專利名稱:種子特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的制作方法
為種子特異性轉(zhuǎn)錄提供植物材料的遺傳修飾。可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性產(chǎn)品的生產(chǎn)或提供新的生產(chǎn)能力。
在遺傳修變中的主要重點(diǎn)已經(jīng)對準(zhǔn)原核 生物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。業(yè)已證明，由于種種原因，植物細(xì)胞比原核生物細(xì)胞更難于進(jìn)行遺傳操作。其部分原因是由于其包括了不同的目的，迄今大部分植物修變已經(jīng)針對改變整個植物或活體植物的特定部分，而不同于改變培養(yǎng)的細(xì)胞。
從多方面的應(yīng)用出發(fā)，人們期望能提供在植物的特殊部分或植物生長周期的特定時間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。為此目的，目前已將注意力集中在修變某些內(nèi)源性植物產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)是以一種有利的方式被調(diào)節(jié)的。在鑒定這類產(chǎn)品時，首先必須尋找那些出現(xiàn)于細(xì)胞生長周期的特定時間或出現(xiàn)于特定植物部分的產(chǎn)物，證明其不存在于其它時間或其它部分，確定與該產(chǎn)物相聯(lián)系的核苷酸序列，之后鑒定植物基因組中的序列，以得到與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的5′非翻譯的序列。為此必須首先鑒定特定序列，之后確證其為正確序列并分離預(yù)期的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域。之后則須制備適當(dāng)?shù)臉?gòu)建物，進(jìn)而證明該構(gòu)建物是可以以預(yù)期的方式發(fā)揮效能的。
鑒定這樣的序列是一個富于挑戰(zhàn)性的課題，其主要困難是在于測定易于出現(xiàn)錯誤而且不易確定。然而，現(xiàn)已更多地注意到能夠遺傳修變植物，為此付出大量的研究經(jīng)費(fèi)并在鑒定轉(zhuǎn)錄序列和對其進(jìn)行遺傳操作以確定其實(shí)用性方面作了大量工作。
相關(guān)文獻(xiàn)
Crouch等人(Molecular Form and Funetion of the Plant Genome，eds、van Vloten-Doting，Groot and Hall，Plenum Publishing Corp.1985，pp555～566)、Crouch和Sussex(Planta(1981)15364～74)、Crouch等人(J.Mol.Appl.Genet.(1983)2273～283)以及Simon等人(Plant Molecular Biology(1985)5191～201)描述了甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)儲存蛋白的各個方面。Beachy等人(EMBO J.(1985)43047～3053)、Sengupta-Gopalan等人(Proc，Natl.Acad.Sci.USA(1985)823320～3324)、Greenwood和Chrispeels(Plant Physiol(1985)7965～71和Chen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838560～8564)描述了有關(guān)種子儲存蛋白和遺傳操作的研究。Eckes等人(Mol.Gen.Genet.(1986)20514～22)和Fluhr等人(Science(1986)2321106～1112)描述了對光誘導(dǎo)的植物基因的遺傳操作。
本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建物可用于操縱植物細(xì)胞，以使之為產(chǎn)生種子特異性轉(zhuǎn)錄提供保證。特別是，將儲存蛋白轉(zhuǎn)錄區(qū)域連接于野生型基因以外的片段上并引入植物基因組內(nèi)，進(jìn)而提供種子特異性轉(zhuǎn)錄。該構(gòu)建物提供了對內(nèi)源性產(chǎn)物的調(diào)節(jié)以及異源性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
提供新的DNA構(gòu)建物，可用于對種子轉(zhuǎn)錄的修變，特別是種子成熟期間胚胎內(nèi)的轉(zhuǎn)錄的修變。該DNA構(gòu)建物包含一與種子生成有關(guān)的，特別是與胚胎形成及種子成熟有關(guān)的調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。其中特別有用的是與儲存蛋白，如napin，cruciferin，β-conglycinin和云扁豆蛋白等有關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)?？捎扇魏畏奖阋椎玫乃拗?，特別是蕓苔屬(Brassica)，例如甘藍(lán)型油菜(napus)或油菜(Campestris)，大豆(Glycine max)，菜豆(Phaseolus Vulgaris)，玉米(Zea mays)，棉花(Gossypium SP.)，紅花(Carthamus tinctorius)，蕃茄(Lycopersican esculentum)和萼距花屬(Cuphea)等植物宿主得到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
在種子特異性區(qū)域的下游并處于種子特異性區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)下的是一個有用序列，該序列將可以提供通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性產(chǎn)物，依據(jù)其其量，相對分布等以改變種子的表型，或者通過產(chǎn)生外源性表達(dá)產(chǎn)物為種子提供新的功能和產(chǎn)物。該DNA構(gòu)建物也將提供一終止區(qū)，進(jìn)而提供可向其中引入某一基因的表達(dá)暗盒(expression cassette)。通過具有一個或多個限制性位點(diǎn)連接子或多聚連接子，可以方便地提供在轉(zhuǎn)錄之方向上分離的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū)，以使基因的插入處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下。連接子通常有1至10個，較好是大約有1至8個，最好是2至6個限制性位點(diǎn)。連接子一般為不足100bp，常常少于60bp，而通常至少為大約5bp。
轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是宿主所固有的或同源于宿主的，或者是外來的或異源于宿主的。所謂外來的是指該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)并不見于野生型宿主，而是向其中引入了轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
特別有用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是與甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)或油菜(B.Campestris)napin基因，酰基載體蛋白相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，這些基因自大約第7至40天在種子中表達(dá)，特別在大約第10天至20天具有最大表達(dá)，此時被表達(dá)的基因并不見于葉子中，而在種子中大量見到已表達(dá)的產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)錄暗盒包括呈5′-3′的轉(zhuǎn)錄方向的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，有用的序列以及在植物中有功能活性的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。DNA序列可具有任何編碼有用肽如一種酶的開放讀碼，或一個互補(bǔ)于基因組序列的序列，該基因組序列可以是一個開放讀碼，一個內(nèi)含子，一個非編碼的前導(dǎo)序列，或任何其它序列，其中互補(bǔ)序列可抑制轉(zhuǎn)錄、信使RNA加工(如裂接)或翻譯。此有用的DNA序列可以是合成的，天然衍生的或以此兩種方式結(jié)合得到的。根據(jù)此有用DNA序列的性質(zhì)，可望使用植物優(yōu)選的密碼子，以合成該序列。植物優(yōu)選的密碼子可根據(jù)在特殊有用植物品種中以最大量表達(dá)的蛋白中有最高頻率的密碼子來確定。
