專利名稱：利用不對稱雙鏈rna特異性抑制kras的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于研究、診斷和治療響應(yīng)KRAS基因表達和/或活性調(diào)節(jié)的特征、疾病和病況的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還涉及與某些特征、疾病和病況有關(guān)的化合物、 組合物和方法，這些特征、疾病和病況響應(yīng)KRAS基因表達通路或介導(dǎo)此類特征、疾病和病況的維持或發(fā)展的其它細(xì)胞過程中所涉及基因的表達和/或活性調(diào)節(jié)。具體而言，本發(fā)明涉及能夠由Dicer酶加工的小核酸分子，例如Dicer底物siRNA (DsiRNA)，其能夠介導(dǎo)針對 KRAS基因表達的RNA干擾(RNAi)。這些抗KRAS DsiRNA可用于例如提供用于治療可響應(yīng)受試者體內(nèi)KRAS調(diào)節(jié)的特征、疾病和病況(例如癌癥和/或其它增生性疾病、病癥或病況) 的組合物。
背景技術(shù)：
Ras信號傳導(dǎo)調(diào)控異常會導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Goodsell DS. Oncologist 4 263-4)。據(jù)估計，所有人腫瘤中有20% -25%含有Ras激活突變；而且在特定腫瘤類型中， 這一數(shù)字高達90% (Downward J. Nat Rev Cancer，3 :11-22)。因此，Ras基因家族的成員是對于癌癥治療設(shè)計值得關(guān)注的分子靶。三個人RAS基因編碼高度相關(guān)的188至189個氨基酸的蛋白質(zhì)，命名為H-Ras、 N-Ras以及K-Ras4A(KRAS同種型a)和K-Ras4B(KRAS同種型b ；這兩種Kras蛋白由替代性基因剪接產(chǎn)生)。Ras蛋白可充當(dāng)二元分子開關(guān)，用以控制細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。Ras調(diào)控的信號通路控制例如肌動蛋白細(xì)胞骨架完整性、增殖、分化、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移等過程。在癌癥中，Ras和Ras相關(guān)蛋白通常失調(diào)，導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移增加以及細(xì)胞凋亡減少。Ras激活許多通路，但對于腫瘤發(fā)生來說特別重要的一條通路似乎是絲裂原激活蛋白(MAP)激酶，這些MAP激酶本身會將信號向下游傳導(dǎo)到其它蛋白激酶和基因調(diào)控蛋白 (Lodish Molecular Cell Biology (第 4 版)· San Francisco H. Freeman,第 25 章， "Cancer，，)。具有鏈長度為25至35個核苷酸的雙鏈RNA(dsRNA)試劑曾被描述為哺乳動物細(xì)胞中靶基因表達的有效抑制劑(Rossi等，美國專利申請No. 2005/0244858和US 2005/0277610)。認(rèn)為這種長度的dsRNA試劑由RNA干擾(RNAi)通路的Dicer酶加工，使得此類試劑被稱為"Dicer底物siRNA” ( “DsiRNA”)試劑。先前也曾描述過DsiRNA試劑的其它修飾結(jié)構(gòu)(Rossi等，美國專利申請No. 2007/0265220)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有雙鏈RNA( “dsRNA”)的組合物及其制備方法。本發(fā)明的dsRNA 能夠在體外或哺乳動物受試者體內(nèi)降低細(xì)胞中靶KRas基因的表達。更具體來說，本發(fā)明涉及優(yōu)選的Dicer底物siRNA( “DsiRNA”)，其結(jié)構(gòu)和修飾模式經(jīng)過優(yōu)化以用作有效且高效的 KRAS抑制劑，任選地具有延長的抑制作用持續(xù)時間。此類DsiRNA中絕大多數(shù)的靶特異性抑制效力和功效相對于針對相同靶RNA的21個核苷酸的siRNA都意外地增強。雖然不希望受理論束縛，但這一增強的活性可能反映了 DsiRNA試劑的固有益處，該DsiRNA試劑在RNAi 通路中處于較短siRNA試劑參與RNAi通路的點的上游的點處參與該通路。一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其3'末端包含1-5 個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，該第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :141-186組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。在一個實施方案中，從第一寡核苷酸鏈3'末端的第一個核苷酸(1位)開始，用經(jīng)過修飾的核苷酸取代1位、2位和/或3位。在某些實施方案中，第一條鏈3'末端的經(jīng)過修飾的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸或熒光分子。在相關(guān)實施方案中，第一寡核苷酸鏈3'末端的1位是脫氧核糖核苷酸。在另一實施方案中，第一條鏈的3'末端與第二條鏈的5'末端形成平端。在另一實施方案中，第一條鏈的長度為25個核苷酸，而第二條鏈的長度為27個核苷酸。在一個實施方案中，第二條鏈包括序列SEQ ID NO 11-50和135-140。在另一實施方案中，第一條鏈包括序列SEQ ID NO :5、8和91_134。在另一實施方案中，dsRNA包括第一條鏈/第二條鏈的序列對，該序列對是SEQ ID NO :5/SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :132/SEQ ID NO :138、SEQ ID NO :91/SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :129/SEQ ID NO :135,SEQ ID NO :92/SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :130/SEQ ID NO : 136、SEQ ID NO :93/SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :131/SEQ ID NO :137, SEQ ID NO :94/SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :133/SEQ ID NO :139, SEQ ID NO :95/ SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :96/SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :97/SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 98/SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :99/SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :100/SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :101/SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :102/SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :103/SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 104/SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :105/SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :106/SEQ ID NO :27,SEQ ID NO :107/SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :108/SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :109/SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :110/SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :111/SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :112/ SEQ ID NO :33,SEQ ID NO :113/SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :114/SEQ ID NO :35、SEQ ID NO: 115/SEQ ID NO :36,SEQ ID NO :116/SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :117/SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :118/SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :119/SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :134/SEQ ID NO :140, SEQ ID NO :120/SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :121/SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :122/SEQ ID NO :44, SEQ ID NO :123/SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :124/SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :125/ SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :126/SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :127/SEQ ID NO :49 或 SEQ ID NO:128/SEQ ID NO :50。