍生序列，所述修飾例如序列的缺失、單點突變、多點突變、特殊限制性內(nèi)切酶位點的改變、功能性元件的添加、元件的重復(fù)或其它方式的分子修飾。可以進行這些修飾以提高或改變轉(zhuǎn)基因植物中鄰氨基苯甲酸合酶的性質(zhì)。修飾的非限制性實例包括原核生物鄰氨基苯甲酸合酶在轉(zhuǎn)基因植物中表達的密碼子優(yōu)化。鄰氨基苯曱酸合酶的基因優(yōu)選在其3，非翻譯區(qū)含有去穩(wěn)定序列，該去穩(wěn)定序列可以包括賦予鄰氨基苯甲酸合酶基因的轉(zhuǎn)錄RNA不穩(wěn)定性(例如通過降低由鄰氨基苯曱酸合酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性或半壽期)的任何序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列為至少一個選自以下元件的序列3，SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合，還可參見"轉(zhuǎn)基因植物r標題下的內(nèi)容。更優(yōu)選去穩(wěn)定序列使得鄰氨基苯曱酸合酶在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達(相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達)。iv.提供轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明各個方面涉及以上段落中所述的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明包括和提供轉(zhuǎn)基因植物(在許多實施方案中尤其是指轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物)，兩者都涉及直接從用包括外源基因(在其3'非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列)的轉(zhuǎn)基因DNA轉(zhuǎn)化的細胞再生的轉(zhuǎn)基因植物以及這些轉(zhuǎn)基因植物的子代(例如轉(zhuǎn)化植物的近交子代和雜交子代)。利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備用于轉(zhuǎn)化植物細胞和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的核酸構(gòu)建體。參見例如Maliga等(1995)和Sambrook和Russell(2001)所介紹的方法，這些文獻都通過引用具體結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)熟悉轉(zhuǎn)化植物細胞以提供本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。參見例如美國專利號5,550,318、5,538,880、6,160,208和6,399,861中公開的微粒轟擊方法；美國專利第5,591,616號中公開的土壤桿菌(^4graM"enMm)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，所述各文獻通過引用具體結(jié)合到本文中。使用位點特異性整合來轉(zhuǎn)化植物細胞的有用技術(shù)包括美國專利第4,959,317號中公開的cre-lox系統(tǒng)和美國專利第5,527,695號中公開的FLP-FRT系統(tǒng)，這兩個專利文獻都通過引用結(jié)合到本文中。轉(zhuǎn)化植物細胞再產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選用培養(yǎng)基中的組織培養(yǎng)物并在控制環(huán)境下實施。美國專利號6,194,636和6,232,526公開了產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的實用轉(zhuǎn)化方法和材料，例如各種培養(yǎng)基和受體耙細胞、未成熟胚的轉(zhuǎn)化和能育轉(zhuǎn)基因植物的后續(xù)再生，這些專利文獻都通過引用結(jié)合到本文中。在轉(zhuǎn)基因DNA傳遞給受體植物細胞后，一般要對轉(zhuǎn)化細胞進行鑒定，以便用于進一步培養(yǎng)和植物再生。為了改進鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可以應(yīng)用選擇標記基因或可篩選標記基因，通過將細胞暴露在一種或多種選擇試劑中或者篩選所需的標記基因性狀，測定可能轉(zhuǎn)化的細胞群?？珊Y選標記的非限制性實例包括表達有色蛋白或熒光蛋白(例如縈光素酶或綠色熒光蛋白(GFP》的基因或者表達p-葡糖醛酸糖苷酶的基因或w'^4基因(GUS),其各種顯色底物是已知的。選擇標記的非限制性實例包括賦予抗生素(例如卡那霉素和巴龍霉素("^/T)、潮霉素B(ap///)/)和慶大霉素(皿c3和aacC4))抗性或賦予除草劑(例如草銨膦(glufosinate)(6ar或；af)和草甘膦(aro4或EPSPS))抗性的選擇標記；這些選擇標記特別有用的實例參見美國專利號5,550，318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有這些專利文獻都通過引用具體結(jié)合到本文中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以進一步改良或雜交以提供具有疊加性狀(stackedtrait)(例如其它農(nóng)藝上所需的性狀)的衍生的轉(zhuǎn)基因植物，該技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。參見例如美國專利申請公告2003/0106096和2002/0112260及美國專利5,034,322、5,776,760、6,107,549和6,376,754,所有這些專利文獻都通過引用具體結(jié)合到本旱或溫度脅迫)的抗性或耐受性以及病蟲害或病原體的抗性，參見美國專利5,250,515、5,880,275、6,506,599和5,986,175、美國專利申請公告2003/0150017Al，所有這些專利文獻都通過引用結(jié)合到本文中?？梢詮哪苡D(zhuǎn)基因植物收獲轉(zhuǎn)基因植物的種子，并用來栽培本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物(包括雜交植物系)的子代，例如用于篩選農(nóng)藝性狀增強的植物。