在制備轉(zhuǎn)錄暗盒中，可以操作各種DNA片段，以便提供在適當(dāng)方向上的，并且如果順利且處于適當(dāng)讀碼中的DNA序列。為此目的，可使用接合物或連接子連接該DNA片段，或使用其它操作法以提供方便的限制性位點(diǎn)，除去多余的DNA或限制性切點(diǎn)等。為此，可以使用體外誘變、引物修復(fù)，限制，退火，切除，連接等方法，其中可包括插入，缺失或置換(如轉(zhuǎn)換和顛換)。
所用的終止區(qū)應(yīng)是便于使用的，因?yàn)榻K止區(qū)似乎是相對可互變的。終止區(qū)可以是連同轉(zhuǎn)錄起始區(qū)固有的，可以是有用DNA序列固有的，或者是可以由其它來源得到的。常用的終止區(qū)是由根癌病土壤桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)?？傻玫剑缯卖~堿合成酶和nopaline合成酶終止區(qū)。
借助于適當(dāng)?shù)倪z傳操作，如限制性切斷，切掉伸長部分或充填懸突部分，以制成平頭，連接上連接子或類似物，以提供用于接合和連接的片段的互補(bǔ)末端。
在完成各步驟中，可使用克隆方法以擴(kuò)增DNA的量和允許分離該DNA，以確保以適當(dāng)方式進(jìn)行操作。有多種克隆載體均可利用，所用的克隆載體包含一種在大腸桿菌中有功能的復(fù)制系統(tǒng)以及一個可用于選擇已轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的標(biāo)志。作為舉例的載體包括PBR332，puc系列，M13mp系列，PACYC184等。從而可將序列在適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)插入載體，用所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主，使該大腸桿菌生長于適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，收獲、并溶解細(xì)胞，從中回收質(zhì)粒。分析可以包括序列分析，限制性酶切分析，電泳或類似的分析。每次處理后，將被用于最終構(gòu)建物中的DNA序列可得以限制并連接于下一個序列，而其中每一部分構(gòu)建物則可在相同或不同的質(zhì)粒中克隆。
除轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物引入植物中的方式不同，尚需要其它一些DNA序列。例如，當(dāng)使用Ti或Ri質(zhì)粒進(jìn)行植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，如下所述，至少須將Ti和Ri質(zhì)粒之T-DNA的右側(cè)邊緣序列，更多是右側(cè)和左側(cè)邊緣序列作為側(cè)接區(qū)，連接到轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物上。業(yè)已就T-DNA在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用作了廣泛的研究，并已在歐洲專利申請(EPA)120，516號、Hoekema(The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V.Alblasserdam，1985，Chapter V)和Fraley等人(Crit.Rev.Plant Sci.，41-46)以及An等人(EMBO J.(1985)4277～284)的文獻(xiàn)中作了充分的描述。
另外，為了提高向植物基因組內(nèi)的整合作用，可以將易位子的末端重復(fù)序列用作與易位酶相聯(lián)系的邊緣區(qū)序列。在這種情況下，易位酶的表達(dá)將是可誘導(dǎo)的，或者易位酶是被失活的，這樣，一旦轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物被整合到基因組內(nèi)，它便是相對穩(wěn)定地整合了的，并且可避免跳躍現(xiàn)象。
轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物正常是與可用于在植物細(xì)胞中進(jìn)行選擇的標(biāo)志相連接的。標(biāo)志物可以是對生物殺傷藥劑，特別是抗生素如卡那霉素，G418，博來霉素，潮霉素，氯霉素等抗生素有抗性的。所用的特定標(biāo)志物應(yīng)是可與缺乏該DNA的細(xì)胞相比較，以選擇那些已轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。
可使用多種不同的技術(shù)，將DNA引入植物細(xì)胞宿主內(nèi)。這些技術(shù)包括使用根癌病土壤桿菌或發(fā)根病土壤桿菌(A.Rhizogenes)作轉(zhuǎn)化劑用Ti-DNA轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體融合，注射及電穿孔等。在用土壤桿菌轉(zhuǎn)化時，可由大腸桿菌內(nèi)制備質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有與Ti質(zhì)粒同源的DNA，特別是T-DNA。該質(zhì)粒能夠或不能在土壤桿菌中復(fù)制，即它可具有或沒有廣譜的原核生物復(fù)制系統(tǒng)，如RK290，此將部分地依賴于是否轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物將被整合到Ti質(zhì)粒中或被保留在某獨(dú)立的質(zhì)粒上。借助于輔助質(zhì)粒，可使轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到根癌病土壤桿菌內(nèi)，并將所得到的已轉(zhuǎn)化的生物體用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
可用根癌病土壤桿菌或發(fā)根病土壤桿菌，簡便地培養(yǎng)外植體，以使轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，使植物細(xì)胞分散于用于選擇的適當(dāng)選擇性培養(yǎng)基中，生長成愈創(chuàng)組織，發(fā)芽并在生根培養(yǎng)基中由幼苗再生成為小植物。土壤桿菌宿主將包含一個具有Vir基因，并可能有或沒有T-DNA的質(zhì)粒，其中Vir基因是使T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)所必須的。為進(jìn)行注射和電穿孔處理，可將失去攻擊能力的Ti質(zhì)粒(缺乏腫瘤基因，特別是T-DNA區(qū)域)引入植物細(xì)胞內(nèi)。
可以以多種方式使用構(gòu)建物。特別是這些構(gòu)建物可用于修變種子內(nèi)的脂肪酸組成，即從鏈長、不飽和程度等方面改變各種不同脂肪酸的比例和/或量。因此對脂肪酸組成的改變可包括，較之16至18碳原子的脂肪酸，提高了10至14碳原子之脂肪酸的量，增加或降低20至24碳原子之脂肪酸，提供用于提高飽和或未飽和之脂肪酸的比例等。這些結(jié)果可通過產(chǎn)生互補(bǔ)于固有基因之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的成熟和/或表達(dá)，以降低一種或多種內(nèi)源性產(chǎn)物，特別是酶或輔助因子的表達(dá)而達(dá)到的，或者是通過提供與脂肪酸合成有關(guān)的某一基因(內(nèi)源性或外源性的)的表達(dá)而達(dá)到的。與脂肪酸合成有關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物包括?；d體蛋白，硫酸酶，乙酰轉(zhuǎn)?；?、乙酰輔酶A羧化酶，酮酯?；铣擅?，丙二酸單酰轉(zhuǎn)酰基酶，硬脂酰-ACP去飽和酶及其它去飽和酶。
此外，可望由包括哺乳動物的其它來源制得各種產(chǎn)品，如血液因子、淋巴細(xì)胞活素、菌落刺激因子、干擾素、纖維蛋白溶酶原活化劑、酶(如過氧化物歧化酶、凝乳酶等)、激素、大鼠乳腺硫酯酶2、參與Cicosapentaenoia acid，合成中的磷脂?；ワ柡兔讣叭搜灏椎鞍椎?。另一個目的是增加種子蛋白特別是突變之種子蛋白的水平，包括改善其氨基酸分配，以便好地保障種子的營養(yǎng)價值。在這種情況下，可以通過生產(chǎn)與固有編碼區(qū)或非編碼區(qū)互補(bǔ)的DNA序列來抑制固有種子蛋白，此時互補(bǔ)系列將不能與突變的序列進(jìn)行有效地雜交，或使固有轉(zhuǎn)錄能力失活。
可依照常規(guī)方法，使已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)入植物內(nèi)生長。例如，可參見Mc Cormick等人(Plant Cell Reports(1986)581～84)。之后培養(yǎng)這些植物，并與同一已轉(zhuǎn)化株或不同的植株授粉，鑒定具有預(yù)期之表型特征的雜種?？梢苑敝硟纱騼纱陨?，以使該表型特征得以穩(wěn)定地保留和遺傳，之后收獲種子以確保得到預(yù)期的表型或其它性質(zhì)。
作為宿主細(xì)胞，可以使用提供有種子的任何品種的植物。因此，對于可選擇的大部分植物來說，應(yīng)是可大量生產(chǎn)種子的，或者可收獲到有價值之種子特異性產(chǎn)品的。有價值的種子包括油料種子，如蕓苔屬(Brassica)種子，棉花種子，大豆，紅花，向日葵等;谷物種子，如小麥，大麥，稻，三葉草，玉米等。
