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生產(chǎn)l-氨基酸的微生物和生產(chǎn)l-氨基酸的方法

文檔序號(hào):555005閱讀:949來源:國(guó)知局

專利名稱::生產(chǎn)l-氨基酸的微生物和生產(chǎn)l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及通過使用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)L-氨基酸的方法.特別地,本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸,例如L-賴氨酸、L-精氨酸、L-烏氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-膽氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸的方法.這些是工業(yè)上有用的L-氨基酸.換句話說,L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-膽氨酸作為動(dòng)物飼料添加刑、健康食品的成分和氨基酸注射液是有用的.L-精氡酸和L-烏氛酸作為肝功能促進(jìn)劑、氨基酸輸注液和全面氨基酸制品的成分是有用的.L-組氨酸作為肝功能促進(jìn)刑和作為組胺的前體是有用的.L-苯丙氨酸作為甜味刑的前體是有用的.
背景技術(shù)
L-氨基酸通過使用屬于短桿菌屬(5"v幼ac紐f/"附)、棒桿菌屬(C07/fWac紐f/"加)、埃希氏菌屬(五sc/^i7'cWa)等的微生物進(jìn)行發(fā)酵來工業(yè)化生產(chǎn).已經(jīng)在EP0857784A、JP11-192088A、WO00/53726和WO96/17930中報(bào)道了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法,巳經(jīng)在EP0999267A、EP1170358A和JP2002-017342A中報(bào)道了生產(chǎn)L-精氨酸的方法.在這些報(bào)道的方法中,使用了產(chǎn)生堿性L-氨基酸的細(xì)菌菌林,包括從其天然或人工突變的菌林、和具有堿性L-氨基酸生物合成酶的増強(qiáng)活性的重組菌林分離的菌林.此外,也已經(jīng)報(bào)道了使用屬于嗜甲基菌屬(Me狄j;/印M附)或甲基菌屬(Me幼j,to^c說"s)的突變的或遺傳修飾的微生物菌林來從甲醇生產(chǎn)L-氨基酸的方法(WO00/61723和JP2001-120269A),甲醉用于發(fā)酵是可以低成本大量地獲得的.修飾細(xì)菌細(xì)胞中L-氨基酸的攝取和輸出的方法是公知的,用來改善所迷細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)能力.修飾L-氨基酸攝取的方法包括消除或降低L-氨基酸攝取進(jìn)入細(xì)胞來增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力,特別地,這些方法包括刪除g/"J5CD採(cǎi)縱子或其部分以消除或減弱L-谷氨酸攝取的方法(EP1038970A)修飾榆出體的方法包括消除或降低L-氨基酸生物合成的中間體或底物的輸出,和增強(qiáng)生產(chǎn)的L-氨基酸的輸出的方法.對(duì)于消除或降低L-谷氨酸生物合成的中間體輸出的方法,突變或破壞a-酮基戊二酸通透酶基因以減少a-酮基戊二酸的輸出的方法是已知的(WO01/005959)對(duì)于增強(qiáng)L-氨基酸輸出的方法,增強(qiáng)棒桿菌屬細(xì)菌的菌林中(^五(堿性L-氨基酸輸出體的基因;J.Mol.Microbiol.Biotechnol"1999Nov;1(2):327-36)的方法是已知的,用于生產(chǎn)L-賴氨酸(W097/23597)或L-精氨酸(美國(guó)專利公開2003-0113899),在埃希y/jr、ya^V基因(EP1016710A)的表達(dá)的方法也是已知的,已經(jīng)提示了這些基因涉及L-氨基酸的輸出.對(duì)于用于堿性L-氨基酸的輸出的基因,上迷的基因是已知的.然而,當(dāng)(ys五基因在同化甲醇的細(xì)菌例如嗜甲基菌屬細(xì)菌中擴(kuò)增,并且產(chǎn)生的菌株被用于L-賴氨酸或L-精氨酸的生產(chǎn)時(shí),來源于"/"e/oiw(棒狀桿菌)細(xì)菌的野生型/w五基因?qū)τ谑燃谆鷮偌?xì)菌是致命的,因而必須導(dǎo)入容許宿主微生物生長(zhǎng)的突變/"五基因(EP1266966A).罔此,當(dāng)被導(dǎo)入到異體微生物中時(shí),/>^£基罔不總是能在L-賴氨酸或L-精氨酸的輸出方面起作用.因此,期望獲得在各種異體宿主微生物中展現(xiàn)出分泌足夠重的L-氨基酸、包括L-賴氨酸和L-精氨酸的能力的,用于L-氨基酸榆出體和生產(chǎn)的基因.yW五基因位于大煬桿菌的基因組上,已經(jīng)被預(yù)測(cè)編碼推定的表面蛋白(Science,277(5331):1453-74,1997).然而,還沒有報(bào)道該基因的克隆和通過在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行分析,因而它的生理功能仍然是未知的.本發(fā)明的目的是提供能有效地生產(chǎn)L-氨基酸的菌林.本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用這樣的菌林有效地生產(chǎn)L-氨基酸的方法.本發(fā)明的發(fā)明人勤勉地研究以實(shí)現(xiàn)上述的目的,結(jié)果,根據(jù)對(duì)高濃度L-賴氨酸的抗性,獲得了yWf基因,一種新型的L-氨基酸輸出體基因.此外,他們還發(fā)現(xiàn),L-氨基酸,包括堿性L-氨基酸例如L-rhtA、B、C基因(JP2000-189177A)和發(fā)明概述賴氨酸、L-精氨酸、L-烏氨酸和L-組氨酸;脂肪族的L-氨基酸例如L-異亮氨酸;羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸;環(huán)狀L-氨基酸例如L-脯氨酸;芳香族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸;含碟的L-氨基酸例如L-半胱氨酸;和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸,可以使用在其中y矽五基因的表達(dá)被增強(qiáng)的橄生物來有效地生產(chǎn).本發(fā)明的目的是提供具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物,其中所述微生物被修飾從而j^/五基因的表達(dá)被増強(qiáng).本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的微生物,其中通過提高所迷y々/五基因的拷貝數(shù)目,或通過修飾所迷j^/五基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列來增強(qiáng)所述j;^五基因的表達(dá).本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中由所述yW五編碼的蛋白質(zhì)的氡基酸序列選自SEQ2、9和10,其中所述蛋白質(zhì)具有L-氨基酸榆出能力.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述紳乂五基因選自(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的DNA;和(b)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的核苷酸序列、或與可從SEQIDNO:1的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA,并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì).本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述J^五基因選自(a)具有SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列的DNA;和(b)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)的到948的核苷酸序列、或與可從SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA,并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì).本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述的微生物,其中所述微生物的所述L-氨基酸榆出能力通過所述增強(qiáng)所述y々/五基因的表達(dá)來提高.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所迷的微生物,其中微生物對(duì)L-氨基酸或L-氨基酸類似物的抗性通過所迷增強(qiáng)所述y矽五基因的表達(dá)來提高.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨脧、L-鳥氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-膽氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述微生物屬于腸細(xì)菌家族.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述屬于腸細(xì)菌家族的微生物是屬于埃希氏桿菌屬的微生物.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述微生物是CV^/ie/iw7if細(xì)菌本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述微生物是同化甲醇的微生物.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述微生物,其中所述同化甲醇的微生物屬于嗜甲基菌屬或甲基菌屬.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法,包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所迷的微生物來產(chǎn)生和引起所迷L-氦基酸的積累,并從培養(yǎng)基或微生物收集所述L-氨基酸.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法,包括在含有甲醉作為主要破源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的微生物來產(chǎn)生和引起所述L-氨基酸的積累,并從所述培養(yǎng)基或所述微生物收集所述L-氨基酸.本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供如上所述方法,其中所述L-氨基酸選自L-賴氦酸、L-精氨酸、L-烏氨酸、L-組氛酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-膽氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸.附困的簡(jiǎn)要說明附困1顯示了用于在埃希氏菌屬細(xì)菌中擴(kuò)增>^/五基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方案.附困2顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了^乂五基因的大麻埃希氏菌(JscAm'c似"co/i')菌林的生長(zhǎng)曲線.附困3顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對(duì)照菌林和破壞了yW五基因的大腸埃希氏菌菌抹的生長(zhǎng)曲線.附田4顯示了用于在同化甲醇的細(xì)菌中擴(kuò)增^W五基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方案.附田5顯示了用于使用同化甲醉的細(xì)菌生產(chǎn)L-賴氨酸的質(zhì)粒的構(gòu)建方案.附困6顯示了在存在L-賴氨酸類似物的情況下對(duì)照菌抹和擴(kuò)增了y^五基罔的食甲基嗜甲基菌(iW^/^topAi'/"sme幼y/Wr印Aus)菌林的生長(zhǎng)曲線,附田7顯示了在存在高濃度L-異亮氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了^^/五基因的大腸埃希氏苗菌林的生長(zhǎng)曲線.附困8顯示了在存在高濃度L-谷氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了>^/五基因的大腸埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困9顯示了在存在高濃度L-蘇氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了yW五基因的大煬埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困10顯示了在存在高濃度L-組氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了^W五基因的大腸埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附閨11顯示了在存在高濃度L-脯氨酸的情況下對(duì)照菌抹和擴(kuò)增了j^五基因的大煬埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困12顯示了在存在高濃度L-烏氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了j^五基因的大麻埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困13顯示了在存在高濃度L-苯丙氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了^y五基罔的大煬埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困14顯示了在存在高濃度L-半胱氨酸的情況下對(duì)照菌抹和擴(kuò)增了W7五基因的大煬埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附田15顯示了在存在高濃度L-精氨酸的情況下對(duì)照菌抹和擴(kuò)增了J^/五基因的大腸埃希氏菌菌林的生長(zhǎng)曲線.附困16顯示了在存在高濃度L-賴氨酸的情況下對(duì)照菌林和擴(kuò)增了(948bp或900bp)基因的大腸埃希氏菌菌抹的生長(zhǎng)曲線.優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明以下,將詳細(xì)解釋本發(fā)明.<1>本發(fā)明的微生物本發(fā)明的微生物具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力,并已經(jīng)被修飾從而y^五基因的表達(dá)被增強(qiáng).在此使用的用語"生產(chǎn)L-氨基酸的能力(L-氨基酸生產(chǎn)能力)"意思是,當(dāng)本發(fā)明的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),引起L-氨基酸在培養(yǎng)基中或在微生物的細(xì)胞中積累的能力.本發(fā)明的微生物可以具有生產(chǎn)多種類型的L-氨基酸的能力.具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物可以是原本具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的徵生物,或可以是通過使用誘變技術(shù)或重組DNA技術(shù)修飾以下提及的微生物的親本菌林使得微生物具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物.本發(fā)明的微生物也可以是已經(jīng)通過增強(qiáng)基因表達(dá)獲得了L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物.在本發(fā)明中要生產(chǎn)的L-氨基酸沒有特別的限制,包括堿性L-氨基酸例如L-賴氨酸、L-精氦酸、L-鳥氨酸、L-組氨酸和L-瓜氨酸;脂肪族的L-氨基酸例如L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸;羥基L-氨基酸例如L-蘇氨酸和L-絲氨酸;環(huán)狀的L-氨基酸例如L-膽氨酸;芳香族L-氛基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸;含碟的L-氨基酸例如L-半胱氨酸、胱氨酸和L-甲碟氨酸;和酸性L-氨基酸和它們的酰胺例如L-谷氛酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺.本發(fā)明的微生物可以具有生產(chǎn)兩種或多種類型的這些L-氨基脧的能力.<賦予1氨基酸生產(chǎn)能力>以下將描述在本發(fā)明中使用的具有L-氛基酸生產(chǎn)能力的微生物的實(shí)例.然而,微生物不局限于所述實(shí)例,而包括具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的任何微生物.對(duì)于本發(fā)明的徵生物的親本菌林,可以使用脈細(xì)菌家族例如埃希氏菌屬細(xì)菌、泛菌屬(iVwfto做)細(xì)菌或Oovie/orm細(xì)菌等等.此夕卜,其^從甲醇生產(chǎn)L-氨基酸.此外,親本菌林的實(shí)例包括屬于r蛋白細(xì)菌的腸細(xì)菌家族,包括屬于埃希氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌屬(五/itew^ictei")、克雷伯氏菌屬(JT/e6siV//)、沙雷氏菌屬(Seir"ftVi)、歐文氏菌屬(五nW/fiVi)、沙門氏菌屬(Sfl/wo"C")和摩根氏菌屬(^/|'0^/<>6"7/附)細(xì)菌和芽孢桿菌屬(5恥《7/附)細(xì)菌,和酵母,包括屬于酵母菌屬(Sncc^wwwyces)、假絲酵母菌屬(CVwirfWfl)屬的那些,等等.這些親本菌抹可以天生具有基因,或可以不是天生地具有yW五基因并且當(dāng)導(dǎo)入W/五基因時(shí)展現(xiàn)出改善的L-氣基酸輸出能力.可以使用在Neidhardt等(Nei他ardt,F(xiàn).C.