人參二醇衍生物在制備預(yù)防或治療肝病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人參二醇衍生物在制備預(yù)防或治療肝病藥物中的 應(yīng)用，更具體的涉及人參二醇衍生物在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是由各種致病因素導(dǎo)致肝損傷后，肝星狀細(xì)胞被激活成為具有很強(qiáng)的生 成細(xì)胞外基質(zhì)能力的肌成纖維樣細(xì)胞，繼而膠原酶抑制物生成增多，膠原酶活性也下降，使 肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解間比例失衡，最終導(dǎo)致肝臟膠原的過(guò)度沉積成為肝纖維化。 肝纖維化繼續(xù)惡化導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌，所以"肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌"這一鏈條 被公認(rèn)為是各種慢性肝病導(dǎo)致嚴(yán)重后果的共同途徑。迄今的研究已經(jīng)證實(shí)肝纖維化經(jīng)過(guò)適 當(dāng)?shù)闹委熓强梢阅孓D(zhuǎn)的，只要能夠減緩或阻止肝纖維化的發(fā)生，就可以減輕或治愈肝臟損 傷病理進(jìn)程。因此，抑制肝星狀細(xì)胞的活化是治療肝纖維化的最有效途徑。
[0003] 我國(guó)近年來(lái)廣泛開展了中醫(yī)藥抗肝纖維化的研究。植物藥、中藥復(fù)方或動(dòng)物藥，展 示了天然藥物用于肝纖維化治療的巨大潛力。因此，繼續(xù)從天然藥物中尋找和研制高效低 毒的抗肝纖維化藥物仍是藥學(xué)工作者的一個(gè)重要研究方向。人參二醇（PD)是人參皂苷酸 水解后的主要產(chǎn)物，具有較好的抗腫瘤活性。但是，人參二醇屬于四環(huán)三萜類化合物，缺乏 活潑基團(tuán)，反應(yīng)位點(diǎn)少，采用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)方法難以制備出滿足要求的衍生物。
[0004] 微生物轉(zhuǎn)化是利用生物體自身特異性的酶體系進(jìn)行的酶催化反應(yīng)，反應(yīng)的類型 多，并具有高度立體及區(qū)域選擇性，成為了有機(jī)合成中的一個(gè)重要工具。將其用于人參二醇 的衍生物制備，能為該類型化合物的后續(xù)研究提供大量樣本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供人參二醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽在在制備預(yù)防或治療 肝病藥物中的應(yīng)用，所述肝病為與肝纖維化有關(guān)的疾病，如慢性肝炎、肝硬化或肝癌。所述 藥物為抗肝纖維化藥物。所述人參二醇衍生物為結(jié)構(gòu)式為1-8的化合物：
化合物3,4, 5、6、7和8為本發(fā)明首次公開的人參二醇新衍生物。
[0006] 本發(fā)明還提供了上述人參二醇衍生物的制備方法，包括如下步驟：1)發(fā)酵培 養(yǎng)微生物，向培養(yǎng)基中加入人參二醇，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體后得到發(fā)酵液，所 述微生物為犁頭霉（Absidia)，小克銀漢霉（Cunninghamella)，毛霉（Mucor)，鏈格孢 (Alternaria)，紅酵母（Rhodotorula)，共頭霉（Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)屬的 菌株；2)將所述發(fā)酵液經(jīng)萃取后，蒸干萃取液，得到轉(zhuǎn)化粗提物；3)將所述轉(zhuǎn)化粗提物以硅 膠柱層析，采用二氯甲烷-無(wú)水乙醇系統(tǒng)，收集合并組分；4)將所述組分用反相高效液相 色譜純化，得到產(chǎn)物。
[0007] 其中，微生物優(yōu)選為犁頭霉（Absidia)或毛霉（Mucor)屬菌株，更優(yōu)選傘枝犁頭 霉。上述方法步驟1)中培養(yǎng)基中人參二醇的濃度為2-2000yg/mL。
[0008] 上述方法步驟2)中萃取溶劑為常規(guī)機(jī)型有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。
[0009] 上述方法步驟3)優(yōu)選反相高效液相色譜制備條件為半制備用色譜柱Hedera ClsA-5ym，10. 01.DX250mm(江蘇漢邦科技），乙腈-水（68:32,V/V)，流速 3.OmL/min，檢測(cè) 波長(zhǎng)203nm。
[0010]文獻(xiàn)PhytochemistyLetters2009, 2, 63-66 和Bioorganic&Medicinal Chemistry2009, 17(8)，3003-3010公開了制備化合物1和2的方法。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所述人參二醇衍生物具有良好的抗肝纖維化活性， 可以作為抗肝纖維化藥物的活性成分。
[0012] 這些抗肝纖維化藥物的活性成分可以是選自人參二醇及結(jié)構(gòu)式1-8的化合物中 的一種或幾種。
[0013] 在以上述化合物為活性成分的藥物中，需要的時(shí)候還可以加入一種或多種藥學(xué)上 可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩 解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制 備。