在一個實施方案中，第一條鏈和第二條鏈各自的長度是至少沈個核苷酸。在另一實施方案中，3'突出的核苷酸包括經(jīng)過修飾的核苷酸。任選地，3'突出的經(jīng)過修飾的核苷酸為2' -0-甲基核糖核苷酸。在相關(guān)實施方案中，3'突出的所有核苷酸都是經(jīng)過修飾的核苷酸。在另一實施方案中，第一和第二寡核苷酸鏈中的一者或兩者包含5'磷酸。在另一實施方案中，dsRNA的經(jīng)過修飾的核苷酸殘基是2' _0_甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基、2' -0-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫代、 4' -CH2-0-2‘-橋、4' -(CH2) 2-0-2‘-橋、2' -LNA、2'-氨基或 2' -0-(N-甲基氨基甲酸酯)。在一個實施方案中，dsRNA的3'突出的長度為1_3個核苷酸。任選地，該3'突出的長度為1-2個核苷酸。在相關(guān)實施方案中，3'突出的長度是兩個核苷酸，并且3'突出的經(jīng)過修飾的核苷酸是2' -0-甲基修飾的核糖核苷酸。在另一實施方案中，從第二條鏈的與第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，第二寡核苷酸鏈包含交替的經(jīng)過修飾和未修飾的核苷酸殘基。在另一實施方案中，從第二條鏈的與第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，第二寡核苷酸鏈在從18位至第二寡核苷酸鏈5'末端的所有位置包含未修飾的核苷酸殘基。在另一實施方案中，第一條鏈和第二條鏈各自的長度為至少沈個且最多30個核苷酸。在一個實施方案中，dsRNA在細(xì)胞中由Dicer內(nèi)源性裂解。在另一實施方案中，在細(xì)胞環(huán)境中，足以降低靶基因表達的分離的雙鏈核酸的量是1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低或1皮摩爾或更低。在另一實施方案中，當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低或者1皮摩爾或更低時，分離的 dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的 2Imer siRNA具有更強的效力。在另一實施方案中，當(dāng)將分離的dsRNA引入哺乳動物細(xì)胞中時，該雙鏈核酸與靶 KRAS cDNA序列充分互補，以使KRAS靶基因表達降低至少10%、至少50%、至少80-90 %、 至少95 %、至少98 %或至少99 %。
在另一實施方案中，第一條鏈與第二條鏈通過化學(xué)連接子連結(jié)。在相關(guān)實施方案中，第一條鏈的3'末端與第二條鏈的5'末端通過化學(xué)連接子連結(jié)。在一個實施方案中，用引導(dǎo)Dicer裂解定向的經(jīng)過修飾的核苷酸取代第二條鏈或第一條鏈的核苷酸。在另一實施方案中，dsRNA具有的經(jīng)過修飾的核苷酸是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸、3'-脫氧腺苷(蟲草素(cordyc印in))、3'-疊氮基_3'-脫氧胸苷(AZT)、2' ,3'-雙脫氧肌苷(ddl)、2' ,3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2 ‘， 3'-雙脫氫-2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)的單磷酸核苷酸、2'，3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)和2'，3'-雙脫氫_2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)的單磷酸核苷酸、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2' -0-烷基核糖核苷酸、2' -0-甲基核糖核苷酸、2'-氨基核糖核苷酸、2'-氟核糖核苷酸或鎖核酸。在另一實施方案中，dsRNA具有磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸三酯磷酸骨架修飾。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于降低哺乳動物細(xì)胞中靶KRAS基因表達的方法，該方法包括使哺乳動物細(xì)胞在體外與足以降低細(xì)胞中靶KRAS基因表達的量的所述分離的dsRNA接觸。在一個實施方案中，將靶KRAS基因表達降低至少10%、至少50%或至少80-90%。 在另一實施方案中，在細(xì)胞與dsRNA接觸后至少8天，將靶KRAS mRNA水平降低至少90%。 在另一實施方案中，在細(xì)胞與dsRNA接觸后至少10天，將KRAS mRNA水平降低至少70%。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種通過對哺乳動物施用足以降低哺乳動物體內(nèi)靶KRAS基因表達的量的所述分離的dsRNA來降低哺乳動物體內(nèi)靶KRAS基因表達的方法。在一個實施方案中，分離的dsRNA以每天每公斤哺乳動物1微克至5毫克、每公斤 100微克至0. 5毫克、每公斤0. 001至0. 25毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至 10微克、每公斤0. 10至5微克或每公斤0. 1至2. 5微克的劑量施用。在另一實施方案中，當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA的具有更強的效力。在另一實施方案中，施用步驟包括靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、輸注、皮下注射、透皮遞送、氣霧劑遞送、直腸遞送、陰道遞送、局部遞送、口服遞送或吸入遞送。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種通過使細(xì)胞與足以抑制所述細(xì)胞生長的量的所述分離的dsRNA接觸來選擇性抑制細(xì)胞生長的方法。在一個實施方案中，所述細(xì)胞是受試者的腫瘤細(xì)胞。任選地，所述細(xì)胞為體外腫瘤細(xì)胞。在相關(guān)實施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制劑，其包含所述分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外將dsRNA引入哺乳動物細(xì)胞中時，dsRNA的存在量可以將靶KRAS RNA水平有效降低至少 10%、至少50%或至少80-90%，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mersiRNA具有更強的效力。在一個實施方案中，在細(xì)胞環(huán)境中，有效量是1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、 2皮摩爾或更低或者1皮摩爾或更低。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制劑，其包含所述分離的dsRNA，其中當(dāng)將 dsRNA引入哺乳動物受試者的細(xì)胞中時，dsRNA的存在量將靶RNA水平有效降低至少10%、 至少50%或至少80-90%，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。在一個實施方案中，有效量是每天每公斤受試者1微克至5毫克、每公斤100微克至0. 5毫克、每公斤0. 001至0. 25毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至10微克、 每公斤0. 10至5微克或每公斤0. 1至2. 5微克的劑量。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種哺乳動物細(xì)胞，其含有所述分離的dsRNA。本發(fā)明的另一實施方案提供一種藥物組合物，其包含所述分離的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明另一實施方案提供一種試劑盒，該試劑盒具有所述分離的dsRNA和其使用說明。另一方面，本發(fā)明提供一種具有KRAS抑制活性的組合物，該組合物實質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成，該分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長度的至少19 個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :141-186組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。在另一方面中，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，該dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的第二條鏈在其 3 ‘末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO 1595-2297和3704-4406組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。在一個實施方案中，第二條鏈包括序列SEQ ID NO :189-891和2298-3000。在另一實施方案中，第一條鏈包括序列SEQ ID NO :892-1594和3001-3703。在另一實施方案中，dsRNA包括選自由表4-5中所示的DsiRNA試劑組成的組的 DsiRNA 試劑。另一方面，本發(fā)明提供一種具有KRAS抑制活性的組合物，該組合物實質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成，該分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25 個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中dsRNA的第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，第二寡核苷酸鏈沿第二寡核苷酸鏈長度的至少19 個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :1595-2297和3704-4406組成的組的靶 KRAS cDNA序列充分互補，由此降低KRAS靶基因表達。附圖簡述

