用于特異性識別人肝羧酸酯酶1的單克隆抗體、生成單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及可特異性識別人肝羧酸酯酶1的單克隆抗體、生成單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其用途。本發(fā)明可通過與人肝羧酸酯酶1的特異性結(jié)合來客觀地分析組織和血液中人肝羧酸酯酶1的表達數(shù)量等。從而，可從尿液或血液中簡單且迅速地診斷出肝癌。
【專利說明】用于特異性識別人肝羧酸酯酶1的單克隆抗體、生成單克 隆抗體的雜交瘤細胞株及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于特異性識別人肝羧酸酯酶1的單克隆抗體、生成所述抗體的雜交 瘤細胞株及其用途，該單克隆抗體用于從人體臨床標本如組織和血液中客觀地分析出人肝 羧酸酯酶1的表達水平。

【背景技術(shù)】
[0002] 人羧酸酯酶（hCE)可主要被分為具有不同特性和結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，如人羧酸酯酶 1 (hCEl)、人羧酸酯酶 2 (hCE2)和人羧酸酯酶 3 (hCE3) (Imai T, Drug Metab Pharmacokinet.， vol. 21，pp. 173-185, 2006) ohCEl為一般在肝臟中被生物合成的酶，并能識別親水性分子的 酰基而分解攝入到組織內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)。然而，hCE2為一般在腸內(nèi)被表達的酶，是與hCEl的 同源率為47%的獨立蛋白質(zhì)，而且與攝入到腸內(nèi)的親水性分子的?；磻?yīng)。hCE3為一般在 大腦中被表達的酶，同時也是與hCEl的同源率為50%的獨立蛋白質(zhì)。
[0003] 肝-羧酸酯酶1是一種在肝、腸、腎、肺、心臟或巨噬細胞中被表達的酶，但在肝 中的表達比其他地方高出10?100倍。所述肝-羧酸酯酶1具有三種主要作用：第一， 它具有外來物質(zhì)代謝功能，其通過改變非活性藥物的酯或酰胺結(jié)構(gòu)，將攝入到人體中的 非活性藥物轉(zhuǎn)化成活性物質(zhì)。例如，洛伐他?。╨ovastatin)可被轉(zhuǎn)化成有活性形式來 降低膽固醇，還用來將在體內(nèi)有毒性的可卡因和海洛因分別轉(zhuǎn)化成無毒的可卡乙堿和嗎 啡。第二，根據(jù)需要它通過分解和組合體內(nèi)的膽固醇和脂肪酸的酯結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)膽固醇代 謝，以及第三，它可以通過直接與蛋白質(zhì)，即與可識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中巨噬細胞免疫的C-反應(yīng) 蛋白（CPR)結(jié)合而調(diào)節(jié)功能（Redinbo MR.，Biochem. Soc. Trans.，31，ρρ· 620-624, 2003 ; Redinbo MR.，Drug Discov. Today.，10, pp. 313-325, 2005)。肝-羧酸酯酶 1 的另一特性是， 在由化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝癌的小鼠的肝微粒體中其酶活性會大幅下降（Maki T.，Jpn. J. Cancer Res.，82, ρρ· 800-806, 1991)，但尚未發(fā)現(xiàn)其機制。
