專利名稱：利用棒狀桿菌生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種利用棒狀桿菌(Coryneform bacteria)生產(chǎn)L-氨基酸的方法、特別是生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其中所述棒狀桿菌中編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的tipA基因已經(jīng)被弱化。
背景技術(shù)：
L-氨基酸，特別是L-賴氨酸已經(jīng)被非常廣泛地應(yīng)用于人體醫(yī)學(xué)、藥品工業(yè)、食品工業(yè)以及動物飼料中。
已知通過發(fā)酵棒狀桿菌菌株，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)可以生產(chǎn)氨基酸。因為它們的極為重要性，一直進行著改進生產(chǎn)方法的研究。對方法的改進可以涉及與發(fā)酵相關(guān)的措施，例如攪拌和氧供、或者培養(yǎng)基的組成、例如發(fā)酵過程中的糖濃度、或例如通過離子交換層析對產(chǎn)品形式的處理、或微生物本身的內(nèi)在性能特點。
為了改進這些微生物的性能特點，使用了誘變、選擇和突變體選擇的方法。這些方法生成了具有抗抗代謝物(例如賴氨酸類似物S-(2-氨甲基)-半胱氨酸)的抗性的、或?qū)υ谡{(diào)節(jié)上是具有重要意義的代謝物是營養(yǎng)缺陷型的、并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。
這些年來，也已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)的方法通過擴增單個氨基酸生物合成基因以及研究對L-氨基酸生成的影響來改進谷氨酸棒桿菌的產(chǎn)L-氨基酸的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明者自我設(shè)定的目的是，為改進利用棒狀桿菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，特別是L-賴氨酸的方法提供新的基礎(chǔ)。
本發(fā)明提供了一種利用棒狀桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法，所述棒狀桿菌中至少編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的核苷酸序列被弱化，特別是被排除或以低水平表達。
本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中進行了以下步驟a)對產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀桿菌進行發(fā)酵，所述棒狀桿菌中至少編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的核苷酸序列被弱化，特別是被排除或以低水平表達；b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞內(nèi)的L-氨基酸；以及c)分離所需的L-氨基酸，其中在終產(chǎn)物中任選部分或全部地殘留有發(fā)酵液和/或生物量的組分。
所用的棒狀桿菌優(yōu)選在編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的tipA基因被弱化之前已經(jīng)能夠產(chǎn)生L-氨基酸，特別是L-賴氨酸。


圖1質(zhì)粒pCR2.1tipAint的圖譜當(dāng)數(shù)值代表著堿基對的數(shù)目時，數(shù)值是在測定結(jié)果的可重復(fù)性范圍內(nèi)所得到的近似數(shù)值。
所用的縮寫和名稱有以下意義KmR耐卡那霉素基因EcoRI 限制性內(nèi)切酶EcoRI的切割位點tipAinttipA基因的內(nèi)在片段CoIE1 質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始點
具體實施例方式
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的tipA基因被弱化后，提高了棒狀桿菌產(chǎn)生L-氨基酸、特別是L-賴氨酸的能力。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是能通過所謂的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的特殊蛋白結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合的那些蛋白，并因此能增強或弱化其它基因的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的功能是抑制對L-氨基酸的生物合成、特別是L-賴氨酸的生物合成中所涉及到的基因。弱化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA能提高相應(yīng)的棒狀桿菌對L-賴氨酸的合成。
在專利申請EP1108790中可找到編碼谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因的核苷酸序列，它們是序列no.2871和序列no.7068。
核苷酸序列也已經(jīng)被儲存于國立醫(yī)學(xué)圖書館(Bethesda，MD，USA)的國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫中，編號為AX122955和AX127152。
根據(jù)本發(fā)明可使用在所引用的參考文獻中所描述的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的序列。也可以使用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的等位基因，它們是由遺傳密碼子的簡并或無功能改變的有義突變所形成的。
下面所提及的任何L-氨基酸或氨基酸指的是一種或多種氨基酸，包括它們的鹽，這些氨基酸選自L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。L-賴氨酸是特別優(yōu)選的。
下面所提及的任何L-賴氨酸或賴氨酸指的不僅是堿還是鹽，例如賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
在權(quán)利要求書中可找到優(yōu)選的具體實施方案。