[0014] 本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對(duì)人參二醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一類新 的人參二醇衍生物，通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外抗肝纖維化細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，這些化合物具有 較好的抗肝纖維化活性，可以作為抗肝纖維化藥物的活性成分，具有廣泛的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明所述化合物3-8的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1、結(jié)構(gòu)式為1-8的化合物的制備 參照文獻(xiàn)PhytochemistyLetters2009, 2, 63-66 和Bioorganic&Medicinal Chemistry2009, 17(8)，3003-3010公開的方法制備化合物1和2。
[0017] 本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化方法，以人參二醇為原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、提取、分離等步 驟，來(lái)制備本發(fā)明化合物。具有轉(zhuǎn)化能力的微生物包括：犁頭霉（Absidia)，小克銀漢霉 (Cunninghamella)，毛霉（Mucor)，鏈格抱（Alternaria)，紅酵母（Rhodotorula)，共頭 霉（Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)屬的微生物；其中轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的是犁頭霉 (Absidia)和毛霉（Mucor)屬的菌株。這些菌株均可以購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏管 理中心（CGMCC)或中國(guó)食品發(fā)酵研究所工業(yè)微生物保藏管理中心（CICC)，于固體斜面培養(yǎng) 基上置4°C冰箱內(nèi)保存。真菌培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基。
[0018]馬鈴薯培養(yǎng)基的配制（PDA培養(yǎng)基）：取200g去皮馬鈴薯，切成薄片，放入適量水 中，煮沸后80°C保溫Ih。用雙層紗布過(guò)濾后取濾液，加入20g葡萄糖，攪拌使葡萄糖完全溶 解，以水定容至l〇〇〇mL。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入3%瓊脂。
[0019] 細(xì)菌培養(yǎng)基的制備（LB培養(yǎng)基）：每1000 mL液體培養(yǎng)基加入5.Og酵母提取物， 10.Og蛋白胨，10.OgNaCl，加水溶解，調(diào)pH值至7. 0。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng) 基中加入1.5%瓊脂。
[0020] 以傘枝犁頭霉AbsidiacorymbiferaAS3. 3387為例，制備結(jié)構(gòu)式為3-8的化合物 的過(guò)程如下： 1)發(fā)酵、轉(zhuǎn)化以及萃取 將傘枝犁頭霉AbsidiacorymbiferaAS3. 3387接入2個(gè)250mL三角瓶（裝有IOOmL馬鈴薯培養(yǎng)基）中，作為種子液。于搖床上160rpm、26°C下振蕩培養(yǎng)1天后，待菌絲生長(zhǎng)處 于旺盛期，用無(wú)菌移液管吸取ImL的種子液，加入到20個(gè)1000 mL搖瓶（裝有400mL馬鈴薯 培養(yǎng)基）中。振蕩培養(yǎng)1天后，每個(gè)搖瓶中加入25mg人參二醇（0.2mL，125mg/mL無(wú)水乙醇 溶液），共用500mg底物。相同條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化7天，將發(fā)酵液過(guò)濾，濾除菌絲體，濾液用等 體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，得到轉(zhuǎn)化物粗提物約I. 5g。
[0021] 2)硅膠柱純化 將所得粗提物溶于少量甲醇，與1.5g柱色譜硅膠（200 - 300目）混合拌樣，自然干 燥，加至裝有45g硅膠（200 - 300目）的色譜柱頂，用二氯甲烷-無(wú)水乙醇系統(tǒng)梯度洗 脫（50:1-1:8)，收集洗脫組分，采用TLC分析方法（硅膠G薄層板，二氯甲烷-無(wú)水乙醇 (15:1)展開，10%硫酸乙醇溶液噴霧，加熱顯色）將所得到的相似洗脫組分合并。
[0022] 3)反相高效液相色譜純化 合并組分用反相高效液相色譜純化。制備條件為半制備用色譜柱HederaClsA_5lim，10. 0I.DX250mm(江蘇漢邦科技），乙腈-水（68:32,V/V)，流速3.OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 203nm。得到結(jié)構(gòu)式為3-8的化合物6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如圖1所示。其13C-NMR數(shù)據(jù)如表1所 /Jn〇

[0024] 利用其他屬的微生物，具體如刺囊毛霉MucorspinosusAS3. 3450、總狀毛霉 MucorracemosusAS3. 205、少根根霉RhzopusarrhizusAS3. 3457、頂頭抱Acremonium strictumAS3. 2059、黑曲霉AspergillusflavusLinkAS3. 3950,均可以米用與上相同 的過(guò)程來(lái)制備化合物。
[0025] 實(shí)施例2本發(fā)明化合物1-8的抗肝纖維化活性 1)實(shí)驗(yàn)材料 儀器與試劑：CO2培養(yǎng)箱（JouanIG0150);酶標(biāo)儀（Bio-TEKELx800);熒光倒置顯微 鏡（Olympus1X51) ;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）、RPM 11640培養(yǎng)基（GibcolBRL)，RnaseA、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO)、胰蛋白酶（上海生物 工程有限公司）。
[0026] 測(cè)試用細(xì)胞株：HSC_T6細(xì)胞株，為SV40轉(zhuǎn)染的SD大鼠肝星狀細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué) 科學(xué)院腫瘤研究所。
[0027] 測(cè)試樣品：化合物1-8,純度在90%以上，陽(yáng)性對(duì)照品秋水仙堿，各化合物均以 DMSO溶解后稀釋。
[0028] 2)實(shí)驗(yàn)方法 采用MTT法測(cè)定各受試化合物對(duì)HSC-T6細(xì)胞株的半數(shù)抑制率IC5。值：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的HSC-T6細(xì)胞，用含1 %DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，藥物 處理組和細(xì)胞對(duì)照組加入每孔100yL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組只加入全培 養(yǎng)基，每孔100yL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔培養(yǎng)板置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加 入不同濃度的受試樣品，使終濃度為〇.. 1-100yM，繼續(xù)培養(yǎng)72h。按MTT法于酶標(biāo)儀，測(cè)定 450nm的吸光度（A)值，計(jì)算抑制率[抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）X100% ]。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS11. 5軟件作回歸方程，計(jì)算各受試樣品對(duì)HSC-T6細(xì)胞作用72h 的半數(shù)抑制濃度（IC5。)。
[0029] 3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)MTT法測(cè)試結(jié)果，計(jì)算本發(fā)明化合物1-8對(duì)上述細(xì)胞的IC5。值，結(jié)果如表2所示。
結(jié)果表明，本發(fā)明的人參二醇（PD)及本發(fā)明化合物1-8具有良好的抗肝纖維化活性， 可以作為抗肝纖維化藥物的活性成分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下列結(jié)構(gòu)式的人參二醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽在制備預(yù)防或治療肝病藥 物中的應(yīng)用，2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病為與肝纖維化有關(guān)的疾病。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝病為慢性肝炎、肝硬化或肝癌。4. 如權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為抗肝纖維化藥物。5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物含有如權(quán)利要求1所述人參二醇衍 生物、或其藥學(xué)上可成的鹽中的一種或幾種以及藥學(xué)上可以接受的載體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類人參二醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽在制備預(yù)防或治療肝病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對(duì)人參二醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了多種新型化合物，通過(guò)體外抗肝纖維化細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，這些化合物具有較好的抗肝纖維化活性，可以作為抗肝纖維化藥物的活性成分，具有廣泛的用途。
【IPC分類】C12R1/785, A61P1/16, A61K31/58, C12R1/845, A61P35/00, C12P33/20, A61P29/00, C12R1/645
【公開號(hào)】CN105030790
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510362096
【發(fā)明人】陳廣通, 宋妍, 李建林, 繆進(jìn), 吳娟娟
【申請(qǐng)人】南通大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月26日