等人,大腸埃希氏菌andSalmonellaiyphimurium,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.,1208,表1)中報(bào)道的埃希氏菌屬細(xì)菌,例如大腸埃希氏菌.大腸埃希氏菌野生型菌株的實(shí)例包括,但不限于,K12菌林和其衍生物、大煬埃希氏菌MG1655菌抹(ATCCNo.47076)和W3110菌林(ATCCNo.27325).這些菌林可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC,地址P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica)獲得,腸桿菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括成團(tuán)腸桿菌(五"tew6ac紐fa欲^mi柳"s)、產(chǎn)氣腸桿菌(J5"teroA"c紐rr£/*0ge/fes)等,泛菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括菠蘿泛菌(戶fl/ftoe"n""/i"泡)等.盡管最初被分類為產(chǎn)氣腸桿菌的某些細(xì)菌現(xiàn)在根據(jù)16SrRNA分析被分類為成團(tuán)泛菌(尸aiftoe"a^^/0附emifs)、菠蘿泛菌(戶a/ttoeaa"awaf&)或斯氏泛菌(i^ifto戰(zhàn)stemir說),在本發(fā)明中使用的屬于腸桿菌家族的微生物可以是腸桿菌屬細(xì)菌或者泛菌屬細(xì)菌,菠蘿泛菌(尸a"toe"a"a"a"'s)的具體實(shí)例包括尸aw似eaa#ta"<m'sAJ13355(FERMBP-6614)、戶a/ftoe"麵mi泡AJ13356(FERMBP-6615)、尸a柳eaa細(xì)"他AJ13601(FERMBP-7207),和它們的衍生物.這些菌林最初作為成團(tuán)腸桿菌被鑒定和保藏,現(xiàn)在被分類為菠蘿泛菌(/^wtoe"n/wmi泡).嗜甲基菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括,但不限于,食甲基嗜甲基菌,食甲基嗜甲基菌的典型實(shí)例包括AS1菌林(NCIMB10515)等.食甲基嗜甲基菌AS1苗林(NCIMB10515)可以從國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏所(地址NCIMBLts.,TorryResearchStation,135,AbbeyRoad,AberdeenAB98DG,UnitedKingdom)獲得.甲基菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括,但不限于,糖原甲基菌(Me狄yto6ac,'Wwsg(yc0g狄es),A/"/^to6aci7/附^age"a似m,等等.糖原甲基菌的實(shí)例包括T-ll菌林(NCIMB11375)、ATCC21276菌抹、ATCC21371菌林、ATR80菌林(Appl.股otechnol.Biotechnol,,vol.42,pp.67-72(1994))、A513菌林(Appl.Microbiol.Bioteclmol.,vol.42,pp.67-72(1994)),等等.甲基菌屬g(vcog你esNCIMB11375菌抹可以從國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏所(地址NCIMBLts.,TorryResearchStation,135,AbbeyRoad,AberdeenAB98DG,UnitedKingdom)獲得,Afe幼y/o6aci7/"s/7age//imim的實(shí)例包括KT菌抹(Arch.Microbiol"vol.149,pp.441-446(1988))等等.CV^/fe/b/7n細(xì)菌是在Bergey,sManualofDeterminativeBacteriology,8thEd"p.599(1974)中定義的一組微生物,可被用于本發(fā)明.這些微生物被分類為需氧的、格蘭氏陽(yáng)性的和不能形成孢子的非抗酸性桿菌.Gwy附/oiw細(xì)菌還包括那些迄今已經(jīng)被分類到短桿菌屬中、但是當(dāng)前合并到棒桿菌屬的那些細(xì)菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991)),以及屬于短桿菌屬或微桿菌屬(Af/cr06actew'"附)、與棒桿菌屬近相關(guān)的細(xì)菌這種CVwy/f</biw細(xì)菌的實(shí)例如下所列.嗜乙耽乙酸棒桿菌(C7(9/^/fe6acter/"macetotf"V/o/^//iiw)醋谷棒桿菌(C0f^/fe6acten'w加acetog/"似m/ci/挑)美棒桿菌(Gwywe6ac紐ri'"加ca〃"/tae)谷氨酸棒桿菌(01^7te60c紐r/M祝g/ifto/yf/cww)百合花棒軒菌(C^o^e6"c紐w'"w//Wwm)力士棒桿菌(CVwy/ie6<ic"r/ffi)乳發(fā)酵短桿菌(丑rev幼ac紐r/um必var/ca似m)黃色短桿菌(丑i"ev幼actef/"附^"v"w)乳發(fā)酵短桿菌(丑rev幼flc"ri.wiii/a"o/erme/f加m)玫瑰色短桿菌(丑rev幼nc紐ri'Mmr卵ewm)解糖短桿菌(丑rev幼"cter/MmsaccAiir0fyft'c"附)生疏短桿菌(丑i"ey幼iic"r/ii加^/oge/t/to/i's)產(chǎn)氨棒桿菌(G^"e6ac紐r/M鵬a加,"/age附)白色短桿菌(丑rev幼acter/niyta/6m)坩狀短桿菌(丑wv幼ac紐r/ifmcerZ/i"m)嗜氨徵桿菌(M/cr06ac紐r/Mmairfm0/t/a/yAi7iiiff)特別地,可以例舉以下菌抹.嗜乙耽乙酸桿菌ATCC13870醋谷棒軒菌ATCC15806C0i^"e6ac紐ri'M附a/先ait0(^i'cu加ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060百合花棒桿菌ATCC15990(70f^/te6acter/"mme/asseco/aATC!C!17965Ory"e^"抓'"加ejQ7c/卿AJ12340(FE應(yīng)BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868乳發(fā)酵短桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(FERMBP-2205)丑revi'6acteW"mZm#miriV7/^//MmATCC14068乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869(谷氨酸棒桿菌ATCC13869)玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生碟短桿菌ATCC19240C0ry"e6ac紐W(fmamm0/tiage1tesATCC6871,ATCC6872白色短桿菌ATCC1S111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些菌抹可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所獲得.每個(gè)菌林被給予了一個(gè)唯一的登記號(hào),其被列在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所的目錄中.使用這個(gè)登記號(hào)可以訂購(gòu)菌林.此外,AJ12340菌林根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定作為閨際保藏于1987年10月27日保藏在國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)學(xué)會(huì),工業(yè)科技機(jī)構(gòu),通產(chǎn)省(也eNationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofInternationalTradeandIndustry)(目前,獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu),國(guó)家高級(jí)工業(yè)科技學(xué)會(huì),國(guó)際專利保藏機(jī)構(gòu)(TsukubaCentra",1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan,postalcode:305-5466)),收到的登記號(hào)是FERMBP-1539.AJ12418菌林根據(jù)根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定作為國(guó)際保藏于1989年1月5日保藏在國(guó)家高級(jí)工業(yè)科技學(xué)會(huì),國(guó)際專利保藏機(jī)構(gòu),收到的登記號(hào)是FERMBP-2205,在下文中,將說明賦予如上所述的親本菌林L-氨基酸生產(chǎn)能力的方法.為了賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力,可以使用通常用來培育屬于埃希氏菌屬或Owy"e/brm細(xì)菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌的方法.例如,可以使用用于獲得具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)突變菌林、類似物抗性菌林或代謝調(diào)節(jié)突變菌抹的方法,和用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的L-氛基酸生物合成醉活性的重組菌林的方法("AminoAcidFermentation",theJapanScientificSocietiesPressGakkaiShuppanCenter,1stEdition,publishedonMay30,1986,pp.77-100)當(dāng)使用這些方法培育L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌時(shí),可以賦予一種或多種性質(zhì),包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變.當(dāng)產(chǎn)生重組菌林時(shí),可以增強(qiáng)單個(gè)或多個(gè)L-氨基酸生物合成酶的活性.此外,賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷型、類似物抗性和代謝調(diào)節(jié)突變性質(zhì)的方法可以與增強(qiáng)L-氨基酸生物合成酶活性的方法組合.具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)突變菌林、L-氨基酸類似物抗性菌林或代謝調(diào)節(jié)突變菌林,可以通過使親本或野生型菌株經(jīng)歷典型的誘變處理,例如X射線或紫外線照射、用例如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基脈(NTG)的誘變?cè)囆烫幚韥慝@得,然后,可以從突變的菌林中挑選具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷菌林、類似物抗性菌林或代謝調(diào)節(jié)突變菌林.L-賴氨酸類似物的實(shí)例包括溶菌素、賴氨酸異羥肟酸鹽S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、a-氣己內(nèi)酰胺、正亮氡酸,等等.L-精氨酸類似物的實(shí)例包括精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸異羥坊酸鹽.具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的L-賴氨酸類似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變菌林的具體實(shí)例包括大煬埃希氏菌AJ11442菌林(FERMBP-1543,NRRLB-12185、JP56-18596A和美國(guó)專利4346,170),大麻埃希氏菌VL611苗林(JP2000-189180A),等等.此外,WC196菌抹(WO96/17930)也可以被用作L-賴氨酸生產(chǎn)大腸埃希氏菌.WC196菌林最初是通過給W3110菌林賦予AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的,W3110菌林來源于大腸埃希氏菌K-12.WC196菌林被命名為大腸埃希氏菌AJ13069菌林,于1994年12月6日保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu),國(guó)家高級(jí)工業(yè)科技學(xué)會(huì),國(guó)際專利保藏機(jī)構(gòu)(TsukubaCentral6,l隱l,Higashil-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,Japan,postalcode:305-8566)),收到的登記號(hào)是FERMP-146卯,之后,于199S年9月29日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,收到的登記號(hào)是FERMBP-5252.具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的。OTK/bm細(xì)菌的實(shí)例包括S-(2-氨乙基)半胱氨酸(在下文中"AEC")-抗性突變菌林,包括乳發(fā)酵短桿菌(乳發(fā)酵短桿菌)AJ11082(NRRLB-11470)(在JP56-1914B、JP56-1915B、JP57-14157B、JP57嗎14158B、JP57畫30474B、JP58-1007SB、JP59-4993B、JP61-35840B、JP62-24074B、JP62-36673B、JP5-11958B、JP7-112437B和JP7-112438B中描述了),對(duì)氨基酸例如L-高絲氨酸有營(yíng)養(yǎng)缺陷的突變菌抹(JP48-M078B和JP56-6紗9B),對(duì)AEC有抗性和對(duì)氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氡酸、L-絲氨酸、L嚇氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸有營(yíng)養(yǎng)缺陷的突變菌林(美國(guó)專利3,708,395和3,825,472),對(duì)DL-a-氨基-s-己內(nèi)耽胺、a-氨基-月桂基內(nèi)耽胺、天冬氛酸類似物、磺胺藥、載型化合物、和N-月桂酰亮氨酸有抗性的L-賴氨酸生產(chǎn)突變菌抹,對(duì)革耽乙酸癍脫羧酶抑制物或呼吸道酶抑制物有抗性的L-賴氨酸生產(chǎn)突變菌林(JP50-53588A、JP50-31093A、JP52-102498A、JP53腸9394A、JP53曙86089A、JP55-9783A、JP55陽(yáng)9759A、JP56-32995A、JP56-39778A、JP53-43591B和JP53-1833B),對(duì)環(huán)己六醇或乙酸有營(yíng)養(yǎng)缺陷的L-賴氨酸生產(chǎn)突變菌林(JP55-9784A和JP56-8692A),對(duì)氣丙稱酸或34°C或更高溫度敏感的L-賴氨酸生產(chǎn)突變菌林(JP55-9783A和JP53-86090A),對(duì)乙二醉有抗性的短桿菌屬或棒桿菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)突變菌抹(美國(guó)專利4,411,997),等等.L-氨基酸生產(chǎn)能力也可以通過増強(qiáng)編碼L-氨基酸生物合成醉的基因的表達(dá)來賦予.例如,L-賴氨酸生產(chǎn)能力可以通過增強(qiáng)編碼二氣吡啶二羧酸合酶的基罔和編碼天冬氨酸激醉的基因的表達(dá)來賦予.也就是說,通過將編碼二氣吡啶二羧酸合酶的基因片段和編碼天冬氨酸激醉的基因片段連接到栽體、優(yōu)選的多拷貝栽體中來制備重組DNA,所述栽體在用于L-賴氨酸生產(chǎn)的宿主微生物中是可搮作的.作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果,在宿主細(xì)胞中編碼二氣吡啶二羧酸合酶的基因和編碼天冬氨酸激醉的基因的拷貝數(shù)增加,從而這些醉的活性增強(qiáng).在下文中,二氬吡啶二羧酸合蘇、天冬氨酸激醉和天冬氨酸激酶III也按它們各自的縮寫DDPS、AK和AKIII來稱謂.編碼DDPS和AK的基因沒有特別的限制,只要它們編碼分別具有DDPS或AK活性的蛋白質(zhì).這種基因的實(shí)例包括大麻埃希氏菌、食甲基嗜甲基菌、谷氨酸櫸桿菌等的基因.由于DDPS基因(!/fl/",Richaud,F(xiàn).等人,J.Bacteriol.,(1986))和AKIII基因(/"C,Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.andPa"e,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986))的核苦酸序列是已知的,這些基因可以通過使用根據(jù)它們的核苷酸序列序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR、從微生物例如五.K-12菌林的染色體DNA獲得.在下文中,通過來源于f.c^/的rffl/^和來例示編碼DDPS的基因和編碼AK的基因,但是編碼DDPS的基因和編碼AK的基因不限于和(vsC*.已知的是,來源于大腸埃希氏菌的野生型DDPS受L-賴氨酸的反饋抑制,來源于大腸埃希氏菌的野生型AKIII受L-賴氨酸的抑制和反饋抑制.因此,當(dāng)使用和時(shí),優(yōu)選的使用對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的編碼DDPS和AK的突變基因.在下文中,具有免受L-賴氨酸的反饋抑制的突變的DDPS也可以被稱為《突變DDPS",編碼突變DDPS的DNA也可被稱為"突變(te/W"或"rfa/"*".來源于大煬埃希氏菌具有消除L-賴氨酸的反饋抑制的突變的AKIII也可以被稱為"突變AKIII",編碼突變AKIIl的DNA也可被稱為"突變(KsC\來源于G>o;/fe6<icte/7'iiiw細(xì)菌的DDPS原本就對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制有抗性,因而用于本發(fā)明的DDPS和AK不必是突變的.編碼對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的突變DDPS的DNA的實(shí)例包括編碼具有一氨基酸序列的DDPS的DNA,所述氨基酸序列包括用酪氨酸取代118-組氨酸殘基.(U.S.專利5,661,012和6,040,160).