專利名稱：用于在多個溫度下進行生化或化學反應(yīng)的方法和設(shè)備的制作方法
用于在多個溫度下進行生化或化學反應(yīng)的方法和設(shè)備 相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求于2005年5月11日提交的美國臨時申請第60/679，714
號的權(quán)益，該文獻全文在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
生化和化學反應(yīng)速率的溫度依賴性，給通過微型化來增加反應(yīng)效 率和速度的努力帶來了特殊的挑戰(zhàn)。不僅將反應(yīng)體積而且將整個反應(yīng) 室保持在所需溫度下的時間域方法僅僅只適合于等溫情況。如果溫度 需要以快速并且受控的方式改變或者循環(huán)，則反應(yīng)室增加的熱量限制 了能夠達到的速率和/或精確性。
在空間域方法中(參見，例如，Kopp, M. U., de Mdlo, A. J" Manz, A., Science 1998, 280, 1046-1048; Burns, M. A., Johnson, B. N., Brahmansandra, S, N., Handique， K., Webster, J. R.， Krishman,M., Sammarco, T. S.， Man， P. M.， Jones, D.， Heldsinger, D.， Mastrangelo， C. H., Burke, D. T., Science 1998, 282, 484-487; Chiou, J.， Matsudaira, P.， Sonn, A., Ehrlich, D.， Anal. Chem. 2001, 73, 2018-2021;以及Nakano, H.， Matsuda， K.， Yohda， M.， Nagamune， T., Endo, I., Yamane, T.， Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994， 58, 349-352)，將反應(yīng)室的不同部分保持在 不同的溫度下，并且引入反應(yīng)體積使其與反應(yīng)室中所期望的部分熱接 觸，從而將其保持在該部分的溫度下。必要時，可以將反應(yīng)體積移動 到反應(yīng)室的不同部分以改變溫度；并且，依照反應(yīng)體積的軌跡，可以 根據(jù)需要來調(diào)整或者循環(huán)其溫度分布。迄今為止，大多數(shù)空間域動態(tài) 熱控制的實現(xiàn)都與微型化PCR熱循環(huán)有關(guān)。已經(jīng)證實，跨溫度區(qū)域 設(shè)置的連續(xù)的彎曲或者渦形通道可用于連續(xù)的通量擴增(參見，例如，F(xiàn)ukuba T, Yamamoto T, Naganuma T， Fujii T Microfabricated flow-through device for DNA amplification-towards in situ gene analysis CHEMICAL ENGINEERING JOURNAL 101 (1-3): 151-156 AUG 1 2004);已經(jīng)描述了具有來回移動的反應(yīng)塊的直接路徑的布置(參見， 例如，Chiou， J,， Matsudaira, R， Sonn, A., Ehrlich， D., Anal. Chem. 2001， 73,2018-2021);并且最后，己經(jīng)證實了通過回路的單獨反應(yīng)循環(huán)(參 見，例如，Jian Liu Markus Enzelberger Stephen Quake A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction Electrophoresis 2002， 23， 1531-1536)。
現(xiàn)有設(shè)備不能在每一熱循環(huán)期間使反應(yīng)體積通過檢測點，這可以 提供實時PCR的能力。它們也不使用多個各自包含多個反應(yīng)體積的平 行通道來提高生產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
--方面，本發(fā)明公開了一種用于進行需要不同溫度的核酸擴增反 應(yīng)的方法。該方法包括如下步驟(a)向包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的電潤 濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，每一個反應(yīng)區(qū)域具有核酸擴增反應(yīng) 所需的不同溫度，該反應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)該核酸擴增所需 要的試劑；(b)通過采用電潤濕，移動至少一個反應(yīng)液滴使其通過至少 兩個反應(yīng)區(qū)域來進行核酸擴增反應(yīng)，從而完成核酸擴增反應(yīng)的第一次 循環(huán)；以及(c)任選地重復步驟(b)來進行核酸擴增反應(yīng)的進一步循環(huán)。
