專利名稱：原人參二醇衍生物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及原人參二醇衍生物及其制備方法，以及該衍生物的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，研究和開發(fā)抗腫瘤藥物一直是醫(yī)藥領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。迄今為止，臨床上常用的主流抗腫瘤藥物大多來源于天然藥物，或以天然藥物為先導(dǎo)化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后得到的產(chǎn)物。如植物來源的長春新堿，鬼臼毒素改造的依托泊甙，以及風(fēng)靡世界的紫杉醇等，這表明天然產(chǎn)物仍然是抗腫瘤藥物的一個重要來源。
人參是著名的中藥，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥體系中占據(jù)了重要的地位。由于其療效確切，活性多樣，一直是研究的熱點(diǎn)。近年來，針對人參中主要活性成分人參皂苷進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物具有良好的抗腫瘤作用，無論是體外細(xì)胞試驗(yàn)，還是流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果均表明此類化合物具有抗腫瘤和降低腫瘤風(fēng)險的活性。值得注意的是，體外試驗(yàn)結(jié)果表明，原人參二醇作用優(yōu)于人參皂苷。但是，原人參二醇屬于四環(huán)三萜類化合物，缺乏活潑基團(tuán)，反應(yīng)位點(diǎn)較少，采用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)方法難以制備出滿足要求的衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類原人參二醇衍生物及其制備方法。
本發(fā)明所提供的原人參二醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為式I， (式I)其中，R1為-OH或H；R2為-CH3或-CH2OH；R3為-CH3或-CH2OH。
更具體地，本發(fā)明的原人參二醇衍生物為結(jié)構(gòu)式為式II、式III或式IV的化合物。
(式II) (式III) (式IV)本發(fā)明原人參二醇衍生物的制備方法，包括如下步驟1)發(fā)酵培養(yǎng)微生物，向培養(yǎng)基中加入原人參二醇，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體后得到發(fā)酵液，所述微生物為小克銀漢霉(Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，鏈格孢(Alternaria)，犁頭霉(Absidia)，紅酵母(Rhodotorula)，共頭霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)屬的菌株；2)將所述發(fā)酵液經(jīng)萃取后，蒸干萃取液，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)?)將所述轉(zhuǎn)化物殘?jiān)怨枘z柱純化，所述硅膠柱純化采用氯仿-乙酸乙酯兩相系統(tǒng)梯度洗脫，收集合并組分；4)將所述組分用反相高效液相色譜純化，得到產(chǎn)物。
其中，微生物優(yōu)選為共頭霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)屬；步驟1)培養(yǎng)基中原人參二醇的濃度為2-2000μg/mL。
本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明原人參二醇衍生物的用途。
本發(fā)明發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的原人參二醇衍生物具有良好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的活性成分。
這些抗腫瘤藥物的活性成分可以是選自結(jié)構(gòu)式為式I，特別是式II、式III和式IV的化合物中的一種或幾種。
在以原人參二醇衍生物為活性成分的藥物中，需要的時候還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對原人參二醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了多種新型化合物，通過體外抗腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，這些化合物具有較好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的活性成分，具有廣泛的用途。