此外,編碼對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制有抗性的突變AKIII的DNA的實(shí)例包括編碼具有一氨基酸序列的AKIII的DNA,所述氨基酸序列包括用異亮氨酸取代352-蘇氨酸殘基,(U.S.專利5,661,012和6,040,160).突變DNA可以通過使用PCR的定點(diǎn)誘變技術(shù)等來獲得,用于基因克隆的質(zhì)粒可以是任何質(zhì)粒,只要它可以在微生物中復(fù)制,其具體實(shí)例包括pBR322、pTWV228(TakaraBio)、pMWU9(NipponGene)、pUC19,等等.用于轉(zhuǎn)化的、在宿主微生物中可搮作的栽體是可在每種微生物的細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒.大腸埃希氏菌栽體的具體實(shí)例包括pSTV29(TakaraBio)、RSF1010(Gene,vol.75(2),pp.271-288,1989)、pUC19、pBR322、pMW119,等等,也可以使用噬菌體DNA栽體,復(fù)制的質(zhì)粒.,f》象劣細(xì)菌的栽體的具體實(shí)例包括RSF1010和其衍生物,例如pAYC32(Chistorerdov,A.Y"Tsygankov,Y.D.Plasmid,16,161-167(1986))、pMFY42(Gene,44,53(1990))、pRP301和pTB70(Nature,287,396,(1980)),在CVwywe/o/w細(xì)菌中可操作的的栽體的實(shí)例包括pAM330(JP58-67699A)、pHM1519(JP58曙77895A)和pSFK6(JP2000-262288A)。此外,通過切除允許質(zhì)粒在"o;/ie/br加細(xì)菌中自主復(fù)制的DNA片段,并將該片段插入到大腸埃希氏菌栽體中所獲得的質(zhì)粒,可被用作所謂的穿梭栽體,其在大腸埃希氏菌和Cwy"e/biw細(xì)菌中都是可自主復(fù)制的.為了通過將"/W和(ysC與任何上述栽體連接制備重組DNA,可以使用限制性內(nèi)切醉來消化含rf印』和的DNA片段以及所迷栽體.通常使用連接酶例如T4DNA連接酶來進(jìn)行連接.""/^4和可以被摻入到獨(dú)立的栽體中或單個(gè)栽體中.可用于限制性內(nèi)切醉消化、DNA連接、染色體DNA制備、PCR、質(zhì)粒DNA制備、轉(zhuǎn)化、寡核苷酸引物設(shè)計(jì)等等的方法,可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法,在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.,"MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition",ColdSpringHarbor,例如,是在^f,芽4細(xì)菌的細(xì)胞中可自主LaboratoryPress(1989)等等中描述了這樣的方法.為了將如上所述制備的重組DNA導(dǎo)入到微生物中,只要達(dá)到足夠的轉(zhuǎn)化效率,可以使用任何方法.例如,可以應(yīng)用電穿孔(CanadianJournalofMicrobiology,43,197(1997)).可以使用廣宿主范閨的質(zhì)粒RSFD80(美國(guó)專利6,040,160)作為含有編碼突變DDPS的突變和編碼突變AKIII的突變/"C的質(zhì)粒.用RSFD80轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌JM109菌林被稱為AJ12396(美國(guó)專利6,040,160),這個(gè)菌林于1993年10月28日被保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu),國(guó)家高級(jí)工業(yè)科技學(xué)會(huì),國(guó)際專利保藏機(jī)構(gòu),收到的登記號(hào)是FERMP-13936.之后,于1995年11月1日^4t布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,收到的登記號(hào)是FERMBP-4859.RSFD80可以通過已知的方法從AJ12396菌林獲得.DDPS基因和AK基因的表達(dá)也可以通過將多個(gè)拷貝的和(FSC整合到徵生物的染色體DNA中來增強(qiáng).為了將多拷貝的&/"和導(dǎo)入到微生物的染色體DNA中,可以通過把向多拷貝存在于染色體DNA上的序列來進(jìn)行同源重組.存在于轉(zhuǎn)座元件末端的重復(fù)DNA或反向重復(fù)可被用作多拷貝存在于染色體DNA上的序列.做為選擇,如在JP2-109985A中公開的,多拷貝的和/或(vsC可通過使用轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入到染色體DNA中.在這兩種方法中,作為在轉(zhuǎn)化的菌林中提高的rfa/W和/^C拷貝數(shù)的結(jié)果,DDPS和AK的活性增強(qiáng)了.除了上述基因擴(kuò)增方法之外,DDPS基因和AK基因的表達(dá)也可以通過用更強(qiáng)的序列替換表達(dá)調(diào)節(jié)序列,例如和(ysC的啟動(dòng)子來增強(qiáng)(JP1-215280A).這種強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例包括toc啟動(dòng)子、W/;啟動(dòng)子、伊c啟動(dòng)子、toc啟動(dòng)子、lambda噬菌體的PK啟動(dòng)子和P!^啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、aw》必啟動(dòng)子、印"c啟動(dòng)子,等等,插入這些啟動(dòng)子代替天然啟動(dòng)子増強(qiáng)了rfa/"和(vsC的表達(dá),引起DDPS和AK活性的増強(qiáng).増強(qiáng)表達(dá)調(diào)節(jié)序列可以與擴(kuò)大"/W和的拷貝數(shù)相組合.L-氨基酸生產(chǎn)能力也可以通過增強(qiáng)編碼除DDPS和AK之外的L-氨基酸生物合成酵的基罔的表達(dá)來賦予.這種酶的實(shí)例包括二氨基庚二酸酯合成途徑的酶,例如二氣吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氣蘇(WO96/40934)、磷酸烯醇式丙稱酸羧化醉(JP60-87788A)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨蘇(JP6-102028B)、二氨基庚二酸表異構(gòu)醉(JP2003-135066A)和天冬氨酸半醛脫氣醉(WO00/61723)這種醉的進(jìn)一步的實(shí)例包括氨基己二酸途徑酶,例如同型烏頭酸水合酶(JP2000-157276A)等等.增強(qiáng)這些醃的基因表達(dá)可以與增強(qiáng)DDPS和AK基因的表達(dá)相組合.此外,具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的微生物也可以通過降低或消除催化一反應(yīng)的醉的細(xì)胞內(nèi)活性來獲得,所述反應(yīng)用于合成除L-賴氨酸之外的化合物,并且是L-賴氨酸生物合成途徑的分支.這種醃的實(shí)例包括高絲氨酸脫氬酶和賴氨酸脫羧酶.在W095/23864和WO96/17930中描述了在其中這些醉的活性被降低的菌林.降低或消除醉的細(xì)胞內(nèi)活性的方法的實(shí)例包括突變或刪除微生物的細(xì)胞內(nèi)編碼所述醉的基罔,使得與非突變菌林相比細(xì)胞內(nèi)活性被降低或消除.突變或刪除基因的方法的實(shí)例包括修飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列,例如啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno(SD)序列,向開發(fā)閱讀框中導(dǎo)入錯(cuò)義突變、非有義突變、或框架平移突變,和刪除基罔的部分(J說olChem.1997272(13):8611-7).可以通過使用同源重組技術(shù)或通過使用轉(zhuǎn)座子或IS因子將突變的基因?qū)氲轿⑸镏校谒鐾粗亟M技術(shù)中染色體上的野生型基因被替換為所述突變的基因.同源重組技術(shù)包括使用線性DNA、溫度敏感質(zhì)粒和非可復(fù)制質(zhì)粒的方法.在ProcNatlAcadSciUSA.2000Jun6;97(12):6640-5.、美國(guó)專利6303383、JP05-007491A等中描述了這些方法.增強(qiáng)和降低L-賴氨酸生物合成蘇活性的方法適合于賦予另一種L-氨基酸生產(chǎn)能力.具有生產(chǎn)L-精氨酸能力的大煬埃希氏菌的具體實(shí)例包括對(duì)a-甲基甲硫氨酸、p-象苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽、S-(2-氨乙基)半胱氨酸、a-甲基絲氦酸、P-2-瘙吩丙氨酸、或橫胺胍有抗性的突變菌抹(JPNo,56-106598A),等等.此外,也可以使用大腸埃希氏菌237菌林,其是L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌,具有賦予L-精氨酸反饋抑制抗性的突變,并展現(xiàn)出高的N-乙酰谷氨酸合酶活性(俄國(guó)專利申請(qǐng)No.2000117677),這個(gè)菌林于2000年4月10日保藏在俄國(guó)工業(yè)微生物國(guó)家保藏所(VKPM),GNIIGenetika,保藏號(hào)VKPMB-7925,于2001年5月18日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)成國(guó)際保藏.也可以使用來源于237菌林、并具有增強(qiáng)的醋酸鹽同化能力的大腸埃希氏菌382菌林(JP2002-017342A)大腸埃希氏菌382菌林于2000年4月10日保藏在俄國(guó)工業(yè)微生物國(guó)家保藏所(VKPM),保藏號(hào)VKPMB-7926.具有L嚇氨酸生產(chǎn)能力的。^"e/orw細(xì)菌的實(shí)例包括不僅對(duì)2-噻唑丙氦酸有抗性、而且對(duì)于L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲碟氨酸或L-色氨酸也是營(yíng)養(yǎng)缺陷的Owy"e/oi7fi細(xì)菌的菌林(JP54-44096A),對(duì)稱丙二酸、氟丙二酸或單氟乙酸有抗性的CVOTie/tfr加細(xì)菌的菌抹(JP57-18989A),對(duì)精氨醇有抗性的CWj;/ie/tfiw細(xì)菌的菌抹(JP62-24075A),對(duì)X-胍有抗性的G07fe/owi細(xì)菌的菌林(X代表脂肪酸或脂肪鏈的衍生物,JP2-186995A),對(duì)精氨酸異羥肟酸鹽和6-氮尿嘧啶有抗性的Owy"e/oi7w細(xì)菌的菌林(JP57-150381A),Jrg及(精氨酸生物合成醉的阻抑蛋白)有缺陷的"o7ie/orw細(xì)菌的菌林(JP2002-51790A),等等可以通過類似于用于L-賴氨酸生物合成酶的上述方法來增強(qiáng)L-精氨酸、L-組氨酸、L-鳥氨酸和其他L-氨基酸的生物合成蘇的活性,L-精氣酸生物合成酶的實(shí)例包括一種或多種選自以下的酶N-乙酰谷氨酸合酶(《r^4)、N-乙酖谷氨砩酸癍還原醉(flwC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(ar^/)、N-乙耽谷氨酸激酶(wg5)、乙耽烏氛酸轉(zhuǎn)氨酶(nrgD)、乙耽烏氨酸脫乙耽基酶(aw五)、烏氨酸氨甲?;D(zhuǎn)移酶(wgF)、精氨基琥珀酸合酶(ar容G)、精氨基琥珀酸裂解醉(iwgiy)和氨甲?;姿狨ズ厦?caM5).編碼這些酶的基因的名稱分別在醉的名字后的括號(hào)中給出.在其中這些醉的活性增強(qiáng)了的菌林的實(shí)例包括,例如,在JP2000-287693A、JP2000-1974卯A、JP07-028749B等等中描述的菌林.也可以通過增強(qiáng)編碼谷氨酸脫氫酶的基因的表達(dá)(EP1057893A)或増強(qiáng)谷氨酸合成酶活性(US2005-00142236)來賦予L-精氨酸生產(chǎn)能力.已知的是,L-精氨酸生物合成酶受L-精氨酸的抑制,因此L-精氨酸生產(chǎn)能力也可以通過刑除精氨酸阻遏物或通過向N-乙跣谷氨酰胺合蘇中導(dǎo)入賦予反饋抑制抗性的突變來(EP1154020A和EP1170361A)有效地增強(qiáng).此外,對(duì)組氨酸類似物或色氨酸類似物有抗性的^icW"s細(xì)菌(JP52-114092A),對(duì)L-甲硪氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、腺嘌呤、烏嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前體)的至少一個(gè)是營(yíng)養(yǎng)缺陷的芽孢桿菌屬細(xì)菌(JP52-99289A),對(duì)精氨酸異鞋肝酸鹽有抗性的芽孢桿菌屬細(xì)菌,對(duì)丁二酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的或?qū)塑账犷愃莆镉锌剐缘恼迟|(zhì)沙雷氏菌(Serr"rfaiw"rcewww)(JP58-9692A),在代謝精氨酸的能力方面有缺陷的、對(duì)精氨酸拮抗物和刀豆氨酸有抗性的、對(duì)賴氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的粘質(zhì)沙雷氏菌(JP52-8729A),對(duì)精氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氦酸、精氨酸異羥肟酸鹽和6-氮尿嘧啶有抗性的酸酒酵母(S恥cAflwwj;c幼ce"vfe/加)(JP53-143288A),對(duì)刀豆氨酸有抗性的熱帶假絲酵母(CVim/iVto《w/w'ca/i's)(JP53-3586A)等等,也可被用作L-精氨酸生產(chǎn)菌林.L-組氨酸生物合成酶的實(shí)例包括ATP礴酸核糖轉(zhuǎn)移酶(WsG)、砩酸核糖AMP環(huán)水解醉(A/s/)、砩酸核糖-ATP焦磷酸水解酶U/s/五)、砩酸核糖亞胺甲基-5-氨基咪唑氨甲耽核糖酸異構(gòu)酶(似")、氨基轉(zhuǎn)移酶(W說)、磷酸組氨醇轉(zhuǎn)氨酵(他C)組氨醉磷酸醉(似M)、組氨醇脫氬醉(A&D),等等.已知的是,編碼L-組氨酸生物合成酶(似sG,A&5^4/7)的基因受L-組氨酸抑制,因此L-組氨酸生產(chǎn)能力也可以通過向ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(A&G)中導(dǎo)入賦予反饋抑制抗性的突變來有效地増強(qiáng)(俄國(guó)專利2003677和2119536).具有L-組氨酸L-組氨酸能力的微生物的具體實(shí)例包括五.co/,'菌林FERM-P5038和5048,其已經(jīng)導(dǎo)入了攜帶編碼L-組氨酸生物合成酶的DNA的栽體(JP56-005099A),導(dǎo)入了r似,一種用于氡基酸輸出的基因的菌林(EP1016710A),賦予了磺胺胍、DL-l,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈審素抗性的五.m//80菌林(VKPMB-7270,俄國(guó)專利2119536),等等.L-烏氨酸生物合成途徑包括與L-精氨酸生物合成途徑共有的幾個(gè)酶.L-烏氨酸生物合成酶的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酸合酶("r^4)、N-乙酰谷氨褲酸癍還原醉(欲gC)、烏氨酸乙耽轉(zhuǎn)移醉("w/)、N-乙耽谷氨酸激酶("W丑)、乙耽烏氨酸轉(zhuǎn)氨酶("^D)乙跣鳥氨酸脫乙跌基酶("^五),等等.具有生產(chǎn)L-烏氨酸的能力的細(xì)菌的實(shí)例包括巳經(jīng)導(dǎo)入了L-瓜氨酸或L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷突變的Owy"e/oi7fi細(xì)菌和節(jié)桿菌屬(A幼w6acter)細(xì)菌(JP02-283290A),對(duì)維生素P樣活性物質(zhì)有抗性的G^/fe/br祝細(xì)菌AJ11589菌林(FERM-P5644,JP57-016696A),等等.具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的微生物的實(shí)例包括具有L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的6-二甲基氨基嘌呤-抗性突變林(JP5-304969A),在其中具有增強(qiáng)睞活性的突變的蘇氨酸生物合成酶基因用質(zhì)粒來擴(kuò)増的菌林(JP1-29559B,JP05-227977A),在其中蘇氨酸搮縱子用質(zhì)粒來擴(kuò)增的菌林(JP2-109985A),在其中擴(kuò)增了編碼丙輛酸羧化酶的基因和編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氬醉的基因的菌林(JP2002-S1787A),等等.大煬埃希氏菌VKPMB-3996菌林(美國(guó)專利5,175,107)也可以被用作L-蘇氨酸生產(chǎn)菌林.VKPMB-3996于1987年11月19日保藏在俄閨工業(yè)徵生物國(guó)家保藏所(VKPM),GNIIGenetika,登記號(hào)為VKPMB-3996.VKPMB-3996菌林?jǐn)y帶質(zhì)粒pVIC40(國(guó)際專利公開WO90/04636),該質(zhì)粒是通過向具有鏈審素抗性標(biāo)記基因的質(zhì)粒pAYC32中插入蘇氨酸搮縱子(^M5C)獲得的(Chistorerdov,A.Y.,Tsygankov,Y.D.,Plasmid,1986,16,161-167).由包含在pVIC40中的突變基因編碼的天冬氨酸激蘇I-高絲氨酸脫氬酶I不受L-蘇氨酸的反饋抑制.大腸埃希氏菌VKPMB-5318菌林(EP0593792B)也可被用作L-蘇氨酸生產(chǎn)菌林.VKPMB-5318于19卯年5月3日保^Mt俄國(guó)工業(yè)微生物國(guó)家保藏所(VKPM),GNIIGenetika(VKPMGNIIGenetika地址Dorozhnyproezd1,Moscow113545,Russia),登記號(hào)為VKPMB-5318.VKPMB-5318菌林對(duì)于L-異亮氨酸是自養(yǎng)的,編碼蘇氨酸生物合成蘇的蘇氨酸操縱子位于C1溫度敏感阻遏物、PR-啟動(dòng)子和來源于X嗷菌體的Cro蛋白質(zhì)N末端的下游,此外,該菌抹攜帶構(gòu)建的質(zhì)粒DNA,使得蘇氨酸生物合成基因的表達(dá)受到來源于i噬菌體的啟動(dòng)子和阻遏物的調(diào)節(jié).此外,大腸埃希氏菌MG442菌林(US4,278,765)也可以用作L-蘇氨酸生產(chǎn)菌林.MG442菌林作為CMIMB-1628保藏在俄國(guó)工業(yè)微生物閨家保藏所(VKPM).