圖1示出靶向KRAS RNA中的本文稱為“KRAS-355”靴位點的位點的示例性DsiRNA 試劑的結(jié)構(gòu)。與所示的21mer siRNA構(gòu)建體相比較測試25/27mer和27/27mer DsiRNA試劑(任選地，具有平端/斷裂(fray)設(shè)計)的KRas抑制功效。大寫字母=未修飾的RNA，小寫字母=DNA，粗體=錯配堿基對核苷酸；箭頭表示預(yù)計的Dicer酶裂解位點；虛線表示對應(yīng)于靶KRas序列內(nèi)預(yù)計的Argonaute 2 (Ago2)裂解位點的有義鏈(上鏈)序列。圖2示出圖1所示試劑當(dāng)以1納摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時的抗KRAS抑制功效。“優(yōu)化的”=圖1中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ；平端/平端和平端/斷裂試劑如圖1所示；“Veh” =媒介物處理的對照物；“Un” =未處理的對照物。圖3示出圖1所示試劑當(dāng)以100皮摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時的抗KRAS抑制功效。“優(yōu)化的”=圖1中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ；平端/平端和平端/斷裂試劑如圖1所示；“Veh” =媒介物處理的對照物；“Un” =未處理的對照物。圖4示出靶向KRAS RNA中的本文稱為“KRAS-940”靴位點的位點的示例性DsiRNA 試劑的結(jié)構(gòu)。測試25/27mer和27/27mer DsiRNA試劑(任選地，具有平端/斷裂設(shè)計)的 KRAS抑制功效，并與所示的21mer siRNA構(gòu)建體相比較。大寫字母=未修飾的RNA，小寫字母=DNA，粗體=錯配堿基對核苷酸；箭頭表示預(yù)計的Dicer酶裂解位點；虛線表示對應(yīng)于靶KRAS序列內(nèi)預(yù)計的Argonaute 2 (Ago2)裂解位點的有義鏈(上鏈)序列。圖5示出圖4所示試劑當(dāng)以1納摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時的抗KRAS抑制功效?！皟?yōu)化的”=圖4中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ；平端/平端和平端/斷裂試劑如圖4所示；“Veh” =媒介物處理的對照物；“Un” =未處理的對照物。圖6示出圖4所示試劑當(dāng)以100皮摩爾的濃度轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)的細(xì)胞中時的抗KRAS抑制功效?！皟?yōu)化的”=圖4中的25/27mer DsiRNA和21mer siRNA ；平端/平端和平端/斷裂試劑如圖4所示；“Veh” =媒介物處理的對照物；“Un” =未處理的對照物。圖7示出測試的DsiRNA和其Dicer加工產(chǎn)物與針對相同的確切KRAS靶序列的同源21mer siRNA的示意性比較。2' _0_甲基修飾以空心圓指示；實心圓指示脫氧核糖核苷酸；實心三角形指示25/27mer試劑內(nèi)的Dicer酶裂解位點；空心三角形指示反義鏈上對應(yīng)于靶RNA內(nèi)的Argonaute 2 (Ago2)裂解位點的位置。當(dāng)與其同源siRNA試劑相比較時，40 種測試的DsiRNA試劑的這些位點相同。圖8示出抗KRAS DsiRNA 25/27mer與其同源21mer siRNA之間抑制功效的比較圖。該圖是按25/27mer DsiRNA試劑針對KRAS靶基因的抑制％的等級次序布置。箭頭指示觀察的DsiRNA試劑與相應(yīng)siRNA試劑之間功效差異。正方形指示siRNA抑制結(jié)果；圓圈指示DsiRNA抑制結(jié)果。圖9示出按DsiRNA試劑與其同源siRNA之間抑制作用差異量的等級次序布置的抑制結(jié)果的圖。以5nM(實心方形)和InM(實心三角形)施用后M小時時以及以5nM(空心方形)和InM(空心三角形)施用后48小時時測試DsiRNA和siRNA。實心區(qū)指示觀察到 DsiRNA與同源siRNA之間存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異的試劑。對于40種測試的抗KRAS DsiRNA 試劑中的沈種，與40種siRNA試劑中僅6種優(yōu)于DsiRNA試劑形成相比，觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著的DsiRNA優(yōu)越性。圖10和圖11示出所觀察的所述人KRAS靶向的DsiRNA的IC-50曲線。圖12-21示出所觀察的所述DsiRNA的人KRAS抑制功效的柱形圖?！癙1”指示第1 階段，而“P2”指示第2階段。在第1階段中，在HeLa細(xì)胞環(huán)境中以InM測試DsiRNA。在第 2階段中，在HeLa細(xì)胞環(huán)境中以InM和0. InM(以0. InM進行兩次重復(fù)實驗)測試DsiRNA。 單獨條形表示三次重復(fù)中觀察到的平均人KRAS水平，同時示出了標(biāo)準(zhǔn)誤差。將人KRAS水平針對HPRT和SFRS9水平歸一化。圖22-31示出所觀察的所述DsiRNA的小鼠KRAS抑制功效的柱形圖。P1”指示第1 階段，而“P2”指示第2階段。在第1階段中，在小鼠H印a 1-6細(xì)胞中以InM測試DsiRNA。 在第2階段中，在小鼠H印a 1-6細(xì)胞中以InM和0. InM(以0. InM進行兩次重復(fù)實驗)測試DsiRNA。單獨條形表示三次重復(fù)中觀察到的平均小鼠KRAS水平，同時顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。 將小鼠KRAS水平針對HPRT和Rpl23水平歸一化。詳細(xì)說明本發(fā)明涉及含有雙鏈RNA( “dsRNA”)的組合物及其制備方法，所述組合物能夠在體內(nèi)或體外降低KRAS基因的水平和/或表達。dsRNA的一條鏈含有長度為19至35個核苷酸的核苷酸序列區(qū)，該核苷酸序列區(qū)可以引導(dǎo)靶KRAS轉(zhuǎn)錄物破壞和/或翻譯抑制。定義除非另外定義，否則本文所述所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常了解的含義。以下參考文獻將向技術(shù)人員提供本發(fā)明所用許多術(shù)語的一般定義 SingletonDictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2 片反，1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker1988) ；The Glossary of Genetics，第 5 版，R.Rieger 等(編輯)，Springer Verlag(1991)；以及 Hale 和 Marham， The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另外詳細(xì)說明，本文中所用的以下術(shù)語具有下文所述定義。本發(fā)明的特征是一個或多個可調(diào)節(jié)(例如，抑制)KRAS表達的DsiRNA分子。本發(fā)明的DsiRNA可任選地結(jié)合與KRAS錯誤調(diào)控相關(guān)疾病或病癥的保持或發(fā)展(例如，腫瘤形成和/或生長等)有關(guān)的其它基因和/或基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)劑來使用。本發(fā)明的DsiRNA試劑調(diào)節(jié)KRASRNA，例如對應(yīng)于GenBank登錄號NM_033360和NM_004985所提到的cDNA序列的那些，這些序列將于下文敘述且在本文中一般稱為“KRAS”。參考示例性的KRAS RNA而提供本發(fā)明各個方面和實施方案的以下說明，該示例性的KRAS RNA在本文中一般稱為KRAS。然而，這樣的參考只是意在示例性的，并且本發(fā)明各個方面和實施方案也針對替代性的KRAS RNA,例如突變KRAS RNA或其它KRAS剪接變體。 某些方面和實施方案還針對KRAS通路中所涉及的其它基因，包括其錯誤調(diào)控與KRAS的錯誤調(diào)控聯(lián)合而起作用(或者受KRAS調(diào)控影響或影響KRAS調(diào)控)以產(chǎn)生可作為治療靶的表型效應(yīng)(例如，腫瘤形成和/或生長等)的基因?？梢允褂肈siRNA和本文所述的使用KRAS 靶向性DsiRNA的方法靶向這些另外的基因。因此，所述另外的基因的抑制和這種抑制的效應(yīng)可如本文所述進行。術(shù)語“KRAS”是指編碼KRas蛋白質(zhì)、肽或多肽(例如，KRAS轉(zhuǎn)錄物，例如KRAS Genbank登錄號NM_033360. 2和NM_004985. 3的序列)的核酸序列。在某些實施方案中，術(shù)語“KRAS”也意在包括其它KRAS編碼序列，例如其它KRAS同種型、突變KRAS基因、KRAS基因的剪接變體和KRAS基因多態(tài)性。術(shù)語“Kras”用于指KRAS基因/轉(zhuǎn)錄物的多肽基因產(chǎn)物，例如Kras蛋白質(zhì)、肽或多肽，例如KRAS Genbank登錄號NM_033360. 2和NM_004985. 3 所編碼者。本文中使用的“KRAS相關(guān)疾病或病癥”是指本領(lǐng)域中已知與改變的KRAS表達、水平和/或活性相關(guān)的疾病或病癥。值得注意的是，“KRAS相關(guān)疾病或病癥”包括癌癥和/或增生性疾病、病況或病癥。如本領(lǐng)域已知，本文中使用的“增生性疾病”或“癌癥”是指以不受調(diào)控的細(xì)胞生長或復(fù)制為特征的疾病、病況、特征、基因型或表型；包括白血病，例如急性骨髓性白血病 (AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血??