另一方面，本發(fā)明公開了一種用于擴增目標核酸的方法。該方法 包括如下步驟(a)向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，該反應(yīng)液 滴含有目標核酸以及實現(xiàn)該核酸擴增反應(yīng)所需的試劑，該試劑含有核 酸引物；(b)釆用電潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列 的具有第一溫度的第一反應(yīng)區(qū)域，從而使目標核酸變性；(c)采用電潤 濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第二溫度的第二反應(yīng)區(qū)域，從而使引物與目標核酸退火；(d)采用電潤濕移動液滴(一 個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第三溫度的第三反應(yīng)區(qū)域，
從而發(fā)生核酸引物的延伸，由此擴增目標核酸；并且任選地重復步驟 (b)、 (c)和(d)。
本發(fā)明還提供了上述用于擴增目標核酸方法的一個方面。該方法
包括如下步驟(a)向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，該反應(yīng)液
滴含有目標核酸以及實現(xiàn)該核酸擴增所需的試劑，該試劑含有核酸引
物；(b)采用電潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具 有第一溫度的第一反應(yīng)區(qū)域，從而使目標核酸變性；(c)采用電潤濕移 動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第二溫度的第二反 應(yīng)區(qū)域，從而使得引物與目標核酸退火，并且從而發(fā)生核酸引物的延 伸，由此擴增目標核酸；并且任選地重復步驟(b)和(c)。
另一方面，本發(fā)明公開了一種用于在各種溫度下進行化學或生化 反應(yīng)的設(shè)備。該設(shè)備包括含有至少一個反應(yīng)通道、至少一個檢測點、 和至少一個返回通道的微流體裝置，以及用于驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體 積通過反應(yīng)通道(一個或多個)、檢測區(qū)域(一個或多個)、和返回通道(一 個或多個)的裝置。該設(shè)備還包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每個反應(yīng)區(qū)域 能夠保持和其它反應(yīng)區(qū)域不同的溫度，其中，反應(yīng)通道穿過至少兩個 反應(yīng)區(qū)i或。
本發(fā)明還提供了上述設(shè)備的一個方面。該設(shè)備包括含有多個反應(yīng) 通道、至少一個檢測點、至少一個返回通道的微流體裝置，以及用于 驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積通過這些反應(yīng)通道、檢測區(qū)域(一個或多個)、 返回通道(一個或多個)的裝置。該設(shè)備還包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每 個反應(yīng)區(qū)域能保持和其它反應(yīng)區(qū)域不同的溫度，其中，每個反應(yīng)通道 穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域，并且至少一個反應(yīng)通道流動地與至少一個檢 測區(qū)連接。
另一方面，本發(fā)明公開了一種用于在各種溫度下進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備。該設(shè)備包括含有多個電潤濕電極的電潤濕陣列，該電潤 濕陣極形成至少一個反應(yīng)通道、至少一個檢測點、以及至少一個返回 通道。該設(shè)備進一步包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每個反應(yīng)區(qū)域能夠保持 和其它反應(yīng)區(qū)域不同的溫度，其中，反應(yīng)通道至少穿過兩個反應(yīng)區(qū)域 并且電潤濕陣列能夠操控反應(yīng)液滴通過反應(yīng)通道(一個或多個)、檢測 區(qū)域(一個或多個)和返回通道(一個或多個)。
另一方面，本發(fā)明公開了一種用于進行需要不同溫度的反應(yīng)的方
法。該方法包括(a)向包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的電潤濕陣列中加入至
少一個反應(yīng)液滴，每個反應(yīng)區(qū)域都具有反應(yīng)所需要的不同溫度，所述 反應(yīng)液滴含有實現(xiàn)反應(yīng)所需要的試劑；(b)通過采用電潤濕移動至少一
個反應(yīng)液滴使其通過至少兩個反應(yīng)區(qū)域來進行反應(yīng)，從而完成反應(yīng)的
第一次循環(huán)；以及(c)任選地重復步驟(b)來進行反應(yīng)的進一步循環(huán)。
本發(fā)明還提供上述用于進行需要不同溫度反應(yīng)的方法的一個方 面。該方法包括(a)向微流體裝置中加入至少一個反應(yīng)液滴或反應(yīng)體 積，該微流體裝置包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域和至少一個檢測點，每個反 應(yīng)區(qū)域都具有反應(yīng)所需的不同溫度，反應(yīng)液滴含有實現(xiàn)反應(yīng)所需的試 劑;(b)通過使用驅(qū)動裝置移動至少一個反應(yīng)液或反應(yīng)體積使其通過至