名詞“弱化”在本文中指的是通過例如使用弱啟動子或使用編碼低水平活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，或通過使得相應(yīng)的基因或酶(蛋白)失活，以及這些措施的任意組合來降低或排除微生物內(nèi)相應(yīng)DNA所編碼的一種或多種酶(蛋白)的細胞內(nèi)活性。
通過弱化措施，相應(yīng)蛋白的活性或濃度通常被降低到野生型蛋白的活性或濃度、或初始微生物內(nèi)蛋白的活性或濃度的0到75％，0到50％、0到25％、0到10％或0到5％。
通過1維和2維蛋白凝膠分離以及隨后用相應(yīng)的評估軟件對凝膠上的蛋白濃度的光學(xué)識別可以測定出蛋白濃度的降低。對棒狀桿菌而言，制備蛋白凝膠以及識別蛋白的常用方法是Hermann等(Electrophoresis，221712-23(2001))所描述的方法。
通過利用針對所測定蛋白的特異抗體的Western印跡雜交(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)以及隨后利用適當(dāng)?shù)臐舛葴y定軟件的光學(xué)評估(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 532-39；Lottspeich(1999)Angewandte Chemie 1112630-2647)也可以分析蛋白濃度。通過DNA條帶遷移測定法(也被稱為凝膠阻留法)可以測定出DNA結(jié)合蛋白的活性(Wilson et al.(2001)Journal ofBacteriology 1832151-2155)。利用各種已被很好描述的報告子基因測定法(Sambrook等Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)可以測定出DNA結(jié)合蛋白對其它基因表達的影響。
本發(fā)明所提供的微生物能從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇生成氨基酸。它們可以是棒狀桿菌的代表菌屬，特別是棒狀桿菌屬(genus Corynebacterium)。對于棒狀桿菌屬而言，特別要提及的是它的谷氨酸棒狀桿菌種，本領(lǐng)域人員已知它的產(chǎn)生L-氨基酸的能力。
棒狀桿菌屬的適宜菌株，特別是谷氨酸棒桿菌的適宜菌株具體的是已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和百合花棒桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020，以及由它們所生成的產(chǎn)L-氨基酸的突變體及菌株，例如產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P 6464以及谷氨酸棒桿菌DSM 5715。
為了實現(xiàn)弱化，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因或基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)性能都可以被降低或排除?？梢匀我饨M合這兩種措施。
通過進行適當(dāng)方式的培養(yǎng)或通過對基因表達的信號結(jié)構(gòu)的遺傳學(xué)改變(突變)可以降低基因表達?；虮磉_的信號結(jié)構(gòu)例如是抑制基因、活化基因、操縱子、弱化子、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子和終止子。本領(lǐng)域人員將在例如專利申請WO 96/15246、Boyd和Murphy(Journal ofBacteriology 1705949(1988))、Voskuil和Chambliss(Nucleic AcidsResearch 263548(1998)、Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58191(1998))、Pátek等(Microbiology 1421297(1996))以及熟知的遺傳學(xué)及分子生物學(xué)教科書、例如Knippers的教科書(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或Winnacker的教科書(″Gene und Klone″，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)中找到相關(guān)信息。
特異地降低基因表達的另一種方法是反義技術(shù)，其中將短脫氧寡核苷酸或載體引入到靶細胞內(nèi)，以合成更長的反義RNA。反義RNA能與特定的mRNA的互補部分結(jié)合并降低它們的穩(wěn)定性或阻斷它們的轉(zhuǎn)錄能力。本領(lǐng)域人員將在Srivastava等(Applied Environmental Microbiology2000 Oct；66(10)4366-4371)中找到實例。
從現(xiàn)有技術(shù)中已知能導(dǎo)致酶蛋白的催化性能改變或降低的突變，可提及的實例包括Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 2728611-8617(1997))、Sugimoto等(Bioscience Biotechnology andBiochemistry 611760-1762(1997))以及Mckel(″Die Threonindehydrataseaus Corynebacterium glutamicumAufhebung der allosterischen Regulationund Struktur des Enzyms″，Berichte des Forschungszentrums Jülich，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，Germany，1994)的研究。在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中可以找到摘要，例如Hagemann的教科書(″AllgemeineGenetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