； AIDS相關(guān)癌癥，例如卡波西氏肉瘤(Kaposi' s sarcoma)；乳腺癌；骨癌，例如骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing' s sarcoma)、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、釉質(zhì)瘤和脊索瘤；腦瘤，例如腦膜瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、低級別星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、垂體瘤、神經(jīng)鞘瘤和轉(zhuǎn)移性腦瘤；頭頸癌癥，包括各種淋巴瘤，例如套細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、腺瘤、鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、膽囊和膽管癌、視網(wǎng)膜癌(例如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、食道癌、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌)、胰腺癌、肉瘤、威爾姆氏腫瘤 (Wilms' tumor)、宮頸癌、頭頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、脂肪肉瘤、上皮腫瘤、腎細(xì)胞癌、膽囊腺癌、腮腺腺癌、子宮內(nèi)膜肉瘤、多重耐藥性癌；以及增生性疾病和病況，例如與腫瘤血管生成有關(guān)的新血管形成、黃斑變性(例如，濕性/干性AMD)、角膜新血管形成、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新血管性青光眼、近視性變性，以及其它增生性疾病和病況，例如再狹窄和多囊性腎病， 和可單獨或與其它療法組合響應(yīng)細(xì)胞或組織中疾病相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)的其它癌癥或者增生性疾病、病況、特征、基因型或表型。在某些實施方案中，評估DsiRNA介導(dǎo)的KRAS靶序列抑制。在這些實施方案中，通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法(例如，RT-PCR、RNA印跡(Northern blot)、表達陣列等)，任選經(jīng)由比較在本發(fā)明抗KRASDsiRNA存在下與不存在這一抗KRAS DsiRNA情況下的KRAS水平，來評估KRAS RNA水平。在某些實施方案中，將在抗KRASDsiRNA存在下的KRAS水平與在單獨媒介物存在下、在針對不相關(guān)靶RNA的DsiRNA存在下或在不存在任何處理的情況下所觀察到的KRAS水平相比較。同樣公認(rèn)的是，可以評估Kras蛋白質(zhì)的水平以用于指示KRAS RNA 水平和/或DsiRNA抑制KRAS表達的程度，因此也可以采用本領(lǐng)域公認(rèn)的評估KRAS蛋白質(zhì)水平的方法(例如，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、免疫沉淀法、其它基于抗體的方法等) 來檢查本發(fā)明DsiRNA的抑制作用。如果當(dāng)將本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA施用于體系(例如， 無細(xì)胞體外體系)、細(xì)胞、組織或生物體時，觀察到KRAS RNA或蛋白質(zhì)水平與適當(dāng)?shù)膶φ瘴锵啾却嬖诮y(tǒng)計顯著降低，那么本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA被認(rèn)為具有“KRAS抑制活性”。實驗值和所進行的重復(fù)試驗次數(shù)的分布將易于決定被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著(如通過本領(lǐng)域中已知的確定統(tǒng)計顯著性的標(biāo)準(zhǔn)方法所評估)的KRAS RNA或蛋白質(zhì)降低水平(以％或以絕對項表示)的參數(shù)。然而，在某些實施方案中，“KRAS抑制活性”是根據(jù)體系、細(xì)胞、組織或生物體中KRAS水平降低的百分?jǐn)?shù)或絕對水平來定義。例如，在某些實施方案中，如果觀察到在本發(fā)明的DsiRNA存在下KRAS RNA相對于在適合對照物所觀察到的KRAS水平存在至少 5%降低或至少10%降低，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。(例如，在某些實施方案中，如果觀察到KRAS水平相對于對照物存在例如5%或10%降低，那么可認(rèn)為組織和/或受試者的體內(nèi)KRAS水平受本發(fā)明的DsiRNA試劑抑制。)在某些其它實施方案中， 如果觀察到KRAS RNA水平相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、 相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?80 %、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5 %、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?0 %、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?5%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?6%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?7%、相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?8%或相對于適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝档椭辽?9%，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。在一些實施方案中，對于被認(rèn)為具有KRAS抑制活性的DsiRNA，KRAS的完全抑制是必需的。在某些模型(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)中，如果觀察到KRAS水平相對于合適的對照物降低至少50%，那么認(rèn)為DsiRNA具有KRAS抑制活性。在某些其它實施方案中，如果觀察到KRAS水平相對于合適的對照物降低至少80%，那么認(rèn)為 DsiRNA具有KRAS抑制活性。也可以隨時間(持續(xù)時間)以及隨濃度范圍(效力)來評估KRAS抑制活性，同時評估具有KRAS抑制活性的DsiRNA的構(gòu)成，所述KRAS抑制活性根據(jù)施用濃度和施用后持續(xù)時間來調(diào)整。因此，在某些實施方案中，如果施用后在2小時、5小時、10小時、1天、2天、3 天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更長的持續(xù)時間觀察到KRAS活性降低至少50%， 那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA具有KRAS抑制活性。在其它實施方案中，如果在細(xì)胞環(huán)境中，在 InM或更低、500pM或更低、200pM或更低、IOOpM或更低、50pM或更低、20pM或更低、IOpM或更低、5pM或更低、2pM或更低或者甚至IpM或更低的濃度下觀察到KRAS抑制活性(例如， 在某些實施方案中，KRAS的至少50%抑制)，那么認(rèn)為本發(fā)明的DsiRNA是有效的KRAS抑制劑。在某些實施方案中，在提到本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA時使用了短語“實質(zhì)上
由......組成”。在一些此類實施方案中，“實質(zhì)上由......組成”是指包含具有至少一
定水平的KRAS抑制活性(例如，至少50% KRAS抑制活性)的本發(fā)明的DsiRNA，并且也包含一種或多種不顯著影響該DsiRNA的KRAS抑制活性的其它組分和/或修飾的組合物。例如，在某些實施方案中，組合物“實質(zhì)上由本發(fā)明的DsiRNA組成”，其中該組合物中本發(fā)明 DsiRNA的修飾和/或DsiRNA相關(guān)組分不會使KRAS抑制活性(任選地包括KRAS抑制活性的效力或持續(xù)時間)相對于分離的本發(fā)明DsiRNA改變超過3%、超過5%、超過10%、超過 15%、超過20%、超過25%、超過30%、超過35%、超過40%、超過45%或超過50%。在某些實施方案中，即使在其它組分或修飾存在下KRAS抑制活性發(fā)生較顯著的降低(例如，功效、持續(xù)時間和/或效力降低80%、降低90%等)，而其中在其它組分或修飾存在下KRAS抑制活性未顯著升高(例如，觀察到的KRAS抑制活性水平小于所觀察的本發(fā)明分離的DsiRNA 的抑制活性水平的10% )，那么認(rèn)為組合物實質(zhì)上由本發(fā)明的DsiRNA組成。本文中使用的的術(shù)語“核酸”是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或經(jīng)過修飾的核苷酸和其聚合物。該術(shù)語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經(jīng)過修飾的骨架殘基或鍵聯(lián)的核酸，這些核酸是合成的、天然的且非天然的，具有與參考核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，而且按照與參考核苷酸類似的方式代謝。這些類似物的實例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。如本領(lǐng)域中公認(rèn)的，本文中使用的“核苷酸”用于包括本領(lǐng)域眾所周知的天然堿基 (標(biāo)準(zhǔn))和經(jīng)過修飾的堿基的核苷酸。這些堿基一般位于核苷酸糖部分的1'位。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基。核苷酸的糖、磷酸和/或堿基部分可以是未修飾的或經(jīng)過修飾的，(也可互換稱為核苷酸類似物、經(jīng)過修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸等；參見例如 Usman 和 McSwiggen，同上文；Eckstein 等，國際 PCT 公開 No. WO 92/07065 ；Usman 等，國際PCT公開No. W093/15187 ；UhIman和Peyman，同上文，全部在此以引用的方式并入本文)。本領(lǐng)域中已知若干經(jīng)過修飾的核酸堿基的實例，如Limbach等，Nucleic Acids Res. 22 :2183,1994中所概述。可以引入核酸分子中的堿基修飾的一些非限制性實例包括次黃嘌呤、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6_三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5_烷基尿苷(例如，核糖胸腺嘧啶)、5_鹵代尿苷(例如，5-溴尿苷)或者6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin，等，Biochemistry 35 14090，1996 ；UhIman 禾口 Peyman，同上文)。 