可以以多種方法鑒定有用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。在已經(jīng)分離了種子蛋白后，即可部分地測定其序列，這樣也就能夠設(shè)計出用于鑒定對種子特異之mRNA的探針。為進(jìn)一步提高與種子特異相關(guān)之mRNA的濃度，可制備CDNA，并用mRNA“扣除”CDNA，或者由非種子相關(guān)細(xì)胞制備CDNA。之后即可使用由植物細(xì)胞制備的適當(dāng)DNA文庫，用殘留的DDNA探查基因組的互補(bǔ)序列。進(jìn)而可分離，操作與CDNA雜交的序列，分離與編碼區(qū)相關(guān)的5′非翻譯區(qū)，并用于表達(dá)構(gòu)建物中以鑒定5′非翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。
在有些情況下，可使用直接篩選基因組文庫的探針，并鑒定與探針雜交的序列，以進(jìn)一步縮短研究工作?？砂瓷鲜龇椒ú倏v該序列以鑒定5′-非翻譯區(qū)。
可按前面已描述的方法，將使用5′-非翻譯區(qū)制得的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)，以檢測其發(fā)揮異源性結(jié)構(gòu)基因(但不是與5′非編碼區(qū)相關(guān)的野生型開放讀碼)功能及種子特異性的能力。以這種方法，可鑒定特異性序列作為種子特異性轉(zhuǎn)錄之序列的使用。特別有價值的表達(dá)暗盒包括來自napin基因特別是蕓苔屬napin基因、更具體地說是甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)或油菜(Brassica campestris)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、與脂類產(chǎn)生，特別是與脂肪酸產(chǎn)生有關(guān)的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因，包括酰基載體蛋白(其對特殊植物可以是內(nèi)源或外源性的)如波菜酰基載體蛋白，蕓苔屬?；d體蛋白，(如甘藍(lán)型油菜或油菜、萼距花屬(Cuphea)等的?；d體蛋白)，乙酰轉(zhuǎn)?；?、丙二酰轉(zhuǎn)?；?、β-酮酯酰合成酶Ⅰ和Ⅱ、硫酯酶，特別是植物、哺乳動物或細(xì)胞來源的硫酯酶Ⅱ(例如大鼠硫酯酶Ⅱ)，?；鵄CP或磷酯?；ワ柡兔?。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)材料和方法克隆載體使用的克隆載體包括pUC載體，即pUC8和pUC9(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268);pUC18和pUC19(Norrander等人，Gene(1983)26101～106;Yanisch-Perron等人，Gene(1985)33103～109)，以及用氯霉素抗性(CAM)交換上述pUC質(zhì)粒之氨芐青霉素抗性作為標(biāo)志物的類似載體(pUC-CAM)〔pUC12-Cm，pUC13-Cm〕Buckley，K.，Pn.D.Thesis，U.C.S.D.，CA1985)。PUC18和pUC19載體的多克隆位點(diǎn)與pUC-CAM的克隆位交換以建成具有CAM抗性的pCGN565和pCGN566。亦使用了PUC118和pUC119，其分別是具有M13之基因間區(qū)的pUC18和pUC19，該基因間區(qū)自5465處的Hgi AⅠ位點(diǎn)至5941處的Aha Ⅲ位點(diǎn)，是在PUC的Nde Ⅰ位點(diǎn)插入的。(可自Vieira J，和Messing處得到，J.Waksman Institute，Rutgers University，Rutgers，N.J.)材料自Bethsda研究實(shí)驗(yàn)室得到的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)、RNase H、大腸桿菌DNA聚合酶，T4激酶和限制性內(nèi)切酶，得自New England Biolads的大腸桿菌DNA連接酶;得自Life Sciences有限公司的逆轉(zhuǎn)錄酶;得自Amtrsham公司的同位素;得自Bachem有限公司(Torrance，CA)的X-gal。
實(shí)例1Napin啟動子的構(gòu)建在pg N1克隆之有napin基因之ATG起始密碼子的298核苷酸上游，將含有napin基因之甘藍(lán)型油菜(B.napus)基因組DNA的3.3Kb Eco RⅠ汽段克隆到pUC8(得自Marti Crouch，University of Indiana)中。用Eco RI和Sst Ⅰ酶切pg N1 DNA并連接到Eco RⅠ/SstⅠ酶切的PCGN706上。(pCG706是一個含有3′和另一個在Sal Ⅰ和Pst Ⅰ位點(diǎn)克隆到pCGN566中之Napin CDNA克隆pN2(Crouch等，1983，上述文獻(xiàn))的聚腺苷酸化序列。)用Sal Ⅰ酶切所得的克隆PCGN707，并用Bal 31酶處理以除去napin基因的某些編碼區(qū)。于Bal 31處理后用Sma Ⅰ酶切所得切斷了的DNA并重新連接之。將按大小選擇的克隆之一，即pCGN713通過Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切再克隆到Eco RⅠ/Bam HⅠ酶切的PEMBL18(Dente等人，Nucleic Acids Res.(1983)111645～1655)和pUC118中，以分別得到E418和E4118。用Sanger二脫氧法檢測E418模板的堿基序列，以進(jìn)一步檢實(shí)Bal 31酶切的范圍。對啟動子區(qū)的Bal 31刪除只擴(kuò)展到起始密碼子的57核苷酸下游區(qū)，因此含有napin編碼序列的5′末端和5′非編碼區(qū)的大約300bp。依照Zoller和Smith方法(Nucleic Acids Res.(1982)106487-6500)。使用一寡核苷酸引物5′-GATGTTTTGTATGTGGGCCCCTAGGAGATC-3′，經(jīng)體外致突變，剪裁E4118，以缺失包括ATG起始密碼子之napin的所有編碼區(qū)域。經(jīng)兩次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM83菌株中(Messing J.，Recombinant DNA Technical Bulletin，NIH Publication No.79～99，2 No、2，1979，pp43-48)并對假定的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行Sma Ⅰ酶切以篩選適當(dāng)?shù)耐蛔凅w。所得napin啟動子克隆為pCGN778，并含有由pgN1的Eco RⅠ位點(diǎn)到恰在napin的ATG起始密碼子之間之A核苷酸的298個核苷酸。用Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切并連接到Eco RⅠ/Bam HⅠ酶切的pCGN565上，使啟動子區(qū)再克隆到氯霉素抗性本庫材料中，以得到pCGN779C。
Napin啟動子克隆的延伸pCGN779C只含有潛在之5′-調(diào)節(jié)序列的298個核苷酸。用見于原始λBnNa克隆上5′-Eco RⅠ位點(diǎn)之上游區(qū)的1.8Kb片段延伸napin啟動子。將包含napin區(qū)的λBnNa(得自M.Crouch)的～3.5Kb Xho Ⅰ片段再克隆到Sal Ⅰ酶切的pUC119中，得到pCGN930。利用緊接著5′Xho Ⅰ位點(diǎn)的Hind Ⅲ位點(diǎn)使pCGN930的Hind Ⅲ/Eco RⅠ片段再克隆到Hind Ⅲ/Eco RⅠ酶切的Bluescript+(載體克隆系統(tǒng)，San Diego，CA)中，得到pCGN942。將用Eco RⅠ和Pst Ⅰ酶切的pCGN779C與用Eco RⅠ和Pst Ⅰ酶切的PCGN942相連制成延伸了的napin啟動子，得到pCGN943。該啟動子含有包含在λBnNa上之napin基因原始ATG的～2.1Kb上游序列。圖1中顯示了啟動子區(qū)的部分序列。
Napin暗盒(Cassettes)使延伸的napin啟動子與napin 3′調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，即得到表達(dá)種子特異性基因的napin暗盒。所用的napin 3′區(qū)來自于含有Xho Ⅰ/Eco RⅠ片段的質(zhì)粒pCGN1924，上述片段則是將pg NⅠ(Xho Ⅰ位點(diǎn)位于距napin基因之終止密碼18個核苷酸處)再克隆到Eco RⅠ/Sal Ⅰ酶切的pCGN565中得到的。連接Hind Ⅲ/Pst Ⅰ酶切的pCGN943和pCGN1924，得到napin暗盒pCGN744，其具有用于插入基因的獨(dú)特的克隆位點(diǎn)Sma Ⅰ、Sal Ⅰ和Pst Ⅰ。