突變可以是轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。依賴于氨基酸取代對酶活性的影響，可以使用名詞反義突變或無義突變?；蛑械闹辽僖粋€堿基對的插入或缺失將導(dǎo)致移碼突變，這將造成不正確的氨基酸被摻入或翻譯被過早地中斷。一些密碼子的缺失通常造成酶活性的完全喪失。對生成這些突變的說明形成了現(xiàn)有技術(shù)的一部分并能在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中找到，例如Knippers的教科書(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科書(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann的教科書(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
使得谷氨酸棒桿菌的基因產(chǎn)生突變的常用方法是Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))所描述的基因打斷和基因取代的方法。
在基因打斷的方法中，將目標基因的編碼區(qū)的中心部分克隆到能在宿主(常為大腸桿菌)中但不能在谷氨酸棒桿菌中被復(fù)制的質(zhì)粒載體中。適宜的載體為例如pSUP301(Simon et al.，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer et al.，Gene 145，69-73(1994))、pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jger et al.，Journal of Bacteriology 1745462-65(1992))、pGEM-T(Promega corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemistry26932678-84；US Patent 5,487,993)、pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands；Bernard et al.，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf et al.，1991，Journal of Bacteriology1734510-4516)。然后將含有基因的表達區(qū)域的中心部分的質(zhì)粒載體通過接合或轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到所需的谷氨酸棒桿菌菌株中。例如在Schfer等(Applied and Environmental Microbiology 60，756-759(1994))中描述了接合的方法。例如在Thierbach等(Applied Microbiology and Biotechnology29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))以及Tauch等(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述了轉(zhuǎn)化的方法。經(jīng)發(fā)生交叉互換的同源重組后，載體序列打斷了目標基因的編碼區(qū)域，得到了兩個相應(yīng)地缺少3’及5’末端的不完全的等位基因。例如Fitzpatrick等(Applied Microbiology and Biotechnology 42，575-580(1994))已經(jīng)用這個方法排除了谷氨酸棒桿菌的recA基因。
在基因取代方法中，在體外生成目標基因的突變，例如缺失、插入或堿基取代。將所形成的等位基因依次地克隆到不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的載體中，然后通過轉(zhuǎn)化或接合將載體轉(zhuǎn)移到所需的谷氨酸棒桿菌宿主中。經(jīng)實現(xiàn)整合的第一次交叉互換以及實現(xiàn)靶基因或靶序列內(nèi)切割的適宜的第二次交叉互換的同源重組后，獲得突變或等位基因的組合。例如Peters-Wendisch等(Microbiology 144，915-927(1998))已經(jīng)用這個方法通過缺失來排除谷氨酸棒桿菌的pyc基因。
通過這個方法將缺失、插入或堿基取代組合到編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因中是有可能的。
除了弱化編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因外，增強特別是過表達目標生物合成途徑、糖酵解、補缺途徑、三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸循環(huán)、氨基酸輸出中的一種或多種酶以及任選地調(diào)節(jié)蛋白，對于L-氨基酸的生產(chǎn)也是有利的。
名詞“強化”或“增強”在本文中指的是通過例如增加基因或基因群的拷貝數(shù)目、使用強啟動子或編碼高水平活性的相應(yīng)酶或蛋白的基因、以及這些措施的任意組合來增強微生物內(nèi)的相應(yīng)DNA所編碼的一種或多種酶或蛋白的細胞內(nèi)活性。
相對于野生型蛋白的活性或濃度或相對于起始微生物內(nèi)的蛋白的活性或濃度，通過強化措施特別是過表達措施，相應(yīng)蛋白的活性或濃度通常至少增加到10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最大到1000％或2000％。
通常優(yōu)選使用內(nèi)源性基因。術(shù)語“內(nèi)源性基因”或“內(nèi)源性核苷酸序列”被理解為指的是在一個物種的群體中所存在的基因或核苷酸序列。
因此，對于L-賴氨酸的合成，除了弱化編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因外，也可增強特別是過表達選自以下組的一種或多種基因■編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(編號No.P26512，EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，■同時，編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