少兩個反應(yīng)區(qū)域，從而完成反應(yīng)的第一次循環(huán)；以及(C)任選地重復步
驟(b)來進行反應(yīng)的進一步循環(huán)。


圖l說明了用于進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的設(shè)備 的一個具體實施方式
的部分橫截面。
圖2說明了采用電潤濕陣列進行實時聚合酶鏈式反應(yīng)的設(shè)備的一
個具體實施方式
。
具體實施方式
本發(fā)明涉及用于進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的方 法和設(shè)備。所述方法包括在微流體裝置上移動一個或多個反應(yīng)液滴 或反應(yīng)體積使其通過具有不同溫度的各反應(yīng)區(qū)域。所述設(shè)備包括微流 體裝置，該微流體裝置包括能夠移動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積使其通過各 反應(yīng)區(qū)域的適當驅(qū)動器。
采用電潤濕的方法和設(shè)備
在一個具體實施方式
中，所述設(shè)備包括含有多個電潤濕電極的電 潤濕陣列，并且所述方法包括采用電潤濕來移動一個或多個反應(yīng)液 滴，使其通過位于電潤濕陣列上的各種反應(yīng)區(qū)域，該電潤濕陣列具有 進行反應(yīng)的不同溫度。
該設(shè)備的電潤濕陣列可以包括一個或多個穿過該設(shè)備的至少兩 個反應(yīng)區(qū)域的反應(yīng)通道。為了將反應(yīng)液滴暴露于所需的溫度下從而進 行需要多個反應(yīng)溫度的反應(yīng)，可以將每個反應(yīng)區(qū)域保持在獨立的溫度 下。每一反應(yīng)通道可以包括，例如，多個位于電潤濕陣列上的電極， 它們一起能夠?qū)蝹€的液滴從一個電極移動到下一個電極，從而可以 采用電潤濕驅(qū)動將反應(yīng)液滴移過整個反應(yīng)通道?？梢允褂玫碾姖櫇耜?br> 列、電潤濕電極以及結(jié)合有它們的設(shè)備包括美國專利第6,565,727和 6,773,566號，以及美國專利申請公開第2004/0058450和2004/0055891
號中所描述的那些，這些文獻的內(nèi)容在這里特此引入作為參考。
可以用于進行需要多個反應(yīng)溫度的反應(yīng)的設(shè)備一般包括第一平 面底層，以及基本上和第一底層平行的第二平面底層。通常，在第一 底層上具有多個基本上平面的電極。通常，在第二個底層上具有多個 基本平面的電極或者一個大的基本上平面的電極。優(yōu)選地，位于第一 或第二底層上的單個或多個電極中的至少一個上涂有絕緣體。第一底 層上的電極(或者包覆電極的絕緣體)和第二底層上的多個或一個電極 (或包覆電極的絕緣體)之間的區(qū)域形成間隙，其中充滿了基本上與被設(shè)備操控的液體不會混合的填充流體。這種填充流體包括空氣、苯類
或者硅油。在一些具體實施方式
中，該間隙為約0.01mm至lmm，盡 管也可以使用更大或更小的間隙。通過間隙相對兩側(cè)電極所形成的穿 越間隙的電場來控制需要被操控的液滴的形成和移動。圖l顯示了用 于進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的設(shè)備的一個具體實施 方式的部分橫截面，其中附圖標記含義如下22—第一底層；24—第 二底層；26—液滴；28a和28b——疏水絕緣涂層；30—填充流體；32a 和32b——電極。
同樣也可以使用僅在一個底層上含有電極的設(shè)備(或者僅含有一 個底層的設(shè)備)來進行需要多個反應(yīng)溫度的反應(yīng)。美國專利申請公開 第2004/0058450和2004/0055891號描述了僅在一個底層上具有電潤濕 電極陣列的設(shè)備，其內(nèi)容在這里特此引入作為參考。該設(shè)備包括第一 底層以及包埋于其上或與其連接的控制電極陣列。 一層介電層覆蓋著 這些控制電極。在該電極陣列上，鋪設(shè)有參比電位下的導線的二維網(wǎng) 格，每根導線(例如，線或棒)位于相鄰的驅(qū)動電極之間。
用于進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備的每一反應(yīng)通道包括至少兩個 反應(yīng)區(qū)域。這些反應(yīng)區(qū)域保持在特定的溫度下，從而可以進行需要多 個反應(yīng)溫度的反應(yīng)。根據(jù)正在進行的特定反應(yīng)，在適當?shù)臅r間使反應(yīng) 液滴移動通過每一反應(yīng)區(qū)域(或者使其保持在其中)。使用任何加熱或 者冷卻的方式(包括，例如，電阻、感應(yīng)或者紅外線加熱)將反應(yīng)區(qū)域 中的溫度保持基本恒定。進行反應(yīng)的設(shè)備可以進一步包括用于產(chǎn)生或 維持將反應(yīng)區(qū)域保持在基本恒定溫度所需熱或冷的機構(gòu)。
用于進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備可以任選地具有位于反應(yīng)通道 之中或之后的檢測點。在一個具體實施方式