[0004] 至今，通過使用酯酶的非特異性底物，如磷酸對硝基苯酯或乙酸對硝基苯酯，來分 析體內(nèi)肝-羧酸酯酶1的活性程度并使之作為酶滴定值。根據(jù)此方法，無法測定單獨肝-羧 酸酯酶1的特異性活性，因為在血液中具有酯酶功能的白蛋白、膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等 也有相同的活性（Li Β.，Niochem. Pharmacol.，70, ρρ· 1673-1684, 2005)。因此，需要一種在 短時間內(nèi)能夠從大量的標本中有選擇地并有效地分析肝-羧酸酯酶1蛋白的方法，這種方 法就是酶免疫測定法。酶免疫測定法是一種通過抗體與目標蛋白質(zhì)（抗原）的結(jié)合反應(yīng)來 誘導(dǎo)抗原-抗體結(jié)合、并在結(jié)合于酶上的抗體與底物間形成的復(fù)合反應(yīng)中由結(jié)合度所產(chǎn)生 的顯色或熒光顯色來定量臨床標本中目標蛋白質(zhì)的方法。
[0005] 最近，本發(fā)明人證明了在人血漿中存有肝-羧酸酯酶1，在肝癌組織中肝-羧酸酯 酶1的表達水平與正常的肝組織中肝-羧酸酯酶1的表達水平相比有下降，但在肝癌患者 的血漿中肝-羧酸酯酶1的表達水平比正常人的血漿中肝-羧酸酯酶1的表達水平平均增 長 2. 8 倍或更多（Na K. et al.，Proteomics. 9, ρρ· 3989-3999, 2009)。然而，所述實驗中使 用的肝-羧酸酯酶1的抗體是市面上可見的多克隆抗體（Abeam，abl875)，而且非特異性蛋 白質(zhì)可以與之結(jié)合，此外其免疫沉淀反應(yīng)的有效性會有下降。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題 本發(fā)明在于提供能夠有效地分析組織或血液中肝-羧酸酯酶1的肝-羧酸酯酶1的單 克隆抗體、以及由所述抗體生成的雜交瘤細胞株。
[0007] 進一步，本發(fā)明在于提供所述抗體的用途，即該抗體可用于分離并純化肝-羧酸 酯酶1，從血液中檢測肝-羧酸酯酶1，而且能特異性地診斷肝癌。
[0008] 技術(shù)方案 本發(fā)明的一方面提供與人肝羧酸酯酶1蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體，該單克隆抗體 是由保藏號為KCLRF-BP-00282的雜交瘤所生成的。
[0009] 本發(fā)明的另一方面提供保藏號為KCLRF-BP-00282的雜交瘤細胞，它能生成本發(fā) 明的單克隆抗體。
[0010] 進一步，本發(fā)明的另一方面提供用于分離并純化人肝羧酸酯酶1蛋白的、含有本 發(fā)明的單克隆抗體的組合物。
[0011] 進一步，本發(fā)明的另一方面提供用于檢測人肝羧酸酯酶1的、含有本發(fā)明的單克 隆抗體的組合物。
[0012] 進一步，本發(fā)明的另一方面提供用于檢測尿液或血液中人肝羧酸酯酶1濃度的方 法，該方法包括通過將本發(fā)明的單克隆抗體與樣本進行接觸來檢測抗原-抗體復(fù)合物的形 成。
[0013] 進一步，本發(fā)明的另一方面提供用于診斷肝癌的、包含發(fā)明的單克隆抗體的試劑 盒。
[0014] 有益效果 根據(jù)本發(fā)明，人肝羧酸酯酶1的單克隆抗體可基于與人肝羧酸酯酶1蛋白的高度特異 性結(jié)合用來探測在組織、細胞或血液中的肝-羧酸酯酶1。尤其，所述單克隆抗體有助于在 早期從血液中簡便地診斷出肝癌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1展示了用抗原肽組進行三次免疫化的小鼠尾部的血清中分離出肝-羧酸酯酶 1的分析結(jié)果。
[0016] 圖2為展示了被肝-羧酸酯酶1的抗原肽免疫化的小鼠脾細胞與骨髓瘤的融合細 胞的反應(yīng)性的圖片。
[0017] 圖3展示了通過使用由于肝-羧酸酯酶1的抗原肽具有高反應(yīng)性的被免疫化的小 鼠脾細胞對能夠生成肝-羧酸酯酶1的單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行篩選的結(jié)果。
[0018] 圖4展示了本發(fā)明的單克隆抗體與已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗體之間的抗 原-抗體結(jié)合度的對比結(jié)果。