圖1為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的色譜圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、結(jié)構(gòu)式為式II、式III和式IV的化合物的制備本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化方法，以原人參二醇為原料，經(jīng)過發(fā)酵、提取、分離等步驟，來制備本發(fā)明化合物。具有轉(zhuǎn)化能力的微生物包括銀漢霉(Cunninghamella，毛霉(Mucor)，鏈格孢(Alternaria)，犁頭霉(Absidia)，紅酵母(Rhodotorula)，共頭霉(Syncephalastrum)或根霉(Rhizopus)屬的微生物；其中轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的是共頭霉(Syncephalastrum)和根霉(Rhizopus)屬的菌株。這些菌株均可以購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)或中國食品發(fā)酵研究所工業(yè)微生物保藏管理中心(CICC)，于固體斜面培養(yǎng)基上置4℃冰箱內(nèi)保存。真菌培養(yǎng)選用馬鈴薯培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)選用LB培養(yǎng)基。
馬鈴薯培養(yǎng)基的配制(PDA培養(yǎng)基)取200g去皮馬鈴薯，切成薄片，放入適量水中，煮沸后80℃保溫1h。用雙層紗布過濾后取濾液，加入20g葡萄糖，攪拌使葡萄糖完全溶解，以水定容至1000ml。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入3％瓊脂。
細(xì)菌培養(yǎng)基的制備(LB培養(yǎng)基)每1000mL液體培養(yǎng)基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，調(diào)pH值至7.0。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂。
以華根霉Rhizopus chinensis CICC 3043為例，制備結(jié)構(gòu)式為式II、式III、式IV的化合物的過程如下1、發(fā)酵、轉(zhuǎn)化以及萃取將華根霉Rhizopus chinensis CICC 3043接入4個250mL三角瓶(裝有100mL馬鈴薯培養(yǎng)基)中，作為種子液。于搖床上160rpm、25℃下振蕩培養(yǎng)1天后，待菌絲生長處于旺盛期，用無菌移液管吸取5mL的種子液，加入20個1000mL搖瓶(裝有400mL馬鈴薯培養(yǎng)基)中。振蕩培養(yǎng)1天后，每個搖瓶中加入20mg原人參二醇(0.2mL，100mg/mL MeOH溶液)，共用400mg底物。相同條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化5天，將發(fā)酵液過濾，濾除菌絲體，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)s1.5g。
2、硅膠柱純化將所得殘?jiān)苡谏倭考状?，與2.5g柱色譜硅膠(200-300目)混合拌樣，自然干燥，加至裝有60g硅膠(200-300目)的色譜柱頂，用氯仿-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(6∶1→1∶8)，收集洗脫組分，采用TLC分析方法(硅膠G薄層板，氯仿-乙酸乙酯(5∶5)展開，10％硫酸乙醇溶液噴霧，加熱顯色)將所得到的相似洗脫組分合并。
3、反相高效液相色譜純化合并組分用反相高效液相色譜分析、純化。分析條件為色譜柱YMC ODS-A 5μm，4.6mmI.D×250mm(日本YMC公司)，洗脫系統(tǒng)為乙腈-水梯度洗脫，具體配比為30分鐘內(nèi)乙腈-水由(30∶70，V/V)變?yōu)?100∶0，V/V)，并維持100％的乙腈10min；41分鐘再次變?yōu)橐译?水(30∶70，V/V)并維持10min。流速為0.7ml/min。檢測波長為203nm，參比波長為360nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的色譜圖如圖1所示制備條件為半制備用色譜柱YMC ODS-A 5μm，10mm I.D×250mm(日本YMC公司)，乙腈-水(40∶60v/v)，流速1.0mL/min，檢測波長203nm。得到結(jié)構(gòu)式為式II、式III、式IV的化合物等3個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
化合物II，12-羰基-7β，15α-二羥基-20(S)-原人參二醇[12-oxo-7β，15α-dihydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色無定形粉末HR-FT-ICR MS(m/z)calculated for C30H50O5Na[M+Na]+513.3550；found513.3545；其1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)如表1所示。
化合物III，12-羰基-7β-羥基-20(S)-原人參二醇[12-oxo-7β-hydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色無定形粉末HR-FT-ICR MS(m/z)497.3595[M+Na]+(calculated for C30H50O4Na[M+Na]+，497.3709)。
化合物IV，12-羰基-7β，27-二羥基-20(S)-原人參二醇[12-oxo-7β，27-dihydroxyl-20(S)-protopanaxadiol]，白色無定形粉末HR-FT-ICR MS(m/z)513.3548[M+Na]+(calculated for C30H50O5Na[M+Na]+，513.3550)。
化合物III和化合物IV的1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)如表2所示。
表1.化合物II的氫譜與碳譜數(shù)據(jù)(C5D5N)

表2.化合物II和化合物IV的氫譜與碳譜數(shù)據(jù)

以上結(jié)果表明，所得化合物結(jié)構(gòu)正確。