中，該設(shè)備在每一反應(yīng)通 道的最后一個反應(yīng)區(qū)域之后都具有檢測點?？梢栽O(shè)計同樣屬于設(shè)備中 電潤濕陣列一部分的檢測點，以使得在該檢測點處能夠檢測反應(yīng)的標 記(例如，指示反應(yīng)發(fā)生或沒有發(fā)生的標記)或者反應(yīng)液滴中的分析物(用于定量，等等)。例如，檢測點可以包括設(shè)備中的透明或半透明的 區(qū)域，使得能在光學上或視覺上檢測到作為反應(yīng)特征的光學標記。另 外，在檢測點可以設(shè)置檢測器，使得在有或者沒有透明或半透明區(qū)域 的情況下都能檢測到反應(yīng)標記?？梢允褂糜衫绮ＡЩ蛩芰现瞥傻牡?層以及由例如氧化銦錫或薄的透明金屬薄膜制成的電極來構(gòu)造透明 或半透明的檢測點。反應(yīng)標記可以包括，例如，熒光或者放射等等， 并且可以使用的標記包括熒光性和放射性標記。另外，檢測點可以包 括結(jié)合酶或者其它試劑使得能夠檢測反應(yīng)液滴中的分析物。
如上所述，設(shè)備的反應(yīng)通道(一個或多個)可以包括電潤濕電極的 陣列。此外，該反應(yīng)通道可以更進一步包括用于幫助限定流體路徑的 導管或管道。該管道或?qū)Ч芸梢允请姖櫇耠姌O本身的一部分，可以是 電極上絕緣涂層的一部分，或者可以是和電極分離的。
反應(yīng)通道可以具有各種幾何形狀。例如，反應(yīng)通道可以是包括至 少兩個反應(yīng)區(qū)域的環(huán)形通道，或者是穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域的直線通 道，或者是其它形狀的通道。此外，該設(shè)備可以包括電潤濕電極陣列， 該電潤濕電極陣列包括多個可能的反應(yīng)通道以及多個反應(yīng)區(qū)域的，使 得該設(shè)備可以為各種反應(yīng)而重構(gòu)。
該設(shè)備也可以包括從反應(yīng)通道末端或從檢測點(如果該設(shè)備包括 位于反應(yīng)通道末端之后的檢測點)至相同反應(yīng)通道起點(或至新的、相 同的反應(yīng)通道)的返回通道，從而使得使用相同的試劑就可以進行反 應(yīng)的多次循環(huán)。也就是說，該設(shè)備可以包含返回通道，從而可以使用 環(huán)形或彎曲通道作為反應(yīng)液滴的總通道來進行多次反應(yīng)循環(huán)。如同反 應(yīng)通道和檢測點一樣，返回通道含有一個或多個電潤濕電極，并且是 設(shè)備中電潤濕陣列的一部分。返回通道可以包括用于幫助限定流體路 徑的導管或者管道。返回通道可以穿過一個或多個反應(yīng)區(qū)域，或者可 以整個繞開反應(yīng)區(qū)域。此外，返回通道可以具有基本上恒定的溫度(與 反應(yīng)區(qū)域中保持的溫度之一相同或不同)，該恒定的溫度通過適當?shù)募訜峄蚶鋮s機構(gòu)來保持。此外，可以操作返回通道，使得反應(yīng)液滴回 到相同或另一個反應(yīng)通道起點快于這些反應(yīng)液滴在反應(yīng)通道中的時 間。
當在一個設(shè)備中含有多個反應(yīng)通道時，可以具有多個返回通道 (例如，每個反應(yīng)通道具有一個返回通道)或者返回通道的數(shù)量少于反 應(yīng)通道(例如，只有一個返回通道)。當返回通道少于反應(yīng)通道時，可 以在電潤濕陣列上操控液滴，使得在第一次反應(yīng)循環(huán)中穿過特定通道 的反應(yīng)液滴回到相同的反應(yīng)通道來進行第二次反應(yīng)循環(huán)，因此使得特 定反應(yīng)液滴每一漸進循環(huán)的結(jié)果能夠與該相同液滴以前循環(huán)的結(jié)果 進行比較。
在其它具體實施方式
中，為了進行相同反應(yīng)的循環(huán)，可以在沒有 返回通道的情況下將反應(yīng)液滴移動到相同反應(yīng)通道的起點。當反應(yīng)通 道和任何檢測點形成一個環(huán)路，或者當反應(yīng)通道和任何檢測點不形成 環(huán)路(例如，直線通道)并且反應(yīng)液滴沿相同通道被反方向移回相同反 應(yīng)通道的起點時，可以不需要這樣的返回通道。如需要，為了實現(xiàn)一 些反應(yīng)，含有電潤濕陣列的設(shè)備能使反應(yīng)液滴在陣列中單向移動以及 在通道中雙向移動。此外，這種設(shè)備能使液滴在進行特定反應(yīng)所需的 陣列中沿著任何方向的組合移動，并且這種設(shè)備并不僅限于在電潤濕 陣列中做直線運動。
該設(shè)備也可以包括將液體(例如，反應(yīng)液滴、填充液體，或者其 它液體)分配入設(shè)備以及將液體(例如，反應(yīng)液滴、廢液、填充液體) 從設(shè)備中排出所需要的適當結(jié)構(gòu)和機構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)可以包括位于設(shè)備 的殼體或底層中的一個或多個孔，從而從電潤濕陣列中的間隙放置或 排出液體。從設(shè)備中分配或排出液體的適當機構(gòu)包括那些使用抽吸、 壓力等的機構(gòu)，并且也包括吸液管、毛細管等等。此外，在這里所述
的設(shè)備中，也可以使用例如，如美國專利第6，565,727號中所描述的由 電潤濕陣列形成的儲液槽以及由電潤濕陣列形成的滴量計。進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的方法包括向這里所 述設(shè)備的電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，然后通過采用電潤濕 移動該至少一個反應(yīng)液滴使其穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域來進行反應(yīng)。所 述至少兩個反應(yīng)區(qū)域保持在反應(yīng)所需的不同溫度下。如果需要，通過 采用電潤濕陣列再一次移動該至少一個反應(yīng)液滴使其穿過至少兩個 反應(yīng)區(qū)域，可以使用相同的液滴重復該反應(yīng)。為了特的反應(yīng)需要或優(yōu) 選多個反應(yīng)循環(huán)時，有可能會需要這種重復操作。