[0019] 圖5展示了通過使用本發(fā)明的單克隆抗體和已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗體對 正常人、肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者的血漿中抗原-抗體結(jié)合度的對比結(jié)果。
[0020] 圖6展示了基于使用本發(fā)明的單克隆抗體和已知肝-羧酸酯酶1的多克隆抗體的 抗原-抗體結(jié)合的樣本顯色結(jié)果（a)、以及基于所述肝-羧酸酯酶1濃度的抗原-抗體結(jié)合 的光密度值（b)。

【具體實施方式】
[0021] 下面將具體描述本發(fā)明的組成部分。
[0022] 本發(fā)明人通過以下方法實現(xiàn)本發(fā)明，即研發(fā)出比市場上可見的人肝羧酸酯酶1的 抗體具有更高有效性的單克隆抗體以及生成該抗體的雜交瘤細胞株，以提供分離血漿中的 肝-羧酸酯酶1并客觀地對比分析酶的量的方法。
[0023] 因此，本發(fā)明提供一種單克隆抗體、生成該單克隆抗體的雜交瘤細胞及其制備方 法，該單克隆抗體能與由保藏號為KCLRF-BP-00282的雜交瘤所生成的人肝羧酸酯酶1蛋白 進行特異性結(jié)合。
[0024] 這里使用的"人肝羧酸酯酶1"包括蛋白質(zhì)本身、其基因重組蛋白質(zhì)、這些蛋白質(zhì)的 人工變異體及突變體、蛋白質(zhì)的天然形態(tài)及其功能性等價物。
[0025] 通過本領(lǐng)域所熟知的融合法制備對人肝羧酸酯酶1特異性的本發(fā)明的單克隆抗 體（參照 Kohler and Milstein(1976)European Journal of Immunology6:511_519) 〇 為形 成能夠分泌所述單克隆抗體的"雜交瘤"而被融合的兩組細胞群中，一組細胞群可以使用注 射了人肝羧酸酯酶1的、免疫學(xué)上適合的宿主動物如小鼠的細胞，另一組細胞群則使用癌 癥或骨髓瘤細胞株。通過本領(lǐng)域所知的方法如聚乙二醇融合這兩組細胞群，然后通過標準 的組織培養(yǎng)方法使抗體生成細胞進行增殖。通過有限稀釋法實施亞克隆并收集均勻的細胞 群，然后通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)或免疫印跡法選取能夠生成對人肝羧酸酯酶1特異 性的抗體的雜交瘤細胞株，并根據(jù)標準技術(shù)在體外或體內(nèi)進行大量培養(yǎng)。所述的體內(nèi)大量 培養(yǎng)是指，將雜交瘤細胞株注射到小鼠腹腔內(nèi)而誘導(dǎo)生成高濃度的抗體后從其腹水中分離 所述雜交瘤細胞株。
[0026] 由所述雜交瘤細胞株生成的單克隆抗體可無需提純，或根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的方法 進行高純度（如，95%或更高）提純。利用這種提純技術(shù)，如凝膠電泳、透析、鹽析、離子交 換層析或抗原親和柱層析，可從培養(yǎng)基或腹水中分離所述單克隆抗體。
[0027] 將本發(fā)明的生成單克隆抗體的雜交瘤叫做雜交瘤YPRC 10E8, 2012年3月28日被 保藏在韓國細胞株研究基金會，該基金會是位于首爾市鐘路區(qū)蓮建洞的首爾大學(xué)校醫(yī)科大 學(xué)癌癥研究所內(nèi)的國際保藏機構(gòu)，保藏號為KCLRF-BP-00282。在本說明書中，將由"雜交瘤 YPRC 10E8"生成的單克隆抗體叫做"YPRC 10E8"。
[0028] 將所述單克隆抗體用于檢測抗原的優(yōu)點在于，所述單克隆抗體由于能夠識別單一 表位而具有特異性相互作用。為了繪制參與到抗原與抗體之間相互作用的表位的圖譜，可 使用多種方法。例如，此方法包括，通過使用噬菌體表面展示肽庫的生物淘選、包含用蛋白 酶分解抗原肽來生成片段并通過免疫印跡法篩選此片段而獲得的表位序列的片段的確定、 被固定于固體如活性化膜或聚乙烯針之上的肽陣列的篩選、以及用可溶性肽的證明表位序 列中每個氨基酸序列殘基的重要性的競爭性ELISA法。
[0029] 使用由AbFrontier制作的軟件，從所述人肝羧酸酯酶1的三維結(jié)構(gòu)中分析出由本 發(fā)明的單克隆抗體識別的人肝羧酸酯酶1上的表位，而從所分析的肽序列表中檢測獲得其 與被免疫化小鼠的相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列是不同的。然后，基于對所分析的人肝羧酸酯 酶1特異性的肽進行重選并確定表位。
[0030] 基于這種表位，可以指定對應(yīng)于所述人肝羧酸酯酶1的氨基酸序列C-末端處的 554?567氨基酸的、列于SEQ ID NO: 1的線性表位。
[0031] 根據(jù)傳統(tǒng)方法可以判斷所述單克隆抗體的抗原結(jié)合親和性，但本發(fā)明不限于此。 更具體地，通過放射免疫分析法（RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、免疫沉淀法、免疫熒光 法、有色粒子結(jié)合法、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)結(jié)合法或免疫印跡法檢測所述抗原結(jié)合親和性。本發(fā)明 的單克隆抗體具有比多克隆抗體高出20倍的結(jié)合親和性。
[0032] 本發(fā)明的單克隆抗體可以為IgGl的同型免疫球蛋白。
[0033] 因此，本發(fā)明提供一種單克隆抗體，該單克隆抗體可識別對應(yīng)于本發(fā)明的人肝羧 酸酯酶1的氨基酸序列中C-末端處的554?567氨基酸的、列于SEQ ID NO: 1的線性表位， 并與所述人肝羧酸酯酶1進行特異性結(jié)合。
[0034] 這里使用的術(shù)語"單克隆抗體"為本領(lǐng)域所熟知的術(shù)語，是指針對單一抗原部位的 高特異性抗體。通常，與包含針對不同表位（抗原決定簇）的不同抗體的多克隆抗體不同， 單克隆抗體只針對抗原上的單一決定簇。單克隆抗體可通過利用抗原-抗體結(jié)合來改善診 斷和分析方法的選擇性及特異性，而且由于通過雜交瘤培養(yǎng)所合成，從而不會受到不同免 疫球蛋白的污染。在本說明書中，所述單克隆抗體，作為人肝羧酸酯酶1的抗體，其不僅包 括整個抗體，還包括抗體分子的功能性片段。所述整個抗體具有2個全長輕鏈和2個全長 重鏈的結(jié)構(gòu)，而且每條輕鏈與所述重鏈通過二硫鍵相連。重鏈恒定區(qū)為Y、μ、α、δ或ε 型，其可被分成子類，如Υ 1、Υ2、γ3、γ 4、α 1和α 2。輕鏈恒定區(qū)為κ或λ型（Cellular and Molecular Immunology, ffonsiewicz, M. J. , Ed. , Chapter45, pp. 41-50, ff. B. Saunders Co. Philadelphia, PA (1991) ；Nisonoff, A. , Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed. , Chapter4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA (1984)) 〇
[0035] 單克隆抗體的功能性片段為具有抗原結(jié)合性能的片段，該片段包括Fab、F(ab'）、 F (ab'）2和Fv?？贵w片段Fab是具有輕、重鏈的可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)以及重鏈的第一恒定區(qū) (CH1)的結(jié)構(gòu)，并且具有一個抗原結(jié)合部位。Fab'與Fab的區(qū)別在于，F(xiàn)ab'具有鉸鏈區(qū)，該 鉸鏈區(qū)在重鏈CH1區(qū)的C末端包含至少一個半胱氨酸殘基。F(ab'）2抗體具有由Fab'鉸 鏈區(qū)的半胱氨酸殘基構(gòu)成的二硫鍵。Fv是僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小的抗體節(jié) 段，而且 W0 88/10649、W0 88/106630、W0 88/07085、W0 88/07086 和 W0 88/09344 中公開了生 成Fv片段的重組技術(shù)。在具有穩(wěn)定二硫鍵的Fv(dsFV)中，重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)一般 通過非共價鍵相連，而在單鏈Fv (scFv)中，重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)一般通過連接肽的共 價鍵相連，或直接與C末端相連，從而形成如dsFv-樣的結(jié)構(gòu)，如二聚體。
[0036] 這種抗體片段可用蛋白水解酶來獲得（例如，可用木瓜蛋白酶分解整個抗體而獲 得Fab，而用胃蛋白酶分解所述抗體而獲得F (ab'）2片段），優(yōu)選地，可通過基因重組技術(shù)制 作所述抗體片段。在本發(fā)明中，所述抗體優(yōu)選為Fab型、或整個抗體。此外，所述重鏈恒定 區(qū)可以為選自包括Y、μ、α、δ以及ε型的同種型中。所述輕鏈恒定區(qū)可以為 K或λ 型。
[0037] 此外，本發(fā)明的抗體可以為人源化抗體或CDR移植抗體，以進一步降低嵌合抗體 或嵌合抗體的免疫原性。
[0038] 嵌合抗體包括源自除人以外動物（例如，小鼠、兔子、家禽等）的可變區(qū)、和源自人 的恒定區(qū)。此嵌合抗體可以通過本領(lǐng)域所知的基因重組進行制備。
[0039] 人源化抗體或CDR移植抗體是指將源自動物的單克隆抗體的互補決定區(qū)（CDR)移 植到人抗體中來維持源自動物的單克隆抗體的高度親和性及特異性并降低免疫誘發(fā)性而 制備的抗體，而且人源化程度可考慮對應(yīng)于抗原的親和性及誘導(dǎo)人體免疫的水平而進行選 取。
[0040] 進一步，本發(fā)明提供用于分離及純化含有本發(fā)明的單克隆抗體的人肝羧酸酯酶1 的組合物。
[0041] 用于分離及純化的含有所述抗體的組合物能夠用于傳統(tǒng)的離子交換層析和親和 層析中，從而可容易地從樣本中分離并純化所述人肝羧酸酯酶1。
[0042] 進一步，本發(fā)明提供用于檢測人肝羧酸酯酶1的、含有本發(fā)明的單克隆抗體的組 合物。
[0043] 進一步，本發(fā)明提供用于檢測尿液或血液中的人肝羧酸酯酶1濃度的方法，該方 法包括將本發(fā)明的單克隆抗體與樣本進行接觸來檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，將所述單克隆抗體與人尿、血清或血漿進行接觸來檢測抗原-抗體 復(fù)合物的形成，從而檢測所述人肝羧酸酯酶1。
[0045] 這里使用的術(shù)語"抗原-抗體復(fù)合物"指酶和識別所述酶的單克隆抗體的組合物， 所述酶可用于確認在生物樣本人尿、血清或血漿中人肝羧酸酯酶1的存在與否。
[0046] 所述抗原-抗體復(fù)合物可以通過使用檢測標記來進行檢測。例如，可選取酶、熒 光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒、氧化還原分子或放射性同位素，但本發(fā)明不會特別地受此限 制。
[0047] 例如，所述酶可以為β -葡萄糖醛酸苷酶、β -D-葡萄糖苷酶、β -D-半乳糖苷酶、 脲酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、核糖核 酸酶、葡萄糖氧化酶和熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨 酶、磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶或β-內(nèi)酰胺酶，但不限于此。所述熒光物質(zhì)可以為熒光素、 異硫氰酸酯、羅丹明（rhodamine)、藻紅蛋白（picoerythrin)、藻藍蛋白（phycocyanin)、別 藻藍蛋白、鄰苯二醛或熒光胺，但不限于此。所述配體可以為生物素衍生物，但不限于此。 所述發(fā)光物質(zhì)可以為吖啶酯、熒光素或熒光素酶，但不限于此。所述微粒可以為膠體金或有 色乳膠，但不限于此。所述氧化還原分子可以為二茂鐵、釕配合物、biologen、醌、鈦離子、銫 離子、二酰亞胺、1，4_ 苯醌、對苯二酚、K4W(CN)8、[0s(bpy)3]2+、[RU(bpy) 3]2+或[M0(CN)8]4-， 但不限于此。放射性同位素可以為 3H、14C、32P、35S、36Cl、 51Cr、57C〇、58C〇、 59Fe、9°Y、125I、131I 或 186Re，但不限于此。
[0048] 所述抗原-抗體復(fù)合物的形成可通過使用比色法、電化學(xué)法、熒光法、發(fā)光測定 法、粒子計數(shù)法、視覺評估法或用閃光計數(shù)法進行檢測。例如，所述抗原-抗體復(fù)合物的形 成可通過流式細胞術(shù)、免疫細胞化學(xué)法、RIA、ELISA、免疫印跡法、免疫沉淀測定法、免疫擴 散測定法、補體結(jié)合測定法或蛋白質(zhì)芯片進行檢測。更具體地，所述抗原-抗體復(fù)合物的形 成可通過有益于回收少量所需蛋白質(zhì)的免疫沉淀測定法和免疫印跡法進行檢測。
[0049] 最具體地，可用ELISA檢測所述抗原-抗體復(fù)合物。所述ELISA包括多種ELISA 方法，即包括：直接性ELISA，其使用用于識別附著于固相載體上的抗原的標記抗體；間接 性ELISA，其使用用于識別抗體復(fù)合物中的捕獲抗體的標記抗體，該抗體復(fù)合物可識別附著 于固相載體上的抗原；直接夾心ELISA，其使用用于識別附著于固相載體上的抗體和抗原 的復(fù)合物中的抗原的另一標記抗體；以及間接夾心ELISA，其使用標記二級抗體，該標記二 級抗體可識別待另一抗體與附著于固相載體的抗體和抗原的復(fù)合物中的抗原進行反應(yīng)后 的所述另一抗體。
[0050] 根據(jù)ELISA檢測方法，將生物樣本如尿液、血液、血清或血漿與涂敷于固相載體上 的本發(fā)明的單克隆抗體接觸，所述固相載體為如微量滴定板、膜或測試條。具體如，在微量 滴定板的孔上涂敷本發(fā)明的單克隆抗體，用如牛血清蛋白（BSA)隔離未被占據(jù)的結(jié)合部 位，將被涂敷的板與樣本一同進行培養(yǎng)，最后可判斷抗原-抗體復(fù)合物的存在與否。通過對 所述抗原-抗體復(fù)合物的抗原特異性的抗體，如通過能與人肝羧酸酯酶1特異性結(jié)合的單 克隆抗體或多克隆抗體，可確定抗原-抗體復(fù)合物的存在與否。所述單克隆抗體或多克隆 抗體可以具有檢測標記，否則可通過能檢測所述單克隆抗體或多克隆抗體的其他抗體進行 確認。
[0051] 具體例子如下，可通過將附著于載體上的捕獲單克隆抗體與生物樣本反應(yīng)，然后 從與人肝羧酸酯酶1進行特異性結(jié)合的單克隆抗體中測定檢測標記信號，或從所述復(fù)合物 上具有可生成檢測信號標記的二級抗體中測定檢測標記型號，來進行測定人肝羧酸酯酶1。
[0052] 進一步，本發(fā)明涉及用于診斷肝癌的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的單克隆抗體。
[0053] 進一步，本發(fā)明的用于診斷肝癌的試劑盒所用的單克隆抗體，只要所述抗體可有 選擇地識別所述人肝羧酸酯酶1，便可使用所述單克隆抗體的片段。這種抗體片段可包括 F(ab'）2、Fab、Fab' 或 Fv 片段。
[0054] 用于診斷肝癌的試劑盒可被制成貼有本發(fā)明的單克隆抗體的蛋白質(zhì)芯片型。
[0055] 本發(fā)明的用于診斷肝癌的試劑盒中，包括有選擇地識別人肝羧酸酯酶1的單克隆 抗體或其片段、以及在免疫分析中所用的工具/試劑。
[0056] 作為在免疫分析中所用的工具/試劑，包括適當?shù)妮d體、生成檢測信號的標記物 質(zhì)、溶劑或清洗劑。此外，當所述標記物質(zhì)為酶時，可包括用于測定酶活性的底物和反應(yīng)終 止劑。
[0057] 作為適當?shù)妮d體，例如，可使用本領(lǐng)域所知的生理上可接受的緩沖液，如PBS、不 溶性載體如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟化樹脂、交聯(lián)葡聚糖、多糖、聚合 物如膠乳上鍍有金屬的磁性微粒、其他紙、玻璃、金屬、瓊脂糖或其組合物，但本發(fā)明不限于 此。