除用重組DNA直4妄轉(zhuǎn)化植物外，還可以通過使具有重組DNA的第一種植物與缺乏該DNA的第二種植物雜交，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以將重組DNA導(dǎo)入適于轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的第一種植物系，可以使之與第二種才直物系雜交，以將重組DNA漸滲入第二種植物系中。具有提供農(nóng)藝性狀增強(例如產(chǎn)量提高)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物，可與具有其它賦予另一種性狀(例如除草劑抗性或病蟲害抗性)的重組DNA的轉(zhuǎn)基因^i物系雜交，以產(chǎn)生具有賦予兩種性狀的重組DNA的子代植物。通常，在這種組合性狀的育種中，賦予額外性狀的轉(zhuǎn)基因植物為雄性系，攜帶基礎(chǔ)性狀的轉(zhuǎn)基因植物為雌性系。這個雜交的子代將分離，以致于某些植物將攜帶雙親性狀的DNA，某些將攜帶一個親代性狀的DNA;可以通過與親代重組DNA相關(guān)的標記對這些植物進行鑒定。攜帶雙親性狀DNA的子代植物可以與母本系多次回交，例如通常6-8代，產(chǎn)生基因型與一個初始轉(zhuǎn)基因親代系基本相同但卻有另一個轉(zhuǎn)基因親代系重組DNA的子代植物。V.通過控制信息穩(wěn)定性轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)錄后降低用于食物或飼料的農(nóng)作物的目標基因信息穩(wěn)定性的方法，該方法包括在用于食物或飼料的農(nóng)作物的目標基因3，非翻譯區(qū)添加去穩(wěn)定序列，從而轉(zhuǎn)錄后降低目標基因的信息穩(wěn)定性。優(yōu)選轉(zhuǎn)錄后信息穩(wěn)定性的降低導(dǎo)致基因的表達水平比去穩(wěn)定序列不存在時的表達水平低。用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物可以是用于食物或飼料的任何單子葉農(nóng)作物或雙子葉農(nóng)作物，在"轉(zhuǎn)基因植物r'標題下提供了其合適的實例。優(yōu)選的用于食物或祠料的雙子葉農(nóng)作物包括但不限于油菜、棉花、馬鈴薯、昆諾阿藜、莧屬植物、蕎麥、紅花、大豆、糖甜菜和向日葵，更優(yōu)選大豆、油菜和棉花。優(yōu)選的用于食物或飼料的單子葉農(nóng)作物包括但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更優(yōu)選玉米、小麥和水稻。在某些具體實施方案中，大豆和玉米為特別優(yōu)選的植物。目標基因可以是借助去穩(wěn)定序列進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的任何基因，因此，任何轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄物，RNA轉(zhuǎn)錄物中至少一部分可翻譯成多肽的目標基因，優(yōu)選轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以經(jīng)改造含有3，非翻譯區(qū)(3'UTR)，并且去穩(wěn)定序列可位于3，UTR中。合適目標基因的實例為"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下所述的外源基因。合適目標基因的非限制性實例包括參與目標分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖和其它^灰水化合物)生物合成的基因。在本發(fā)明一個實施方案中，目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。去穩(wěn)定序列可以包括賦予目標基因的轉(zhuǎn)錄RNA不穩(wěn)定性的任何序列，還可參見"轉(zhuǎn)基因植物I"標題下的內(nèi)容。在一個優(yōu)選的實施方案中，去穩(wěn)定序列為至少一個選自以下元件的序列3'SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。ATTTADNA基序或ATTTAADNA基序被轉(zhuǎn)錄成AUUUARNA基序或AUUUAARNA基序。更優(yōu)選相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，去穩(wěn)定序列的存在導(dǎo)致目標基因在轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達?？梢允褂貌恢灰粋€去穩(wěn)定序列或多拷貝的一個或多個去穩(wěn)定序列。在一個非限制性的實例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以在其基因組DNA內(nèi)包括目標基因，該目標基因在其3，非翻譯區(qū)具有至少一個SAUR終止子或多拷貝的DST元件，或者SAUR終止子、DST元件或AUUUA或AUUUAA基序的任何組合。VI.實施例下面的實施例用來證明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人人揭示的技術(shù)在實施本發(fā)明時運作良好，因此，可認為構(gòu)成其實施的優(yōu)選方式。然而根據(jù)本說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解的是，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變，仍可獲得相同或相似的結(jié)果而又不偏離本發(fā)明的精神和范圍。所有的核酸序列按5，—3，方向給出，除非另有說明。本文所述構(gòu)建體和載體作為說明性實例提供，不應(yīng)視為任何方式的限制。實施例1:擬南芥SAUR終止子的克隆本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列。更準確地說，本實施例描述了擬南芥SAUR終止子的克隆。使用引物SAURforl,ACCAGCCTTTGTTTCAACAA(SEQIDNO:11)和SAURrevl，CATAATCAATAAGAAAATAGATGTAC(SEQIDNO:12)(按照已開的基因序列設(shè)計并由Invitrogen(Carlsbad，CA)供應(yīng))，從擬南齊(cv.Columbia)基因組DNA,通過PCR擴增擬南芥(Jra6z^fo/w^^a/Z朋a)SAUR-AC1基因的終止子(Gil等，1994,該文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)。