反應(yīng)液滴(一個或多個)含有進行所期望反應(yīng)所需要的試劑，并且 該反應(yīng)液滴(包括任何待測樣品)可以在設(shè)備外制備，或者通過采用電 潤濕陣列在設(shè)備中混合一個或多個液滴來制備。此外，可以在反應(yīng)期 間，或者在反應(yīng)循環(huán)之后以及進行新的反應(yīng)循環(huán)之前將其它試劑加入 到反應(yīng)液滴中(例如，通過混入一種含有適當試劑的新反應(yīng)液滴)。
這里所述的設(shè)備適合于，但不僅限于進行需要溫度循環(huán)的核酸擴 增反應(yīng)。也就是說，該設(shè)備適用于進行擴增核酸的反應(yīng)，該反應(yīng)需要 多于一種的溫度來進行總反應(yīng)中的部分反應(yīng)，例如，核酸(一種或多 種)的變性，核酸引物與核酸(一種或多種)的退火，以及核酸的聚合 (即，核酸引物的延伸)。
很多核酸擴增方法需要反應(yīng)溫度從較高的變性溫度到較低的聚 合溫度的循環(huán)，并且其它方法需要這樣的反應(yīng)溫度循環(huán)，即，從較高 的變性溫度到較低的退火溫度，再到處于變性溫度和退火溫度之間的 聚合溫度。 一些這樣的核酸擴增反應(yīng)包括，但不限于，聚合酶鏈式反 應(yīng)(PCR)、連接酶鏈式反應(yīng)、以及轉(zhuǎn)錄依賴擴增反應(yīng)。
在一個特定的具體實施方式
中，提供了一種用于進行需要不同溫
度的反應(yīng)的方法。該方法包括(a)在包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的電潤濕陣
列中加入至少一個反應(yīng)液滴，以及(b)通過采用電潤濕移動該至少一個 反應(yīng)液滴使其通過至少兩個反應(yīng)區(qū)域，從而完成反應(yīng)的第一次循環(huán)。 每一反應(yīng)區(qū)域具有反應(yīng)所需的不同溫度。反應(yīng)液滴含有實現(xiàn)反應(yīng)所需的試劑。為了進行反應(yīng)的進一步循環(huán)，可以任選地重復步驟(b)。
在另一個特定的具體實施方式
中，提供了一種用于進行需要不同
溫度的核酸擴增反應(yīng)的方法。該方法包括(a)在包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域
的電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，以及(b)通過采用電潤濕移動 該至少一個反應(yīng)液滴使其通過至少兩個反應(yīng)區(qū)域，從而完成核酸擴增 反應(yīng)的第一次循環(huán)。每一反應(yīng)區(qū)域具有核酸擴增反應(yīng)所需的不同溫 度。反應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增所需的試劑。這種試劑 可以包括適當?shù)暮怂嵋?、核苷酸、?例如，聚合酶)、以及其它試 劑。為了進行核酸擴增反應(yīng)的進一步循環(huán)，可以任選地重復步驟(b)。 在一個進一步的具體實施方式
中，提供了擴增目標核酸的另一種
方法。該方法包括以下步驟(a)向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液
滴，該反應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增所需的試劑，該試劑
包括核酸引物；(b)采用電潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤 濕陣列的具有第一溫度的第一反應(yīng)區(qū)域，從而使目標核酸變性；(c) 采用電潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第二 溫度的第二反應(yīng)區(qū)域，從而使引物與目標核酸退火；以及(d)采用電潤 濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第三溫度的第 三反應(yīng)區(qū)域，從而發(fā)生核酸引物的延伸，由此擴增目標核酸。為了進 行核酸擴增反應(yīng)的進一步循環(huán)，可以任選地重復步驟(b)、 (c)和(d)。
在又一具體實施方式
中，提供了另一種擴增目標核酸的方法，該 方法包括如下步驟(a)向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，該反 應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增反應(yīng)所需的試劑，該試劑包括 核酸引物；(b)采用電潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣 列的具有第一溫度的第一反應(yīng)區(qū)域，從而使目標核酸變性；(c)采用電 潤濕移動液滴(一個或多個)，使其通過電潤濕陣列的具有第二溫度的 第二反應(yīng)區(qū)域，從而使引物與目標核酸退火并因此發(fā)生核酸引物的延 伸，由此擴增目標核酸。為了進行核酸擴增反應(yīng)的進一步循環(huán)，可以任選地重復步驟(b)和(C)。