得自菠菜葉之CDNA文庫的構(gòu)建依顧Facciotti等人(Biotechnology(1985)3241～246)所述的方法，在4M硫氰酸胍緩沖液內(nèi)，從嫩菠菜葉中提取總RNA。依照Maniatis等人(1982)(Molecular CloningA Laboratory Manual，(1982)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)所述的方法使總RNA經(jīng)兩次Oligo(dT)-纖維柱層析，以得到poly(A)+RNA。依照稍加改進(jìn)的Gubler和Hoffman方法(Gene(1983)25263-269)在pUC13-Cm中構(gòu)建cDNA文庫。在合成第一股cDNA時須將RNasin刪除，如果不完全除去，它將干擾第二股的合成，同時如文獻(xiàn)中所述用dCTP接尾載體DNA并用dGTP接尾雙股cDNA以防止倒轉(zhuǎn)。接Hanahan所述的方法(J.Mol.Biol.(1983)166557-580)將已退火的cDNA轉(zhuǎn)化到足夠的大腸桿菌JM83(Messing(1979)上述文獻(xiàn))細(xì)胞內(nèi)，并散布于含有50微克/毫升(氯霉素和0.005%X-Gal的LB瓊脂平皿上(Miller，(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。
菠菜ACP-Ⅰ cDNA的鑒定通過Southern吸印法(Southern，J.Mol.Biol.(1975)98503)并與得自各代表200個cDNA克隆的40份儲集品的克隆分析DNA(見下述)進(jìn)行斑點(diǎn)印跡(見下述)雜交，篩選出總共大約8000個cDNA克隆。與菠菜ACP-Ⅰ的16氨基酸區(qū)至少有66%同源性5′末端標(biāo)記的合成寡核苷酸(ACPP4)(5′-GATGTCTTGAGCCTTGTCCTCATCCACATTGATACCAAACTCCTCCTC-3′)互補(bǔ)于能夠編碼16氨基酸肽glu-glu-glu-phe-gly-ile-asn-val-asp-glu-asp-lys-ala-gln-asp-ile，菠菜ACP-Ⅰ的殘基49-64(Kuo and Ohlrogge，Arch.Biochem.Biophys.(1984)234290-296)的DNA序列被用作ACP探針。
用于Soufhern或斑點(diǎn)吸印雜交的克隆分析DNA是按下述方法制備的。將轉(zhuǎn)化體由瓊脂板上轉(zhuǎn)移到含50微克/毫升氯霉素的LB培養(yǎng)中，按每10毫升培養(yǎng)基含10個克隆進(jìn)行分配。培養(yǎng)物于37℃震蕩孵箱內(nèi)保溫過夜，之后用等體積培養(yǎng)基稀釋并使之生長5小時以上。混合20份樣品的內(nèi)容得到各含200個cDNA克隆的儲備品。按Birnboim和Doly所述的方法(Nucleic Acids Res、(1979)71513-1523)，由這些細(xì)胞內(nèi)提取DNA。在用苯酚和氯仿提取后用乙醇沉淀以純化DNA，使之能夠用限制內(nèi)切酶消化。將DNA重新懸浮于無菌的蒸餾水中，用Eco RⅠ和HindⅢ酶切40份儲集的每份各1微克的DNA樣品，并通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離。用Southern的印跡雜交技術(shù)將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。
依照廠商提供的說明中所述的方法用r-32P dATP和T4激酶標(biāo)記ACPP4的5′末端。依照Berent等人的方法(Bio Techniques(1985)3208-220)對來自Southern印跡轉(zhuǎn)移克隆分析DNA的硝酸纖維素濾膜進(jìn)行雜交(24小時，42℃)并洗滌。將各1微克DNA儲集物加至0.5MNaOH中的尼龍濾膜上，制備同一組DNA儲集物的斑點(diǎn)印跡。將這些印跡于42℃在50%甲酰胺/1%SDS/1M NaCl中與探針雜交24小時，并與室溫下在2×SSC/0.1%SDS(1×SSC＝0.15M NaCl;0.015M檸檬酸鈉;SDS＝十二烷基磺酸鈉)中洗滌。按上述方法將被ACPP4寡聚核苷酸探針雜交的儲集物的DNA轉(zhuǎn)移到JM83細(xì)胞內(nèi)并鋪極以得到個別的轉(zhuǎn)化體。將DNA加到已與ACPP4寡聚核酸探針雜交的硝酸纖維素濾膜上制得這些個別cDNA克隆的斑點(diǎn)印跡，并使用與作儲集DNA樣品之Southern印跡相同的條件分析之。
核苷酸序列分析用限制性內(nèi)切酶消化，以分析陽性克隆pCGN1SOL，得到如下的部分酶切圖。
＊前面的pstⅠ位點(diǎn)被接尾破壞＊＊具有所示可利用的限制性酶切位點(diǎn)的多聚連接子使用限制性切斷、連接、轉(zhuǎn)化和分析等標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Maniatis等，(1982)上述文獻(xiàn))將cDNA克隆再克隆到pUC118和pUC119中。制備單股DNA模板，并使用Sanger二脫氧技術(shù)(Sanger等人，(1977)Proc.Nat.Acad Sci USA745463-5467)測定DNA序列。使用Intelli-Genetics有限公司的程序設(shè)備(sofftware package)進(jìn)行序列分析。
pCGN1SOL含有(近似于)700bp cDNA插入片段，該片段在3′末端包括A殘基的延伸部分，其代表了mRNA的、poly(A)尾部。推定61位上的ATG密碼子為編碼MET的翻譯起始密碼子。該密碼子是411核苷酸開放讀碼的起始，其中核苷酸229-471編碼一個其氨基酸序列幾乎完全與Kuo和Ohlrogge所述的ACP-Ⅰ之氨基酸序列相符的蛋白質(zhì)。除成熟蛋白質(zhì)外，pCGN1SOL還編碼-56殘基轉(zhuǎn)換肽序列，可望其為核編碼的葉綠體蛋白。
Napin-ACP構(gòu)建物將用HindⅢ/Bam HⅠ酶切的pCGN1SOL、用HindⅢ和Bam HⅠ酶切的pUC8和用Bam HⅠ酶切的pUC118相連接而構(gòu)建成pCGN796。用Bam HⅠ酶切pCGN796并與Bam HⅠ酶切的pCGN565連接，使來自pCGN1796的ACP基因轉(zhuǎn)移到氯霉素本底中。用Eco RⅠ和Sma Ⅰ酶切所得的pCGN1902，并連接到Eco R1/Sma Ⅰ酶切的pUC118上，得到pCGN1920。在Nco 1位點(diǎn)上切斷pCGN1920中的ACP基因，經(jīng)用Klenow片段處理充填之，用Sma Ⅰ酶切并再連接以得到pCGN1919。這樣便由ACP基因除掉了5′編碼序列并重新產(chǎn)生了ATG。用Eco RⅠ酶切pCGN1919，用Klenow片段填入此位點(diǎn)，并連接一Pst Ⅰ連接子，即使這-ACP基因側(cè)接以Pst Ⅰ位點(diǎn)。該克隆被稱為pCGN945。
pCGN945的ACP基因作為Bam HⅠ/Pst Ⅰ片段移到用Bam HⅠ和Pst Ⅰ酶切的pUC118上，即產(chǎn)生出pCGN945a，致使Sma Ⅰ位點(diǎn)(由pUC118提供的)處于ACP序列的5′末端從而有利于克隆到napin暗盒pCGN944中。將用Sma Ⅰ和PstⅠ酶切的pCGN945a連接到用Sma 1和Pst Ⅰ酶切的pCGN944上，以產(chǎn)生napin ACP暗盒PCGN946。之后通過自Hin dⅢ位點(diǎn)克隆，將napin ACP暗盒轉(zhuǎn)移到雙載體pCGN783中，以產(chǎn)生pCGN948。
雙載體pCGN783的構(gòu)建pCGN783是含有根癌病土壤桿菌之左和右T-DNA邊緣區(qū)(Barker等人，Plant Mol.Biol，(1983)2335-350);pPH1JI之慶大霉素抗性基因(Hirsch等人，Plasmid(1984)，12139-141)，花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)(Gardner等，Nucleic Acids Res.(1981)92871-2890)之35S啟動子、Tn5(Jorgenson等，下述文獻(xiàn)和Wolff等人，上述文獻(xiàn)(1985)13355-367)之卡那霉素抗性基因和來自pTiA6之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物7之3′區(qū)(Barker等上述文獻(xiàn)(1983))的雙質(zhì)粒。
為得到慶大霉素抗性標(biāo)志，自pPHIJ1的3.1Kb Eco RⅠ-Pst Ⅰ片段分離慶大霉素抗性基因，并克隆到產(chǎn)生pCGN549的pUC9中。用含有慶大霉素抗性基因的HindⅢ-Bam HI片段取代產(chǎn)生pCGN594之pCGN587的HindⅢ-BglⅡ片段。