■編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992).Journalof Bacteriology 1746076-6086)，■編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(EP-A-1083225)，■編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661，WO01/70995)，■編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar et al.，European Journal of Biochemistry 254，395-403(1998)；EP-A-1038969)，■編碼Zwal蛋白的zwal基因(DE19959328.0，DSM 13115；EP-A-1111062)，■編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，■編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)，■編碼二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)的dapA基因(EP-B 0 197 335)。
除了弱化編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因外，同時弱化特別是降低一種或多種選自以下一組的基因的表達對于氨基酸的合成、特別是L-賴氨酸的合成也可能是有利的■編碼分解代謝物調(diào)控蛋白A的ccpA1基因(EP1311685)，■編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DSM 13047，EP-A-1094111)，■編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(DSM 12969，EP-A-1087015，WO 01/07626)，■編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DSM 13114，EP-A-1096013)，
■編碼果糖二磷酸醛縮酶的fda基因(Mol.Microbiol.3(11)，1625-1637(1989)；ACCESSION Number X17313)，■編碼Zwa2蛋白的zwa2基因(DSM 13113，EP-A-1106693)。
最后，除了弱化編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因外，去除不必要的繼發(fā)反應(yīng)對于氨基酸的合成可能是有利的(Nakayama″Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms″，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明所生成的微生物，為了合成L-氨基酸的目的，通過分批法或通過補料分批或重復(fù)補料分批法可以連續(xù)地或不連續(xù)地生成微生物。在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik l.Einführung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中都描述了已知的培養(yǎng)方法的概述。
所用的培養(yǎng)基必須以適當(dāng)?shù)男问椒夏繕司甑囊?。在美國細菌學(xué)學(xué)會的手冊“Manual of Methods for General Bacteriology”(WashingtonD.C.，USA，1981)中可以找到各種微生物的培養(yǎng)基的敘述。
糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪例如豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚油、硬脂酸和亞油酸，醇例如甘油和乙醇，以及有機酸例如乙酸都可以作為碳源?？梢詥为毣蛞曰旌衔锏男问绞褂眠@些物質(zhì)。
有機含氮化合物例如蛋白胨、酵母浸膏、肉浸膏、麥精浸膏、玉米浸液、豆粉和尿素，或無機化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨都可以作為氮源?？梢詥为毜鼗蛞曰旌衔锏男问绞褂玫础?br> 可以用做為磷源的是磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉的鹽。培養(yǎng)基也必須包含金屬，例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們對于生長是必需的。最后除了上述的物質(zhì)外，還可以使用必需生長物質(zhì)，例如氨基酸和維生素。可以單次將所述的物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，或在培養(yǎng)期間適當(dāng)?shù)匮a料這些物質(zhì)。
為了控制培養(yǎng)基的pH值，恰當(dāng)?shù)厥褂脡A性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸。為了控制泡沫的發(fā)生，可以使用消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以將具有選擇活性的適宜物質(zhì)例如抗生素加入到培養(yǎng)基中。為了保持有氧條件，可將氧氣或含有氧氣的氣體混合物例如空氣引入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度通常是從20℃到45℃，以及優(yōu)選的從25℃到40℃。持續(xù)培養(yǎng)直到已經(jīng)形成最大量的所需產(chǎn)物。通常在從10個小時到160個小時的間期內(nèi)實現(xiàn)這個目標。
從現(xiàn)有技術(shù)中可知測定L-氨基酸的方法?？梢匀缭赟packman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)中所描述的利用陰離子交換層析以及隨后的水合茚三酮衍生作用進行分析，或可以通過如在Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)511167-1174)中所描述的反相HPLC進行分析。
根據(jù)布達佩斯條約，將以下微生物以純培養(yǎng)物的形式于2002年2月15日儲存于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)■大腸桿菌(Escherichia coli)Top10/pCR2.1tipAint，編號為DSM14816。
下面以實施例的方式更具體地描述本發(fā)明。
實施例1.制備用于tipA基因的整合誘變的整合載體通過Eikmanns等(Microbiology 1401817-1828(1994))的方法從ATCC 13032菌株中分離得到染色體DNA。
根據(jù)谷氨酸棒桿菌的tipA基因的已知序列，選擇以下的寡核苷酸用于聚合酶鏈反應(yīng)