當該方法用于進行PCR時，反應(yīng)液滴中的試劑可以包括脫氧核苷
三磷酸鹽、核酸引物、以及聚合酶，例如，耐熱聚合酶如r"《DNA聚合酶。
示例性
具體實施例方式
本發(fā)明公開了一種用于在各種溫度下進行化學或生化反應(yīng)的方
法，該方法通過以下方式來進行移動多個反應(yīng)液滴使其通過保持在 所要求溫度下的殼體的某些部分，在所期望的時間點，這些反應(yīng)液滴 既可以通過也可以不通過檢測點。為達到上述目的所使用的設(shè)備包 括用于移動這些反應(yīng)使其通過具有控制溫度的區(qū)域的通道(一個或 多個)、任選的檢測點、以及任選的用于將溫度循環(huán)重復所需次數(shù)的 返回通道。
圖2顯示了一個用于實現(xiàn)實時PCR的特定具體實施方式
。如圖2所
示，電潤濕控制電極的十四條平行線為移動反應(yīng)液滴使其通過三個溫
度區(qū)域提供了驅(qū)動力。每一通道一開始被加入最多十滴PCR反應(yīng)液 滴。當液滴離開最后一個溫度控制區(qū)域時每個通道穿過一個專用檢測 點。進行熒光測量，然后特定液滴或者被排出或者通過返回通道回到 第一溫度區(qū)域。在該特定的布局中，所有的十四條活動通道都使用一 條返回通道。優(yōu)選地，當返回環(huán)形通道可以在比每一通過溫度控制區(qū) 域的通道更高的通過量下操作時，可是使用該方案。例如，如果液滴 在20Hz下從一個電極移動到下一個電極，十四個正向通道和一個返回 通道的相應(yīng)轉(zhuǎn)換頻率是280Hz。同樣優(yōu)選地，在正向通道的之前或之 后，或者在兩端，采取措施使液滴重新排列，從而使它們以相同的順 序進出每一循環(huán)。這種方法尤其適用于定量PCR(當所有反應(yīng)都應(yīng)處 于非常類似的、理論上相同的溫度變化過程時)。使用其它流體或微流體驅(qū)動器的方法和設(shè)備
為了驅(qū)動反應(yīng)液滴通過設(shè)備上的反應(yīng)區(qū)域，除了采用電潤濕陣列 和電極以外，這里所述的方法和設(shè)備也可以使用其它的驅(qū)動裝置。也 就是說，在這里所述的設(shè)備和方法中，可以使用任何用于驅(qū)動反應(yīng)液 滴或反應(yīng)體積的機構(gòu)，其包括，但不限于熱驅(qū)動器、基于氣泡的驅(qū) 動器、以及基于微閥的致動器。這里，這里對于采用電潤濕來操控流 體進行反應(yīng)的方法和設(shè)備的說明也同樣適用于使用其它驅(qū)動裝置的 方法和設(shè)備。
因此，用于進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的設(shè)備可以 包括一個微流體裝置，該微流體裝置包括至少一個穿過該設(shè)備的至少 兩個反應(yīng)區(qū)域的反應(yīng)通道。該設(shè)備可以包括一個或多個檢測點以及一 個或多個返回通道。該設(shè)備進一步包括用于驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積
通過反應(yīng)通道(一個或多個:i、檢測點(一個或多個)、和/或返回通道(一
個或多個)的裝置；設(shè)備的反應(yīng)通道(一個或多個)、檢測點(一個或多 個)、和/或返回通道(一個或多個)可以以各種方式流動地連接。
在一個具體實施方式
中，該設(shè)備包括多個穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域 的反應(yīng)通道，其中每一反應(yīng)通道可以包含多個的反應(yīng)液滴/體積。在 另一個具體實施方式
中，該設(shè)備包括至少一個位于一個或多個反應(yīng)通 道之中或之后的檢測點。在這樣的具體實施方式
中，檢測點(一個或 多個)和一個或多個反應(yīng)通道可以流動地連接。
如上所述，反應(yīng)通道可以具有各種幾何形狀。例如，反應(yīng)通道可 以是包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的環(huán)形通道，穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域的直 線通道，或者其它形狀的通道。
該設(shè)備也可以包括從反應(yīng)通道末端或從檢測點(如果該設(shè)備包括 位于反應(yīng)通道末端之后的檢測點)到相同反應(yīng)通道起點(或者到新的、 相同的反應(yīng)通道)的返回通道，從而使得可以使用相同的試劑來進行 反應(yīng)的多次循環(huán)。也就是說，該設(shè)備可以包含返回通道，從而可以使用環(huán)路或彎曲通道作為反應(yīng)液滴/體積的總路徑來進行多次反應(yīng)循 環(huán)。返回通道可以穿過一個或多個反應(yīng)區(qū)域，或者可以整個繞開反應(yīng) 區(qū)域。此外，返回通道可以具有基本上恒定的溫度(和反應(yīng)區(qū)域中所 保持的溫度之一相同或不同)，該溫度由適當?shù)募訜峄蚶鋮s機構(gòu)來保 持。此外，可以操作返回通道，使得反應(yīng)液滴/體積回到相同或新的 反應(yīng)通道起點快于該反應(yīng)液滴/體積在反應(yīng)通道中的時間。
當設(shè)備中含有多個反應(yīng)通道時，可以具有多個返回通道(例如， 每一反應(yīng)通道具有一個返回通道)或者可以返回通道的數(shù)量少于反應(yīng) 通道(例如，只有一個返回通道)。當返回通道少于反應(yīng)通道時，可以 在裝置上操控液滴/體積，使得在第一次反應(yīng)循環(huán)中穿過特定通道的 反應(yīng)液滴/體積回到用于進行第二次反應(yīng)循環(huán)的相同反應(yīng)通道，因此 使得特定反應(yīng)液滴/體積的每一漸進循環(huán)的結(jié)果能夠與該相同反應(yīng)液 滴/體積以前循環(huán)的結(jié)果進行比較。
在其它的具體實施方式
中，為了進行相同反應(yīng)的循環(huán)，可以在沒 有返回通道的情況下將反應(yīng)液滴/體積移動到相同反應(yīng)通道的起點。 當反應(yīng)通道和任何檢測點形成環(huán)路，或者當反應(yīng)通道和任何檢測點不 形成環(huán)路(例如，直線通道)并且反應(yīng)液滴/體積沿相同通道反向移動返 回相同反應(yīng)通道的起點時，可能不需要這樣的返回通道。
可以將多個反應(yīng)體積/液滴同時移動通過微流體裝置。此外，可 以使用具有多個反應(yīng)體積/液滴的多個反應(yīng)通道。
在一個特定的具體實施方式
中，該設(shè)備包括多個反應(yīng)通道、至少 一個位于反應(yīng)通道之中或之后的檢測點、以及至少一個返回通道。在 這樣的具體實施方式
中，當使用一個返回通道時，該多個反應(yīng)通道、 至少一個檢測點以及返回通道可以流動地連接，從而形成環(huán)路。當使 用多個返回通道時，可以形成多個環(huán)路。
同樣如上所述，進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的方法 包括向這里所述微流體裝置中加入至少一個反應(yīng)液滴/體積，然后通過使用任何驅(qū)動裝置移動該至少一個反應(yīng)液滴/體積使其穿過至少兩 個反應(yīng)區(qū)域。所述至少兩個反應(yīng)區(qū)域保持在反應(yīng)所需的不同溫度下。 如果需要，通過使用驅(qū)動裝置再次移動該至少一個反應(yīng)液滴使其通過 至少兩個反應(yīng)區(qū)域，可以使用相同的反應(yīng)液滴重復所述反應(yīng)。當特定 反應(yīng)需要或者優(yōu)選多個反應(yīng)循環(huán)時，可能需要這種重復操作。
雖然上文已經(jīng)參照本發(fā)明特定的具體實施方式
對本發(fā)明做出了 詳細地說明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，在不背離本發(fā)明精神和 范圍的前提下，可以對其作出各種變化及改變。
權(quán)利要求
1.一種用于進行需要不同溫度的核酸擴增反應(yīng)的方法，該方法包括如下步驟(a)向包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，每一個反應(yīng)區(qū)域具有核酸擴增反應(yīng)所需的不同溫度，反應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增所需的試劑；(b)通過采用電潤濕移動至少一個反應(yīng)液滴使其通過至少兩個反應(yīng)區(qū)域來進行核酸擴增反應(yīng)，從而完成核酸擴增反應(yīng)的第一次循環(huán)；(c)任選地重復步驟(b)來進行核酸擴增反應(yīng)的進一步循環(huán)。
2. —種用于擴增目標核酸的方法，其包括如下步驟(a) 向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，所述反應(yīng)液滴含有目 標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增所需的試劑，該試劑包括核酸引物；(b) 采用電潤濕移動液滴，使其通過電潤濕陣列的具有第一溫度的 第一反應(yīng)區(qū)域，從而使目標核酸變性；(c) 采用電潤濕移動液滴，使其通過電潤濕陣列的具有第二溫度的 第二反應(yīng)區(qū)域，從而使引物與目標核酸退火；(d) 采用電潤濕移動液滴，使其通過電潤濕陣列的具有第三溫度的 第三反應(yīng)區(qū)域，從而發(fā)生核酸引物的延伸，由此擴增目標核酸；并且任選地重復步驟(b)、 (c)和(d)。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其進一步包括(e) 采用電潤濕將液滴從第三反應(yīng)區(qū)域移動到檢測點；(f) 檢測反應(yīng)液滴中已擴增核酸的存在。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其進一步包括 沿電潤濕陣列的返回通道，將反應(yīng)液滴從檢測點移動到第一個反應(yīng)區(qū)域，并且重復步驟(b)、 (c)和(d)。
5. —種用于擴增目標核酸的方法，其包括如下步驟 (a)向電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng)液滴，該反應(yīng)液滴含有目標核酸以及實現(xiàn)核酸擴增所需試劑，該試劑包括核酸引物；(b) 采用電潤濕移動液滴，使其通過電潤濕陣列的具有第一溫度的 第一反應(yīng)區(qū)域，使得目標核酸變性；(c) 采用電潤濕移動液滴，使其通過電潤濕陣列的具有第二溫度的第二反應(yīng)區(qū)域，使得引物與目標核酸退火并且使得發(fā)生核酸引物的延伸，由此擴增目標核酸；并且 任選地重復步驟(b)和(c)。