按下述方法制備pCGN587將含有APH Ⅱ之完整結(jié)構(gòu)基因的Tn5(Jorgenson等人，Mol.Gen.Genet.(1979)17765)的HindⅢ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)，因有一個Eco RⅠ位點(diǎn)直接與Sma 1位點(diǎn)相鄰故可將該片段轉(zhuǎn)化到HindⅢ-Eco RⅠ片段中，之后使含有APH基因之3′部位的Pst Ⅰ-Eco RⅠ片段與Eco RⅠ-Bam HⅠ-Sal Ⅰ-Pst Ⅰ連接子結(jié)合到pUC7的Eco R1位點(diǎn)(PCGN546W)。因?yàn)樵摌?gòu)建物并不給出卡那霉素抗性，故須將APH Ⅱ基因的Bgl Ⅱ-Pst Ⅰ片段插入到Bam HⅠ-Pst Ⅰ位點(diǎn)(pCGN546X)以得到卡那霉素抗性。該方法重新裝配了APH Ⅱ基因，以使Eco R1位點(diǎn)側(cè)接于基因上。一個ATG密碼子是來自帶有APH Ⅱ之ATG起始密碼子的讀碼以外的上游。將來自APH Ⅱ之5′末端的Sau 3A-Pst Ⅰ片段，(該片段缺乏不必要的ATG)插入到pCGN546W的Bam HⅠ-Pst 1位點(diǎn)，以得到質(zhì)粒pCGN550，即可避開不需要的ATG。
之后將含有APH Ⅱ基因的Eco R1片段克隆到pCGN451的含有表達(dá)章魚堿合成酶的暗盒唯一的Eco R1位點(diǎn)，以提供pCGN552(1ATG)。
PCGN451包含章魚堿暗盒，其包括通過Eco RⅠ連接子融合于pTiA6之章魚堿合成酶基因3′編碼區(qū)的約1556 bp 5′非編碼區(qū)。PTi等同物是如Barker等人(Plant Mol.Biol.(1983)2325)所定義的3′區(qū)的11，207至12，823bp片段和5′區(qū)的13，643至15，208bp片段。
依照下述方法制得5′區(qū)。將含有編碼區(qū)之5′末端的小的再克隆的片段作為Bam HⅠ-Eco RⅠ片段克隆到作為質(zhì)粒pCGN407的pBR322中。Bam HⅠ-Eco RⅠ片段在編碼區(qū)有-Xmn I位點(diǎn)，而pBR322有兩個Xmn Ⅰ位點(diǎn)。用Xmn Ⅰ酶切pCGN407，用Bal 31核酸酶切斷并將Eco RⅠ連接子加到該片段上。用Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后，按大小分離各片段，克隆各部分并分析其序列。一種情況是使整個編碼區(qū)和5′非翻譯序列的10bp脫離5′非翻譯區(qū)被除去，而mRNA帽位點(diǎn)和5′非翻譯區(qū)的16bp(至Bam HⅠ位點(diǎn))是完整的。在7%聚丙烯酰胺凝膠上按大小分離得到該小片段并洗脫出大約130bp的片段。
將這個按大小分離的DNA連接到M13mp9中，并分析幾個克隆的核苷酸序列，此序列與章魚堿合成酶基因的已知序列差不多。M13構(gòu)建物被定名為P14，用Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切其質(zhì)粒提供小的片段，該小片段被連接于含有PTiA6(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)之上游5′序列的Xho Ⅰ至Bam HⅠ片段以及含有3′序列的Eco RⅠ至Xho Ⅰ片段上。
將所得的Xho Ⅰ片段克隆到pUC8衍生物的Xho Ⅰ位點(diǎn)中(定名為pCGN426)。該質(zhì)粒因具有用DNA聚合酶Ⅰ填入的單一Eco RⅠ位點(diǎn)，并且因Hin CⅡ限制性核酸內(nèi)切酶的核酸酶污染致使丟失Pst Ⅰ和HindⅢ(此時Xho Ⅰ連接物被插入到pUC8的唯一Hin CⅡ位點(diǎn)中)，故不同于pUC8。所得到的質(zhì)粒pCGN451具有一個在5′非編碼區(qū)(其含有1550bp5′未翻譯的序列，該序列包含T-DNA的右側(cè)邊緣區(qū)，mRNA帽位點(diǎn)和16bp5′未翻譯的序列)和3′區(qū)(其含有267bp編碼區(qū)、終止密碼子、196bp3′未翻譯的DNA，polyA位點(diǎn)及1153bp3′未轉(zhuǎn)錄的序列)之間插入蛋白編碼序列的單一Eco RⅠ位點(diǎn)。pCGN451也提供了右側(cè)T-DNA邊緣區(qū)。
用Eco RⅠ酶切得到在適當(dāng)方向上具有OCS5′和OCS3′的質(zhì)粒pCGN451，并將得自含完整卡那霉素抗性其因之PCGN551的Eco RⅠ片段插入到Eco RⅠ位點(diǎn)中，以提供在適當(dāng)方向上有卡那霉素抗性基因的pCGN552。
該OCS/KAN基因被用于為反式雙載體pCGN587提供一個可選擇的標(biāo)志。
工程化章魚堿合成酶啟動子暗盒的5′部分在bp15208-13644(Barker的序列編號)始自Xho Ⅰ的pTiA6 DNA組成，該DNA也含有卷入T-DNA轉(zhuǎn)移的T-DNA邊界序列(邊緣區(qū))。在質(zhì)粒pCGN587中，來自pCGN552的OCS/KAN基因提供一個可選擇的標(biāo)志以及右側(cè)邊緣區(qū)。首先將左邊緣區(qū)作為-Hind Ⅲ-Sma Ⅰ片段(pCGN502)(堿基對602-2213)，克隆到M13mp9中，再作為為Kpn 1-Eco RⅠ片段克隆到pCGN565中以得到pCGN580。pCGN565是一個基于pUC8-Cm的克隆載體，但含有pUC18連接子。用Bam HⅠ酶切使pCGN580成為線性的，并用于取代pVCK102(Knauf和Nester，Plasmid(1982)845)的較小的Bgl Ⅱ片段，建成pCGN585。用來自含OCS/KAN基因之pCGN552的Xho Ⅰ片段置換pCGN585的較小Sal Ⅰ片段，得到pCGN587。
用得自pUC18的Hin dⅢ-Bam HⅠ多聚連接子區(qū)取代含有5′-OCS-卡那霉素-OCS-3′片段的pCGN594 Hin dⅢ-Bam HⅠ區(qū)(OCS是具有5′標(biāo)示之啟動子區(qū)和3′終止信號區(qū)的章魚堿合成酶基，見美國專利申請775，923號，申請日為1985年9月13日)。
pCGN566含有插入到PUC13-Cm之Eco RⅠ-Hin dⅢ位點(diǎn)之pUC18的Eco RⅠ-Hin dⅢ連接子。將含有ORF 1和pTiA6之-2的PNW31C-8，29-1(Thomashow等人，Cell(1980)19729)的HindⅢ-Bgl Ⅱ片段再克隆到pCGN566的Hin dⅢ-Bam HⅠ位點(diǎn)得到pCGN703。
將含有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物7之3′區(qū)(相當(dāng)于pTiA6(Barker等人，(1983上述文獻(xiàn))的堿基對2396-2920)的pCGN703的Sau 3A片段再克隆到pUC18的Bam HⅠ位點(diǎn)中得到pCGN709。用pCGN587的Eco RⅠ-Sma Ⅰ片段(其含有卡那霉素抗性基因(APH 3-Ⅱ))取代pCGN 709的Eco RⅠ-Sma Ⅰ多聚連接子區(qū)，得到pCGN726。
以pCGN726的Eco RⅠ-Sal Ⅰ片段接加pCGN734的BglⅡ-Eco RⅠ片段，之后插入到pUC8-Cm的Bam HⅠ-Sal Ⅰ位點(diǎn)，得到pCGN738。pCGN726C是通過自pCGN738缺失900bp Eco RⅠ-Eco RⅠ片段而得到的。
為構(gòu)建pCGN167，將用Alu Ⅰ酶切得到CaMV(bp7144-7735)(Gardner等人，Nud.Acids Res.(1981)92871-2888)的Alu Ⅰ片段，并克隆到M13mp7(Messing等人，Nucl.Acids Res.(1981)9309-321)的Hin CⅡ位點(diǎn)中，建成C614。用Eco RⅠ酶切C614，產(chǎn)生出含有35S啟動子的得自C614的Eco RⅠ片段，將其克隆到pUC8(Vieira和Messing，Gene(1982)19259)的Eco RⅠ位點(diǎn)得到pCGN146。
為了修剪啟動子區(qū)，用Bgl Ⅱ處理Bgl Ⅱ位點(diǎn)(bp7670)并用Bal 31切斷，之后將-Bgl Ⅱ連接子接到Bal 31處理的DNA上，得到pCGN147。
用Bgl Ⅱ酶切pCGN528并插入到pCGN147的Bam HⅠ-BglⅡ啟動子片段中，制得含有啟動子區(qū)、可選擇標(biāo)志(有2個ATG的KAN)和3′區(qū)的pCGN148a。將該片段克隆到pCGN528的Bgl Ⅱ位點(diǎn)中，從而使Bgl Ⅱ位點(diǎn)緊接于pCGN528的卡那霉素基因的旁側(cè)區(qū)。
依照下述方法制備用于這一構(gòu)建物的穿梭載體。用Hin dⅢ-Bam HⅠ酶切含Tn5(其中包含一卡那霉素基因)的質(zhì)粒(Jorgenson等人，Mol.Gen.Genet.(1979)17765)，并將含有卡那霉素基因的Hin dⅢ-Bam HⅠ片段插入到pACYC184(Chang和Cohen，J.Bacteriol.(1978)1341141～1156)之四環(huán)素基因中的Hin dⅢ-Bam HⅠ位點(diǎn)內(nèi)制得pCGN525。將用Xho Ⅰ連接子插入到Sma Ⅰ位點(diǎn)內(nèi)經(jīng)修飾的pTiA6(Thomashow等人，Cell(1980)19729-739)的Bam HⅠ片段19插入到pCGN525的Bam HⅠ位點(diǎn)中，制得pCGN526。經(jīng)用Xho Ⅰ酶切并再連接，以刪去pCGN526的小的Xho Ⅰ片斷，得到pCGN528。
將pMB9 KanⅩⅩⅠ的Bam HⅠ-卡那霉素基因片段克隆到pCGN148a的Bam HⅠ位點(diǎn)，得到pCGN149a。
pMB9KanⅩⅩⅠ是一種pUC4K變異體(Vieira和Messing，Gene(1982)19259-268)，其有Xho Ⅰ位點(diǎn)缺失但含有來自Tn903的功能性卡那霉素基因，以允許在土壤桿菌中進(jìn)行有效的選擇。