用Expand高保真PCR系統(tǒng)(ExpandHighFidelityPCRSystem)(目錄號1732641，RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)進行PCR。初次PCR的組分和條件見表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>通過樣品在94。C變性1分鐘啟動反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物進行20次循環(huán)，每次循環(huán)由94°C15秒、68°C30秒(每次循環(huán)降低1。C)和72°C3分鐘組成。然后，將反應(yīng)'混合物進行11次循環(huán)，每次循環(huán)由94。C15秒、48。C30秒、72。C3分鐘組成。該過程在72°C10分鐘的步驟后結(jié)束，反應(yīng)混合物于4。C保存直到下一次實驗。從初次PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物用QIAqmckPCR純化試劑盒(目錄號28104，QIAGENInc.,Valencia,CA)純化，用30微升H20洗脫。使用5微升由初次反應(yīng)產(chǎn)生的純化PCR產(chǎn)物作為模板，并使用？1物SAURfor2EcoRI，C(SEQIDNO:13)和SAURrev2Not，NO:14)(按照已公開的基因序列設(shè)計并由Invitmgen(Carlsbad,CA)供應(yīng))，用嵌套式PCR引物進ft再次反應(yīng)。用Expand高保真PCR系統(tǒng)(目錄號1732641,RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)進行PCR。嵌套式PCR的組分和條件見表l;擴增反應(yīng)按上述方法進4亍。嵌套式PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物用QIAqmckPCR純化試劑盒(目錄號28104,QIAGENInc.,Valencia,Califomia)進行純化，再用30微升雙蒸水洗脫。等分的5微升洗脫DNA用Notl和EcoRI消化。消化產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行分離。切下預(yù)期大小的條帶(750bp)，用QIAquick凝膠提取試劑盒(目錄號28704，QIAGENInc.,Valencia,California)純化。將推定的SAUR片段作為3'終止子克隆到包含Lea9作為啟動子和GUS作為編；馬序列的PUC質(zhì)粒上。所得構(gòu)建體(pMON63688)見圖1。對pMON63688構(gòu)建體的多克隆進行測序，根據(jù)序歹'J比較(Dnastar軟件包，DNASTAR，Inc.，Madison，WI53715;www.dnastar.com)，鑒定出SAUR終止子的數(shù)個變異體。在一個獨立的克隆實驗中，NOS終止子被克隆到具有Lea9啟動子和GUS編碼序列的同一骨架載體中，得到pMON63691(圖1),它用作瞬時測定的對照，以對SAUR全冬止子的作用與NOS終止子的作用進行比較。制備另一構(gòu)建體pMON13773(圖1)，其中含有驅(qū)動GUS的7Sa，啟動子與NOS終止子。將SAUR的變異體1克隆到pMON13773以置換NOS終止子。新的構(gòu)建體pMON63692含有驅(qū)動GUS的7Sa，啟動子與NOS終止子(圖1)。實施例2:SAUR終止子在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的表征本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其在轉(zhuǎn)基因植物模型中的用途。更準確地說，本實施例描述了SAUR終止子在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的表征。開花后25-28天，收獲雙子葉農(nóng)作物大豆的種子(AsgrowA3244),在GAMBORG培養(yǎng)基(目錄號G5893,SigmaCompany,St.Louis,MO)(pH5.6)中，于25。C避光經(jīng)滲透處理過夜，培養(yǎng)基中補充了50毫摩爾谷氨酰胺、111毫摩爾麥芽糖、125毫摩爾棉子糖、125毫摩爾甘露糖醇和3克/升純化瓊脂。分離所得子葉，采用基因槍技術(shù)(Maliga等，1995),用pMON63691(NOS終止子)或pMON63688(SAUR終止子)的純化超螺旋DNA轟擊。作為使實驗性差異歸一化的內(nèi)部對照，另外的e35S-驅(qū)動的螢光素酶構(gòu)建體pMON19425(圖l)也包括在內(nèi)，濃度為l微克/微升，與各個試驗構(gòu)建體的摩爾比為1:1。各板具有6片子葉，每個構(gòu)建體轟擊各板一式5-6份。經(jīng)轟擊的組織于25。C下孵育48小時。用1毫升含有0.1摩爾磷酸鉀(pH7.8)、10毫摩爾DTT、1毫摩爾EDTA、5%甘油和蛋白酶抑制劑(1片/50毫升，目錄號1697498,RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,Indiana))的提耳又緩沖液,從6片經(jīng)轟擊的大豆子葉中提if又蛋白質(zhì)。100微升等分的蛋白提取物通過Promega(目錄號E2510,PromegaCorporationMadison,WI)的"Steady-Glo"步驟后，用于營光素酶測定。將8.8毫克MUG(4-甲基傘花基-P-D-葡糖苷酸，目錄號M9130,Sigma,St.Loms,MO)加入到10毫升提取緩沖液中，制備GUS測定緩沖液。將50微升等分的蛋白提取物與200微升GUS測定緩沖液混合。應(yīng)用配有355納米激發(fā)光、460納米發(fā)射光和455納米截止光的SoftmaxPro軟件的基礎(chǔ)動力學(xué)方案(BasicKineticProtocol)(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)，用SpectramaxGemini分光光度讀板儀進行GUS測定。在2小時內(nèi)每間隔7分鐘便記錄熒光讀數(shù)，得到每個樣品的GUSVn值。每個樣品測定兩次，用平均值進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)每個樣品的螢光素酶活性使GUS活性歸一化，相對啟動子強度通過將對照載體pMON63691(圖l)任意設(shè)置為100%來表示?