6. —種用于在各種溫度下進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備，該設(shè)備包括含有至少一個反應(yīng)通道、至少一個檢測點、以及至少一個返回通道的微流體裝置；用于驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積通過反應(yīng)通道、檢測區(qū)域、返回通道的裝置；至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每一反應(yīng)區(qū)域能夠保持和其它反應(yīng)區(qū)域不同 的溫度，其中，反應(yīng)通道穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域。
7. 如權(quán)利要求6所述的設(shè)備，其中，至少一個反應(yīng)通道、至少一 個檢測點、以及至少一個返回通道形成流體連接的環(huán)路。
8. 如權(quán)利要求6所述的設(shè)備，其中，用于驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體 積的裝置包括一個或多個電潤濕電極、熱驅(qū)動器、基于氣泡的驅(qū)動器 或基于微閥的驅(qū)動器。
9. 一種用于在各種溫度下進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備，該設(shè)備 包括含有多個反應(yīng)通道、至少一個檢測點、以及至少一個返回通道的 微流體裝置；用于驅(qū)動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積通過反應(yīng)通道、檢測區(qū)域、以及返 回通道的裝置；以及至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每一反應(yīng)區(qū)域能夠保持和其它反應(yīng)區(qū)域不同的溫度，其中每一反應(yīng)通道穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域，并且 其中至少一個反應(yīng)通道與至少一個檢測區(qū)流體連接。
10. —種用于在各種溫度下進行化學或生化反應(yīng)的設(shè)備，該設(shè)備 包括包括多個電潤濕電極的電潤濕陣列，所述電潤濕電極形成至少一 個反應(yīng)通道、至少一個檢測點、以及至少一個返回通道，以及至少兩個反應(yīng)區(qū)域，每一反應(yīng)區(qū)域能夠保持和其它反應(yīng)區(qū)域不同 的溫度，其中，所述反應(yīng)通道穿過至少兩個反應(yīng)區(qū)域并且電潤濕陣列能夠 操控反應(yīng)液滴通過反應(yīng)通道、檢測點，以及返回通道。
11. 如權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其中每一反應(yīng)通道與至少一個檢 測點相鄰。
12. —種用于進行需要不同溫度的反應(yīng)的方法，該方法包括(a) 向包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域的電潤濕陣列中加入至少一個反應(yīng) 液滴，每一反應(yīng)區(qū)域具有反應(yīng)所需的不同溫度，所述反應(yīng)液滴含有實 現(xiàn)反應(yīng)所需的試劑；(b) 通過釆用電潤濕移動至少一個反應(yīng)液滴使其通過至少兩個反 應(yīng)區(qū)域來進行反應(yīng)，從而完成反應(yīng)的第一次循環(huán)；以及(c) 任選地重復步驟(b)來進行反應(yīng)的進一步循環(huán)。
13. —種用于進行需要不同溫度的反應(yīng)的方法，該方法包括(a) 向微流體裝置中加入至少一個反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積，該微流體 裝置包括至少兩個反應(yīng)區(qū)域和至少一個檢測點，每一反應(yīng)區(qū)域具有反 應(yīng)所需的不同溫度，所述反應(yīng)液滴含有實現(xiàn)反應(yīng)所需的試劑；(b) 通過使用驅(qū)動裝置移動至少一個反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積使其通 過至少兩個反應(yīng)區(qū)域，從而完成反應(yīng)的第一次循環(huán)；以及(c) 任選地重復步驟(b)來進行反應(yīng)的進一步循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于進行需要多個反應(yīng)溫度的化學或生化反應(yīng)的方法和設(shè)備。所述方法涉及在微流體裝置上移動一個或多個反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積，使其通過具有不同溫度的各反應(yīng)區(qū)域。所述設(shè)備包括微流體裝置，該微流體裝置包括能移動反應(yīng)液滴或反應(yīng)體積使其通過各反應(yīng)區(qū)域的適當驅(qū)動器。
文檔編號C12Q1/68GK101287845SQ200680025497
公開日2008年10月15日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者A·D·申德羅夫, M·G·波拉克 申請人:先進液體邏輯公司;杜克大學