[0058] 所用的用于本發(fā)明的檢測方法和診斷試劑盒的檢測系統(tǒng)包括ELISA板、 dip-stick裝置、免疫層析試紙條、放射免疫測定裝置及流通裝置，但本發(fā)明不限于此。
[0059] 實施例 下面，本發(fā)明將結(jié)合實施例進行詳細描述。所提供的實施例僅用于例證本發(fā)明，本發(fā)明 的范圍不會受限于實施例。
[0060] 實施例1>肝組織和血漿樣本的提供 將50mg肝組織置于細胞裂解RIPA緩沖液[50mM Tris、150mM氯化鈉（NaCl)、1 % 1')0]1丨(16七?-40、0.25(%脫氧膽酸鈉4!17.4]中，在41€冷藏條件下使其分解，在14000印1]1下離 心分離20分鐘，回收蛋白質(zhì)溶液。
[0061] 從Severance醫(yī)院的基因庫中獲得了確保病理學(xué)上各項數(shù)據(jù)的、取自正常人、肝 炎患者、肝硬化患者和肝癌患者的血漿。作為正常人的血漿，使用了從肝癌標準測試因素中 被判定為陰性的樣本，如源自人免疫缺陷病毒（HIV)的HIV-1和HIV-2抗體、HIV-1抗原、 乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、丙型肝炎病毒、T細胞白血病病毒（HTLV-I/II)抗原和梅毒 螺旋體測試，在測試前保管于_70°C下。所述血漿的供應(yīng)遵守了延世醫(yī)療中心機構(gòu)審查委員 會（IRB)的規(guī)定。
[0062] 〈實施例2>最佳抗原決定簇的選取 通過使用由AbFrontier制作的軟件分析在所述肝-羧酸酯酶1的三維結(jié)構(gòu)中具有最 佳抗原決定簇的肽的選取，并且從所分析的肽序列表中可確認，所選取的肽與待免疫化的 小鼠的相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列是不同的。最終，通過在實際研究中進行分析并基于對所 述肝-羧酸酯酶1特異性的肽進行重選，從而合成具有13個氨基酸序列的肽（參考表1)。
[0063] [表 1]

【權(quán)利要求】
1. 一種特異性結(jié)合至人肝羧酸酯酶1蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號為 KCLRF-BP-00282的雜交瘤生成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體能夠識別所述人 肝羧酸酯酶1蛋白的C-末端處的554-567氨基酸表位序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體為IgGl的同型免 疫球蛋白。
4. 保藏號為KCLRF-BP-00282的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞能夠生成權(quán)利要求1所述的 單克隆抗體。
5. 用于分離和純化人肝羧酸酯酶1蛋白的組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所述的單 克隆抗體。
6. 用于檢測人肝羧酸酯酶1的組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
7. 用于檢測尿液或血液中的人肝羧酸酯酶1的濃度的方法，該方法包括：通過使權(quán)利 要求1所述的單克隆抗體與樣本進行接觸來檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。
8. 用于診斷肝癌的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/574GK104066749SQ201280029813
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】白隆基, 羅瑾 申請人:延世大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團