；蛘撸摐y定中還包括從轉(zhuǎn)基因植物(目錄號G8162,Sigma,St.Louis,MO)中純化的GUS蛋白(已知濃度)，用來計算樣品中GUS的絕對含量。結(jié)果(圖2)表明，當與NOS終止子(轉(zhuǎn)基因植物中基因表達的基準終止子)比較時，SAUR終止子的所有變異體都顯著降低GUS的表達。以類似方式進行的另一個瞬時測定顯示，當7Sot，用作驅(qū)動GUS表達的啟動子時，SAUR終止子有效地降低基因表達(圖3)。實施例3:將多拷貝的DST元件克隆到帶有不同啟動子的載體中本實施例進一步說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例描述了將多拷貝的DST元件克隆到帶有不同啟動子的載體中。SAUR基因的DST元件被鑒定為負責(zé)使mRNA不穩(wěn)定的關(guān)鍵元件。為了測試DST元件能否與與大豆的異源表達盒結(jié)合有效地發(fā)揮作用，設(shè)計出兩條單鏈寡核苦酸片段(由Invitrogen(Carlsbad,CA)供應(yīng))，即2xDSTfor，個拷貝DST的雙鏈DNA片段的組裝。用Expand高保真PCR系統(tǒng)(目錄號1732641,RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)進行PCR用于片段組裝。因為兩條單鏈DNA片段具有彼此互補的重疊區(qū)，所以不需要模板DNA。片段組裝式PCR的組分和條件見表1;:按照實施例1中所述方法進行反應(yīng)。3微升等分的PCR反應(yīng)物用EcoRI和BamHI酶消化，并克隆到在GUS編碼基因與NOS終止子之間的位點線性化的pMON58101(圖l)中。通過測序鑒定出含有2XDST的克隆，并命名為pMON63687(圖1)。預(yù)期pMON58101與pMON63687之間的比較可證實2XDST對基因表達的作用。通過用Lea9啟動子或7Sa'啟動子置換pMON63687的USP啟動子，產(chǎn)生pMON63697和pMON63698(圖1)，來制備兩個額外的載體。將pMON63697與pMON63691進行比較，對照載體含有驅(qū)動GUS的7Sa，啟動子與NOS終止子。將pMON63698與pMON13773進行比較，另一個對照載體含有驅(qū)動GUS的7Soc，啟動子與NOS終止子。用瞬時測定法進行比較，見實施例4。實施例4:2XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的表征本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例描述了2XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的表征。開花后25-28天，收獲大豆植物的種子(AsgrowA3244),并按照實施例2中所述方法進行滲透處理。分離所得子葉，采用實施例2中所述的基因槍技術(shù)，用pMON58101(NOS終止子)或pMON63687(2XDST和NOS終止子)的純化超螺旋DNA轟擊。對照載體為e35S-驅(qū)動的螢光素酶構(gòu)建體pMON19425。提取蛋白質(zhì)，按實施例2中所述的"Steady-Glo"螢光素酶測定法和GUS測定法進行分析。根據(jù)每個樣品的螢光素酶活性使GUS活性歸一化，相對啟動子強度通過將對照載體pMON58101(圖l)任意設(shè)置為100%來表示。結(jié)果(圖4)表明，當與僅有NOS終止子比較時，所包含的2XDST顯著降低GUS的表達。進行其它實驗以對pMON13773與pMON63698(圖5)及對pMON63691與pMON63697(圖6)進行比較。結(jié)果始終顯示，2XDST有效地降低大豆子葉中的基因表達。數(shù)據(jù)共同顯示出，不論實驗中所用的啟動子，2XDST都能有效地起作用。實施例5:含有2XDST、4XDST或6XDST的Perl載體的克隆與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例描述了含有2XDST、4XDST或6XDST的Perl載體的克隆。通過以下標準分子克隆方案(Sambrook和Russell,2001,該文獻通過引用結(jié)合到本文中)，構(gòu)建另外的載體以測試DST拷貝數(shù)對基因表達水平的作用。載體pMON42316(圖1),即對照載體，含有驅(qū)動GUS表達的Perl啟動子與NOS終止子。切下pMON63697的Lea9啟動子，用Perl啟動子置換以制備pMON78113(圖1),它具有2XDST與NOS終止子組合。為了制備多拷貝的DST,將實施例3產(chǎn)生的5微升等分的PCR產(chǎn)物用Spel和Nhel消化。經(jīng)消化的DNA用瓊脂糖凝膠進行分離，采用QIAqmck凝膠提取試劑盒(目錄號28704,QIAGENInc.,Valencia,CA)提取，并連接到用Spel線性化并用CIP堿性磷酸酶處理的pMON78113上。通過Spel和Nhel雙重消化，篩選出含有4XDST的克隆，并命名為pMON78116(圖1)。pMON78116再次用Spel線性化，用CIP^M"生石壽酸酶處理，并連接到早前制備的2XDST片段上。通過SpeI和NheI雙重消化，篩選出含有6XDST的克隆，并命名為pMON78U7(圖1)。實施例6:2XDST、4XDST或6XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的比較本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例描述了2XDST、4XDST和6XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的比專交。開花后25-28天，收獲大豆植物的種子(AsgrowA3244),按實施例2中所述方法進行滲透處理。分離所得子葉，采用實施例2中所述的基因槍技術(shù)，用pMON42316(僅NOS終止子)、pMON78113(2XDST和NOS終止子)、pMON78116(4XDST和NOS終止子)或pMON78117(6XDST和NOS終止子)的純化超螺旋DNA轟擊。對照載體為e35S-驅(qū)動的螢光素酶構(gòu)建體pMON19425。提取蛋白質(zhì)，按實施例2中所述的"Steady-Glo，，螢光素酶測定法和GUS測定法進行分析。根據(jù)每個樣品的螢光素酶活性使GUS活性歸一化，相對啟動子強度通過將對照載體pMON42316(圖l)任意設(shè)置為100%來表示。結(jié)果(圖7)表明，DST拷貝數(shù)與基因表達水平呈負相關(guān)。