具有生產(chǎn)L-蘇氨酸的能力的細(xì)菌也可以通過增強(qiáng)L-蘇氛酸生物合成醉的活性來獲得.編碼L-蘇氨酸生物合成睞的基因的實(shí)例包括天冬氨酸激錄III基因、天冬氨酸半醛脫氬酶基因,等等.L-蘇氨酸生物合成醉的活性可以在細(xì)菌中被增強(qiáng),在所迷細(xì)菌中蘇氨酸降解蘇的活性被抑制,在其中蘇氣酸降解睞的活性被抑制的細(xì)菌的實(shí)例包括TDH6菌林,其是在蘇氨酸脫氨醉活性方面有缺陷的(JP2001-346578A)具有生產(chǎn)L-谷氨酸的能力的細(xì)菌也可以通過増強(qiáng)L-谷氨酸生物合成酶的活性來獲得.L-谷氨酸生物合成睞的實(shí)例包括谷氨酸脫氬酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合睞、異桿檬酸脫氬醉、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、丙明酸羧化醉、砩酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙明酸合酶、烯醉酶、辨酸甘油酸變位酶、礴酸甘油酸激酶、甘油搭-3-磷酸脫氬醉、褲酸丙糖異構(gòu)醉、二磷酸果糖醉、果糖褲酸激醉、礴酸葡糖異構(gòu)睞,等等.特別地,具有這些L-谷氨酸生物合成酶的增強(qiáng)的活性的細(xì)菌包括在WO00/18935和JP2000-2328卯A中公開的CVw"e/b/7if細(xì)菌的菌林,和在JP2001-333769A、JP2000-106869A、JP2000-189169A和JP2000-333769A中公開的煬桿菌家族的菌林.具有生產(chǎn)L-谷氨酸的能力的細(xì)菌也可以通過降低或消除催化一反應(yīng)的一種或多種醉的活性來獲得,所述反應(yīng)使得從L-谷氨酸的合成產(chǎn)生分支并產(chǎn)生L-谷氛酸以外的化合物.這種酶包括異檸檬酸裂解酶、a-酮戊二眵脫氬蘇、磷酸酯轉(zhuǎn)乙耽酶、乙酰激酶、乙酰醇酸合酶、乙酸乳酸合酶、甲酸醋轉(zhuǎn)乙酕酶、乳酸脫氬酶、谷氨酸脫羧蘇、酸癍脫氬醉,等等.特別地,在其中a-輛戊二搭脫氬酶活性被降低的細(xì)菌包括在W095/34672中公開的乳發(fā)酵短桿菌厶s菌林、在JP6-237779A中公開的乳發(fā)酵短桿菌AJ12821菌抹(FERMBP-4172)、在JP5^244970A或JP7-203卯0A中公開的大腸埃希氏菌菌林,和在JP2001-333769A中公開的成團(tuán)腸桿菌菌林.具有生產(chǎn)L-半胱氨酸的能力的細(xì)菌的實(shí)例包括在其中胱硫鍵p-裂解酶活性被降低的大脈埃希氏菌菌林(JP2003-169668A)和在其中絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移醉受L-半胱氨酸的反饋抑制被釋放的大腸埃希氏菌的菌林(JP11-155S71A)或Gw^"e/oiw6""ew"w(JP2002-233384A),具有生產(chǎn)L-脯氨酸的能力的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括大腸埃希氏菌702菌林(VKPMB-8011),其式對(duì)3,4-二雍基脯氨酸和azathidin-2-carboxylate有抗性的,和702ilvA菌林(VKPMB-8012)其是通過在702菌抹中刪除ilvA基因獲得的(JP2002-300874A),具有生產(chǎn)L-苯丙氨酸的能力的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括在其中刪除了。M和,及基罔大腸埃希氏菌AJ12739菌林(tyrA::TnlO,TyrR;VKPMB-8197),在其中導(dǎo)入了突變的M"的大煬埃希氏菌HWIOW菌林(美國(guó)專利5,3S4,672)和在其中擴(kuò)增了和基因的大腸埃希氏菌菌林(WO03/044192).具有生產(chǎn)L-苯丙氡酸的能力的CVio^e/tfnw細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)于酪氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的和對(duì)L-苯丙氨酰-L-酪氨酸有抗性的菌抹(JP5-49489A),具有生產(chǎn)L-色氨酸的能力的細(xì)菌可以通過增強(qiáng)L-色氨酸生物合成酶,包括砩酸甘油酸脫氬酶和鄰氨基苯甲酸醋合醉的活性來獲得.這些睞可以是對(duì)L-色氨酸或L-絲氨酸的反饋抑制有抗性的.例如,具有這些反饋抗性醉的細(xì)菌可以通過將質(zhì)粒pGH5導(dǎo)入大腸埃希氏菌SV164菌株來獲得,所迷質(zhì)粒pGH5含有編碼L-色氨酸抗性磷酸甘油酸脫氣醉的突變w"基因,所述大腸埃希氏菌SV164菌林帶有編碼L-絲氨酸抗性鄰氨基苯甲酸醋合醃的基因(WO94/08031).具有生產(chǎn)L-色氨酸的能力的細(xì)菌也可以通過增強(qiáng)由色氨酸操縱子編碼的L-色氨酸生物合成醃的活性來獲得.這種酶包括L-色氨酸搮縱子色氡酸合酶和鄰氨基苯甲酸醋合醉.這些細(xì)菌的實(shí)例包括在其中導(dǎo)入了色氨酸操縱子的大腸埃希氏菌菌抹,所述色氨酸搮縱子含有編碼L-絲氨酸抗性鄰氨基苯甲酸癍合蘇的基因(JP57-71397A、JP62-244382A和美國(guó)專利4,371,614).此外,具有生產(chǎn)L-色氨酸的能力的細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)L-苯丙氨酸和L-酪氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的大煬埃希氏菌AGX17AGX17(pGX44)NRRLB-122631菌林,和攜帶含有色氨酸操縱子的質(zhì)粒pGX50的AGX6(pGX50)aroPlNRRLB-12264菌抹(美國(guó)專利4,371,614),具有生產(chǎn)L-異亮氨酸的能力的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突變菌抹((JP5-304969A),對(duì)L-異亮氨酸異幾肝酸鹽、碟代異亮氨酸、DL-乙硫氨酸或精氨酸異羥肟酸鹽有抗性的突變菌林((JP5-130882A),和在其中編碼蘇氨酸脫氨酶和乙耽羥酸合醉的基因用質(zhì)粒擴(kuò)增了的重組菌林(JP2-458A、JP2-42988A和JP8華47397A).具有生產(chǎn)L-纈氨酸的能力的細(xì)菌可以通過增強(qiáng)L-纈氨酸生物合成睞的活性來獲得,所迷L-纈氨酸生物合成醉包括由ilvGMEDA採(cǎi)縱子編碼的那些,特別是由,7v(基因編碼的乙酰羥酸合醉(JP02-748418B).這些睞可以是對(duì)L-緗氨酸的反饋抑制有抗性的.具有生產(chǎn)L-纈氨酸的能力的細(xì)菌可以是在其中乙酸乳酸合醉III基因(:7v/開基因)的表達(dá)被降低的細(xì)菌.具有生產(chǎn)L-^氨酸的能力的細(xì)菌可以是對(duì)氨基酸類似物有抗性的.這種細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)L-異亮氨酸和L-甲疏氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的并且對(duì)D-核糖、嘌呤核苷或嘧焚核糖核苷有抗性的突變菌林(FERMP-1841,P5556;JP53-025034A),和對(duì)聚新(polyketonoid)有抗性的突變菌林(FERMP-9325;JP04-045314B),具有生產(chǎn)L-丙氛酸的能力的細(xì)菌的實(shí)例包括在H+-ATPase活性方面有缺陷的007fe/017rt細(xì)菌(ApplMicrobiolBiotechnol,2001Nov;57(4):534-40),或在其中擴(kuò)增了天冬氨酸P-脫羧蘇基因的CVw>7fe/oi7w細(xì)菌菌林(JP07-163383A)<增強(qiáng)>^/£基因的表達(dá)>本發(fā)明的徵生物可以通過修飾如上所述的具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物、使得yW五基因的表達(dá)增強(qiáng)來獲得.做為選擇,可以先増強(qiáng)J^/五基因的表達(dá),隨后賦予L-氨基酸生產(chǎn)能力.可以通過經(jīng)由修飾表達(dá)調(diào)節(jié)序列,例如啟動(dòng)子來增強(qiáng)內(nèi)源性y6/五基因的表達(dá),或通過使用質(zhì)粒等外源地導(dǎo)入基因,來增強(qiáng)J^/五基因的表達(dá).可以組合這些技術(shù).可以通過northern雜交或RT-PCR(Molecularcloning:ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA),2001)測(cè)量本發(fā)明的細(xì)菌中由^W五基因表達(dá)出的RNA的數(shù)量,并于野生型或未修飾的菌抹相比較,來確認(rèn)^W五基因表達(dá)的増強(qiáng).在本發(fā)明的微生物中基因的表達(dá)被增強(qiáng)超過野生型或未修飾的菌林,優(yōu)選的是野生型或未修飾的菌林的不少于l.S倍,更優(yōu)選的不少于2倍,和最優(yōu)選的不少于3倍.基因可以來自大場(chǎng)埃希氏菌或其同源物.來自大腸埃希氏菌的yW五基因的實(shí)例包括編碼具有SEQIDNO:2中氨基酸編號(hào)17到315的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因,優(yōu)選的是具有SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列的基因.盡管在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置l上Val的密碼子是gtg,它可以被轉(zhuǎn)化為Met,j^/五基因編碼的蛋白質(zhì)可以是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列(1到315)的蛋白質(zhì).在這種情況下,優(yōu)選的是使用含有SEQIDNO:1的核苷酸編號(hào)1到948的核苷酸序列的DNA.然而,從實(shí)施例可以清楚地了解到,可用于本發(fā)明的生產(chǎn)方法的微生物可以通過使用含有核苷酸序列SEQIDNO:1(49到948)的DNA來獲得,不管哪個(gè)氨基酸殘基是翻譯起始密碼子.大腸埃希氏菌y/t/五基因的同源物是指展現(xiàn)出與大麻埃希氏菌j^五基因高度的結(jié)構(gòu)相似性、并増強(qiáng)L-氨基酸榆出能力或L-氨基酸抗性,和宿主徵生物的L-氨基酸生產(chǎn)能力的基因.y矽五基因同源物的實(shí)例包括編碼具有SEQIDNO:9或NO:10的絲酸序列的蛋白質(zhì)的基因.SEQIDNO:9的氨基酸序列是在大腸埃希氏菌的YbjE蛋白質(zhì)(SEQIDNO:2)和鼠傷寒沙門氏菌(5^/附0/te"a0^A/ww"'"附)LT2菌林的YbjE蛋白質(zhì)之間保守的序列.SEQIDNO:10的氨基酸序列是在大腸埃希氏菌的YbjE蛋白質(zhì)和Ifeiw'/iwC092YP01361菌林的YbjE蛋白質(zhì)之間保守的序列.j;^/五基因同源物可以是編碼與SEQIDNO:2的4^氡基酸序列或SEQIDNO:2中氨基酸編號(hào)17到315的氨基狄列具有70%或更高、優(yōu)選的80%或更高、更優(yōu)選的卯%或更高、更優(yōu)選的95%或更離、特別優(yōu)選的98%或更高的同源性的蛋白質(zhì),并且具有L-氨基酸輸出能力的基因.j^/五基閎同源物的實(shí)例還包括具有SEQIDNO:9或NO:10的氨基酸序列并具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì).氨基酸序列和DNA序列的同源性可以使用Karlin和Altschul的BLAST(Pro.Natt.Acad.Sd.USA,90,and5873(1993))和FASTA(MethodsE股ymol.,183,and63(19卯))算法來確定,根據(jù)這個(gè)算法BLAST開發(fā)了稱為BLASTN和BLASTX的程序(參考http:〃w\m.ncbi.nlm.nUi.gov)來源于除大腸埃希氏菌以外的微生物的^t/五基因可以使用,包括來源于Shigellaflexneri2astr.2457T菌抹的基因,其具有與GenBank登記入冊(cè)No.AE016980的核苷酸編號(hào)275793到276692或275793到276740互補(bǔ)的序列,來源于鼠傷寒沙門氏菌LT2菌抹的基因,其具有與GenBank登記入冊(cè)No.AE008740的核苷酸編號(hào)97到996互補(bǔ)的序列,和來源于投rw'ii/aC092菌林的基因,其具有與GenBank登記入冊(cè)No.AJ414147的核苷酸編號(hào)197812到198708互補(bǔ)的序列.此外,可以根據(jù)與以上例舉的基因的同源性,從Gwy/ie/ww細(xì)菌例如谷氨酸棒桿菌和乳發(fā)酵短桿菌,假單胞菌屬(戶郷&w卵做)細(xì)菌(i)/yco6ac紐r/Mm)細(xì)菌例如結(jié)核分枝桿菌(3fjw6flc紐i7'M附似&rcu/0s/s)等等克隆^/E基因.此外,本發(fā)明的^々/五基因不局限于野生型基因,而可以是突變或人工修飾的基因,所述基因編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列、SEQIDNO:2中氨基酸編號(hào)17到315的氨基酸序列、或SEQIDNO:9或IO的氨基酸序列的蛋白質(zhì).編碼的蛋白質(zhì)可以包括在一個(gè)或多個(gè)位置替換、刑除或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基,只要維持了編碼的YbjE蛋白質(zhì)的功能,即L-賴氨酸輸出能力。盡管取決于三維結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的類型的不同而"幾個(gè)"氛基酸殘基的數(shù)目不同,其可以是2到20個(gè),優(yōu)選的2到10個(gè),更優(yōu)選的2到5個(gè).氨基酸的替換優(yōu)選的是保守替換,包括ser或thr對(duì)ala的替換,gln、his或lys對(duì)arg的替換,glu、gln、lys、his或asp對(duì)asn的替換,asn、glu或gin對(duì)asp的替換,ser或ala對(duì)cys的替換,asn、glu、lys、his、asp或arg對(duì)gin的替換,gly、asn、gln、lys或asp對(duì)glu的替換,pro對(duì)gly的替換,asn、lys、gln、arg或tyr對(duì)his的替換,leu、met、val或phe對(duì)ile的替換,ile、met、val或phe對(duì)leu的替換,asn、glu、gln、his或arg對(duì)lys的替換,ile、leu、val或phe對(duì)met的替換,trp、tyr、met、ile或leu對(duì)phe的替換,thr或ala對(duì)ser的替換,ser或ala對(duì)于也r的替換,phe或tyr對(duì)trp的替換,his、phe或trp對(duì)tyr的替換,met、ile或leu對(duì)val的替換.如上所迷替換、刪除或插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸還包括起因于攜帶基因的微生物(突變體或變體)的個(gè)體差異和物種差異的天然發(fā)生的突變.可以通過例如,位點(diǎn)特異性誘變來修飾SEQIDNO:1所示的核苷酸序列,或SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列(i^gui/0m0"asamigiVt0sa),分枝桿菌屬獲得這樣的基因,從而將一個(gè)或多個(gè)替換、刪除或插入導(dǎo)入到由該基因編碼的蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)上.在SEQIDNO:1的序列中具有突變的J^/五基罔的實(shí)例包括,具有SEQIDNO:l的序列、其中笫三位置上的核苷酸(烏嚷呤)被腺鄰呤替代的J^JF基罔.此外,這種基因也可以通過常規(guī)的誘變處理,例如以下所述的那些來獲得.誘變處理的實(shí)例包括在體外用幾胺處理具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列或SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列的基因,和用紫外線照射或用于典型的突變處理的誘變?cè)囆汤鏝-甲基-N,-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或EMS(甲橫酸乙酯)處理帶有該基因的微生物,例如埃希氏菌屬細(xì)菌.可以通過例如在適合的細(xì)胞中表達(dá)所述基因并確定輸出到培養(yǎng)基中的L-氨基酸的數(shù)量是否升高,來確認(rèn)這些基因編碼的蛋白質(zhì)是否具有L-氨基酸輸出能力.可以通過將所述基因?qū)氲剿拗魑⑸镏校诖嬖诟邼舛萀-氦基酸的情況下培養(yǎng)該宿主,并與對(duì)照菌林比較微生物的生長(zhǎng)情況,來確認(rèn)這些基因是否給宿主微生物賦予L-氨基酸抗性.^A/五基因還包括能在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的核苷酸序列、SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列、或從這些序列制備的探針雜交,并且編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì)的DNA.如在此使用的"嚴(yán)格條件"是這樣的條件,在這些條件下形成所謂的特異性雜交,而不形成非特異性雜交.很難通過使用任何數(shù)值來清楚地表述這種條件.然而,嚴(yán)格條件的實(shí)例包括這樣的條件,在該條件之下,相互具有高同源性的DNA,例如,具有不低于50%的同源性的DNA相互雜交,具有低于50%的同源性的DNA不相互雜交,和這樣的條件,在該條件下,在運(yùn)用典型Sou也ern雜交洗涂的一定鹽濃度下,例如在1xSSC、0,1%SDS在60。C,優(yōu)選的0.1xSSC、0.1%SDS在60°C,更優(yōu)選的0,1xSSC、0.1%SDS在68°C下洗滌一次或優(yōu)選的2-3次,DNA相互雜交.可以通過例如使用遣傳重組技術(shù)提高^々/五基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)來增強(qiáng)j;矽必基罔的表達(dá).例如,可以通過將含有j^/五基因的基因片段連接到能在宿主微生物中復(fù)制的栽體,優(yōu)選的多拷貝栽體,并將產(chǎn)生的栽體導(dǎo)入到宿主微生物中來制備重組DNA.