用Bgl Ⅱ和Sph Ⅰ酶切pCGN149a。用Bam HⅠ和Sph Ⅰ酶切MI(見下述)，并分離得到Bam HⅠ-Sph Ⅰ片段，再用該片段置換上述pCGN149a的小的Bgl Ⅱ-Sph Ⅰ片段。這樣得到pCGN167，該構(gòu)建物含有全長CaMV啟動子，1ATG-卡那霉素基因，3′末端和細(xì)菌的Tn903型卡那霉素基因。MI是來自pCGN546X(見pCGN587的構(gòu)建)的Eco R1片段，并以一種使1ATG-卡那霉素基因中的Pst Ⅰ位點(diǎn)鄰接于M13mp9的多聚連接子區(qū)的方式被克隆到M13mp9的Eco R1克隆位點(diǎn)中。
將含有CaMV-35S啟動子、1ATG-卡那霉素基因和pTiA6之Bam HⅠ-片段19之pCGN167中的Hin dⅢ-Bam HⅠ片段克隆到pUC19的Bam HⅠ-Hin dⅢ位點(diǎn)內(nèi)，制得pCGN976。將pCGN976的0.7Kb Hin dⅢ-Eco R1片段(35S啟動子)和pCGN709的0.5Kb Eco RⅠ-Sam Ⅰ片段(轉(zhuǎn)錄本7∶3′)克隆到pCGN566的Hin dⅢ-Sal Ⅰ位點(diǎn)，建成pCGN766C。
將pCGN766C的0.7Kb Hin dⅢ-Eco RⅠ片段(CaMV-35S啟動子)連接到pCGN726C中的1.5Kb Eco RⅠ-Sal Ⅰ片段(1ATG-KAN3′區(qū))上，之后插入到pUC19的Hin dⅢ-Sal Ⅰ位點(diǎn)中得到pCGN778。用含有CaMV-35S啟動子和1ATG-KAN-3′區(qū)的pCGN778的2.2Kb區(qū)即Hin dⅢ-Sal Ⅰ片段取代pCGN739的Hin dⅢ-Sal Ⅰ連接子區(qū)，以得到pCGN783。
雙載體pCGN948轉(zhuǎn)移到土壤桿菌內(nèi)通過轉(zhuǎn)化作用將pCGN948引入根癌病土壤桿菌EHA101(Hood等人，J.Bacteriol.(1986)1681291-1301)內(nèi)。將2毫升EHA101的培養(yǎng)物在MG/L液體培養(yǎng)基中于30℃保溫過夜。取0.5毫升接種于100毫升MG/L液體培養(yǎng)基(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)144732-743)中，并使之在振蕩孵箱中于30℃生長5小時。于7K離心沉淀細(xì)胞，再懸浮于1毫升MG/L液體培養(yǎng)基中并置于冰上。將大約1微克pCGN948DNA加入已加了200微升(μl)EHA101懸液的100微升MG/L液體培養(yǎng)基內(nèi);將含有DNA-細(xì)胞混合物的試管立即放入干冰/乙醇浴中5分鐘。在37℃水浴中將試管內(nèi)容快速融溶5分鐘，加入1毫升新鮮MG/L培養(yǎng)基后于30℃振蕩2小時。離心收集細(xì)胞沉淀并分散于含有100毫克/升慶大霉素的MG/L平皿(1.5%瓊脂)上。自各自獨(dú)立的慶大霉素抗性菌落分離質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化回到大腸桿菌內(nèi)，并使用限制性內(nèi)切酶作定性分析，以確證卡那霉素抗性EHA101含有pCGN948的完整拷貝。收集單個菌落并通過在含有100毫克/升慶大霉素的平皿上作兩次以上劃線而純化之。
甘藍(lán)型油菜(B.Napus)的轉(zhuǎn)化與再生將甘藍(lán)型油菜(Wester變種)的種子在95%乙醇中浸泡4分鐘。浸于每100毫升無菌溶液含50微升“Tween 20”表面活性劑的1%次氯酸鈉溶液中滅菌。浸泡45分鐘后，用無菌蒸餾水將種子洗滌4次。將其植于寬7厘米，長7厘米，高10厘米，含50毫升MS(Murashige最小量有機(jī)物培養(yǎng)基，Gibco)的無菌塑料盒(Magenta)內(nèi)，其中MS的濃度為1/10，加有吡哆素(500微克/升)、煙酸(50微克/升)、甘氨酸(200微克/升)，并且是已用0.6%瓊脂固化了的。種子于22℃在16小時-8小時光-暗循環(huán)(光強(qiáng)度約為65μEm-2S-1)條件下發(fā)芽并生長。5天后于無菌條件下取出籽苗，切掉下胚軸，并切成長約4毫米的碎片。將下胚軸碎片放在飼養(yǎng)平皿上，或者在固化的B50/1/1或B50/1/0培養(yǎng)基上之濾紙的頂上而沒有飼養(yǎng)層。B50/1/0培養(yǎng)基含有B5鹽和維生素(Gamborg，Miller和Ojima，Experimental Cell Res.(1968)50151-158)、3%蔗糖、2，4-二氯苯氧基乙酸(1.0毫克/升)，PH調(diào)至5.8，且培養(yǎng)基是用0.6%Phgtagar固定的;B50/1/1除了含上述成分外，另外加有1.0毫克/升激動素。在B50/1/0或B50/1/1培養(yǎng)基上吸移1.0毫升靜止期煙草懸浮培養(yǎng)物(按Fillatti等人，Molecular General Genetics(1987)206192-199中所述方法維持的將飼養(yǎng)皿預(yù)制備24小時。切掉下胚軸碎片并在作土壤桿菌處理之前于飼養(yǎng)皿上放置24小時。
于30℃在MG/L液體培養(yǎng)基中孵育土壤桿菌的單個菌落，制備根癌病土壤桿菌(菌株EHA101×948)。16小時后收獲細(xì)菌并在MG/L液體培養(yǎng)基中制成每毫升108細(xì)菌的細(xì)菌懸液。將下胚軸碎片放入土壤桿菌懸液內(nèi)，并使之靜置30-60分鐘以用細(xì)菌接種下胚軸碎片，之后移出并轉(zhuǎn)移到含有B50/1/1或0/1/0培養(yǎng)基(0/1/1是指1毫克/升，2，4-二氯苯氧基乙酸和1毫克/升激動素，而0/1/0是指沒有激動素)之培養(yǎng)皿內(nèi)。于22℃低光照下溫育培養(yǎng)皿。細(xì)菌與下胚軸碎片共保溫24-48小時。移去下胚軸碎片并放在含有500毫克/升羧芐青霉素(有時是加濃度為10、25或50毫克/升的硫酸卡那霉素)的B50/1/1或0/1/0上，于22℃連續(xù)光照(大約65μEm-2s-1)下溫育7天。將碎片轉(zhuǎn)移到含1%蔗糖、3毫克/升芐氨基嘌呤(BAP)和1毫克/升玉米素的B5鹽培養(yǎng)基內(nèi)，該培養(yǎng)基添加有500毫克/升羧芐青霉素，10、25或50毫克/升硫酸卡那霉素、并用0.6%Phytagar(Gibco)固化。此后，每兩周給外植體換一次新鮮培養(yǎng)基。
一個月后由已在含卡那霉素培養(yǎng)基上選擇的綠色愈創(chuàng)組織長出綠色幼芽。幼苗繼續(xù)發(fā)育三個月。當(dāng)其至少有1厘米長時，由愈創(chuàng)組織上切掉嫩芽并置于含1%蔗糖，不加生長物質(zhì)，含300毫克/升羧芐青霉素，并用0.6%Phytagar固化了的B5培養(yǎng)基上。使幼苗繼續(xù)生長并取幾片葉試驗(yàn)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPT Ⅱ)活性。將得有NPT Ⅱ活性陽性結(jié)果的幼苗放在裝有含1%蔗糖，2毫克/升吲哚丁酸，200毫克/升羧芐青霉素，并用0.6%Phytagar固化之B50/1/1培養(yǎng)基的Magenta盒子內(nèi)。幾周后幼苗長出根，并被移到土壤中。該植物在生長室(growth chamber)內(nèi)，于22℃，在16-8小時光-暗循環(huán)(光強(qiáng)度為220μEm-2s-1)條件下生長并于幾周后移入溫室內(nèi)。
Southern吸印分析資料試驗(yàn)了自含pCGN948之根癌病土壤桿菌EHA101與甘藍(lán)型油菜(B.napus)下胚軸之混合細(xì)胞培養(yǎng)(cocultivatious)所再生的甘藍(lán)型油菜植物的適當(dāng)整合及菠菜葉ACP基因的胚胎特異性表達(dá)。Southern分析是依照Dellaporta等人的方法(Plant Mol.Biol.Rep.(1983)119-21)，使用由再生之植物的葉子分離的DNA進(jìn)行的，并通過在CsCl梯度中成帶而一次離心純化的。用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ切斷DNA(10微克)，在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳并吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上(見Maniatis等人，(1982)上述文獻(xiàn))。用含有1.8Kb菠菜ACP序列的pCGN945DNA，或用自含有32p-dCTP標(biāo)記之napin 5′序列的pCGN936C(其為將pCGN930的Hin dⅢ/Eco RⅠ片段轉(zhuǎn)移到pCGN566中制得的)分離的Eco RⅠ/Hin dⅢ片段(按照制造商所述的缺口翻譯方法，使用BRL缺口翻譯試劑盒〔Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD.〕完成上述標(biāo)記)探查印跡。將印跡于42℃在50%甲酰胺，10×Denhardt′s試劑，5×SSC、0.1%SDS、5mMEDTA、100微克/毫升牛胸腺DNA及10%硫酸葡聚糖(只用于雜交)中預(yù)雜交和雜交(試劑已在Mani tis等人(1982)上述文獻(xiàn)中述及)。在1×SSC、0.1%SDS中洗30分鐘并在0.1×SSC，0.1%SDS中于55℃洗兩次。