實施例7:1XDST、3XDST和5XDST的克隆本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列。更準確地說，本實施例描述了1XDST、3XDST和5XDST的克隆。制備另外的載體以進一步評價DST拷貝數(shù)與基因表達水平的相關(guān)性。設(shè)計出兩條單鏈寡核苷酸片(由IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville，IA)供應(yīng))，即Forward退火1XDST,ATAGGA(SEQIDNO:17)和RevComp退火1XDST,CCTAG(SEQIDNO:18)，用于含有1個拷貝DST的雙鏈DNA片段的組裝。在Expand高保真PCR系統(tǒng)(目錄號1732641,RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,Indiana)才是供的IXPCR纟爰沖液中使2個片段進行退火。通過樣品在96C變性10分鐘啟動反應(yīng)后，以0.2。C/秒的速度使溫度降低，分別于80。C、70°C、60°C、5CTC、40'C和30。C暫停7分鐘。該過程于4。C結(jié)束，混合物于4。C保存直到下一次實驗。然后，退火的1XDST片段用QIAqmckPCR純化試劑盒(目錄號28104,QIAGENInc.,Valencia,CA)進行純化，再用32微升雙蒸水洗脫。經(jīng)洗脫的DNA用T4多核普酸激酶試劑盒(目錄號]8004-010，Invitrogen,Carlsbad,CA)處理，保存為1XDST插入片段。為了產(chǎn)生1XDST構(gòu)建體，pMON78113用SpeI和NheI消化，并用CIP堿性磷酸酶處理。然后，將骨架載體與1XDST插入片段連接在一起產(chǎn)生pMON78119(圖1)。為了產(chǎn)生3XDST和5XDST構(gòu)建體，pMON78113和pMON78116用Spel消化使之線性化并用CIP堿性磷酸酶處理。然后，將骨架載體與1XDST插入片段連接在一起。通過SpeI和NheI雙重消化，篩選出含有3XDST或5XDST的克隆并分別命名為pMON78120和pMON78121(圖1)。實施例8:1XDST、2XDST、3XDST、4XDST和5XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的比較本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例描述了1XDST、2XDST、3XDST、4XDST和5XDST在大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的比較。開花后25-28天，收獲大豆植物的種子(AsgrowA3244)，按實施例2中所述方法進行滲透處理。分離所得子葉，采用實施例2中所述的基因槍技術(shù)，用pMON42316(僅有NOS終止子)、pMON78119(1XDST和NOS終止子)、pMON78113(2XDST和NOS終止子)、pMON78120(3XDST和NOS終止子)、pMON78116(4XDST和NOS終止子)或pMON78121(5XDST和NOS終止子)的純化超螺旋DNA轟擊。對照載體為e35S-驅(qū)動的螢光素酶構(gòu)建體pMON19425。提取蛋白質(zhì)，按實施例2中所述的"Steady-Glo"螢光素酶測定法和GUS測定法進行分析。根據(jù)每個樣品的螢光素酶活性使GUS活性歸一化，相對啟動子強度通過將對照載體pMON42316(圖l)任意設(shè)置為100%來表示。結(jié)果(圖7)表明，DST拷貝數(shù)與基因表達水平呈負相關(guān)。結(jié)杲還顯示1XDST足以降低基因表達。實施例9:去穩(wěn)定序列在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物(大豆)中的有效性本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例證明了去穩(wěn)定序列在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物(大豆)中的有效性。為了進一步證實DST作為信息一去穩(wěn)定序列在轉(zhuǎn)基因大豆中的有效性，根據(jù)標準分子克隆方案(Sambrook和Russell，2001,該文獻通過引用結(jié)合到本文中)，構(gòu)建了多個土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體(圖8)。表達盒由FMV啟動子、CTP2和CP4編碼基因組成，所有載體中都包括E93，UTR作為選擇標記。用擬南芥SSU1ACTP和土壤桿菌鄰氨基苯甲酸合酶(AS)的融合蛋白作為編碼基因使色氨酸生物合成途徑去調(diào)節(jié)。用Perl、Lea9或7Sot，啟動子來驅(qū)動AS基因的表達。在AS盒3，端使用NOS終止子與DST組合。通過三親雜交方法(Ditta等(1980),該文獻通過引用結(jié)合到本文中)，將上述載體轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌04grak7c&r,'wwfwme/acwM)菌林ABI中。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備用于轉(zhuǎn)化的細菌細胞。使市售的大豆種子(AsgrowA3244)在10-12小時內(nèi)萌發(fā)。切取分生組織外植體，置于創(chuàng)傷容器(woundingvessel)內(nèi)，通過超聲處理使之受創(chuàng)傷。受創(chuàng)傷后，加入上述土壤桿菌培養(yǎng)物，孵育外植體約l小時。接種后，用移液管取出土壤桿菌培養(yǎng)物，將外植體置于共培養(yǎng)物中2-4天。然后，將外植體轉(zhuǎn)移至由木本植物培養(yǎng)基(WPM)(參見McCown和Lloyd(1981)，該文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)、加上75微摩爾草甘膦和抗生素組成的選擇培養(yǎng)基中，以控制土壤桿菌過度生長，5-7周后進行選擇并使轉(zhuǎn)基因苗生長發(fā)育。接種后約5-7周收獲表型陽性苗，放入包含大豆生根培養(yǎng)基(BRM)與25微摩爾草甘膦的選擇性生根培養(yǎng)基(參見美國專利第5,914,451號，該專利文獻通過引用全部結(jié)合到本文)中2-3周。將生出根的苗移至溫室內(nèi)，栽培于盆栽土壤中。將選擇時保持健康但不生根的苗轉(zhuǎn)移至非選擇性生根培養(yǎng)基(即無草甘膦的BRM)中再培養(yǎng)兩周。