一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法，將底物α-乙酸萘酯和底物β-乙酸萘酯按1∶1等體積混合作為混合底物，制備吸附混合底物的濾紙；采集蚜蟲田間種群，勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，濾紙顯色越深，個體酶活性越高。本發(fā)明所述方法能夠通過檢測個體非特異性酯酶（NSE）活性來判斷田間種群的抗性水平。通過吸附混合底物的濾紙上個體顯色顏色的深淺，與標準色板比較，從而得到抗性個體頻率，進而了解種群抗性水平。
【專利說明】一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法及檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)害蟲對有機磷抗藥性的快速生化檢測方法及混合底物檢測試劑
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【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲抗藥性的形成和發(fā)展給化學防治造成了很大困難，如何快速、準確的檢測蚜蟲抗藥性水平是非常重要的。在昆蟲抗藥性檢測方面目前主要是使用生物測定法和酶活性分析法，前者使用蟲量大，操作復雜，不易掌握；后者對操作條件要求高，而且需要一定的儀器設(shè)備等條件，不適合在基層和田間推廣使用。
[0003]目前蚜蟲對有機磷的抗性檢測主要是通過傳統(tǒng)的生物測定一葉片藥膜法進行:取新鮮無污染的甘藍葉片浸在系列濃度的有機磷類藥液中15秒，以蒸餾水(含
0.05%Triton-X100)作對照，室內(nèi)晾干后接大小一致的無翅成蚜20頭，每個濃度3次重復，24小時后檢查結(jié)果。然后用POLO或SAS軟件處理數(shù)據(jù)，計算LC5tl值，根據(jù)LC5tl值的比較來判斷蚜蟲對有機磷類藥劑的抗性水平。
[0004]有機磷殺蟲藥劑作用于昆蟲非特異性酯酶，昆蟲非特異性酯酶活性越高，表明對藥劑抗性越高。非特異性酯酶活性越高，分解其底物a-乙酸萘酯和3-乙酸萘酯能力越強，分解產(chǎn)物與顯色劑結(jié)合顯色就越深。因此顯色越深的個體，表明其對有機磷藥劑抗性越強。1981年Nicole Pasteur和George P.使用濾紙法測定蚊蟲對有機磷的抗性(NicolePasteur, George P.1981.Mosquito News:Filter paper test for rapid determinationof phenotypes with high esterase activity in organophosphate resistantmosquitoes[J])。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測與有機磷類殺蟲劑抗性相關(guān)的蚜蟲非特異性酯酶活性的方法及檢測試劑盒。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種檢測蚜蟲非特異性酯酶(NSE)活性的方法，其是將底物a -乙酸萘酯(a -NA)和底物P -乙酸萘酯(P -NA)按1:1等體積混合作為混合底物，制備吸附混合底物的濾紙；采集蚜蟲田間種群，勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，濾紙顯色越深，個體酶活性越高。
[0007]進一步地，所述方法具體包括以下步驟:
[0008](I)配制底物:用丙酮配制質(zhì)量濃度(w/v)為1%的a -乙酸萘酯和質(zhì)量濃度(w/v)為1%的P -乙酸萘酯，4°C冰箱保存；
[0009](2 )將步驟(1)配制的底物按1:1等體積混合，將濾紙浸入其中，2min后，室溫陰干;
[0010](3)用pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的固藍B鹽作為勻漿液，勻漿單頭蚜蟲，取1/20體積的勻漿液滴到步驟(2)中制備的濾紙上，室溫避光放置15min ；[0011](4)待顯色完全后，統(tǒng)計步驟(3)中的個體顯色顏色，與標準色板對比，濾紙顯色越深，個體酶活性越高。
[0012]其中，步驟(3)中pH7.0的磷酸緩沖液，是由磷酸二氫鉀(KH2P04)和十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4 ? 12H20)配制，濃度為 0.04M。
[0013]本發(fā)明還提供了一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的檢測試劑盒，該試劑盒包括:
[0014]( I)吸附有混合底物的濾紙:
[0015]將丙酮配制的質(zhì)量濃度為1%的a -乙酸萘酯和質(zhì)量濃度為1%的P -乙酸萘酯等體積混合，吸附于定性濾紙上，陰干，錫箔紙包裹于4°C保存；
[0016](2)顯色劑緩沖液:以0.04M、pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的顯色劑固藍B，該顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0017]本發(fā)明還提供了利用前述檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法，檢測蚜蟲種群抗性個體頻率的方法。
[0018]具體為，采集蚜蟲田間種群，按照前述方法勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，統(tǒng)計個體顯色顏色，每一種群重復檢測100頭以上，計算種群抗性個體頻率；
[0019]所述抗性為有機磷抗性。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:
[0021 ] 本發(fā)明以a -乙酸萘酯(a -NA)和@ -乙酸萘酯(P -NA)混合底物對蚜蟲田間種群的非特異性酯酶的生物化學性質(zhì)進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各測試種群抗性個體頻率與生物測定數(shù)據(jù)存在明顯相關(guān)性。
[0022]因此，本發(fā)明所述方法能夠通過檢測個體非特異性酯酶(NSE)活性來判斷田間種群的抗性水平。通過吸附混合底物的濾紙上個體顯色顏色的深淺，與標準色板比較，從而得到抗性個體頻率，進而了解種群抗性水平。
[0023]本發(fā)明方法適合應(yīng)用于田間測定蚜蟲種群抗性酯酶個體的頻率分布，明確田間蚜蟲種群抗性頻率，從而及早掌握蚜蟲種群抗性發(fā)展動態(tài)，為合理使用農(nóng)藥、制定治理抗性方案提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明所述檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法流程圖。
[0025]圖2為比色標準色板。
[0026]圖3為本發(fā)明實施例1中蚜蟲非特異性酯酶在濾紙上的顯色情況。
[0027]圖4為不同底物蚜蟲非特異性酯酶在濾紙上的顯色情況。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0029]實施例1
[0030]1、研究對象
[0031 ] 本發(fā)明研究對象為全國各地采集的田間樣本，室內(nèi)飼養(yǎng)蚜蟲種群。
[0032]2、方法[0033]用混合底物濾紙顯色的方法，檢測蚜蟲田間種群非特異性酯酶活性，根據(jù)顯色顏色深淺，與標準色板對比統(tǒng)計結(jié)果，具體流程參見附圖1。
[0034]2.1蚜蟲樣本的采集及處理
[0035]采集無翅成蚜于離心管中，液氮速凍后保存到_80°C冰箱中。
[0036]2.2濾紙底物的制備
[0037]用丙酮制備1%的(w/v)的a-NA和P-NA,各稱取Ig a-NA和P_NA用丙酮定容至100ml，保存于4°C冰箱中，使用前取等體積的二者混合，濾紙浸入其中計時2min，取出后陰干。
[0038]2.3緩沖液顯色劑的制備
[0039]0.04M、pH7.0 的磷酸緩沖液(PBS)的配制，稱取 8.75gNa2HP04 ? Iffi2O 和 2.12gKH2PO4,用蒸懼水定容至1L。
[0040]用上述配制的緩沖液配制0.15%固藍B鹽，稱取0.03g固藍B鹽溶解到20ml的PBS中，作為勻漿液、顯色劑，注意此勻漿液需現(xiàn)配現(xiàn)用。用該勻漿液勻漿單頭蚜蟲，取1/20體積的勻漿液滴到上述制備的濾紙上，室溫避光放置15min，被測種群須檢測100頭以上。
[0041]2.4濾紙法非特異性酯酶活性測定結(jié)果統(tǒng)計計算
[0042]有機磷殺蟲藥劑作用于昆蟲非特異性酯酶，昆蟲非特異性酯酶活性越高，表明對藥劑抗性越高。非特異性酯酶活性越高，分解其底物a-乙酸萘酯和3-乙酸萘酯能力越強，分解產(chǎn)物與顯色劑結(jié)合顯色就越深。因此顯色越深的個體，表明其對有機磷藥劑抗性越強。
[0043]根據(jù)標準色板(如圖2所示)，對比顯色與2號顏色相同或比2號顏色深的個體為低敏感個體即抗性個體；顯色與4號顏色相同或比4號顏色淺的個體為高敏感個體；處于2號與4號之間的為中度敏感個體。對比區(qū)分個體敏感度情況(如圖3所示)，每一種群重復檢測100頭以上，計算種群抗性個體頻率。
[0044]抗性個體頻率=抗性個體數(shù)/供試蟲總數(shù)
[0045]實施例2
[0046]1、研究對象
[0047]研究對象為全國各地采集的田間樣本，室內(nèi)飼養(yǎng)蚜蟲種群。
[0048]2、方法
[0049]采用單一底物，a -NA或P -NA,勻漿液采用普通的磷酸緩沖液。
[0050]2.1蚜蟲樣本的采集及處理
[0051]采集無翅成蚜于離心管中，液氮速凍后保存到_80°C冰箱中。
[0052]2.2底物的制備
[0053]用丙酮制備1%的(w/v)的a -NA或@ -NA,保存于4°C冰箱中。
[0054]2.3顯色劑的制備
[0055]用蒸餾水配制0.15%固藍B鹽，作為顯色劑，注意此勻漿液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取1/20體積的勻漿液滴到上述制備的濾紙上，室溫避光放置15min，被測種群須檢測100頭以上。
[0056]2.4緩沖液的制備
[0057]0.04M、pH7.0 的磷酸緩沖液(PBS)的配制，稱取 8.75gNa2HP04 ? Iffi2O 和 2.12gKH2PO4,用蒸懼水定容至1L。[0058]2.5用2.4中制備的PBS勻漿2.1準備好的單頭蚜蟲，取1/20勻漿液點樣至定性濾紙上，將點過樣的濾紙浸入2.2制備的底物中2min，取出用薄紙吸除濾紙上多余的水分，再將濾紙浸入2.3制備的顯色劑中4min，取出后將濾紙條過蒸餾水，之后在10%的冰醋酸中固定數(shù)分鐘，置于黑暗中晾干。
[0059]顯色情況見圖4，從圖4可以明顯看出，由左至右底物依次為:a -NA、^ -NA、a -NA與@ -NA等體積混合底物。從實施例1和實施例2的具體操作步驟中可以明顯看到，單獨用a -NA、^ -NA做底物，顯色顏色較淺，而混合底物較單一底物來說，由于對不同羧酸酯酶同工酶更有針對性，可滿足不同同工酶的水解要求，體現(xiàn)在最終的反應(yīng)顏色上，顯色顏色更深、更充分，因此更容易將不同抗性水平的種群區(qū)分開。另外，本發(fā)明還將勻漿液改為緩沖液顯色劑，大大簡化了操作步驟。
[0060]實施例3試劑盒的制備及應(yīng)用
[0061]1.吸附有混合底物的濾紙:
[0062]將丙酮配制的質(zhì)量濃度為1%的a -乙酸萘酯和質(zhì)量濃度為1%的0 -乙酸萘酯等體積混合，吸附于定性濾紙上，陰干，錫箔紙包裹于4°C保存；
[0063]2.顯色劑緩沖液:以0.04M、pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的顯色劑固藍B，此顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0064]具體應(yīng)用同實施例1:采集蚜蟲田間種群，按照前述方法勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，統(tǒng)計抗性個體顯色顏色，每一種群重復檢測100頭以上，計算種群抗性個體頻率，了解供試種群抗性水平。
[0065]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的方法，其特征在于，將底物a-乙酸萘酯和底物β-乙酸萘酯按1:1等體積混合作為混合底物，制備吸附混合底物的濾紙；采集蚜蟲田間種群，勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，濾紙顯色越深，個體酶活性越高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其具體包括以下步驟: (1)配制底物:用丙酮配制質(zhì)量濃度為1%的a-乙酸萘酯和質(zhì)量濃度為1%的P -乙酸萘酯，4°C冰箱保存； (2)將步驟(1)配制的底物按1:1等體積混合，將濾紙浸入其中，2min后，室溫陰干； (3)用pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的固藍B鹽作為勻漿液，勻漿單頭蚜蟲，取1/20體積的勻漿液滴到步驟(2)中制備的濾紙上，室溫避光放置15min ； (4)待顯色完全后，統(tǒng)計步驟(3)中的個體顯色顏色，與標準色板對比，濾紙顯色越深，個體酶活性越高。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中pH7.0的磷酸緩沖液，由磷酸二氫鉀和十二水合磷酸氫二鈉配制，濃度為0.04M。
4.一種檢測蚜蟲非特異性酯酶活性的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: (1)吸附有混合底物的濾紙: 將丙酮配制的質(zhì)量濃度為1%的a -乙酸萘酯和質(zhì)量濃度為1%的P -乙酸萘酯等體積混合，吸附于定性濾紙上，陰干，錫箔紙包裹于4 V保存； (2)顯色劑緩沖液:以0.04M、pH7.0的磷酸緩沖液配制0.15%的顯色劑固藍B。
5.利用權(quán)利要求1-3任一項所述方法，檢測蚜蟲種群抗性個體頻率的方法，其特征在于，采集蚜蟲田間種群，勻漿單頭蚜蟲后，將勻漿液滴到濾紙上顯色，與標準色板對比，統(tǒng)計個體顯色顏色，每一種群重復檢測100頭以上，計算種群抗性個體頻率；所述抗性為有機磷抗性。
【文檔編號】C12Q1/44GK103497990SQ201310476436
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】高希武, 劉曉嵐, 湯秋玲, 李永丹, 梁沛 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學