在這一方面中，“經(jīng)過修飾的堿基”是指在1'位除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸堿基或其等效物。本文中使用的“經(jīng)過修飾的核苷酸”是指在核苷、核堿基、戊糖環(huán)或磷酸基中具有一種或多種修飾的核苷酸。例如，經(jīng)過修飾的核苷酸不包括含有單磷酸腺苷、單磷酸鳥苷、單磷酸尿苷和單磷酸胞苷的核糖核苷酸，以及含有單磷酸脫氧腺苷、單磷酸脫氧鳥苷、 單磷酸脫氧胸苷和單磷酸脫氧胞苷的脫氧核糖核苷酸。修飾包括由修飾核苷酸的酶(例如甲基轉(zhuǎn)移酶)修飾產(chǎn)生的天然修飾。經(jīng)過修飾的核苷酸還包括合成或非天然的核苷酸。核苷酸中合成或非天然修飾包括具有2'修飾(例如2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、 2'-烯丙基、2' -0-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫代、4' -CH2-0-2 ‘-橋、 4' -(CH2)2-2'-橋、2' -LNA和2' _0_(N-甲基氨基甲酸酯))的修飾或包含堿基類似物的修飾。與本公開所述的2'-修飾的核苷酸相關(guān)，“氨基”是指2' -NH2或2' -O-NH2, 其可以是經(jīng)過修飾的或未修飾的。這些經(jīng)過修飾的基團描述于例如Eckstein等，美國專利 No. 5，672，695，以及 Matulic-Adamic 等，美國專利 No. 6，248，878 中。關(guān)于本公開的核酸分子，修飾可根據(jù)這些試劑的模式而存在于雙鏈核糖核酸 (dsRNA)的一條或兩條鏈上。本文中使用的“交替位置”是指每隔一個核苷酸是經(jīng)過修飾的核苷酸或在指定長度的鏈dsRNA上每一經(jīng)過修飾的核苷酸之間有一個未修飾的核苷酸 (例如，未修飾的核糖核苷酸)的模式(例如，5‘ -MNMNMN-3‘ ；3' -MNMNMN-5‘；其中M 是經(jīng)過修飾的核苷酸，且N是未修飾的核苷酸)。根據(jù)位置編號的慣例，修飾模式是從5' 或3'末端的第一核苷酸位置開始，例如，如本文所述(在某些實施方案中，1位是在本發(fā)明 DsiRNA試劑的預(yù)計Dicer裂解事件之后根據(jù)鏈的末端殘基而指定；因此，1位并不總是構(gòu)成加工前本發(fā)明試劑的3'末端或5'末端殘基)。在交替位置處經(jīng)過修飾的核苷酸的模式可出現(xiàn)在整個鏈長度上，但在某些實施方案中分別包括含有至少2、3、4、5、6或7個經(jīng)過修飾的核苷酸的至少4、6、8、10、12、14個核苷酸。本文中使用的“交替位置對”是指在指定長度的鏈dsRNA上兩個連續(xù)的經(jīng)過修飾的核苷酸由兩個連續(xù)的未修飾的核苷酸分隔開的模式 (例如，5‘ -MMNNMMNNMMNN-3‘ ；3' -MMNNMMNNMMNN-5‘；其中M是經(jīng)過修飾的核苷酸且N 是未修飾的核苷酸)。根據(jù)位置編號的慣例，修飾模式是從5'或3'末端的第一核苷酸位置開始，例如本文所述者。在交替位置處經(jīng)過修飾的核苷酸的模式可出現(xiàn)在整個鏈長度上， 但在某些實施方案中分別優(yōu)選地包括含有至少4、6、8、10、12或14個經(jīng)過修飾的核苷酸的至少8、12、16、20、24、觀個核苷酸。應(yīng)強調(diào)的是，上述修飾模式是示例性的，且不旨在限制本發(fā)明的范圍。本文中使用的“堿基類似物”是指位于可并入核酸雙鏈體中的經(jīng)過修飾的核苷酸中核苷酸糖部分的1'位(或可并入核酸雙鏈體中的核苷酸糖部分取代物的等效位置)的雜環(huán)部分。在本發(fā)明dsRNA中，堿基類似物一般為嘌呤或嘧啶堿基，不包括常見堿基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。堿基類似物可與dsRNA中的其它堿基或堿基類似物形成雙鏈體。堿基類似物包括可用于本發(fā)明化合物和方法中的堿基類似物，例如，Benner的美國專利No. 5，432，272和No. 6, 001, 983以及Manoharan的美國專利公開No. 20080213891中所公開的那些，這些專利以引用的方式并入本文。堿基的非限制性實例包括次黃嘌呤(I)、黃嘌呤(X)、3i3-D-呋喃核糖基-(2，6_ 二氨基嘧啶) (K)、3-β-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5，7(4H，6H)_ 二酮)(P)、異胞嘧啶(iso-C)、異鳥嘌呤(iso-G)、1-β -D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1_β -D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、4-硫代-dT、7- (2-噻吩基)-咪唑并W，5-b] 吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛0^)、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-氧代吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基羥基異喹啉基、5-甲基羥基異喹啉基和3-甲基-7-丙炔基羥基異喹啉基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、批咯并吡嗪基、羥基異喹啉基、7-丙炔基羥基異喹啉基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2，4，5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4，6_ 二甲基吲哚基、苯基、萘基、 蒽基、菲基、芘基、芪基(stilbenzyl)、并四苯基、并五苯基和其結(jié)構(gòu)衍生物(^Aweitzer 等，J. Org. Chem. , 59 :7238-7242 (1994) ；Berger 等，Nucleic Acids Research, 28 (15) 2911-2914(2000) ；Moran 等，J. Am. Chem. Soc.，119 :2056-2057(1997) ；Morales 等，J.Am. Chem. Soc.，121 :2323-2324(1999) ；Guckian 等，J. Am. Chem. Soc.，118 :8182-8183(1996)； Morales 等，J. Am. Chem. Soc. , 122(6) :1001-1007(2000) ；McMinn 等，J. Am. Chem. Soc.， 121 :11585-11586(1999) ；Guckian 等，J. Org. Chem. ,63 :9652-9656(1998) ；Moran 等， Proc. Natl. Acad. Sci. ,94 :10506-10511 (1997) ；Das φ, J. Chem. Soc. , Perkin Trans., 1 :197-206(2002) ；Shibata φ, J. Chem. Soc. , Perkin Trans. , 1 1605-1611 (2001)； Wu 等，J.Am. Chem. Soc. , 122(32) :7621-7632(2000) ；0 ‘ Neill 等，J. Org. Chem. , 67 5869-5875(2002) ；Chaudhuri 等，J. Am. Chem. Soc.，117 :10434-10442(1995)；和美國專利 No. 6，218，108.)。堿基類似物還可以是通用堿基。本文中使用的“通用堿基”是指位于經(jīng)過修飾的核苷酸中核苷酸糖部分的1'位或核苷酸糖部分取代物中等效位置的雜環(huán)部分，該雜環(huán)部分當(dāng)存在于核酸雙鏈體中時，可與一種以上堿基相對定位，同時不改變雙螺旋結(jié)構(gòu)(例如，磷酸骨架的結(jié)構(gòu))。此外，通用堿基不會破壞其所駐留的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力。含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方法測定(例如，UV吸光度、圓二色性、凝膠遷移法、單鏈核酸酶敏感性等)。另外，可以改變能觀察到雙鏈體形成的條件， 以確定雙鏈體穩(wěn)定性或形成，例如，溫度，如解鏈溫度(Tm)，與核酸雙鏈體穩(wěn)定性相關(guān)。相較于與靶核酸精確互補的參考單鏈核酸，含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的 Tm低于與互補核酸形成的雙鏈體。然而，與其中通用堿基被堿基置換而產(chǎn)生單一錯配的參考單鏈核酸相比較，含有通用堿基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的Tm高于用具有錯配堿基的核酸形成的雙鏈體。
一些通用堿基能夠通過在通用堿基與所有堿基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)在堿基配對條件下形成氫鍵，來實現(xiàn)堿基配對。通用堿基不是只與單一互補堿基形成堿基對的堿基。在雙鏈體中，通用堿基可與雙鏈體相對鏈上與之相對的G、C、A、T和U中每一者不形成氫鍵、形成一個氫鍵或形成一個以上氫鍵。優(yōu)選地，通用堿基不與雙鏈體相對鏈上與之相對的堿基相互作用。在雙鏈體中，與通用堿基之間發(fā)生的堿基配對不會改變磷酸骨架的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通用堿基也可以借助堆疊相互作用與相同核酸鏈上的相鄰核苷酸中的堿基相互作用。這種堆疊相互作用可使雙鏈體穩(wěn)定，尤其是在通用堿基不與雙鏈體相對鏈上與之相對定位的堿基形成任何氫鍵的情形中。通用結(jié)合核苷酸的非限制性實例包括肌苷、1-β -D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或l-β -D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等的美國專利申請公開No. 20070254362 ；Van Aerschot等， An acyclic5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 年 11 月；23^1) :4363-70 ;Loakes 等，3-Nitropyrrole and5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 年 7 月 11 日；23(13) :2361-6 ;Loakes 禾口 Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 年 10 月 11 日；22 (20) :4039-43)。