完成選擇后，測定任何生根苗組織內(nèi)植物選擇標記的表達，再移至溫室內(nèi)，栽培于盆栽土壤中。各植株維持在標準溫室條件下直到收獲R1種子。采用下面的方法對每個轉(zhuǎn)基因植林的游離氨基酸水平進行分析。將每個轉(zhuǎn)基因植抹的種子分別碾成細粉，將約50毫克所得粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的離心管中。記錄樣品的精確樣品重量，向各樣品管中加入1.0毫升5%三氯乙酸。將樣品于室溫下通過旋轉(zhuǎn)混合，然后在Eppendorf微量離心機(5415C型，BrinkmannInstrument,Westbury,NY)中離心15分鐘(14,000rpm)。取出上清液等分，應(yīng)用AgilentTechnicalPublication"AminoAcidAnalysisUsingtheZorbaxEclipse隱AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC(采用ZorbaxEclipse-AAA柱和Agilent1100HPLC進行氨基酸分析)"(2000年3月17日，該文獻通過引用結(jié)合到本文中)所述的步驟，用HPLC(AgilentU00)進行分析。因為從各個轉(zhuǎn)基因植林所收獲的Rl種子代表一群分離種子，從每次事件所分析的10粒種子中挑選出色氨酸水平最高的種子，作為純合基因型(homozygousgenotype)的表。還只寸AsgrowA3244的10粒隨機選擇的非轉(zhuǎn)基因種子進行了分析。從非轉(zhuǎn)基因A3244中選擇色氨酸水平最高的種子作為陰性對照。實施例10:SAUR3'-UTR、2XDST、3XDST、4XDST、5XDST和6XDST在玉米葉瞬時轉(zhuǎn)化中的有效性本實施例說明用于本發(fā)明的去穩(wěn)定序列及其用途，其中目標基因與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。更準確地說，本實施例證明了SAUR3'-UTR、2XDST、3XDST、4XDST、5XDST和6XDST在玉米葉瞬時轉(zhuǎn)化中的有效性。在雙子葉植物起作用的基因表達元件不一定也在單子葉植物起作用。在本發(fā)明前面的實施例中描述了應(yīng)用SAUR3'-UTR和DST元件減量調(diào)節(jié)雙子葉農(nóng)作物大豆中的基因表達。對單子葉植物，特別是單子葉農(nóng)作物(玉米)的相同元件進行評價，以確定它們降低基因表達的有效性。除了SAUR3，-UTR和DST元件以外，還對瞬時轉(zhuǎn)化單子葉系統(tǒng)中富含AU基序重疊的重復(fù)序列的兩種不同排列(重疊AUUUA和新的重疊AUUUAA基序)的有效性進行了比較。在該非限制性的實例中，使用11個拷貝的富含AU基序；或者，可以使用較少(優(yōu)選至少3個)或較多(ll個以上)的拷貝。制備4個構(gòu)建體，其中2個含有間隔序列(相同長度的隨機序列)，用作對照。使用合成的互補寡核苷酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)來產(chǎn)生間隔控制序列和2種不同排列的11個拷貝的富含AU基序的序列。用于重疊AUUUA排列的寡核苷酸引物是TTTAG(SEQIDNO:19)和AATAAATG(SEQIDNO:20)。對于新的重疊AUUUAA排列的寡核香酸引物是ATTTAATTTAATTTAG(SEQIDNO:21)和TTAAATTAAATTAAATG(SEQIDNO:22)。對于第一間隔對照序列的寡核苷酸引物是TTGTATG(SEQIDNO:23)和ATTCATG(SEQIDNO:24)。對于第二間隔對照序列的寡核苦酸引物是TGAATTCAATACGTACG(SEQIDNO:25)和GATCCGTACGTATTGAATTCATGCATGTCTGAATTAGCATGATGCATGTCAGTATCAGATG(SEQE)NO:26)。將這些互補寡核苷酸引物對一起在含有1微升各引物(100微摩爾)、10微升10XInvitrogen緩沖液10(150毫摩爾NaCl終濃度)和88微升無菌雙蒸水的反應(yīng)混合物中退火。循環(huán)變溫器條件為95°C5分鐘，隨后從95。C開始70次循環(huán)(每次循環(huán)降低1°C)。將退火產(chǎn)物設(shè)計成兩端具有NheI和BamHI位點。退火后，產(chǎn)物按l:50稀釋，用1微升與pMON64263(之前已用Nhel和BamHI切割)的骨架連接，進行凝膠純化。所得構(gòu)建體命名為pMON64264、pMON64265、pMON64266和pMON64267。按實施例10中所述方法，用表2所列構(gòu)建體進行玉米葉瞬時測定。數(shù)據(jù)顯示，2個富含AU基序的11個拷貝排列導(dǎo)致較低的表達(相對于富含AU基序重復(fù)序列不存在時的表達，大約降低50%)(圖9)。表2構(gòu)建體編號啟動子編碼序列DST或富含AU基序的拷貝終止子pMON64256e35SGUS無NOSpMON64257e35SGUS——SAURpMON64259e35SGUS2XDSTNOSpMON64260e35SGUS3XDSTNOSpMON64261e35SGUS4XDSTNOSpMON64262e35SGUS5XDSTNOSpMON64263e35SGUS6XDSTNOSpMON64264e35SGUS11XAUUUANOSpMON64265e35SGUS間隔區(qū)lNOSpMON64266e35SGUS11XAUUUAANOSpMON64267e35SGUS間隔區(qū)2NOSpMON19437e35S螢光素酶(對照)無NOS在大豆子葉瞬時測定中進4亍分析的SAUR3'-UTR和DST構(gòu)建體(pMON63691、pMON63688、pMON63697、pMON78121、pMON78120、pMON78117、pMON781116)中所用的啟動子為種子特異性啟動子(圖1)。其它空間特異性啟動子、時間特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子也是適宜的。作為玉米葉原生質(zhì)體瞬時系統(tǒng)中用于評價的初始構(gòu)建體，可應(yīng)用標準分子生物學(xué)技術(shù)，用增強型35S啟動子置換這些構(gòu)建體的種子特異性啟動子。全部構(gòu)建體見表2。如下進行玉米葉原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化實驗從黃化生長12天的LH200xH50玉米葉中分離出原生質(zhì)體，用2。/。