tipA-int15’CGC CTT TAC ACA GAA GAC G 3’tipA-int25’GTG TAC CAC TGA CCG ATG C 3’用MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成所示的引物，根據(jù)Innis等(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，AcademicPress)的標準PCR方法，利用Boehringer Mannheim(Germany，productdescription Taq DNA polymerase，Product No.1 146 165)的Taq聚合酶進行PCR反應(yīng)。在聚合酶鏈反應(yīng)的幫助下，引物容許擴增具有482個堿基對的tipA基因的內(nèi)在片段。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳研究所擴增的產(chǎn)物。
利用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，USA；Catalog Number K4500-01)將所擴增的DNA片段連接到載體pCR2.1-TOPO(Mead et al.(1991)，Bio/Technology 9657-663)上。
然后用連接產(chǎn)物電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TOP10(Hanahan，inDNACloning.A practical approach.Vol.I.IRL-Press，Oxford，Washington DC，USA，1985)。通過將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物平板培養(yǎng)在加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上進行對攜帶有質(zhì)粒的細胞的選擇(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)。用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化細胞中分離得到質(zhì)粒DNA，并通過限制性內(nèi)切酶EcoRI的限制性內(nèi)切以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)測定質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒被命名為pCR2.1tipAint，并顯示于圖1中。
根據(jù)布達佩斯條約，將以下微生物以純培養(yǎng)物的形式于2002年2月15日儲存于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)■大腸桿菌Top10/pCR2.1tipAint，編號為DSM 14816。
實施例2.對DSM 5715菌株中的tipA基因的整合誘變通過Tauch等(FEMS Microbiological Letters，123343-347(1994))的方法將實施例1中所述的載體pCR2.1tipAint電穿孔到谷氨酸棒桿菌DSM 5715中。菌株DSM 5715是耐AEC的產(chǎn)賴氨酸菌株，在EP-B-0435132中描述了該菌株。載體pCR2.1tipAint在DSM 5715中不能獨立地復(fù)制，只有它已經(jīng)被整合到DSM 5715的染色體中時，它才被保留于細胞內(nèi)。通過將電穿孔產(chǎn)物平板培養(yǎng)在加有15mg/l卡那霉素的LB瓊脂上來實現(xiàn)對具有pCR2.1tipAint整合于染色體的克隆的選擇(Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
所選擇的在DSM5715的染色體tipA基因內(nèi)插入有質(zhì)粒pCR2.1tipAint的耐卡那霉素的克隆被稱為DSM5715∷pCR2.1tipAint。
實施例3.賴氨酸的生產(chǎn)將在實施例2中得到的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1tipAint培養(yǎng)在適合于產(chǎn)生賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并測定培養(yǎng)物上清液的賴氨酸成分。
為此，首先將菌株在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂平皿(具有卡那霉素(25mg/l)的腦-心瓊脂)上33℃培養(yǎng)24個小時。從該瓊脂平皿培養(yǎng)開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中的10ml培養(yǎng)基)。將CgIII完全培養(yǎng)基用做為預(yù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。
CgIII培養(yǎng)基氯化鈉2.5g/l細菌用蛋白胨 10g/l細菌用酵母浸膏10g/l
葡萄糖(分別高壓滅菌) 2％(w/v)pH值被調(diào)整到pH7.4將卡那霉素(25mg/l)加入到其中。將預(yù)培養(yǎng)物在振蕩器(240rpm)上33℃孵育16個小時。從該預(yù)培養(yǎng)物中接種主培養(yǎng)物，使得主培養(yǎng)物的初始OD(660nm)為0.1 OD。將MM培養(yǎng)基用做為主培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。
MM培養(yǎng)基CSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉基丙磺酸) 20g/l葡萄糖(分別高壓滅菌)50g/l鹽(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O5.0mg/l生物素(過濾除菌)0.3mg/l硫胺素*HCl(過濾除菌)0.2mg/l亮氨酸(過濾除菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL、MOPS和鹽溶液的pH值調(diào)整到pH7，并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和微生物溶液，以及干燥的經(jīng)高壓滅菌的CaCO3。
在100ml帶有擋板的錐形瓶中進行體積為10ml的培養(yǎng)。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％濕度下進行培養(yǎng)。