本文中使用的“環(huán)”是指由核酸的單一鏈形成的結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，側(cè)接特定單鏈核苷酸區(qū)的互補區(qū)按使互補區(qū)之間的單鏈核苷酸區(qū)被排除在雙鏈體形成或Watson-Crick 堿基配對外的方式雜交。環(huán)是任何長度的單鏈核苷酸區(qū)。環(huán)的實例包括例如發(fā)夾 (hairpin)、莖環(huán)或延伸環(huán)等結(jié)構(gòu)中存在的未配對核苷酸。在有關(guān)dsRNA的上下文中，本文中使用的“延伸環(huán)”是指單鏈環(huán)以及側(cè)接該環(huán)的另外1、2、3、4、5、6或多達20個堿基對或雙鏈體。在延伸環(huán)中，在5'側(cè)側(cè)接該環(huán)的核苷酸與在3'側(cè)側(cè)接該環(huán)的核苷酸形成雙鏈體。延伸環(huán)可形成發(fā)夾或莖環(huán)。在有關(guān)dsRNA的上下文中，本文中使用的“四核苷酸環(huán)”是指由四個核苷酸組成的環(huán)(單鏈區(qū))，該環(huán)形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，有助于使相鄰Watson-Crick雜交的核苷酸穩(wěn)定。在不受理論限制的情況下，四核苷酸環(huán)可通過堆疊相互作用使相鄰Watson-Crick堿基對穩(wěn)定。此外，四核苷酸環(huán)中四個核苷酸間的相互作用包括但不限于，非Watson-Crick 堿基配對、堆疊相互作用、氫鍵和接觸相互作用(Cheong等，Nature 1990年8月16日； 346 (6285) :680-2 ；Heus 和 Pardi，Sciencel991 年 7 月 12 日；253 (5016) :191-4)。四核苷酸環(huán)使相鄰雙鏈體的解鏈溫度(Tm)升高，其高于所預(yù)期的由四個隨機堿基組成的簡易模型環(huán)序列的Tm。例如，在IOmM NaHPO4中，四核苷酸環(huán)可使包含長度為至少2個堿基對的雙鏈體的發(fā)夾的解鏈溫度為至少^°C。四核苷酸環(huán)可以含有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸和其組合。RNA四核苷酸環(huán)的實例包括UNCG家族四核苷酸環(huán)(例如，UUCG)、 GNRA家族四核苷酸環(huán)(例如，GAAA)和CUUG四核苷酸環(huán)。(Woese等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990 年 11 月；87 (21) :8467-71 ；Antao 等，Nucleic Acids Res. 1991 年 11 月 11 日； 19(21) :5901-5)。DNA四核苷酸環(huán)的實例包括d (GNNA)家族四核苷酸環(huán)(例如，d (GTTA))、 d (GNRA)家族四核苷酸環(huán)、d (GNAB)家族四核苷酸環(huán)、d (CNNG)家族四核苷酸環(huán)、d (TNCG)家族四核苷酸環(huán)(例如，d (TTCG))。(Nakano 等，Biochemistry，41 08) ,14281-14292，2002.； SHINJI 等，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 第 78 卷；第 2 期；第 731 頁 Q000)。)本文中使用的術(shù)語“siRNA”是指其中每條鏈都包含RNA、RNA類似物或RNA和DNA的雙鏈核酸。siRNA包含介于19個與23個之間核苷酸，或包含21核苷酸。siRNA通常在每條鏈的3'端具有2bp突出，以致siRNA中的雙鏈體區(qū)包含17-21個核苷酸或19個核苷酸。通常，siRNA的反義鏈與KRAS基因/RNA的靶序列充分互補。本發(fā)明的抗KRAS DsiRNA的鏈長度為至少25個核苷酸。因此，抗KRAS DsiRNA含有一個寡核苷酸序列，即第一序列，其長度為至少25個核苷酸且不超過35個或多至50個核苷酸。這一 RNA序列的長度可介于沈與35個J6與34個J6與33個J6與32個J6與 31個J6與30個以及沈與四個核苷酸之間。這一序列的長度可以是27或28個核苷酸或27個核苷酸。DsiRNA試劑的第二序列可以是在生物條件下(例如在真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)) 與第一序列退火的序列。一般說來，第二寡核苷酸序列中至少有19個堿基對與第一寡核苷酸序列互補，更通常第二寡核苷酸序列中有21或更多個堿基對或者25或更多個堿基對與第一寡核苷酸序列互補。在一個實施方案中，第二序列的長度與第一序列相同，且DsiRNA 試劑為平端。在另一實施方案中，DsiRNA試劑末端具有一個或多個突出。在某些實施方案中，DsiRNA試劑的第一和第二寡核苷酸序列存在于單獨的寡核苷酸鏈上，這些寡核苷酸鏈可以是且通常是化學(xué)合成的。在一些實施方案中，兩條鏈的長度在 26與35個核苷酸之間。在其它實施方案中，兩條鏈的長度在25與30個或沈與30個核苷酸之間。在一個實施方案中，兩條鏈的長度為27個核苷酸，完全互補并且具有平端。在本發(fā)明某些實施方案中，抗KRAS DsiRNA的第一和第二序列存在于單獨RNA寡核苷酸(鏈)上。 在一個實施方案中，一條或兩條寡核苷酸鏈能夠用作Dicer的底物。在其它實施方案中，存在至少一種修飾，用以促進Dicer按照使雙鏈RNA結(jié)構(gòu)抑制基因表達的功效最大的定向結(jié)合于雙鏈RNA結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明某些實施方案中，抗KRAS DsiRNA試劑包含長度不同的兩條寡核苷酸鏈，其中抗KRAS DsiRNA在第一條鏈(有義鏈)的3'末端具有平端且在第二條鏈 (反義鏈)的3'末端具有3'突出。DsiRNA也可含有一個或多個脫氧核糖核酸(DNA)堿基取代。含有兩個單獨寡核苷酸的適合DsiRNA組合物可通過化學(xué)連接基團以化學(xué)方式在其退火區(qū)外部連接。本領(lǐng)域中已知并可使用許多適合的化學(xué)連接基團。適合的基團不會阻斷Dicer對DsiRNA的活性，并且不會干擾由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的定向破壞。或者，兩個單獨寡核苷酸可以通過第三寡核苷酸連接，以致在構(gòu)成DsiRNA組合物的兩個寡核苷酸退火后產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)不會阻斷Dicer對DsiRNA的活性，并且不會干擾靶RNA的定向破壞。本文中使用的具有與靶RNA或cDNA序列(例如，KRAS mRNA)“充分互補”的序列的 dsRNA(例如，DsiRNA或siRNA)是指dsRNA具有的序列足以觸發(fā)由RNAi機構(gòu)(例如，RISC 復(fù)合物)或過程引起的靶RNA破壞(在敘述cDNA序列情況下，RNA序列對應(yīng)于所述的cDNA 序列)?？蓪sRNA分子設(shè)計成使反義鏈的每一殘基都與靶分子中的殘基互補?；蛘撸稍谠摲肿觾?nèi)進行取代，以增加所述分子的穩(wěn)定性和/或增強其加工活性。取代可以在鏈內(nèi)進行，或者可以對鏈末端的殘基進行。在某些實施方案中，取代和/或修飾是在DsiRNA試劑內(nèi)的特定殘基處進行。所述取代和/或修飾可以包括例如，當(dāng)從DsiRNA試劑有義鏈的3 ‘ 末端位置開始編號時，在1、2和3位的一個或多個殘基處的脫氧修飾；以及在DsiRNA試劑反義鏈的3'末端殘基處引入2' -0-烷基(例如，2' -0-甲基)修飾，其中這樣的修飾也在反義鏈3'部分的突出位置進行和在DsiRNA試劑的加工形成活性siRNA試劑的區(qū)域內(nèi)包括的DsiRNA反義鏈替代殘基處進行。前述修飾都是作為示例提供，并且不旨在以任何方式進行限制。有關(guān)優(yōu)選DsiRNA試劑結(jié)構(gòu)的其它考慮，包括可對本發(fā)明抗KRAS DsiRNA試劑進行的修飾和取代的其它說明，可見于下文中。短語“雙鏈體區(qū)”是指兩個互補或基本上互補的寡核苷酸中的區(qū)域，所述兩個互補或基本上互補的寡核苷酸通過Watson-Crick堿基配對或使互補或基本上互補的寡核苷酸鏈之間形成雙鏈體的其它方式相互間形成堿基對。例如，具有21個核苷酸單位的寡核苷酸鏈可與另一具有21個核苷酸單位的寡核苷酸堿基配對，而每條鏈上只有19個堿基互補或基本上互補，以致“雙鏈體區(qū)”由19個堿基對組成。其余堿基對可例如作為5'和3'突出存在。此外，在雙鏈體區(qū)內(nèi)，不需要100%互補；在雙鏈體區(qū)內(nèi)允許出現(xiàn)基本上互補?；旧匣パa是指各鏈之間的互補性使其能夠在生物條件下退火。本領(lǐng)域眾所周知憑經(jīng)驗確定兩條鏈?zhǔn)欠衲軌蛟谏飾l件下退火的技術(shù)。或者，可以合成兩條鏈，并在生物條件下加在一起， 以確定其是否相互退火。單鏈核酸在多個堿基內(nèi)堿基配對稱為“雜交”。雜交通常在生理或生物相關(guān)條件 (例如，分子內(nèi)pH 7. 2，140mM鉀離子；細(xì)胞外pH 7. 4，145mM鈉離子)下確定。雜交條件一般含有單價陽離子和生物學(xué)上可接受的緩沖液，并且可以含有或可不含有二價陽離子、 復(fù)合陰離子(例如葡糖酸鉀中的葡糖酸根)、不帶電荷物質(zhì)(例如蔗糖)和用以降低樣品中水的活性的惰性聚合物(例如PEG)。這樣的條件包括可形成堿基對的條件。雜交是通過解離形成雙鏈體的單鏈核酸所需的溫度(即，解鏈溫度；Tm)而度量。 雜交條件也是可以形成堿基對的條件。可以使用各種嚴(yán)格度條件來測定雜交(參見例如， Wahl，G.M.和 S. L. Berger (1987)Methods Enzymo 1. 152 :399 ；Kimmel，A. R. (1987)Methods Enzymo 1. 152 :507)。嚴(yán)格的溫度條件將通常包括至少約30°C，更優(yōu)選至少約37°C且最優(yōu)選至少約42°C的溫度。預(yù)期長度小于50個堿基對的雜交物的雜交溫度應(yīng)比該雜交物的解鏈溫度(Tm)低5-10°C，其中Tm是根據(jù)以下等式確定。對于長度小于18個堿基對的雜交物， Tm(0C) =2(A+T堿基的數(shù)量)+4(G+C堿基的數(shù)量)。對于長度介于18與49個堿基對之間的雜交物，Tm(°C )=81. 5+16. 6 (log 10 [Na+]) +0. 41 (% G+C) - (600/N)，其中 N 是雜交物中堿基的數(shù)目，且[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(對于1XSSC，[Na+] = 0. 165M)。例如，雜交測定緩沖液示出在表1中。表 1.