利用前述其他屬的微生物，具體如總狀共頭霉Syncephalastrum racemosum AS3.264、藍(lán)色犁頭霉Absidia coerulea AS 3.3389、刺囊毛霉Mucor spinosus AS 3.3450，均可以采用與上相同的過程來制備化合物II、III和IV。
實(shí)施例2、本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性
1、實(shí)驗(yàn)材料儀器與試劑酶標(biāo)儀為TECAN多孔分光光度計(jì)(U.S.A)；CO2氣體培養(yǎng)箱為BB5060型紫外清潔型CO2培養(yǎng)箱(Heraeus Co.)；高速冷凍離心機(jī)為TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(上?？茖W(xué)儀器廠)。所用化學(xué)試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑廠)；細(xì)胞培養(yǎng)基分別購自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO，USA)和Hyclone公司(Logan，Utah，USA)測試用腫瘤細(xì)胞株HL-60，人白血病細(xì)胞(human leukemia cells)，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。
測試樣品原人參二醇(PD)及實(shí)施例1所合成得到的化合物II-IV，純度在90％以上；同時，選取順鉑為陽性對照藥物，各化合物均以DMSO溶解后稀釋。
2、實(shí)驗(yàn)方法采用MTT法測定各受試化合物對腫瘤細(xì)胞株的半數(shù)抑制率IC50值取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液配成2×104的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2、95％濕度條件下培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的受試樣品，使終濃度為0.1-100μM，再繼續(xù)培養(yǎng)72h。按MTT法于酶標(biāo)儀上570nm測定吸收值。每個濃度設(shè)三個平行孔。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)MTT法測試結(jié)果，計(jì)算原人參二醇(PD)及本發(fā)明化合物II-IV對HL-60細(xì)胞的IC50值，結(jié)果如表3所示。
表3.測試樣品體外細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物II-IV具有良好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的活性成分。
權(quán)利要求
1.具有式I結(jié)構(gòu)的原人參二醇衍生物， (式I)其中，R1為-OH或H；R2為-CH3或-CH2OH；R3為-CH3或-CH2OH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原人參二醇衍生物，其特征在于所述原人參二醇衍生物為結(jié)構(gòu)式為式II、式III或式IV的化合物。 (式II) (式III) (式IV)
3.權(quán)利要求1所述原人參二醇衍生物的制備方法，包括如下步驟1)發(fā)酵培養(yǎng)微生物，向培養(yǎng)基中加入原人參二醇，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體后得到發(fā)酵液，所述微生物為小克銀漢霉，毛霉，鏈格孢，犁頭霉，紅酵母，共頭霉或根霉屬的菌株；2)將所述發(fā)酵液經(jīng)萃取后，蒸干萃取液，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)?)將所述轉(zhuǎn)化物殘?jiān)怨枘z柱純化，所述硅膠柱純化采用氯仿—乙酸乙酯兩相系統(tǒng)梯度洗脫，收集合并組分；4)將所述組分用反相高效液相色譜純化，得到產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述得到的產(chǎn)物為結(jié)構(gòu)式為式II、式III或式IV的化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于所述微生物為共頭霉或根霉屬的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述培養(yǎng)基中原人參二醇的濃度為2-2000μg/mL。
7.以權(quán)利要求1所述原人參二醇衍生物為活性成分的抗腫瘤藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述活性成分選自結(jié)構(gòu)式為式II、式III和式IV化合物中的一種或幾種。
9.權(quán)利要求1所述原人參二醇衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類原人參二醇衍生物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的原人參二醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為式I，其中，R
文檔編號C12P33/00GK1830995SQ20051005361
公開日2006年9月13日 申請日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月9日
發(fā)明者郭洪祝, 田茵, 果德安 申請人:北京大學(xué)