當(dāng)使用大煬埃希氏菌的^々/五基因時(shí),可以,例如使用根據(jù)SEQIDNO:l的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物,例如具有SEQIDNO:5或6的序列的引物,并使用大腸埃希氏菌的染色體DNA作為模板,通過PCR方法(聚合醉鏈?zhǔn)椒磻?yīng),參見White,T.J.等人,TrendsGenet"5,185(1989))來獲得,也可以使用來自其他微生物的j^/五基因,可以通過使用根據(jù)它們的y矽五基因或其同源序列、或來自不同物種微生物的YbjE蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR,或通過使用根據(jù)這樣的序列信息制備的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交,從它們的染色體DNA或染色體DNA文庫(kù)獲得yW五基因可以通過例如Saito和Miura的方法(參見H.SaitoandK,Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963),TextforBioengineeringExperiments,EditedbytheSocietyforBioscienceandBioengineering,Japan,pp.97-98,Baifukan,1992))從作為DNA供體的微生物制備染色體DNA.然后,將j^!/五基因連接到可在宿主微生物中操作的栽體DNA來制備重組DNA.優(yōu)選的,使用可在宿主微生物中自主復(fù)制的栽體.可在大腸埃希氏菌中自主復(fù)制的栽體的實(shí)例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可從TakaraBio獲得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可從NipponGene獲得),等等,可在Coiy/ie/biTW細(xì)菌中自主復(fù)制的栽體的實(shí)例包括pAM330(JP58-67699A)、pHM1519(JP58-77895A)、pVK7(US2003-0175912)和pSFK6(JP2000-262288A)此外,也可以使用在大腸埃希氏菌和G^/ie/oiw細(xì)菌中都可自主復(fù)制的所謂的穿梭栽體.可在嗜甲基菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的栽體的實(shí)例包括RSF1010和其衍生物,例如pAYC32(Chistorerdov,A.Y.,Tsygankov,Y.D.Plasniid,16,pp.l61-167(1986))、pMFY42(Gene,44,p.53(1990))、pRP301和pTB70(Nature,287,396,(1980)).為了通過連接^/B基因和任何上述栽體來制備重組DNA,用限制性內(nèi)切酶消化所迷栽體和舍有所述;^/£基因的片段,并且通常通過使用連接醉,例如T4DNA連接酶進(jìn)行連接.為了將如上所述制備的重組DNA導(dǎo)入微生物中,可以采用迄今為止報(bào)道的任何已知轉(zhuǎn)化方法.可以采用例如,用氣化鈣處理受體細(xì)胞以提高DNA的透過性,針對(duì)大麻埃希氏菌已經(jīng)報(bào)道了(Mandel,M.and扭ga,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)),并使用從生長(zhǎng)細(xì)胞制備的感受態(tài)細(xì)胞來導(dǎo)入DNA,對(duì)于丑ac'7/附sn&戰(zhàn)s已經(jīng)報(bào)道了(D咖can,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.E.,Gene,1,153(1977)),除這些方法之外,可以采用已經(jīng)被拫道適合于iac///i狄6說&、放線菌和酵母的方法(Chang,S.andChoen,S.N.,Molec.Gen.Genet"168,111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.andHopwood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.andFink,G.R.,Proc.Natl.Sci.,USA,75,1929(1978))將重組DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體或原生質(zhì)體樣受體細(xì)胞.此外,Owy"e/biTW細(xì)菌的轉(zhuǎn)化也可以通過電脈沖方法(Sugimoto等人,JP2-207791A)進(jìn)行.y/t/五基因的拷貝數(shù)也可以通過將多拷貝的基因整合到微生物的染色體DNA上來增加.為了將多拷貝的y矽五基因整合到微生物的染色體DNA上,可以通過靶向多拷貝存在于染色體DNA上的序列來進(jìn)行同源重組.轉(zhuǎn)座子末端的重復(fù)DNA和反向重復(fù)可被用作多拷貝存在于染色體DNA上的序列.做為選擇,如在JP2-109985A中公開的,也有可能將y矽五基因摻入到轉(zhuǎn)座子中,并容許其被轉(zhuǎn)染,從而將多拷貝的基因整合到染色體DNA沖.可以通過使用具有j^/五基因的部分序列的探針進(jìn)行southern雜交來確認(rèn)y矽五基罔整合到染色體中.也可以如WO00/18935中描述的通過用更強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列替換染色體DNA或質(zhì)粒上的表達(dá)調(diào)節(jié)序列,包括y6y五基因的啟動(dòng)子,通過擴(kuò)增提高,矽五基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子,或刪除或削弱降低^W五基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子,來實(shí)現(xiàn)^7五基因表達(dá)的增強(qiáng).例如,toc啟動(dòng)子、吵啟動(dòng)子、啟動(dòng)子等等是已知的強(qiáng)啟動(dòng)子.此外,還有可能的是向j^/五基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)霂讉€(gè)核苷酸替換使得所述啟動(dòng)子更為強(qiáng)力.在Goldstein等人(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1,105-128)中公開了評(píng)估啟動(dòng)子效力的方法和強(qiáng)力啟動(dòng)子的實(shí)例.此外,已知的是,在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和翻譯起始密碼子之間的間隔區(qū)序列,特別是緊靠起始密碼子上游的幾個(gè)核苷酸,對(duì)翻譯效率有很大的影響.因此,可以修飾這種序列.j^/五基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列可以使用用于啟動(dòng)子鑒定的栽體或基因分析軟件例如GENETYX來鑒定.通過這樣的啟動(dòng)子替換或修飾來增強(qiáng)^^五基因的表達(dá).表達(dá)調(diào)節(jié)序列的替換也可以通過例如使用溫度敏感質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn).Owywe/biw細(xì)菌的溫度敏感質(zhì)粒的實(shí)例包括p48K和pSFKT2(JP2000-262288A)、pHSC4(參見法國(guó)專利Laid-openPublicationNo.266787S,1992和JP5-7紗1A),等等.在Gwy"e/o/w細(xì)菌中這些質(zhì)粒至少可以在25°C的溫度下自主復(fù)制,但在37°C的溫度下不能自主復(fù)制.表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾可以與提高j^/五基因的拷貝數(shù)相組合.為了增強(qiáng)yA/f基因編碼的蛋白質(zhì)的活性,可以向y々/五基罔中導(dǎo)入増強(qiáng)L-氨基酸榆出能力的突變.提高j^五基罔編碼的蛋白質(zhì)(YbjE蛋白質(zhì))的活性的突變的實(shí)例包括,啟動(dòng)子序列中提高W/五基因轉(zhuǎn)錄的突變和>^/五基罔編碼區(qū)中提離YbjE蛋白質(zhì)的比活性的突變.本發(fā)明的微生物優(yōu)選的是在其中L-氨基酸輸出能力由于引起y6乂五基因表達(dá)增加的修飾而被增強(qiáng)的微生物.在此使用的用語"L-氨基酸生產(chǎn)能力被增強(qiáng)"意思是,當(dāng)培養(yǎng)被修飾以增強(qiáng)y々/五基閎表達(dá)的微生物時(shí),由所述徵生物輸出到培養(yǎng)基中的L-氨基酸的數(shù)量超過從未修飾的菌抹,例如親本菌林或相應(yīng)的野生型菌林輸出的L-氨基酸的數(shù)量,通過測(cè)定培養(yǎng)基中L-氨基酸濃度的増加來觀察L-氨基酸輸出能力的增加.此外,也通過測(cè)定在y々/五基因?qū)胛⑸镏袝r(shí)L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度的下降來觀察L-氨基酸輸出能力的増加.與從未修飾的菌抹輸出的L-氨基酸的數(shù)量相比較,從本發(fā)明的微生物輸出的L-氨基酸的數(shù)重優(yōu)選的增加10%或更多,更優(yōu)選的30%或更多,特別優(yōu)選的50%或更多.此外,也根據(jù)在y々/五基因?qū)胛⑸镏袝r(shí)L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度的下降來觀察L-氨基酸輸出能力的增加.例如,可以如下測(cè)量L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度向含有微生物細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加具有1.07的比重的硅油,通過離心從培養(yǎng)基中收集細(xì)胞,優(yōu)選的是在12,000rpm離心2分鐘.然后用22%高氣酸處理細(xì)胞(A.Ishizakietal,Biotech.Teqniq.(1995)Vo19,No.6,p409).使用這樣制備的細(xì)胞,可以測(cè)量L-氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度.此外,可以通過使用反轉(zhuǎn)的(everted)胰囊測(cè)量放射性標(biāo)記的L-氨基酸的細(xì)胞攝取來間接地檢查"L-氨基酸輸出能力"(J.Biol.Chem.,Vol.277,Issue51,49841-49849).例如,從在其中導(dǎo)入了姊yE基因的細(xì)胞制備反轉(zhuǎn)的膜囊,然后,向所迷囊添加提供驅(qū)動(dòng)能重的ATP或其他底物,測(cè)量放射性標(biāo)記的L-氨基酸的細(xì)胞攝取.做為選擇,通過測(cè)重活性細(xì)胞中非標(biāo)記氨基酸和標(biāo)記氨基酸之間的轉(zhuǎn)換反應(yīng)速率來檢測(cè)"L-氨基酸輸出能力",此外,本發(fā)明的微生物優(yōu)選的是由于引起^々/五基因表達(dá)增強(qiáng)的修飾而變得對(duì)L-氨基酸或L-氨基酸類似物更有抗性的微生物.也就是說,優(yōu)選的本發(fā)明的微生物是在存在一定濃度的L-氨基酸或L-氨基酸類似物的情況下能夠生長(zhǎng)的微生物,在所述濃度下未修飾的菌林不能生長(zhǎng).可以在含有高濃度的L-氨基酸或L-氦基酸類似物,例如,0.3g/L或更高的基本培養(yǎng)基中,來證實(shí)在存在L-氨基酸或L-氡基酸類似物的情況下的細(xì)胞生長(zhǎng).可以通過測(cè)量含有高濃度L-氨基酸或L-氨基酸類似物的基本培養(yǎng)基中所述菌林的生長(zhǎng),并與親本菌林或未修飾的菌林的生長(zhǎng)進(jìn)行比較來確認(rèn)姊y五基因增強(qiáng)菌林的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性.比較生長(zhǎng)的方法包括比較每種菌林生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的580-660nm處光密度的方法.只要能抑制未修飾菌抹的生長(zhǎng),添加到培養(yǎng)基中的L-氨基酸或L-氨基酸類似物的濃度沒有特別的限制,優(yōu)選的不少于0.3g/L.例如,以80g/L添加L-賴氨酸氬氣化物,以卯g/L添加L老氨酸氬氣化物,以45g/L添加L-烏氨酸氬氣化物,以30g/L添加L-組氨酸氬氯化物,以12g/L添加L-異亮氨酸,以40g/L添加L-蘇氨酸,以15g/L添加L-谷氨酸單鈉,以8g/L添加L-苯丙氨酸,以85g/L添加L-脯氨酸,和以0.3g/L添加L-半胱氨酸,此外,本發(fā)明的徵生物可以是由于引起^乂五基因表達(dá)增強(qiáng)的修飾而變得對(duì)L-賴氨酸或L-賴氨酸類似物更有抗性的微生物.L-賴氨酸類似物的實(shí)例包括溶菌素、賴氦酸異羥Jlf酸鹽、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-曱基賴氨酸、a-氣己內(nèi)耽胺,等等,但不限于這些.可以按照與上述的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性相同的方法確認(rèn)L-賴氨酸抗性.此外,本發(fā)明的微生物可以是由于引起J^/五基因表達(dá)増強(qiáng)的修飾而變得對(duì)L-精氨酸或L-精氨酸類似物更有抗性的微生物.L-精氨酸類似物的實(shí)例包括精氨酸異羥肟酸鹽、高精氨酸、D-精氨酸、刀豆氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽,等等.可以按照與上述的L-氨基酸或L-氨基酸類似物抗性相同的方法確認(rèn)L-精氨酸或L-精氨酸類似物抗性.<2>生產(chǎn)L-氨基酸的方法本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物以生產(chǎn)和促使L-氨基酸在培養(yǎng)基或所述微生物的細(xì)胞中的積累,并從所述培養(yǎng)基或細(xì)胞收集L-氨基酸.用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以選自通常用于利用微生物發(fā)酵的L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的公知的培養(yǎng)基.也就是說,可以使用含有破源、氮源、無機(jī)離子,和如果有必要含有其他有機(jī)成分的普通培養(yǎng)基.對(duì)于碳源,可以使用糖類例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解產(chǎn)物,醇類例如甘油或山梨醇,或有機(jī)酸例如反丁烯二酸、檸檬酸或丁二酸.對(duì)于氮源,可以使用無機(jī)銨鹽例如疏酸銨、氯化銨或礴酸銨,有機(jī)氮例如大豆蛋白水解產(chǎn)物,氨氣,氨水,等等.期望的是以合適的數(shù)量向培養(yǎng)基中添加物質(zhì)例如維生素Bl和L-高絲氨酸、酵母提取物等作為有機(jī)痕量營(yíng)養(yǎng)物.除了上迷的,如有必要,少量添加礴酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、銩離子等.本發(fā)明使用的培養(yǎng)基可以是天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基,只要它含有碳源、氮源、無機(jī)離子,和如有必要含有其他有機(jī)成分.優(yōu)選的在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)1到7天.在培養(yǎng)期間,培養(yǎng)溫度優(yōu)選的控制在24°C到37°C,pH值優(yōu)選的控制在5到9,無機(jī)的或有機(jī)的酸性或堿性物質(zhì),以及氨氣等,可被用于調(diào)整pH值.通??梢酝ㄟ^公知技術(shù)的組合,例如通過利用離子交換樹脂、沉淀和其他技術(shù)從發(fā)酵肉湯收集L-氨基酸.當(dāng)L-氨基酸在細(xì)胞中積累時(shí),例如,可以通過超聲破碎來破壞細(xì)胞,可以通過離心除去破壞的細(xì)胞,可以使用離子交換樹脂等等從獲得的上清液收集L-氨基酸.如果在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中使用甲醇作為主要碳源,降低了成本,因此具有同化甲醇的能力的微生物例如嗜甲基菌屬和甲基菌屬細(xì)菌是優(yōu)選的.在這種情況下,可以根據(jù)典型的用于普通甲醇同化微生物的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)(參見,例如,WO00/61723,JP2001-120269A等等).當(dāng)使用甲醇作為主要碳源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),優(yōu)選的以0.001到30%的濃度向培養(yǎng)基添加甲醇.對(duì)于甲醇同化微生物的培養(yǎng),優(yōu)選的向培養(yǎng)基中添加硤酸銨等等,并用作氮源.此外,優(yōu)選的以少量添加痕量成分,例如鱗酸軒、轔酸納、疏酸鎂、碟酸亞鐵和硫酸錳.曱醇同化微生物的培養(yǎng)優(yōu)選的在伴隨著用于通風(fēng)的搖動(dòng)或攪動(dòng)的有氧條件下,在5到9的pH值范圍,和在20到45°C的溫度下,通常進(jìn)行24到120小時(shí).通??梢酝ㄟ^公知技術(shù)的組合,例如通過利用離子交換樹脂、沉淀和其他技術(shù)從培養(yǎng)物收集L-氨基酸.從細(xì)胞收集L-氨基酸可以按照與如上所述相同的方法進(jìn)行.實(shí)施例在下文中,將參考以下非限制性實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明.除非另有說明,用于以下實(shí)施例的試劑是從WakoPureChemicals或NakaraiTesque獲得的.用于每個(gè)實(shí)施例的培養(yǎng)基的組成如下所示.對(duì)于所有的培養(yǎng)基用NaOH或HCl調(diào)整pH值.L培養(yǎng)基Bactotrypton(Difco)10g/L酵母提取物(Difco)5g/L氯化鈉10g/LpH7.0在120°C對(duì)這些培養(yǎng)基進(jìn)行蒸氣滅菌20分鐘.L瓊脂培養(yǎng)基L培養(yǎng)基Bacto瓊脂15g/L在120°C對(duì)這些培養(yǎng)基進(jìn)行蒸氣滅菌20分鐘.基本培養(yǎng)基(按照MolecularcloningVol.3)5*M9鹽200ml20%葡萄糖20ml1M疏酸鎂2ml1M氯化鉤0.1ml加至1L,調(diào)整pH7.0.5*M9鹽砩酸氬二鈉64g15g2.5g5.0g礴酸鐘氯化鈉氣化銨加至1L在加至1L以后,在115°C對(duì)這些培養(yǎng)基進(jìn)行蒸氣滅菌IO分鐘,在合適的時(shí)間添加L-賴氨酸.