72個小時后，利用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長測定OD。利用來自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀通過離子交換層析以及以水合茚三酮進行柱后衍生化檢測來測定已經(jīng)形成的賴氨酸的量。測定的結(jié)果顯示于表1。
表1

序列表<110>德古薩股份公司<120>利用棒狀桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>020077 BT<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>Primer tipA-int1<400>1cgcctttaca cagaagacg 19<210>2<211>19<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>Primer tipA-int2<400>2gtgtaccact gaccgatgc 19
權(quán)利要求
1.通過發(fā)酵棒狀桿菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于所用的細菌中的編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的核苷酸序列(tipA)被弱化，特別是被排除或以低水平表達。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于生產(chǎn)L-賴氨酸。
3.生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-賴氨酸的方法，其特征在于進行以下步驟a)對產(chǎn)生所需L-氨基酸的棒狀桿菌進行發(fā)酵，該細菌中至少編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因被弱化；b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞內(nèi)的所需產(chǎn)物；以及c)分離所需的L-氨基酸，其中在終產(chǎn)物中任選部分或全部地殘留有發(fā)酵液和/或生物量的組分。
4.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于所用的細菌中所需L-氨基酸的生物合成途徑中的其它基因被額外增強。
5.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于所用的細菌中使所需L-氨基酸形成減少的代謝途徑至少部分被排除。
6.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的多核苷酸的表達被降低。
7.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的核苷酸序列(tipA)所編碼的多肽(酶蛋白)的調(diào)節(jié)性能被降低。
8.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于，為了生產(chǎn)L-賴氨酸，所發(fā)酵的棒狀微生物中同時有選自以下組中的一或多個基因被增強，特別是被過表達8.1編碼具有反饋抗性的天冬氨酸激酶的lysC基因，8.2編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因，8.3編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，8.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，8.5編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，8.6編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，8.7編碼Zwa1蛋白的zwa1基因，8.8編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的tpi基因，8.9編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因，8.10編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因。
9.權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于，為了生產(chǎn)L-氨基酸，所發(fā)酵的棒狀微生物中同時有選自以下組中的一或多個基因被弱化9.1編碼分解代謝物調(diào)控蛋白A的ccpA1基因，9.2編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，9.3編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，9.4編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，9.5編碼果糖二磷酸醛縮酶的fda基因，或9.6編碼Zwa2蛋白的zwa2基因。
10.權(quán)利要求1到9中任一項的方法，其特征在于使用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)菌種的微生物。
11.棒狀桿菌，其中至少編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因以弱化形式存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)L－氨基酸的方法，其中進行了以下步驟a)對產(chǎn)生所需L－氨基酸的棒狀桿菌進行發(fā)酵，所述棒狀桿菌中至少編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子TipA的基因被弱化，b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的所需L－氨基酸，以及c)分離該L－氨基酸，并且任選地，所用的細菌中的所需L－氨基酸的生物合成途徑的其它基因被額外增強，或所用的細菌中的使所需L－氨基酸形成減少的代謝途徑至少部分被排除。
文檔編號C12P13/08GK1680564SQ20051005412
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者布麗吉特·巴瑟 申請人:德古薩股份公司