纖維素酶RS和0.3%離析酶R10(KarlanResearch,SantaRosa，CA)進行酶消化。原生質(zhì)體用4皮摩爾質(zhì)粒DNA進行電穿孔(1毫秒兩次，120伏特，5秒間隔進行3次^0中)，質(zhì)粒DNA為實驗DNA和內(nèi)部對照DNA(螢火蟲螢光素酶，pMON19437)的等量混合物。每個構(gòu)建體一式三〗分進行電穿孔，在不同天數(shù)中重復(fù)(兩個實驗天之間至少24小時以使天與天之間的差異最小化)，共一式六份。孵育過夜后，通過將0.25體積的5X被動裂解緩沖液(雙重螢光素酶報道分子測定系統(tǒng)(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem),目錄號El960，Promega,Madison,WI)力口入到轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體細胞中來提取蛋白質(zhì)，按照雙重螢光素酶報道分子測定系統(tǒng)的方案，用20微升蛋白提取物進行螢光素酶測定?？M火蟲螢光素酶(fLUC)活性用作內(nèi)部對照。為測定GUS活性，將20微升IXMUG(目錄號M9130,Sigma,St.Louis,MO)加入到20微升蛋白提取物中，于37。C孵育0.5小時。加入180微升0.2摩爾Na2CCM亭止反應(yīng)后，使用WallacVictor2機器(PerkinElmer,Boston,MA)，于355納米激發(fā)光和460納米發(fā)射光下測量焚光。結(jié)果(圖9)證實，導(dǎo)致基因在大豆瞬時系統(tǒng)中以較低水平表達的DST元件，也在單子葉植物系統(tǒng)起作用。與大豆結(jié)果相似，減量調(diào)節(jié)的程度一般與DST的拷貝數(shù)相關(guān)。在該具體的實施例中，3個拷貝以上的DST不會引起表達水平進一步降低(圖9)，使用僅含有1個拷貝DST的SAUR終止子導(dǎo)致基因以相當?shù)偷乃奖磉_。發(fā)現(xiàn)DST元件有效地降j氐轉(zhuǎn)基因大豆中的色氨酸水平(見實施例9)。相對于在DST序列不存在時所觀察到的水平，2個拷貝(2X)的DST元件導(dǎo)致色氨酸水平大約降低30。/。(圖10)，這與2個不同"親本"構(gòu)建體(pMON66892和pMON66891)所觀察到的結(jié)果相似。瞬時轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物數(shù)據(jù)都證實DST元件可以用來調(diào)節(jié)農(nóng)作物的基因表達。根據(jù)上述所公開的內(nèi)容，無需過多實驗就可以制備和使用本文公開和要求的所有材料和方法。雖然在優(yōu)選的實施方案和說明性實施例中已經(jīng)描述了本發(fā)明的材料和方法，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明所述材料和方法進行改變。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。參考文獻下列參考文獻，在某種程度上提供示例性的流程性資料或其它對本文所述方法予以補充的詳細資料，都通過引用具體結(jié)合到本文中。美國專利美國專利4,959,317;美國專利5,527,695;美國專利5，538,8805,633,4355，780,7085,914,4516,118,0476,194,636美國專利5，550,318美國專利5,750,848美國專利5,880,275美國專利5,986,175美國專利6,140,078美國專利5,591，616美國專利5,776,760美國專利5,837,848美國專利6,107,549美國專利6,160,208美國專利6,232,526;美國專利6,376,754美國專利美國專利美國專利美國專利美國專利美國專利美國專利6,506,599美國專利5,034,322美國專利6,084,089美國專利6,426,446美國專利6,583,338美國專利5,250,515美國專利6,252,138美國專利6,433,252美國專利美國專利美國專利美國專利6,399,8616,759,5755,763,2456,294,7146,437,217美國專利公告2004/0216189美國專利公告2002/0112260美國專利公告2003/0106096美國專利公告2004/0123347美國專利公告2003/0150017AlAltschul等，M/c/e/c^c,血i^y.，25:3389-3402,1997。Bayer和Smolke,淑訓(xùn)5z'她c/mo/.,23:337-343,2005。Davidson和Ellington,7>e/7<is"說她c/mo/.,23:109-112,2005。Ditta等，Prac.編.爿o^.Sc/.園，77:7347-7351,1980。Feldbmgge等，P/"WA/o/.說o/.,49:215-223,2001。Gil等，尸/朋？P/乂由/.,104:777-784,1994。Green，尸/朋f尸/2，^/.,102:1065-1070,1993。Guti6rrez等，7>ew&尸/a加4:429-438,1999。Isaacs等，Ato.說ofec/z"o/.,22:841-847,2004。Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiology,ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。Mandal和Breaker,AtowreAev.^fo/.Ce〃Ao/.，5:451-463,2004。Mandal和Breaker,A^fw"Mo/.說o/.,11:29-35,2004。McClure等，尸/朋fCe〃，1:229-239,1989。McCo稱和Lloyd,P/朋fSoc.,30:421,1981。Newman等，尸/朋fCe//，5:701-714,1993。Ohme-Takagi等，A^/.Jowf."M,90:11811-11815,1993。PCT申請WO05007829Sambrook禾口Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual.第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001。Sudarsan等，9:644-647,2003。Winkler等，胸wre，419:952-956,2002。Yamamoto等，尸/"WCe〃尸/zjwo/.,33:93-97,1992。