基本瓊脂培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基Bacto瓊脂15g/L在115。C對(duì)這些培養(yǎng)基進(jìn)行蒸氣滅菌10分鐘.用于埃希氏菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基葡萄糖40g/L碟酸銨24g/L辨酸二氫鉀1.0g/L疏酸鎂七水化物1.0g/L硤酸鐵(IV)七水化物0.01g/L硫酸錳(IV)七水化物0.01g/L酵母提取物2.0g/L藥典碳酸鉀30g/L用氬氣化鉀調(diào)節(jié)pH值到7.0,在115°C使成分進(jìn)行蒸氣滅菌10分鐘,除了葡萄糖和MgS04'7H20之外,這些單獨(dú)地滅菌.對(duì)于抗生素,添加50mg/L氣霉素.用于埃希氏菌屬細(xì)菌的L精氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基葡萄糖60g/L(羊獨(dú)地滅菌)碟酸鎂七水化物lg/L(羊獨(dú)地滅菌)疏酸銨25g/L褲酸二氬鐘2g/L酵母提取物(Difco)5g/L維生素Bl0.1mg/LpH7.2藥典碳酸鉤25g/L(單獨(dú)地滅菌)用氬氧化鐘調(diào)節(jié)pH值到7.2,在U5。C使成分進(jìn)行蒸氣滅菌10分鐘,除了葡萄糖和MgS04.7H20之外,這些單獨(dú)地滅菌,對(duì)于抗生素,添加50mg/L的氣審素.用于嗜甲基菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(SEII培養(yǎng)基)礴酸二氦鐘1.9g/L鱗酸二氬鈉1.56g/L疏酸鎂0.2g/L碟酸銨5g/L碟酸銅五水化物5嗎/L砥酸錳(IV)五水化物25嗎/L疏酸鋅(IV)七水化物23將/L氯化鉀(II)二水化物72mg/L氣化鐵(II)六水化物9.7mg/L碳酸鈣(KantoKagaku)30g/L甲醇2%(vol/vol)pH7.0在121°C對(duì)除甲醇以外的成分進(jìn)行蒸氣滅菌IS分鐘,甲醇在成分充分地冷卻之后添加參考JournalofGeneralMicrobiology(1989)125,135,3153-3164,SilmanN.J.,CarverM.A.&JonesC.W制備這個(gè)培養(yǎng)基.除了硫酸按之外,使用1.18g乙耽胺,并以72mg/L的濃度添加氣化鈣.SEII琮脂培養(yǎng)基確酸二氣奸1.9g/L磷酸二氬鈉1.56g/L硤酸鎂0.2g/L硤酸銨5g/L硤酸銅五水化物5將/L疏酸錳(IV)五水化物25叫/L疏酸鋅(IV)七水化物23叫/L脫水氯化鉀(II)72mg/L氯化鐵(II)六水化物9.7mg/L破酸鈣(KantoKagaku)30g/L甲酵2%(volpH7.0Bacto瓊脂(Difco)15g/L在121°C對(duì)除甲醇以外的成分進(jìn)行蒸氣滅菌15分鐘,甲醇在成分充分地冷卻之后添加.用于CVwy/w/br加細(xì)菌的CM2S培養(yǎng)基:多種蛋白脒10g/L酵母提取物10g/L氯化鈉5g/L蔗糖5g/LDL-甲碟氨酸0.1g/L用氬氧化鐘調(diào)節(jié)pH值到7.2,在120°C使成分進(jìn)行蒸氣滅菌30分鐘.然后將培養(yǎng)基用于平皿培養(yǎng),添加20g/L的瓊脂.用于Gwy"e/oiw細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基:葡萄糖100g/L碟酸銨55g/L黃豆水解產(chǎn)物1.05g總氮/L磷酸二氦鐘1.0g/L硤酸鎂七水化物1.0g/L硤酸鐵(IV)六水化物0.01g/L硫酸錳(IV)五水化物0.01g/L硤酸鎂GD113藥典碳酸鈣0.2g/L0.05ml/L50g/L(單獨(dú)地滅菌)用氬氧化鐘調(diào)節(jié)pH值到7.5,在115°C使成分進(jìn)行蒸氣滅菌10分鐘,除了葡萄糖和MgS04.7H20之外,這些羊獨(dú)地滅菌.實(shí)施例l:L-賴氨酸輸出基因的篩選L-賴氨酸輸出基因的搜索如下進(jìn)行.<1-1>構(gòu)建在其中導(dǎo)入了質(zhì)粒文庫(kù)的大腸埃希氏菌菌林按常規(guī)的方式從通過在MG165S(ATCC47076)菌林中刪除lysA(二氨基庚二酸脫羧醉基因)獲得的菌抹提取染色體DNA.將用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分消化染色體DNA獲得的2到4kbp片段導(dǎo)入到栽體pTWV229(TakaraBio)、pSTV28(TakaraBio)和pMW118(NipponGene)的每一個(gè)中,所有栽體預(yù)先用BamHI消化,從而獲得質(zhì)粒文庫(kù).通過電穿孔將這些質(zhì)粒文庫(kù)的每一個(gè)導(dǎo)入到MG1655菌林中.<1-2>1^-賴氨酸抗性基因的篩選在L培養(yǎng)基上對(duì)導(dǎo)入了質(zhì)粒文庫(kù)的MG1655菌^L據(jù)氡芐青霉素抗性挑選導(dǎo)入了pTWV229的菌林,根據(jù)氯審素抗性挑逸導(dǎo)入了pSTV28的菌林,和根據(jù)氨千音審素抗性挑選導(dǎo)入了pMW118的菌林.總共獲得了約80,000個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落.將這些轉(zhuǎn)化體平鋪到含有60g/L鹽酸賴氨酸的基本培養(yǎng)基上,如果有的話,在培養(yǎng)基上MG1655菌株可以形成非常少的菌落.在37°C培養(yǎng)36小時(shí)之后,在含有高濃度賴氨酸的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的約50個(gè)菌落被選出作為賴氨酸抗性菌抹的候選者.為了確定插入到候選賴氨酸抗性菌林的栽體中的序列,通過使用具有SEQIDNO:3(M13正向引物)和SEQIDNO:4(M13反向引物)的合成寡核苷酸進(jìn)行PCR,并測(cè)定擴(kuò)增的片段的序列,所述兩個(gè)引物與位于質(zhì)粒的克隆位點(diǎn)附近的DNA序列互補(bǔ).作為核苷酸序列測(cè)定的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了在L-賴氨酸抗性菌林中幾乎所有的片段都含有^W五,位于編號(hào)913181到914128.分析從W/五基因序列預(yù)測(cè)的氨基酸序列,當(dāng)分析蛋白質(zhì)的序列的疏水性質(zhì)時(shí),發(fā)現(xiàn)該蛋白是高度疏水的.因此,暗示由y々/五編碼的蛋白質(zhì)是膜蛋白,并且可能涉及氨基酸輸出.實(shí)施例2:在大麻埃希氏菌中yW五基因擴(kuò)增的影響<2-1>構(gòu)建用于^t/五擴(kuò)增的質(zhì)粒并將其導(dǎo)入到大腸埃希氏菌中然后,為了研究>^/£基因的擴(kuò)增的影響,構(gòu)建用于擴(kuò)增j^/五的栽體并導(dǎo)入到MG1655中.已經(jīng)報(bào)道了大腸埃希氏菌(大腸埃希氏菌K-12菌林)的染色體的全部核苷酸序列,因此,在上述文獻(xiàn)中報(bào)道的^A歷基因的核苷酸序列的基礎(chǔ)上制備SEQIDNO:5的合成寡核苷醵和SEQIDNO:6的合成寡核苷酸,分別用作5,引物和3,引物來進(jìn)行PCR,其中SEQIDNO:5的合成寡核苷酸具有與GenBank登記入冊(cè)No.AE000189的核普酸編號(hào)4085到4104的序列亙補(bǔ)的序列,SEQIDNO:6的合成寡核苷酸相應(yīng)于同一核苷酸序列的核苷酸編號(hào)2689到2708的序列.使用大腸埃希氏菌MG1655菌抹的染色體DNA作為模板.將獲得的PCR產(chǎn)物連接到已經(jīng)用Smal消化了的栽體pSTV28(TakaraBio)來構(gòu)建用于yW五的擴(kuò)増的質(zhì)粒pSYBJE.構(gòu)建方案在附困1中示出.在其中按照toc啟動(dòng)子的正向連接了j^/五基因的質(zhì)粒被稱為pSYBJEl,在其中按照反方向連接基因的質(zhì)粒稱為pSYBJE2.按常規(guī)方式將用于yW五基因擴(kuò)增的質(zhì)粒pSYBJEl、pSYBJE2和對(duì)照質(zhì)粒pSTV28(TakaraBio)各自導(dǎo)入到MG1655(ATCC47076)中.根據(jù)氯審素抗性選擇轉(zhuǎn)化體,導(dǎo)入pSYBJEl的菌林稱為MG1655/pSYJEl,導(dǎo)入pSYBJE2的菌林稱為MG1655/pSYBJE2,導(dǎo)入pSTV28的菌林稱為MG16S5/pSTV28.<2-2>在埃希氏菌屬細(xì)菌中>^/£基因擴(kuò)增的影響使用導(dǎo)入了pSYBJEl或pSYBJE2的菌林檢驗(yàn)基因的擴(kuò)增對(duì)大腸埃希氏菌MG1655菌林針對(duì)各種氨基酸的抗性的影響.將MG1655/pSYBJEl、MG1655/pSYBJE2和對(duì)照MG1655/pSTV28菌林各自接種到5mL含有50jig/mL氣審素DL培養(yǎng)基中,使用培養(yǎng)設(shè)備通過往復(fù)運(yùn)動(dòng)搖動(dòng)培養(yǎng)約6小時(shí).對(duì)在其中細(xì)胞已經(jīng)增殖到OD600-約l.O的混濁度的培養(yǎng)肉湯進(jìn)行離心,然后用M9基本培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次.然后,將細(xì)胞接種到含有50fig/mL氣審素的M9基本培養(yǎng)基和含有80g/L鹽酸賴氨酸的M9基本培養(yǎng)基中到OD600-0.05的混濁度,培養(yǎng)約70小時(shí).結(jié)杲在附田2中示出,其顯示了與對(duì)照菌抹相比,在存在高濃度L-賴氨酸的情況下,増強(qiáng)y矽五基因表達(dá)改善了早期的生長(zhǎng)速率,以及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期期間的細(xì)胞分裂速率.實(shí)施例3:j;A/五基因破壞對(duì)埃希氏菌屬細(xì)菌的氨基酸抗性的影響<3-1>;^/五基因破壞菌林的構(gòu)建通過Datsenko和Wanner開發(fā)的稱為"紅色驅(qū)動(dòng)整合(Red-drivenintegration)"的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645)來實(shí)現(xiàn)y矽五基因的刪除.依據(jù)這種方法,使用在5'側(cè)含有目的基因和在3,側(cè)含有抗生素抗性基西的合成寡核苷酸獲得PCR產(chǎn)物.使用這種方法,可以單步構(gòu)建基因被破壞的菌林.依據(jù)這種方法,設(shè)計(jì)與f/5/丑基因或?yàn)槟0遒|(zhì)粒賦予抗生素抗性的基因附近的區(qū)域互補(bǔ)的引物,獲得內(nèi)源y好五基因的PCR產(chǎn)物.通過使用質(zhì)粒pACYC184(NBLGeneSciencesLtd.,U.K.,GenBank/EMBLAccessionNumberX06403)作為棋板和具有SEQIDNOS:7和8的序列的合成寡核苷酸作為引物,可以獲得PCR產(chǎn)物.在瓊脂糖凝膠上純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物,用來對(duì)大麻桿菌MG1655菌株進(jìn)行電穿孔,大腸桿菌MG16S5菌抹帶有具備溫度敏感性復(fù)制能力的質(zhì)粒pKD46.質(zhì)粒pKD46(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645)含有由阿拉伯棘可誘導(dǎo)性ParaB啟動(dòng)子(GenB肌k/EMBLAccessionNo.J02459,笫31088到33241位核苷酸)控制的入噬菌體的2154核苷酸DNA片段,所述X噬菌體含有入Red同源重組系統(tǒng)的基因(X、p、ejw基因).質(zhì)粒pKD46是將PCR產(chǎn)物摻入MG1655菌林的染色體中所必需的.用于電穿孔的感受態(tài)細(xì)胞如下制備.在30。C在含有100mg/L氨千青審素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸埃希氏菌MG1655菌抹過夜,然后用含有氡芐音審素和L-阿拉伯糖(lmM)的5mLSOB培養(yǎng)基稀釋100倍(MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,J.等人,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)).稀釋的細(xì)胞在30。C通風(fēng)生長(zhǎng)直到OD600變成約0.6,然后濃縮100倍,用冰冷的去離子水洗滌三次,從而細(xì)胞可被用于電穿孔.通過使用70fil感受態(tài)細(xì)胞和約lOOngPCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔.將電穿孔后的細(xì)胞添加到lmL的SOC培養(yǎng)基中(MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,J.等人,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)),在37。C培養(yǎng)2.5小時(shí),然后在37。C平鋪在L瓊脂培養(yǎng)基上.照這樣,挑選Cm(氯審素)抗性重組菌林.然后,為了固化pKD46質(zhì)粒,細(xì)胞在42°C在L瓊脂培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)兩次,檢驗(yàn)獲得的菌落的氨千音審素抗性.照這樣,獲得了在其中固化了pKD46的氨節(jié)音審素敏感菌林.通過PCR確認(rèn)突變菌株中^乂五基因的破壞,其可以通過氯審素抗性鑒定出來.使用j^五基因被破壞的菌林MG1655A^^/五cat的細(xì)胞中的DNA獲得的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度,比從野生型菌抹獲得的更長(zhǎng).因而,證實(shí)了氯審素抗性基因被插入到y(tǒng)矽五基因中,這證實(shí)了yW五基罔已經(jīng)被破壞.具有插入的氯審素抗性基因的y々/E破壞菌林稱為MG1655厶肖五Cm<3-2>確認(rèn)^y五基因缺陷菌林的氨基酸抗性檢驗(yàn)y矽五基因缺陷菌抹MG1655AybjE::Cm對(duì)氨基酸抗性的影響.通過在由往復(fù)運(yùn)動(dòng)來?yè)u動(dòng)的培養(yǎng)設(shè)備上在L培養(yǎng)基中培養(yǎng)MG1655厶》^五Cm和對(duì)照MG1655菌林約6小時(shí)獲得培養(yǎng)肉湯(600OD-1.0),對(duì)培養(yǎng)肉湯進(jìn)行離心.然后,細(xì)胞用M9基本培養(yǎng)基洗滌兩次并接種到M9基本培養(yǎng)基或含有80g/L鹽酸賴氨酸的M9基本培養(yǎng)基中到OD600-0.05,培養(yǎng)約70小時(shí).然后檢查生長(zhǎng)情況,結(jié)果在附困3中示出,如附困3所示,與對(duì)照菌林相比,當(dāng)存在高濃度的L-賴氨酸時(shí),W乂五基因的刪除降低了早期的生長(zhǎng).根據(jù)這個(gè)結(jié)果和實(shí)施例2的結(jié)果,揭示了j^t/五基因賦予了對(duì)L-賴氨酸的抗性.實(shí)施例4:擴(kuò)增對(duì)埃希氏菌屬細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)的影響對(duì)于大腸埃希氏菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌林,使用WC196菌林(AJ13069(FERMBP-5252),WO96/17930),其是AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性的.用質(zhì)粒pSYBJEl轉(zhuǎn)化WC196菌林用于y々/五擴(kuò)增.質(zhì)粒pSTV28(TakaraBio)作為對(duì)照(如實(shí)施例2中)單獨(dú)地進(jìn)行轉(zhuǎn)化.從而,獲得氣霉素抗性菌林.證實(shí)質(zhì)粒的引入,導(dǎo)入質(zhì)粒pSYBJEl的菌林稱為WC196/ybjE,導(dǎo)入對(duì)照質(zhì)粒pSTV28的菌抹稱為WC衡pSTV28.WC196/ybjE和WC196/pSTV28菌林各自在37°C在含有50mg/L氯審素的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到OD仰0變成約0.6.然后,向每個(gè)培養(yǎng)肉湯添加等體積的40%甘油溶液,攪拌,然后分成合適的體積,保存在-80。C.在此這些被稱為甘油貯備液.解凍這些菌林的甘油貯備液,將100nL的每個(gè)貯備液均一地平鋪在含有50mg/L氯霉素的L平皿上,在37°C孵化24小時(shí).將從平皿收集細(xì)胞的約1/8接種到500mLSakaguchi燒瓶中20mL含有50mg/L氣霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基(M9基本培養(yǎng)基)中,在往復(fù)運(yùn)動(dòng)搖動(dòng)的培養(yǎng)設(shè)備上37°C培養(yǎng)"小時(shí).培養(yǎng)之后,使用BiotechAnalyzerAS210(SakuraSeiki)測(cè)量培養(yǎng)基中積累的賴氨酸數(shù)量.對(duì)于細(xì)胞中的L-賴氨酸濃度,將適當(dāng)體積的培養(yǎng)肉湯添加到比重1.07的硅油中,通過在12000rpm離心2分鐘收集細(xì)胞.然后,用22%高氣酸處理來破壞收集的細(xì)胞,測(cè)量賴氨酸的濃度.24小時(shí)后L-賴氦酸的積累和產(chǎn)生以及細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度的比例在表1中示出.用*表示的細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度的比例通過用細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度(mg/g細(xì)胞干重)除細(xì)胞外賴氦酸濃度(mg/g細(xì)胞千重)來確定.如表1所示,與沒有被導(dǎo)入^^五基因的WC196/pSTV28菌株相比,WC196/pSYBJEl菌林積累了大量的賴氨酸.此外,在導(dǎo)入了^y五基因的WC196/pSYBJEl菌林中,由于相對(duì)對(duì)照WC196/pSTV28菌林的細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度的明顯下降,細(xì)胞外L-賴氨酸濃度相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)L-賴氨酸濃度升高了,因而表明yW五基因是L-賴氨酸輸出基因.