放射自顯影表明有兩條大約3.3和3.2Kb的帶雜交到得自四株植物之DNA的Eco RⅠ消化產(chǎn)物中，因?yàn)?.3和3.2Kb Eco RⅠ片段是存在于pCGN948的T-DNA區(qū)內(nèi)，所以當(dāng)用ACP基因(pCGN945)探查時，即證明了菠菜葉ACP構(gòu)建物在植物基因組中的適當(dāng)整合。用napin 5′序列探查時，正如由測得的植物DNA-構(gòu)建物DNA邊緣區(qū)片段之序列的序數(shù)所判定的，基因構(gòu)建物是存在于不同植物之單一或多個座位中。
Northern吸印分析資料經(jīng)Northern吸印分析法檢測自napin啟動子整合的菠菜葉ACP基因的表達(dá)，結(jié)果表明在已轉(zhuǎn)化植物之一的種子中而不是葉子中含有構(gòu)建物DNA。開花后21天由轉(zhuǎn)化的種子收集發(fā)育中的種子。自種子內(nèi)切除胚胎并冷凍于液氮中。按Crouch等人(1983，上述文獻(xiàn))的方法由已轉(zhuǎn)化之植物的種子胚胎和葉子中分離總RNA，按已知方法(Shewmaker等人，Virology(1985)140281-288)在含甲醛的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并吸印到硝酸纖維素濾膜上(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1980)775201-5205)。按上述方法對印跡預(yù)雜交、雜交并洗滌。該探針是一自pCGN945分離的Pst Ⅰ/Bam HⅠ片段，而該pCGN945只含有以缺口翻譯法標(biāo)記的菠菜葉ACP序列。
在已轉(zhuǎn)化的植物的胚胎材料中而不是葉子材料中，檢測到～0.8Kb RNA帶，這就證明了菠菜葉ACP基因的種子特異性表達(dá)。
實(shí)施例Ⅱ油菜(B.Campestris)Napin啟動子暗盒的構(gòu)建使用已建立的方法(Maniatis等人，(1982)上述文獻(xiàn))在λ載體Charon 35中制得油菜(B.Campestris)DNA的Bgl Ⅱ部分基因組文庫。經(jīng)放大的文庫的滴度為～1.2×109個噬菌體/毫升。使40萬個重組噬菌體于37℃經(jīng)20分鐘吸附于DH1大腸桿菌細(xì)胞(Hanahan，Mol.Biol.(1983)166557)后，于NZY+10mM MgSO4+0.9%瓊脂糖中以每9×9吋105個噬菌體的密度在NZY平面(NZYM，如Maniatis等人(1982)上述文獻(xiàn)中所述)上鋪板。平皿于37℃保溫～13小時，于4℃冷卻2.5小時，通過在平皿上鋪敷預(yù)切割的濾膜約1分鐘并剝脫之，以使噬菌體吸附到基因?yàn)V網(wǎng)附加物(Gene Screen Plus)(New England Nuclear)上。使濾膜在1.5M NaCl、0.5M NaOH上漂浮1分鐘，在1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl(PH8.0)中中和2分鐘，并在2×SSC中漂浮3分鐘，以固定已吸附的噬菌體DNA。將濾膜風(fēng)干直到潮濕為止，按前述作Southern分析的方法，于42℃進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。使用CDNA克隆BE5的Xho Ⅰ/Sal Ⅰ片段(該片段是使用探針PN1(Crouch等人，1983，上述文獻(xiàn))自上述油菜(B.Campestris)種子CDNA文庫分離的)，探查濾膜上含napin的克隆。三個噬斑強(qiáng)雜交在成對的濾膜上，并按前已述及的方法(Maniatis等人，1982，上述文獻(xiàn))純化之。
制作其中一個定名為λCGN1-2之克隆的限制性酶切圖，napin基因被定位到與2.7Kb Xho Ⅰ和2.1Kb Sal Ⅰ交搭的限制性片段上。將這兩個片段由λCGN1-2 DNA再克隆到pCGN789(與pUC119相同的pUC基載體，其中正常多聚連接子被合成的連接子-5′GGAATTCGTCGACAGATCTCTGCAGCTCGAGGGATCCAAGCTT 3′(其代表了多聚連接子Eco R1，Sal Ⅰ，Bgl Ⅱ，Pst Ⅰ，Xho Ⅰ，Bam Ⅰ，Hin dⅢ)所取代)中。通過序列分析進(jìn)一步肯定了對napin亞克隆的鑒定。測定了整個編碼區(qū)序列以及伸延之5′上游和3′下游序列(圖2)。λCGN1-2napin基因?yàn)榫幋a相對應(yīng)于BE5 CDNA之mRNA者，經(jīng)測定證明它們的核苷酸序列是準(zhǔn)確匹配的。
按構(gòu)建pCGN944的相似方法，自λCGN1-2 napin基因的5′末端和3′末端構(gòu)建表達(dá)暗盒。經(jīng)用Sal Ⅰ酶切并再連接刪除pCGN940的大部分napin編碼區(qū)，以形成pCGN1800。使用合成的寡核苷酸5′-GCTTGTTCGCCATGGATATCTTCTGTATGTTC-3′，將得自pCGN1800的單股DNA用于體外誘變反應(yīng)(Adelman等人，DNA(1983)2183-193)。該寡核苷酸在napin基因的啟動子區(qū)與ATG起始密碼子的連接處插入了一個Eco RⅤ和Nco Ⅰ限制性酶切位點(diǎn)。通過與用以誘變的寡核苷酸雜交以鑒定出一適用的突變體，分析其核苷酸序列并定名為pCGN1801。
經(jīng)用Eco RⅤ部分消化并連接到用Eco RⅠ酶切的pCGN786(為-pCGN566氯霉素抗性基載體，其中以上述合成的連接子代替了正常多聚連接子)上以再克隆-pCGN1801的1.7Kb啟動子片段，再用DNA聚合酶ⅠKlenow片段填充使成平頭得到pCGN1802。將來自λCGN1-2napin基因的3′序列加到Xho Ⅰ/Hin dⅡ酶切的pCGN1802上即完成暗盒的構(gòu)建。所得的表達(dá)暗盒即PCGN1803含有1，725Kb napin啟動子序列和1，265Kb napin 3′序列，在其中間含有獨(dú)特的克隆位點(diǎn)Sal Ⅰ，Bgl Ⅰ，Pst Ⅰ和Xho Ⅰ。需要在蕓苔屬(Brassica)中進(jìn)行種子特異性轉(zhuǎn)錄或表達(dá)任何序列，即脂肪酸基因可以以與實(shí)施例Ⅰ中所述插入菠菜葉ACP及甘藍(lán)型油菜(B.napus)napin暗盒的相似方法被插入到該暗盒中。
實(shí)施例Ⅲ
可以自編碼參與種子三酰基甘油合成之蛋白質(zhì)(如蕓苔屬種子的?；d體蛋白)的基因分離其它種子特異性啟動子。自油菜(Brassica campestris)變種“R-500”(蕪菁油菜(turnip rape)的一種自身兼容性變種)收集未成熟的種子。在相當(dāng)于開花后的大約14至28天時收集整個種子。依照上述分離菠菜ACP CDNA克隆的方法，分離RNA并制備CDNA庫，不同的是使用PCGN565作載體。為探查CDNA庫，使用380A型Applied Biosystems DNA合成儀，依照廠商推薦的方法合成寡核苷酸(5′)-ACTTTCTCAACTGTCTCTGGTTTAGCAGC-(3′)。這一合成的DNA分子以低嚴(yán)格程度雜交到編碼氨基酸序列(ala-ala-lys-pro-glu-thr-val-glu-lys-val)的DNA序列上。已報導(dǎo)了自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的種子分離的ACO的氨基酸序列(Slabas等人，7th International Symposium of the Structure and Fuction of Plant Lipids，University of California，Davis，CA，1986)與自油菜(B.Campestris)種子分離的ACP是高度同源的。使用菌落雜交技術(shù)(Taub和Thompson，Anal，Biochem.(1982)126222-230)及相當(dāng)于Wood等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(1985)821585-1588)所述的雜交條件分析大約2200個不同的CDNA克隆。對兩個顯示與寡核苷酸探針產(chǎn)生明顯雜交的CDNA克隆的DNA序列分析表明，一個定名為PCGN1Bcs的克隆確實(shí)編碼ACP前體蛋白，因其編碼的氨基酸序列與上述得自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)的ACP蛋白(Slabas等，1980，上述文獻(xiàn))具有顯著的同系性。與實(shí)施例Ⅱ相似，可使用ACP CDNA克隆分離基因克隆，而該克隆即可以以連接相類似于制備油菜(B.Campestris)napin暗盒的方式，由之制成-表達(dá)暗盒。
其它實(shí)施例通過miniprep DNA在基因?yàn)V網(wǎng)附加物(Gene Screen Plus)尼龍濾膜上的斑點(diǎn)印跡雜交，由開花后14-28天的油菜(B.Campestris)種子CDNA文庫(如前面的實(shí)施例中述及的)篩選出96個克隆。所用的探針是由開花后14-28天的mRNA或由油菜(B.Campestris)葉mRNA制得的放射活性標(biāo)記之第一股鏈合成CDNA。將與種子CDNA產(chǎn)生強(qiáng)雜交，且很小或完全不與葉CDNA雜交的克隆列入編目。經(jīng)與PN1(Crouch等人，1983，上述文獻(xiàn))的Xho Ⅰ/Sal Ⅰ片段(為-甘藍(lán)型油菜napin CDNA)交叉雜交將許多克隆鑒定為種子儲存蛋白。上述BE5可用于鑒定作為胚胎特異性啟動子之來源的油菜(B.Campestris基因組克隆。