權(quán)利要求
1.一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的所述第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :141-186組成的組的靶 KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中從所述第一寡核苷酸鏈3'末端的第一個核苷酸(1位)開始，用經(jīng)過修飾的核苷酸取代1位、2位和/或3位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的所述3'末端和所述第二條鏈的所述5'末端形成平端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的長度是25個核苷酸且所述第二條鏈的長度是27個核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第二條鏈包含選自由SEQID NO 11-50和135-140組成的組的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈包含選自由SEQID NO :5、 8和91-134組成的組的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其包括選自由以下組成的組的第一條鏈/第二條鏈序列對SEQ ID NO :5/SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :8/SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :132/ SEQ ID NO :138,SEQ ID NO :91/SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :129/SEQ ID NO :135,SEQ ID NO: 92/SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :130/SEQ ID NO :136,SEQ ID NO :93/SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO :131/SEQ ID NO :137, SEQ ID NO :94/SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :133/SEQ ID NO :139, SEQ ID NO :95/SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :96/SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :97/SEQ ID NO 18、SEQ ID NO :98/SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :99/SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :100/SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :101/SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :102/SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :103/ SEQ ID NO :24,SEQ ID NO :104/SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :105/SEQ ID NO :26、SEQ ID NO: 106/SEQ ID NO :27,SEQ ID NO :107/SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :108/SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :109/SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :110/SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :111/SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :112/SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :113/SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :114/SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :115/SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :116/SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :117/SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO :118/SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :119/SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :134/SEQ ID NO :140, SEQ ID NO :120/SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :121/SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :122/ SEQ ID NO :44,SEQ ID NO :123/SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :124/SEQ ID NO :46、SEQ ID NO: 125/SEQ ID NO :47,SEQ ID NO :126/SEQ ID NO :48,SEQ ID NO :127/SEQ ID NO :49 禾口 SEQ ID NO :128/SEQ ID NO :50。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈和所述第二條鏈各自的長度為至少沈個核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的所述3'末端的所述經(jīng)過修飾的核苷酸殘基選自由脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸和熒光分子組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的dsRNA，其中所述第一寡核苷酸鏈的所述3'末端的 1位是脫氧核糖核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所述核苷酸包含經(jīng)過修飾的核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所述經(jīng)過修飾的核苷酸是2' -0-甲基核糖核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所有核苷酸都是經(jīng)過修飾的核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一和第二寡核苷酸鏈中一者或兩者包含5'磷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述經(jīng)過修飾的核苷酸殘基選自由以下組成的組2' -0-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基、2' -0-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫代、4' -CH2-0-2'-橋、4' -(CH2) 2-0-2'-橋、2' -LNA, 2'-氨基和2' -0-(N-甲基氨基甲酸酯)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是1-3個核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是1-2個核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是兩個核苷酸，且其中所述3'突出的所述經(jīng)過修飾的核苷酸是2' -0-甲基修飾的核糖核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中從所述第二條鏈的與所述第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，所述第二寡核苷酸鏈包含交替的經(jīng)過修飾和未修飾的核苷酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中從所述第二條鏈的與所述第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，所述第二寡核苷酸鏈在從18位到所述第二寡核苷酸鏈5'末端的所有位置包含未修飾的核苷酸殘基。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈和所述第二條鏈各自的長度為至少沈個且最多30個核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述dsRNA在所述細(xì)胞中由Dicer內(nèi)源性裂解。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，足以降低所述靶基因表達的所述分離的雙鏈核酸的量選自由以下組成的組1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及1皮摩爾或更低。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAkDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為選自由200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20 皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及1皮摩爾或更低組成的組時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mersiRNA具有更強的效力。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述分離的dsRNA與所述靶KRAS cDNA序列充分互補，以使KRAS靶基因表達降低選自由以下組成的組的量(以％表示)至少10%、至少50%、至少80-90%、至少95%、至少98% 以及至少99%。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈與第二條鏈通過化學(xué)連接子連結(jié)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中所述第一條鏈的所述3'末端與所述第二條鏈的所述5'末端通過化學(xué)連接子連結(jié)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其中用引導(dǎo)Dicer裂解定向的經(jīng)過修飾的核苷酸取代所述第二條鏈或第一條鏈的核苷酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由以下組成的組的經(jīng)過修飾的核苷酸脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸、3'-脫氧腺苷(蟲草素)、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2' ,3'-雙脫氧肌苷(ddl)、2' ,3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2'，3'-雙脫氫-2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)、3 ‘-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)的單磷酸核苷酸、2'，3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)和2'， 3'-雙脫氫-2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)的單磷酸核苷酸、4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 5-碘尿嘧啶、5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2' -0-烷基核糖核苷酸、2' -0-甲基核糖核苷酸、2'-氨基核糖核苷酸、2'-氟核糖核苷酸和鎖核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和磷酸三酯組成的組的磷酸骨架修飾。
32.一種用于降低哺乳動物細(xì)胞中靶KRAS基因表達的方法，所述方法包括使哺乳動物細(xì)胞在體外與足以降低所述細(xì)胞中靶KRAS基因表達的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的 dsRNA接觸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中靶KRAS基因表達降低選自由至少10%、至少 50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsRNA接觸后至少8天，KRAS mRNA水平降低的量(以％表示)為至少90%。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsRNA接觸后至少10天， KRAS mRNA水平降低的量(以％表示)為至少70%。
36.一種用于降低哺乳動物中靶KRAS基因表達的方法，所述方法包括對哺乳動物施用足以降低所述哺乳動物中靶KRAS基因表達的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分離的dsRNA以選自由以下組成的組的劑量施用每天每公斤所述哺乳動物1微克至5毫克、每公斤100微克至0. 5毫克、每公斤 0. 001至0. 25毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至10微克、每公斤0. 10至5微克和每公斤0. 1至2. 5微克。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述施用步驟包括選自由以下組成的組的模式靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、輸注、皮下注射、透皮遞送、氣霧劑遞送、直腸遞送、陰道遞送、局部遞送、口服遞送和吸入遞送。
40.一種用于選擇性抑制細(xì)胞生長的方法，所述方法包括使細(xì)胞與足以抑制所述細(xì)胞生長的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA接觸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞是受試者的腫瘤細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞是體外腫瘤細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
44.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外將所述dsRNA 引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述dsRNA的存在量將靶KRAS RNA水平有效降低選自由至少 10%、至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述dsRNA在降低靶KRAS RNA 水平方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的制劑，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，所述有效量選自由以下組成的組1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低和1皮摩爾或更低。