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例5:y矽五擴(kuò)增對(duì)埃希氏菌屬細(xì)菌的L-精氨酸生產(chǎn)的影響已經(jīng)觀察到,與對(duì)照菌林相比在^乂五基因擴(kuò)增了的菌林中L-賴氨酸的積累和產(chǎn)生都提高了.還檢驗(yàn)了擴(kuò)增對(duì)L-精氨酸生產(chǎn)的影響,L-精氨酸是類似L-賴氨酸的已知堿性氨基酸.對(duì)于大腸埃希氏菌L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌,使用具有釋放了N-乙酰谷氨酸合酶的反饋抑制的237菌株(VKPMB-7925,俄國(guó)專利申請(qǐng)No.2000117677).<5-1>大腸埃希氏菌237菌抹的j;W五基因擴(kuò)增菌抹的制備通過使用與實(shí)施例4中相同的方法,制備基因擴(kuò)增237/pSYBJEl菌林和對(duì)照237/pSTV28菌林.<5-2>1^-精氨酸的生產(chǎn)通過使用如下所述的培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和分析方法,檢驗(yàn)>^/£基因擴(kuò)增對(duì)L-精氨酸生產(chǎn)的影響.對(duì)于前培養(yǎng)物,將100pL甘油貯備液接種在L瓊脂培養(yǎng)基上,然后均一地平鋪在含有50mg/L氟審素的L平皿上,在32°C孵化24小時(shí).將從平皿收集的細(xì)胞的約1/8接種到20mL精氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中并在32。C培養(yǎng)90小時(shí),導(dǎo)入了質(zhì)粒的菌林的培養(yǎng)在添加氣審素的情況下進(jìn)行.在培養(yǎng)期間取出lml培養(yǎng)肉湯,測(cè)量細(xì)胞和培養(yǎng)肉湯中的葡萄糖濃度和L-精氨酸積累.為了確定培養(yǎng)肉湯中的葡萄糖濃度和L-精氨酸濃度,將培養(yǎng)肉湯在15,000rpm離心5分鐘,獲得的上清液適當(dāng)?shù)赜盟♂?,通過使用BiotechAnalyzer(SakuraSeiki)和AminoAcidAnalyzerL-8500(Hi似chiInstrumentService)測(cè)量稀釋的上清液中的濃度.為了測(cè)定細(xì)胞中的L-精氡酸濃度,將適當(dāng)體積的培養(yǎng)肉湯添加到比重1.07的硅油中,在12000rpm離心2分鐘,然后通過22%高氣酸處理來破壞收集的細(xì)胞,測(cè)量L-精氨酸濃度.卯小時(shí)后L-精氨酸的積累和產(chǎn)生以及細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸濃度的比例在表2中示出.用*表示的細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)的比例通過用細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸濃度(mg/g細(xì)胞干重)除細(xì)胞外L-精氨酸濃度(mg/g細(xì)胞干重)來確定.表2:j^/五基罔擴(kuò)增的菌株的L-精氨酸生產(chǎn)菌林L嚇氨酸積累L-精氨酸產(chǎn)量(%)細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)精氨酸濃度的比例*237/pSTV280.81.723.0237/pSYBJEl1.73.625.6觀察到,與對(duì)照菌林相比在WW基因擴(kuò)增了的菌林中L-精氨酸的積累和產(chǎn)生都提高了.此外,細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)精氨酸還的比例也升高了.因而,表明該基因還涉及L-精氨酸的榆出.實(shí)施例6:將來源于埃希氏菌屬細(xì)菌的^y五基因?qū)隵Tf《象4細(xì)菌中的影響<6-1>用于擴(kuò)增的質(zhì)粒pRSybjE的構(gòu)建為了將j^/五基因?qū)氲娇鋐差泉秀細(xì)菌中,用已知質(zhì)粒pRS(JP3-501682A)來構(gòu)建用于y々/五表達(dá)的質(zhì)粒pRSybjE,pRS是具有pVIC40質(zhì)粒的栽體片段的質(zhì)粒,其是(WO90/04636,JP3-S01682A)通過刪除編碼蘇氨酸搮縱子的DNA區(qū)域獲得的.質(zhì)粒pVIC40來源于廣宿主范圍栽體質(zhì)粒pAYC32(Chistorerdov,A.Y.,Tsygankov,Y.D"Plasmid,1986,16,161-167),其是RSF1010的衍生物.首先,根據(jù)附困3和以下所示的方案從pRS構(gòu)建含有toc啟動(dòng)子的質(zhì)粒pRStac,用限制性內(nèi)切醉EcoRI和Pstt消化pRS栽體,添加到苯酚/氯仿溶液中,混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醉沉淀收集DNA,在0.8%瓊脂糖凝膠上分離.通過使用EASYTRAPVer.2(DNAcollectionkit,TakaraBio)收集約8千堿基對(duì)(在下文中"kbp")的DNA片段.做為選擇,使用pKK223-3質(zhì)粒(表達(dá)栽體,Pharmacia)作為棋板,和具有SEQIDNOS:16和17的引物進(jìn)行PCR(在94°C變性20秒、在55°C退火30秒、在72°C延長(zhǎng)反應(yīng)60秒的循環(huán)重復(fù)30個(gè)循環(huán))來擴(kuò)增toe啟動(dòng)子區(qū)域.使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio)進(jìn)行PCR.含有toe啟動(dòng)子的擴(kuò)增的DNA片段使用PCRpr印(Promega)進(jìn)行純化,然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和EcoT221消化,其識(shí)別位點(diǎn)已經(jīng)設(shè)計(jì)在引物中了.然后,將反應(yīng)混合物添加到苯酚/氣仿溶液中,混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醇沉淀收集DNA,在0.8%瓊脂糖凝膠上分離.通過使用EASYTRAPVer.2收集約0.15kbp的DNA片段,如上所述制備的pRS栽體消化產(chǎn)物和似c啟動(dòng)子區(qū)域片段通過使用DNA連接試劑盒Ver.2(TakaraBio)連接.這個(gè)連接反應(yīng)凌液用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(大煬埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,TakaraBio).將細(xì)胞平鋪在含有20mg/L鏈審素的LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37°C孵化過夜.出現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落各自接種到含有20mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí).通過堿-SDS方法從每個(gè)培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA,通過用限制性內(nèi)切蘇消化來確認(rèn)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu).選擇其中鏈審素抗性基因和toe啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向相同的質(zhì)粒,稱為pRStac.如上所述獲得的pRStac用Sse8387I(TakaraBio)消化,與苯酚/氯仿溶液混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醇沉淀收集DNA,隨后用DNABlunting試刑盒進(jìn)行末端鈍化.此外,如上所述的pSYBJEl用限制性內(nèi)切酶PvuII消化,與苯酚/氯仿溶液混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醇沉淀收集DNA,在0.8%瓊脂糖凝膠上分離.使用EASYTRAPVer.2(DNAcollectionkit,TakaraBio)收集含有/"c啟動(dòng)子和y辦/E基因的約1.5kbpDNA片段.如上所述制備的pRStac栽體消化產(chǎn)物和y矽五基罔區(qū)域片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(TakaraBio)連接到一起.這個(gè)連接反應(yīng)溶液用于轉(zhuǎn)化大脈桿菌(大場(chǎng)埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,TakaraBio),將細(xì)胞平鋪在含有20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37°C孵化過夜.出現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落各自接種到含有20mg/L鏈審素的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí),通過堿-SDS方法從每個(gè)培養(yǎng)肉湯中提取質(zhì)粒DNA,通過用限制性內(nèi)切酶消化和DNA測(cè)序來確認(rèn)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),以選擇pRSybjE(附田4).在pRSybjE質(zhì)粒中,定位j^/五基因使得其按照與似c啟動(dòng)子相同的方向轉(zhuǎn)錄.<6-2>將pRSybjE導(dǎo)入到嗜甲基菌屬細(xì)菌中通過電穿孔(CanadianJournalofMicrobiology,43,197(1997))將如上所迷獲得的pRSybjE導(dǎo)入到食甲基嗜甲基菌AS1菌林(NCIMB10515)中.此外,還將pRS導(dǎo)入到AS1菌林中作為對(duì)照.根據(jù)鏈審素抗性獲得pRSybjE和pRS的轉(zhuǎn)化體.將帶有pRS或pRSybjE的食甲基嗜甲基菌AS1菌林(ASl/pRS,ASl/pRSybjE)平鋪到含有20mg/L鏈審素的SEII平皿上并在37°C培養(yǎng)過夜.然后,從0.3112的培養(yǎng)基表面上刮下細(xì)胞,接種到含有20mg/L鏈審素的SEH生產(chǎn)培養(yǎng)基(20mL)中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)34小時(shí).在完成培養(yǎng)之后,通過離心除去細(xì)胞,通過使用氨基酸分析儀(N他onBunko,高效液相色詳法)測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的L-賴氨酸濃度.結(jié)果在表3中示出,表3菌林L-賴氨酸的生產(chǎn)量(g/L)L-精氨酸的生產(chǎn)量(g/L)ASl/pRS<0.01<0.01ASl/pRSybjE0.700.14作為姊y五基因的擴(kuò)増的結(jié)果,與對(duì)照ASl/pRS菌林相比,積累的L-賴氨酸和L-精氨酸數(shù)重明顯増加了.罔而,表明了fW五也在食甲基嗜甲基菌中的堿性L-氨基酸榆出方面起作用實(shí)施例7:評(píng)估食甲基嗜甲基菌,在其中導(dǎo)入了編碼二氬吡啶二羧酸合酶反饋抑制釋放型的基因和姊乂五基因由于發(fā)現(xiàn)在食甲基嗜甲基菌ASl菌抹中導(dǎo)入y々/五基因促進(jìn)了L-賴氨酸的榆出,嘗試在導(dǎo)入了^y五基因的菌抹中増強(qiáng)L-賴氨酸生物合成醉的活性來進(jìn)一步改善L-賴氨酸生產(chǎn).<7-1>構(gòu)建含有編碼對(duì)L-賴氨酸反饋抑制有抗性的二氬吡啶二羧酸合酶的基因的質(zhì)粒pRSdapA根據(jù)附困2所示的構(gòu)建方案制備含有編碼對(duì)L-賴氨酸反饋抑制有抗性的二氬吡啶二羧酸合醉的基因(以下稱為的質(zhì)粒.在實(shí)施例6中制備的pRStac用Sse83871和Xbal消化,與苯紛/氯仿溶液混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醇沉淀收集DNA,在0.8%瓊脂糖凝膠上分離.結(jié)果,收集到約8.2kbp的DNA片段.使用含有</"/"*基因的質(zhì)粒RSFD80(參見美國(guó)專利6,040,160)作為模板和具有SEQIDNOS:14和15的引物進(jìn)行PCR(在94°C變性20秒、在55°C退火30秒,在72°C延長(zhǎng)反應(yīng)60秒)來擴(kuò)増基因片段.使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio)進(jìn)行PCR,使用PCRpr印(Promega)純化獲得的|/<伊^*片段,然后用限制性內(nèi)切酶Sse8387I和Xbal消化.然后,反應(yīng)混合物與苯酚/氣仿溶液混合以終止反應(yīng).在對(duì)反應(yīng)混合物離心之后,收集上層,通過乙醇沉淀收集DNA并在0.8%瓊脂糖凝膠上分離,結(jié)果,收集到約1.0kbp的DNA片段.如上所述制備的pRStac栽體消化產(chǎn)物和&/^*基因區(qū)域片段使用DNA連接試劑盒Ver.2(TakaraBio)相互連接.這個(gè)連接反應(yīng)溶液用于轉(zhuǎn)化大煬桿菌(大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,TakaraBio).將細(xì)胞平鋪在含有20mg/L鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37。C孵化過夜,出現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落各自接種到含有20mg/L鏈審素的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí).通it^-SDS方法從每個(gè)培養(yǎng)肉湯中提取質(zhì)粒DNA,通過用限制性內(nèi)切酶消化和DNA測(cè)序來確認(rèn)每個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),以選擇pRSdapA質(zhì)粒.在pRSdapA質(zhì)粒中,放置^/^*基因使得其按照與似c啟動(dòng)子相同的方向轉(zhuǎn)錄.用pRSdapA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌JM109菌林被稱為AJ13831,這個(gè)菌林于2001年6月4日被保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu),國(guó)家高級(jí)工業(yè)科技學(xué)會(huì),國(guó)際專利保藏機(jī)構(gòu),收到的登記號(hào)是FERMP-18370.之后,于2002年5月13日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏,收到的登記號(hào)是FERMBP-8041.因此,pRSdapA質(zhì)粒也可以從這個(gè)菌林獲得.<7-2>含有;^^和血!^*的質(zhì)粒的構(gòu)建為了評(píng)估>^/五和"《/"*的組合的影響,根據(jù)附田5所示的方法來構(gòu)建通過將j^/五基因插入到pRSdapA質(zhì)粒獲得的質(zhì)粒.實(shí)施例6中制備的pRSybjE用限制性內(nèi)切睞Sapl消化,使用DNABlunting試刑盒(TakaraBio)進(jìn)行末端鈍化.此外,質(zhì)粒pRSdapA用EcoRI和Sapl消化,在0.8%瓊脂糖凝膠上分離含有似c啟動(dòng)子和&/"*區(qū)域的約1kbp片段并用EASYTRAPVer.2(TakaraBio)收集.按照如上所述相同的方法對(duì)這個(gè)片段進(jìn)行末端鈍化,使用DNA連接試劑盒Ver.2(TakaraBio)與上述pRSybjE的消化產(chǎn)物連接,這個(gè)連接反應(yīng)溶液用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,TakaraBio)將細(xì)胞平鋪在含有20mg/L鏈審素的LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37°C孵化過夜.出現(xiàn)在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落各自接種到含有20mg/L鏈審素的LB液體培養(yǎng)基中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)8小時(shí).通過堿-SDS方法從所述培養(yǎng)肉湯中提取質(zhì)粒DNA,通過用限制性內(nèi)切醉消化和DNA測(cè)序來確認(rèn)所迷質(zhì)粒的結(jié)構(gòu),以選擇pRSybjEdapA質(zhì)粒.在這個(gè)質(zhì)粒中,定位J7矽五基因幽/^*基因使得它們相互之間的按相同方向轉(zhuǎn)錄.通過電穿孔分別將如上所述獲得的pRSybjEdapA以及pRSybjEpRSdapA和對(duì)照質(zhì)粒pRS導(dǎo)入食甲基嗜甲基菌AS1菌林(NCIMB10515)<7-3>通過攜帶3^/五和&/^*的嗜甲基菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-賴氨酸如上所述獲得的導(dǎo)入pRSybjEdapA、pRSybjE、pRSdapA或pRS的每個(gè)AS1菌林平鋪在含有20mg/L鏈審素的SEII平皿上并在37°C培養(yǎng)過夜.然后,從0.3112的培養(yǎng)基表面上刮下細(xì)胞,接種到含有20mg/L鏈審素的SEII生產(chǎn)培養(yǎng)基(20mL)中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng)34小時(shí).在完成培養(yǎng)之后,通過離心除去細(xì)胞,通過使用氨基酸分析儀(NihonBunko,高效液相色讒法)測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的L-賴氨酸濃度.結(jié)果在表4中示出.與僅導(dǎo)入pRSdapA或pRSybjE的菌^M百比,導(dǎo)入了pRSybjEdapA的菌林顯示了升高的L-賴氨酸積累,因而,發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)基因和&/"*基因的表達(dá)在L-賴氨酸生產(chǎn)上具有協(xié)同效應(yīng).表4<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例8:>^/五擴(kuò)增對(duì)賴氨酸類似物抗性的影響然后,檢查y^五基因擴(kuò)增對(duì)賴氨酸類似物抗性的影響.