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，所述外源基因在其3’非翻譯區(qū)具有至少第一去穩(wěn)定序列，從而相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述多肽在所述轉(zhuǎn)基因植物的種子中以較低水平表達。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為農(nóng)作物，選自谷類作物、油料種子作物、飼草作物和蔬菜作物。3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因才直物，其中所述多肽包括鄰氨基苯曱酸合酶。4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述去穩(wěn)定序列選自3，SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。5相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所迷多肽在所述轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物為農(nóng)作物。7.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因才直物，其中所述非組成型啟動子選自空間特異性啟動子、時間特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。8.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述去穩(wěn)定序列選自3'SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。9.一種用于食物或祠料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，所述外源基因在其3，非翻譯區(qū)包含去穩(wěn)定序列，從而相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述多肽在所述用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中以較低水平表達。10.權(quán)利要求9的用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中所述用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為單子葉植物。11.權(quán)利要求10的用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中所述單子葉植物為玉米。12.權(quán)利要求9的用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中所述用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為雙子葉植物。13.權(quán)利要求12的用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中所述雙子葉植物為大豆。14.權(quán)利要求9的用于食物或伺料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其中所述去穩(wěn)定序列選自3'SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。15.—種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼多肽的外源基因，所述外源基因在其3，非翻譯區(qū)包含去穩(wěn)定序列，所述去穩(wěn)定序列包含重疊的ATTTAA重復(fù)序列，^v而相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述多肽在所述轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。16.—種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包含編碼鄰氨基苯曱酸合酶的基因，所述基因在其3'非翻譯區(qū)包含去穩(wěn)定序列，從而相對于所述去穩(wěn)定序列不存在時的表達，所述鄰氨基苯曱酸合酶在所述轉(zhuǎn)基因植物中以較低水平表達。17.—種轉(zhuǎn)錄后降低用于食物或飼料的農(nóng)作物中目標基因的信息目標基因3，非翻譯區(qū)添加去穩(wěn)定序列，從而使所述目標基因的信息穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄后降低。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為單子葉植物。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述單子葉植物為玉米。20.權(quán)利要求17的方法，其中所述用于食物或飼料的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為雙子葉植物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述雙子葉植物為大豆。22.權(quán)利要求17的方法，其中所述去穩(wěn)定序列選自3，SAUR終止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序與ATTTAA基序的組合。23.權(quán)利要求17的方法，其中所述目標基因與轉(zhuǎn)基因表達盒內(nèi)的至少一個啟動子元件操作性連接。全文摘要本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組DNA內(nèi)包括編碼多肽的外源基因，該外源基因在其3’非翻譯區(qū)具有去穩(wěn)定序列，從而相對于在去穩(wěn)定序列不存在時的表達，該多肽在轉(zhuǎn)基因植物的種子中以較低水平表達。本發(fā)明還提供用于轉(zhuǎn)錄后降低植物中目標基因的信息穩(wěn)定性的方法，該方法包括在目標基因的3’非翻譯區(qū)添加去穩(wěn)定序列。文檔編號C12N15/82GK101223276SQ200680025740公開日2008年7月16日申請日期2006年5月16日優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日發(fā)明者I·M·霍斯,J·P·達布洛夫斯基,K·Y·泰,Q·王,T·N·烏爾馬索夫申請人:孟山都技術(shù)有限公司