其它種子特異性基因亦可作為啟動子來源。已鑒定了cruciferin，甘藍(lán)型油菜(B.napus)的另一主要種子儲存蛋白的CDNA克隆(Simon等人，1985，上述文獻(xiàn))并可用于篩選啟動子的基因組文庫。
在沒有了解其特異性功能的情況下，仍可根據(jù)其在種子組織中表達(dá)的水平，其表達(dá)時間(即它們于開花后被表達(dá))及其在油菜(B.Campestris)基因組中的大約重現(xiàn)數(shù)(拷貝數(shù))來對其它CDNA克隆進(jìn)行分類。為表達(dá)與脂肪酸合成或其它種子功能有關(guān)之基因所必需的標(biāo)準(zhǔn)的克隆，可被用來篩選含有表達(dá)所必需之5′和3′調(diào)節(jié)區(qū)之基因組克隆的基因組文庫?？梢砸郧笆鰧?shí)施例中描述適于napin基因的一般方法操作非編碼調(diào)節(jié)區(qū)域，以制得組織特異性表達(dá)暗盒。
CDNA克隆的一個例子是EA9。其可在油菜的種子，而不是葉子中得以高表達(dá)。經(jīng)用斑點(diǎn)印跡雜交法，與得自文庫的7個其它CDNA作交叉雜交，表明其可提供高度豐富的mRNA。使用EA9的700bp Eco RⅠ片段作為探針，對從14天種子以及開花后21、28天胚胎分離的mRNA所作Northern印跡分析結(jié)果表明EA9可在14天時高度表達(dá)，而在21和28天時則以極低水平表達(dá)。對EA9聚腺苷酸化信號及3′末端poly A接尾序列的鑒定進(jìn)一步肯定了CDNA克隆的定向以及mRNA的轉(zhuǎn)錄方向。這里提供的克隆EA9的部分序列(圖3)，可被用于合成鑒定特定類蕓苔屬種子特異性啟動子的探針。
上述結(jié)果表明，可在種子中獲得特定地轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，以致可以調(diào)整種子，特別是胚胎產(chǎn)品的表型或改變產(chǎn)品性質(zhì)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，可以使用與種子中序列的轉(zhuǎn)錄有關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，結(jié)合使用正常序列以外的其它序列，以產(chǎn)生內(nèi)源性或外源性蛋白或調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。以這種方法，種子可以產(chǎn)生出新的產(chǎn)物，用以改善蛋白質(zhì)組成，修變脂肪酸的分布等。
本說明書中所提到的所有出版物和專利申請均體現(xiàn)出本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)熟練技術(shù)人員的技術(shù)水平。列為本文參考文獻(xiàn)的所有出版物和專利申請與特別指出的每一個別出版物或?qū)＠暾埗加兄瑯拥膮⒖家饬x。
雖然為了清楚了解之目的，前于已通過闡述和實(shí)施例的方式較詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但應(yīng)明確的是在本發(fā)明待批權(quán)利要求
范圍內(nèi)可以實(shí)踐某些改動或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.包含表達(dá)暗盒的種子，所說的暗盒含有一個種子特異性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，一個處于所說之起始區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的有用序列，以及一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，所說的表達(dá)暗盒于所說的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然位點(diǎn)以外的位點(diǎn)插入到所說之種子的基因組中。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的種子，其中所說的有用序列是編碼某種內(nèi)源性蛋白或其突變體的開放讀碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的種子，其中所說的有用序列是編碼某種外源性蛋白的開放讀碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的種子，其中所說的有用序列，編碼一種互補(bǔ)于所說種子之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的種子，其中所說的種子是蕓苔屬植物的種子。
6.包含一個種子特異性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，一個具有至少兩個用來在所說起始區(qū)的轉(zhuǎn)錄控制下插入某DNA序的限制性位點(diǎn)的少于大約100bp的多聚連接子，以及一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達(dá)構(gòu)建物，其中所說多聚連接子的序列不同于天然處于所說起始區(qū)轉(zhuǎn)錄控制下之基因的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的表達(dá)構(gòu)建物，其中所說的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是得自于蕓苔屬植物種子基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的表達(dá)構(gòu)建物，其中所說的基因是napin基因。
9.包括一個種子特異性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，一個有用的DNA序列，一個處于所說起始區(qū)轉(zhuǎn)錄控制下并連接到所說起始區(qū)之與天然序列不同的有用序列，以及一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達(dá)暗盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的表達(dá)暗盒，其中所說的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是一蕓苔屬植物基團(tuán)起始區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10的表達(dá)暗盒，其中所說的基團(tuán)是napin基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
10的表達(dá)暗盒，其中所說的有用序列是結(jié)構(gòu)基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的表達(dá)暗盒，其中所說的結(jié)構(gòu)基因編碼一種在生物合成途徑中調(diào)節(jié)脂肪酸生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13的表達(dá)暗盒，其中所說的蛋白質(zhì)是?；d體蛋白。
15.含有根據(jù)權(quán)利要求
9至14中任一項(xiàng)之表達(dá)暗盒，原核生物復(fù)制系統(tǒng)，以及用于選擇含所說標(biāo)誌的已轉(zhuǎn)化原始細(xì)胞之標(biāo)誌的載體。
16.修變種子之基因型的方法，其包括繁殖產(chǎn)生種子的植物，其中所說植物的細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求
9至14的表達(dá)暗盒，由之產(chǎn)生物變了基因型的種子。
專利摘要
提供了完成種子特異性轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列及其使用方法，用以調(diào)節(jié)修變在種子，特別是胚胎細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是由植物細(xì)胞中鑒定并分離的，并被用于制備可轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞內(nèi)完成種子特異性轉(zhuǎn)錄的表達(dá)暗盒。該方法特別適用于改變植物組織內(nèi)的脂肪酸產(chǎn)生。
文檔編號C07K14/415GK87106120SQ87106120
公開日1988年6月22日 申請日期1987年7月31日
發(fā)明者讓·C·克里, 維·C·克瑙夫 申請人:加利福尼亞基因公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan