人參二醇衍生物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人參二醇衍生物及其制備方法以及該衍生物 的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，研究和開發(fā)抗腫瘤藥物一直是醫(yī)藥領(lǐng) 域的重要研究?jī)?nèi)容。天然產(chǎn)物一直是人類尋找有效活性成分的源泉，在新藥開發(fā)過程中，一 方面具有良好活性的天然產(chǎn)物可以直接被用于臨床；另一方面，以天然活性成分為先導(dǎo)化 合物，通過有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)改造等方法尋找和開發(fā)新的高效低毒藥物，是被實(shí)踐證明最行之 有效的開發(fā)新藥的途徑之一。
[0003] 人參中的主要活性成分人參皂苷具有良好的抗腫瘤作用，無論是體外細(xì)胞試驗(yàn)， 還是流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果均表明此類化合物具有抗腫瘤和降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的活性。現(xiàn)代的藥 理研究表明，人參二醇具有較好的抑瘤作用，同時(shí)還能增強(qiáng)5氟尿嘧啶的抗腫瘤療效。但 是，人參二醇屬于四環(huán)三萜類化合物，缺乏活潑基團(tuán)，反應(yīng)位點(diǎn)少，采用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)方法 難以制備出滿足要求的衍生物。
[0004] 微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn) 物）的過程，這一過程是由某種微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催 化劑進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技 術(shù)。這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對(duì)其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物 轉(zhuǎn)化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反應(yīng)。由于微生物產(chǎn)生的這些能夠被用于 化學(xué)反應(yīng)的大多數(shù)生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時(shí)對(duì)外源添加的 底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(yīng)，因而微生物轉(zhuǎn)化可以認(rèn)為是有機(jī)化 學(xué)反應(yīng)中的一個(gè)特殊的分支。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一系列人參二醇衍生物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的人參二醇衍生物如下： 一種具有3位羰基，7 β位，24 α位羥基取代的人參二醇衍生物：3_羰基-7 β，24 α -二 羥基人參二醇，具有式I結(jié)構(gòu)； 一種具有3位羰基，7 β位，24 β位羥基取代的人參二醇衍生物：3_羰基-7 β，24 β-二 羥基人參二醇，具有式II結(jié)構(gòu)； 一種具有3位羰基，15 α位，24α位羥基取代的人參二醇衍生物：3_羰 基-15 α，24 α -二羥基人參二醇，具有式III結(jié)構(gòu)； 一種具有3位羰基，15α位，24β位羥基取代的人參二醇衍生物：3_羰 基-15 α，24 β -二羥基人參二醇，具有式IV結(jié)構(gòu)； 一種具有3位羰基，7β位，24β位羥基取代，15位雙鍵的人參二醇衍生物：3_羰 基-7 β，24 β -二羥基-15, 16-雙鍵人參二醇，具有式V結(jié)構(gòu)； 一種具有3位羰基，7 β位，24 β位羥基取代，15 α，30位形成三元環(huán)的人參二醇衍生 物：3_羰基-7 β，24 β -二羥基-15 α，30-環(huán)合人參二醇，具有式VI結(jié)構(gòu)； 式I、式II、式III、式IV、式V或式VI的化合物結(jié)構(gòu)式如下：
本發(fā)明還提供了上述人參二醇衍生物的制備方法，包括如下步驟：1)發(fā)酵培養(yǎng)微生 物，向培養(yǎng)基中加入人參二醇，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體后得到發(fā)酵液，所述微生物 為犁頭霉（Absidia)，小克銀漢霉（Cunninghamella)，毛霉（Mucor)，鏈格孢（Alternaria)， 紅酵母（Rhodotorula)，共頭霉（Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)屬的菌株；2)將所 述發(fā)酵液經(jīng)萃取后，蒸干萃取液，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)?)將所述轉(zhuǎn)化物殘?jiān)怨枘z柱純化，所 述硅膠柱純化采用氯仿-乙酸乙酯兩相系統(tǒng)梯度洗脫，收集合并組分；4)將所述組分用反 相高效液相色譜純化，得到產(chǎn)物。
[0007] 其中，微生物優(yōu)選為犁頭霉（Absidia)或毛霉（Mucor)屬菌株，更優(yōu)選傘枝犁頭霉 上述方法步驟1)中培養(yǎng)基中人參二醇的濃度為2-2000 μ g/mL。
[0008] 上述方法步驟2)中萃取溶劑為常規(guī)機(jī)型有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明人參二醇衍生物式I、式II、式III、式IV、式V和 式VI的化合物的用途。
[0010] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的人參二醇衍生物具有良好的抗腫瘤活性，可以作 為抗腫瘤藥物的活性成分。