46.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)將所述dsRNA引入哺乳動物受試者的細(xì)胞中時，所述dsRNA的存在量將靶RNA水平有效降低選自由至少10%、 至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的制劑，其中所述有效量是選自由以下組成的組的劑量每天每公斤所述受試者1微克至5毫克、每公斤100微克至0. 5毫克、每公斤0. 001至0. 25 毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至10微克、每公斤0. 10至5微克和每公斤0. 1 至2. 5微克。
48.一種哺乳動物細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA。
49.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。
50.一種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的dsRNA和其使用說明。
51.一種具有KRAS抑制活性的組合物，其實質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成， 所述分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述 dsRNA的所述第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :141-186組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。
52.一種分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25 個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的所述第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :1595-2297和3704-4406組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中從所述第一寡核苷酸鏈3'末端的第一個核苷酸(1位)開始，用經(jīng)過修飾的核苷酸取代1位、2位和/或3位。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的所述3'末端和所述第二條鏈的所述5'末端形成平端。
55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的長度是25個核苷酸且所述第二條鏈的長度是27個核苷酸。
56.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第二條鏈包含選自由SEQID NO 189-891和2298-3000組成的組的序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈包含選自由SEQID NO 892-1594和3001-3703組成的組的序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其包含選自由表4_5中所示DsiRNA試劑組成的組的第一條鏈/第二條鏈序列對。
59.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈和所述第二條鏈各自的長度為至少26個核苷酸。
60.根據(jù)權(quán)利要求53所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈的所述3'末端的所述經(jīng)過修飾的核苷酸殘基選自由脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸和熒光分子組成的組。
61.根據(jù)權(quán)利要求53所述的分離的dsRNA，其中所述第一寡核苷酸鏈的所述3'末端的 1位是脫氧核糖核苷酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所述核苷酸包括經(jīng)過修飾的核苷酸。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所述經(jīng)過修飾的核苷酸是2' -0-甲基核糖核苷酸。
64.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的所有核苷酸都是經(jīng)過修飾的核苷酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一和第二寡核苷酸鏈中一者或兩者包含5'磷酸。
66.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述經(jīng)過修飾的核苷酸殘基選自由以下組成的組2' -0-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基、2' -0-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-硫代、4' -CH2-0-2'-橋、4' -(CH2) 2-0-2'-橋、2' -LNA, 2'-氨基和2' -0-(N-甲基氨基甲酸酯)。
67.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是1_3個核苷酸。
68.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是1_2個核苷酸。
69.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述3'突出的長度是兩個核苷酸，且其中所述3'突出的所述經(jīng)過修飾的核苷酸是2' -0-甲基修飾的核糖核苷酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中從所述第二條鏈的與所述第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，所述第二寡核苷酸鏈包含交替的經(jīng)過修飾和未修飾的核苷酸殘基。
71.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中從所述第二條鏈的與所述第一寡核苷酸鏈5'末端核苷酸殘基互補的核苷酸殘基開始，所述第二寡核苷酸鏈在從18位到所述第二寡核苷酸鏈5'末端的所有位置包含未修飾的核苷酸殘基。
72.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈和所述第二條鏈各自的長度為至少26個且最多30個核苷酸。
73.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述dsRNA在所述細(xì)胞中由Dicer內(nèi)源性裂解。
74.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，足以降低所述靶基因表達的所述分離的雙鏈核酸的量選自由以下組成的組1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及1皮摩爾或更低。
75.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
76.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時， 在所述細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為選自由200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低以及1皮摩爾或更低組成的組時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mersiRNA具有更強的效力。
77.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述分離的dsRNA與所述靶KRAkDNA序列充分互補，以使KRAS靶基因表達降低選自由以下組成的組的量(以％表示)至少10%、至少50%、至少80-90%、至少95%、至少 98%以及至少99%。
78.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中所述第一條鏈與第二條鏈通過化學(xué)連接子連結(jié)。
79.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的雙鏈核酸，其中所述第一條鏈的所述3'末端與所述第二條鏈的所述5'末端通過化學(xué)連接子連結(jié)。
80.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的雙鏈核酸，其中用引導(dǎo)Dicer裂解定向的經(jīng)過修飾的核苷酸取代所述第二條鏈或第一條鏈的核苷酸。
81.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由以下組成的組的經(jīng)過修飾的核苷酸脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸、無環(huán)核苷酸、3'-脫氧腺苷(蟲草素)、3'-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)、2' ,3'-雙脫氧肌苷(ddl)、2' ,3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)、2'，3'-雙脫氫-2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)、3 ‘-疊氮基-3'-脫氧胸苷(AZT)的單磷酸核苷酸、2'，3'-雙脫氧-3'-硫代胞苷(3TC)和2'， 3'-雙脫氫-2'，3'-雙脫氧胸苷(d4T)的單磷酸核苷酸、4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、 5-碘尿嘧啶、5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、2' -0-烷基核糖核苷酸、2' -0-甲基核糖核苷酸、2'-氨基核糖核苷酸、2'-氟核糖核苷酸和鎖核酸。
82.根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的雙鏈核酸，其包含選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和磷酸三酯組成的組的磷酸骨架修飾。
83.一種用于降低哺乳動物細(xì)胞中靶KRAS基因表達的方法，所述方法包括使哺乳動物細(xì)胞在體外與足以降低所述細(xì)胞中靶KRAS基因表達的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的 dsRNA接觸。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中靶KRAS基因表達降低選自由至少10%、至少 50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsRNA接觸后至少8天，KRAS mRNA水平降低的量(以％表示)為至少90%。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中在所述細(xì)胞與所述dsRNA接觸后至少10天， KRAS mRNA水平降低的量(以％表示)為至少70%。
87.一種用于降低哺乳動物中靶KRAS基因表達的方法，所述方法包括對哺乳動物施用足以降低所述哺乳動物中靶KRAS基因表達的量的根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述分離的dsRNA以選自由以下組成的組的劑量施用每天每公斤所述哺乳動物1微克至5毫克、每公斤100微克至0. 5毫克、每公斤 0. 001至0. 25毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至10微克、每公斤0. 10至5微克和每公斤0. 1至2. 5微克。
89.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述分離的dsRNA在降低靶KRAS基因表達方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
90.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述施用步驟包括選自由以下組成的組的模式靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、輸注、皮下注射、透皮遞送、氣霧劑遞送、直腸遞送、陰道遞送、局部遞送、口服遞送或吸入遞送。
91.一種用于選擇性抑制細(xì)胞生長的方法，所述方法包括使細(xì)胞與足以抑制所述細(xì)胞生長的量的根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA接觸。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述細(xì)胞是受試者的腫瘤細(xì)胞。
93.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述細(xì)胞是體外腫瘤細(xì)胞。
94.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
95.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)在體外將所述 dsRNA引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述dsRNA的存在量將靶KRAS RNA水平有效降低選自由至少10%、至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述dsRNA在降低靶KRAS RNA 水平方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的制劑，其中在所述細(xì)胞的環(huán)境中，所述有效量選自由以下組成的組1納摩爾或更低、200皮摩爾或更低、100皮摩爾或更低、50皮摩爾或更低、20皮摩爾或更低、10皮摩爾或更低、5皮摩爾或更低、2皮摩爾或更低和1皮摩爾或更低。
97.一種制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA，其中當(dāng)將所述dsRNA引入哺乳動物受試者的細(xì)胞中時，所述dsRNA的存在量將靶RNA水平有效降低選自由至少10%、 至少50%和至少80-90%組成的組的量(以％表示)，且其中當(dāng)在體外于哺乳動物細(xì)胞中測定時，在細(xì)胞環(huán)境中有效濃度為1納摩爾或更低時，所述dsRNA在降低靶KRAS RNA水平方面比針對所述靶KRAS cDNA的同樣至少19個核苷酸的分離的21mer siRNA具有更強的效力。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的制劑，其中所述有效量是選自由以下組成的組的劑量每天每公斤所述受試者1微克至5毫克、每公斤100微克至0. 5毫克、每公斤0. 001至0. 25 毫克、每公斤0. 01至20微克、每公斤0. 01至10微克、每公斤0. 10至5微克和每公斤0. 1 至2. 5微克。
99.一種哺乳動物細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA。
100.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。
101.一種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求52所述的分離的dsRNA和其使用說明。
102.一種具有KRAS抑制活性的組合物，其實質(zhì)上由分離的雙鏈核糖核酸(dsRNA)組成，所述分離的dsRNA包含第一和第二核酸鏈以及具有至少25個堿基對的雙鏈體區(qū)，其中所述dsRNA的所述第二條鏈在其3'末端包含1-5個單鏈核苷酸，其中當(dāng)將所述雙鏈核酸引入哺乳動物細(xì)胞中時，所述第二寡核苷酸鏈沿所述第二寡核苷酸鏈長度的至少19個核苷酸且最多35個核苷酸與選自由SEQ ID NO :1595-2297和3704-4406組成的組的靶KRAS cDNA序列充分互補，以降低KRAS靶基因表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使用具有不對稱末端結(jié)構(gòu)的Dicer底物siRNA(DsiRNA)試劑而用于降低KRAS靶RNA和蛋白質(zhì)水平的化合物、組合物和方法。
文檔編號C12N15/113GK102575254SQ201080024105
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者B·D·布朗 申請人:戴瑟納制藥公司