將攜帶ASl/pRSybjE或?qū)φ誴RS的上述食甲基嗜甲基菌AS1菌林各自在含有20mg/L鏈審素的SEII培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜.將每個(gè)培養(yǎng)物以10%的體積接種到新鮮SEII培養(yǎng)基(含有20mg/L的鏈審素沖,并在37°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)直到細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.將每個(gè)培養(yǎng)物以4%的體積接種到含有20mg/L鏈霉素和0、3或5g/L的S-(2-氨乙基)半胱氨酸(AEC)的SEII培養(yǎng)基中,在37°C搖動(dòng)培養(yǎng),在培養(yǎng)期間,每30分鐘測(cè)量660nm的OD值來檢查菌林的AEC抗性程度.結(jié)果在附困6中示出.使用Advantec生產(chǎn)的生物困象記錄儀TN-1506來測(cè)量抗性的程度,將5mL培養(yǎng)物放入試管中并進(jìn)行分析,結(jié)果在附困6中示出.結(jié)果,在添加AEC的情況下,AS1pRSybjE菌抹沒有觀察到生長(zhǎng)延遲,二ASl/pRS菌抹的生長(zhǎng)被顯著地延遲.因而,這揭示了j^/五基因的擴(kuò)增不僅賦予了L-賴氨酸抗性,還賦予了L-賴氨酸類似物抗性.實(shí)施例9:>^/£擴(kuò)增對(duì)L-蘇氨酸生產(chǎn)的影響大麻埃希氏菌B-5318菌林(EP0593792)被用作起始菌林.用如實(shí)施例2描述的質(zhì)粒pSYBJEl或?qū)φ召|(zhì)粒pSTV28(TakaraBio)轉(zhuǎn)化B-5318菌林以獲得氣莓素抗性菌林.在序列測(cè)定之后,可以逸擇B-5318/pSYBJEl菌林和B-S318/pSTV28菌林.這些菌林在含有50mg/L氦審素的L-培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)直到OD600變成約0,6.培養(yǎng)物與相同數(shù)量的40%甘油溶液混合,分成各自具有適合的體積的部分,保存在-80。C.解凍甘油貯備液,將它的100ml均一地接種到含有50mg/L氣霉素的L-平皿上,在37。C孵化24小時(shí),然后,從約八分之一的培養(yǎng)基表面收集細(xì)胞,接種到L-蘇氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中,在37。C搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí).在完成培養(yǎng)之后,通過離心除去細(xì)胞,通過常規(guī)方法測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的L-蘇氨酸濃度.從而,可以獲得在其中擴(kuò)増了yW五基因和具有增強(qiáng)的L-蘇氨酸生產(chǎn)能力的菌林實(shí)施例10:在。o;"e/om細(xì)菌中^7五基因擴(kuò)増的影響<10-1>用于^矽五基因擴(kuò)增的質(zhì)粒的構(gòu)建如實(shí)施例2描述的pSYBJE2用EcoRI和Pstl消化,將消化的片段連接到已經(jīng)用相同的酶消化的pVK7(US20030175912)上.獲得的質(zhì)粒稱為pVYBJEl.〈10-2〉^y五基因擴(kuò)增對(duì)使用G^/K/iww細(xì)菌生產(chǎn)L-賴氨酸的影響谷氨酸棒桿菌(乳發(fā)酵短桿菌)ATCC13861菌林被用作起始菌林.用質(zhì)粒pVYBJEl或?qū)φ召|(zhì)粒pVK7轉(zhuǎn)化ATCC13861菌林以獲得卡那審素抗性菌林.在序列測(cè)定之后,選擇ATCC13861/pVYBJEl菌林和ATCC13861/pVK7菌林,這些菌林在含有25mg/L卡那審素的M-CM2S培養(yǎng)基中在31.5°C培養(yǎng)直到OD600變成約0.6.培養(yǎng)物與等量的40%甘油溶液混合,分成各自具有適合的體積的部分,保存在-80。C.解凍甘油貯備液,將它的100ml均一地接種到含有25mg/L卡那審素的M-CM2S平皿上,在31,5。C孵化M小時(shí).然后,從約八分之一的培養(yǎng)基表面收集細(xì)胞,接種到含有25mg/L卡那審素的加ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,在31.5。(115卬111搖動(dòng)培養(yǎng)42小時(shí).在完成培養(yǎng)之后,通過離心除去細(xì)胞,通過使用說otechAnalyzerAS210(SakuraSeiki)測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的L-賴氨酸濃度.在培養(yǎng)42小時(shí)后,在培養(yǎng)基中的所有葡萄糖都被完全地消耗.結(jié)果在表5中示出.與對(duì)照ATCC13861/pVK7菌林相比,在其中擴(kuò)增了^W五基因的ATCC13861/pVYBJEl能夠引起L-賴氨酸更高數(shù)量的積累.發(fā)現(xiàn),J^/五基因在。OTie/oiw細(xì)菌中的L-氨基酸輸出和增強(qiáng)L-賴氨酸生產(chǎn)方面也起到作用.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>^y五基罔擴(kuò)增對(duì)高濃度L-氨基酸下生長(zhǎng)的影響用包括J^/五基因的pSYBJEl或?qū)φ召|(zhì)粒pTSV28(TakaraBio)轉(zhuǎn)化大煬埃希氏菌MG1655菌林(ATCC47076),此外,還用包括突變yA/五基因的pSYJEl*2-l轉(zhuǎn)化MG1655菌抹,所迷突變Wy五基因具有SEQIDNO:l的序列,其中第三位置的核苷酸(鳥嘌呤)被替換為腺嚷呤.根據(jù)氣審素抗性選擇導(dǎo)入了這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體,選出的菌林分別稱為MG1655/pSYJEl、MG1655/pSYJEl*2-l和MG16S5/pSTV28.pSYJEl*2-l如下構(gòu)建.通過各自具有SEQIDNOS:5或6的序列的引物從co/,'的L-賴氨酸生產(chǎn)NVC578菌林的染色體DNA進(jìn)行PCR,來擴(kuò)增突變^y五基因.對(duì)擴(kuò)增的DNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)具有SEQIDNO:l的序列,在其中笫三位置的核苷酸(烏嘌呤)被替換為腺嘌呤.擴(kuò)增的DNA與用Smal消化的pTV28連接,挑選出其中放置了突變yA乂五基因、因而由toc啟動(dòng)子表達(dá)的質(zhì)粒,稱為pSYJEl*2-l.也可以使用例如重疊延伸PCR的方法(NucleicAcidsRes,25,2227-8.1997),通過向野生型y々/五基因中導(dǎo)入突變來獲得突變y矽五基因,其中用引物之一具有核苷酸替換的引物來擴(kuò)增突變基因然后,檢查在各自存在高濃度的L-氨基酸的情況下,MG1655/pSYJEl、MG1655/pSYJEl*2-l和MG1655/pSTV28菌林的生長(zhǎng).這些菌抹在含有50mg/L氣霉素的5mlL-培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)約6小時(shí).在培養(yǎng)基的OD600達(dá)到約l.O時(shí),培養(yǎng)物進(jìn)行離心,用M9基本培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,以O(shè)D600-0.05接種到含有50mg/L氯審素和各自的L-氨基酸(12g/L異亮氨酸、40g/L蘇氨酸、15g/L谷氨酸鈉、30g/L鹽酸組氨酸、45g/L,烏氨酸氳氣化物、卯g/L鹽酸精氨酸、8g/L苯丙氨酸、85g/L脯氨酸或0.3g/L半胱氨酸)的M9基本培養(yǎng)基中,培養(yǎng)70小時(shí).選擇L-異亮氨酸作為脂肪族L-氨基酸的代表,選擇L-蘇氨酸作為羥基L-氨基酸的代表,選擇L-脯氨酸作為環(huán)形L-氨基酸的代表,選摔L-苯丙氨酸作為芳香族L-氨基酸的代表,選擇L-半胱氨酸作為含疏的L-氨基酸的代表,選擇L-谷氨酸作為脧性L-氨基酸和它們的耽胺的代表.結(jié)果在附困7-15中示出,發(fā)現(xiàn),在存在高濃度的L-氨基酸、特別是L-精氨酸、L-烏氨酸、L-異亮氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸和L-半胱氨酸的情況下,《^/五基因擴(kuò)增改善了MG1655菌抹的生長(zhǎng).還發(fā)現(xiàn),突變姊歷基閎比野生型W/B基因更有效地給MG1655菌林賦予了氨基酸抗性.實(shí)施例12:具有SEQIDNO:1核苷酸編號(hào)49-948的核苷酸序列的^A/五基因的影響使用具有SEQIDNO:13或12的核苷酸序列的引物進(jìn)行PCR從MG1655菌林的染色體DNA擴(kuò)增j^五基因,其具有SEQIDNO:1的核苷酸編號(hào)49-948的核苷酸序列(在下文中稱為ybjE-900).還使用具有SEQIDNO:11或12的核苷酸序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增了^A/五基因,其具有SEQIDNO:1的核苷酸編號(hào)1-948的核苷M列,其中位置1的烏嘌呤被替換為腺嘌呤(在下文中稱為ybjE-948).對(duì)從每個(gè)反應(yīng)獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,各自與Smal消化的pTV28栽體(TakaraBio)連接,從而獲得用于擴(kuò)增ybjE-900基因或ybjE-948基因的質(zhì)粒.挑選其中放置了ybjE-900基因、罔而由toc啟動(dòng)子表達(dá)的質(zhì)粒,稱為pSYBJE卯0,和挑選其中放置了ybjE-948基因、因而由toc啟動(dòng)子表達(dá)的質(zhì)粒,稱為pSYBJE948.用pSYBJE900、pSYBJE948、用于實(shí)施例2的pSYBJEl或?qū)φ召|(zhì)粒pSTV28轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌MG1655菌抹(ATCC47076).根據(jù)氣審素抗性選掙導(dǎo)入了這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體,選出的菌林分別稱為MG1655/pSYBJE900、MG1655/pSYBJE948、MG1655/pSYJEl和MG1655/pSTV28.然后,檢查在存在高濃度的L-氨基酸的情況下,MG1655/pSYBJE900、MG1655/pSYBJE948、MG1655/pSYJEl和MG1655/pSTV28菌林的生長(zhǎng).這些菌林在含有50mg/L氣審素的3mlL-培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)約6小時(shí).在培養(yǎng)基的OD600變成約l.O之后,對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心,細(xì)胞用M9基本培養(yǎng)基洗涂?jī)纱危設(shè)D600=0.05接種到含有50mg/L氯莓素和80g/L鹽酸賴氨酸的M9基本培養(yǎng)基中,培養(yǎng)約20小時(shí).結(jié)果在附困16中示出.發(fā)現(xiàn),在存在高濃度L-賴氨酸的情況下,在早期生長(zhǎng)期以及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,ybjE-900基因的擴(kuò)增改善了MG1655菌林的生長(zhǎng),達(dá)到與和包含在pSYJEl中的W乂五基因幾乎相同的程度.這些數(shù)據(jù)表明,在神W基因的序列(SEQIDNO:1)中核苷酸編號(hào)49-948的序列足以發(fā)揮它們的L-氨基酸輸出效果.工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明,可以通過發(fā)酵有效地生產(chǎn)L-氨基酸,特別是L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-膽氨酸、L-精氨酸、L-烏氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氦酸和L-谷氨酸.L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-脯氨酸作為動(dòng)物飼料添加刑、健康食品的成分和氨基酸注射液是有用的.L老氨酸和L-烏氨酸作為肝功能促進(jìn)刑、氨基酸注射液和全面氨基酸制品的成分是有用的.L-組氨酸作為肝功能促進(jìn)刑和作為組胺的前體是有用的.L-苯丙氨酸作為甜味刑的前體是有用的.權(quán)利要求1.具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物,其中所述微生物被修飾從而ybjE基因的表達(dá)被增強(qiáng)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物,其中通過提高所述J^/五基因的拷貝數(shù)目,或通過修飾所述J^/五基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列增強(qiáng)了所述基因的表達(dá).3.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物,其中由所述^^五基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列選自SEQIDNO:2、9和10,其中所述蛋白質(zhì)具有L-氨基酸輸出能力.4.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物,其中所迷^y五基因選自(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的DNA;和(b)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的核苷酸序列或與可從SEQIDNO:l的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA,并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì).5.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物,其中所述j^/五基因選自(a)具有SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列的DNA;和(b)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列或與可從SEQIDNO:1中核苷酸編號(hào)49到948的核苷酸序列制備的探針可雜交的DNA,并且其中所述DNA編碼具有L-氨基酸輸出能力的蛋白質(zhì).6.根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的微生物,其中所述微生物的所述L-氨基酸輸出能力通過所述增強(qiáng)所述^W五基因的表達(dá)來提高7.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的微生物,其中所述微生物對(duì)L-氨基酸或L-氨基酸類似物的抗性通過所述増強(qiáng)所述基因的表達(dá)來提高.8.根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的微生物,其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-烏氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-膽氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸和L-谷氨酸.9.根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的微生物,其中所述微生物屬于腸桿菌家族.10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物,其中所迷屬于腸桿菌科家族的微生物是屬于埃希氏菌屬的微生物.11.根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的微生物,其中所述微生物是Coi^we/o/w細(xì)菌12.根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的微生物,其中所述微生物是甲醇同化細(xì)菌.13.根據(jù)權(quán)利要求12的微生物,其中所述甲醇同化細(xì)菌是屬于嗜甲基菌屬或甲基菌屬的微生物.14.生產(chǎn)L-氨基酸的方法,包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的微生物來產(chǎn)生和引起所述L-氨基酸的積累,并從所迷培養(yǎng)基或所述微生物收集所述L-氨基酸.15.生產(chǎn)L-氨基酸的方法,包括在含有曱醇作為主要破源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12或13的微生物來產(chǎn)生和引起所述L-氨基酸的積累,并從所述培養(yǎng)基或所述微生物收集所述L-氡基酸.16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法,其中所述L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-精氨酸、L-烏氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氡酸、L-半胱氛酸和L-谷氨酸.全文摘要通過培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力、但被修飾以使ybjE基因的表達(dá)被增強(qiáng)的微生物,來生產(chǎn)L-氨基酸。從培養(yǎng)基或從微生物收集L-氨基酸。文檔編號(hào)C12P13/04GK101243177SQ20058000139公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2005年1月28日優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日發(fā)明者中井勇太,城永祐志,植田拓嗣,瀧川里繪,郡司義哉申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社
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