[0011] 這些抗腫瘤藥物的活性成分可以是選自結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V和 式VI的化合物中的一種或幾種。
[0012] 在以上述化合物為活性成分的藥物中，需要的時(shí)候還可以加入一種或多種藥學(xué)上 可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩 解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制 備。
[0013] 本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對(duì)人參二醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一類新 的人參二醇衍生物，通過體外抗腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，這些化合物具有較好的抗腫瘤活性，可 以作為抗腫瘤藥物的活性成分，具有廣泛的用途。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明所述人參二醇衍生物的HPLC液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1、結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V和式VI的化合物的制備 本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化方法，以人參二醇為原料，經(jīng)過發(fā)酵、提取、分離等步驟， 來制備本發(fā)明化合物。具有轉(zhuǎn)化能力的微生物包括：犁頭霉（AbSidia)，小克銀漢霉 (Cunninghamella)，毛霉（Mucor)，鏈格抱（Alternaria)，紅酵母（Rhodotorula)，共頭 霉（Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)屬的微生物；其中轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的是犁頭霉 (Absidia)和毛霉（Mucor)屬的菌株。這些菌株均可以購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏管 理中心（CGMCC)或中國(guó)食品發(fā)酵研究所工業(yè)微生物保藏管理中心（CICC)，于固體斜面培養(yǎng) 基上置4°C冰箱內(nèi)保存。真菌培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基。
[0016] 馬鈴薯培養(yǎng)基的配制（PDA培養(yǎng)基）：取200g去皮馬鈴薯，切成薄片，放入適量水 中，煮沸后80°C保溫Ih。用雙層紗布過濾后取濾液，加入20g葡萄糖，攪拌使葡萄糖完全溶 解，以水定容至l〇〇〇mL。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入3%瓊脂。
[0017] 細(xì)菌培養(yǎng)基的制備（LB培養(yǎng)基）：每1000 mL液體培養(yǎng)基加入5. Og酵母提取物， 10.0 g蛋白胨，10.0 g NaCl，加水溶解，調(diào)pH值至7. 0。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng) 基中加入1.5%瓊脂。
[0018] 以傘枝犁頭霉Absidia corymbiferaAS 3. 3387為例，制備結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式 III、式IV、式V和式VI的化合物的過程如下： 1)發(fā)酵、轉(zhuǎn)化以及萃取 將傘枝犁頭霉Absidia corymbiferaAS 3. 3387接入2個(gè)250mL三角瓶（裝有IOOmL 馬鈴薯培養(yǎng)基）中，作為種子液。于搖床上160rpm、26°C下振蕩培養(yǎng)1天后，待菌絲生長(zhǎng)處 于旺盛期，用無菌移液管吸取ImL的種子液，加入到20個(gè)1000 mL搖瓶（裝有400mL馬鈴薯 培養(yǎng)基）中。振蕩培養(yǎng)1天后，每個(gè)搖瓶中加入25mg人參二醇（0.2mL，125mg/mL無水乙醇 溶液），共用500mg底物。相同條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化7天，將發(fā)酵液過濾，濾除菌絲體，濾液用等 體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，得到轉(zhuǎn)化物殘?jiān)sI. 5g。
[0019] 2)硅膠柱純化 將所得殘?jiān)苡谏倭考状?，與1.5g柱色譜硅膠（200 - 300目）混合拌樣，自然干燥， 加至裝有45g硅膠（200 - 300目）的色譜柱頂，用二氯甲烷-無水乙醇系統(tǒng)梯度洗脫 (50:1-1:8)，收集洗脫組分，采用TLC分析方法（硅膠G薄層板，二氯甲烷-無水乙醇 (15:1)展開，10%硫酸乙醇溶液噴霧，加熱顯色）將所得到的相似洗脫組分合并。
[0020] 3)反相高效液相色譜純化 合并組分用反相高效液相色譜純化。制備條件為半制備用色譜柱Hedera C1SA_5 μ m， 10. 0I.DX250mm(江蘇漢邦科技），乙腈-水（68:32, V/V)，流速3. OmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 203nm。得到結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V和式VI的化合物等6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。色譜 圖如圖1所示。
[0021 ] 化合物I，3-羰基-7 β，24 α -二羥基人參二醇[3 -0X0-7 β , 24 a -dihydroxy-pan axadiol]，白色無定形粉末： HR-ESI-MS (m/z) 513. 3552 [M+Na] +(c