目標(biāo)粒子的定量方法、光分析裝置以及光分析用計(jì)算機(jī)程序的制作方法
【專利摘要】該目標(biāo)粒子的定量方法具有以下工序：調(diào)制包含所述目標(biāo)粒子和與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述試樣溶液中結(jié)合；(b)移動(dòng)工序，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；檢測(cè)工序，一邊使所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊檢測(cè)從所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，來直接或間接地逐個(gè)檢測(cè)所述目標(biāo)粒子；(c)計(jì)數(shù)工序，對(duì)在所述檢測(cè)工序中檢測(cè)出的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；以及計(jì)算工序，基于對(duì)所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度或量與所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)所述工序(b)中所計(jì)數(shù)出的所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)，計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
【專利說明】目標(biāo)粒子的定量方法、光分析裝置以及光分析用計(jì)算機(jī)程序
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)到來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)而求出在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的濃度的方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2011年04月18日在日本提交的日本特愿2011-092168號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠測(cè)量/測(cè)定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測(cè)技術(shù)來進(jìn)行生物分子等分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種裝置或方法。例如，對(duì)于熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見專利文獻(xiàn) 1、2、非專利文獻(xiàn)I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)定來自在試樣溶液中的微小區(qū)域(被稱為顯微鏡的激光聚光到的焦點(diǎn)區(qū)域-共焦區(qū)組織。)內(nèi)出入的熒光分子或進(jìn)行了熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度?；谟蓽y(cè)定出的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值決定的、微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值，能夠取得熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度或大小、濃度這類信息，或者檢測(cè)分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集這類各種現(xiàn)象。此外，利用熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻(xiàn)3)或光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如:專利文獻(xiàn)4),生成與FCS同樣地測(cè)量到的出入共焦區(qū)組織內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖。對(duì)于該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型式，由此估算熒光分子等的固有明亮度的平均值和滯留于共焦區(qū)組織內(nèi)的分子個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息，推測(cè)分子結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此外，專利文獻(xiàn)5、6中提出了基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)量出的試樣溶液的熒光信號(hào)的時(shí)程來檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7中使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光。而且，提出了一種用于利用微弱光檢測(cè)流中或基板上的熒光微粒的存在的信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)。
[0004]特別的是，通過應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測(cè)定技術(shù)的方法，測(cè)定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(一次測(cè)定使用的量最多數(shù)十UL左右)，測(cè)定時(shí)間也大幅地縮短(一次測(cè)定中重復(fù)進(jìn)行數(shù)次秒數(shù)量級(jí)時(shí)間的測(cè)量)。因此，特別在對(duì)于醫(yī)學(xué)/生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體數(shù)量多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待成為能夠低廉或迅速地實(shí)施實(shí)驗(yàn)或檢查的強(qiáng)有力的工具。
[0005]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876號(hào)公報(bào)[0006]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371號(hào)公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)3:日本專利第4023523號(hào)公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開第2008-080417號(hào)
[0009]專利文獻(xiàn)5:日本特開2007-20565號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)6:日本特開2008-116440號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)7:日本特開平4-337446號(hào)公報(bào)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號(hào)、第1431?1438 頁。
[0013]非專利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁。
[0014]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號(hào)、第271?277 頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明要解決的問題
[0016]所述FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡(jiǎn)而言之是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算所測(cè)量出的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的大小，根據(jù)該波動(dòng)的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在所述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度適合調(diào)制成在平衡狀態(tài)下在一次秒數(shù)量級(jí)長(zhǎng)度的測(cè)量時(shí)間中有能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)，優(yōu)選調(diào)制成在微小區(qū)域內(nèi)總是存在有一個(gè)左右的熒光分子等(典型地，共焦區(qū)組織的體積為IfL左右，所以熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。)。換言之，試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度大幅地低于能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)(例如，大幅地低于InM時(shí))，產(chǎn)生測(cè)量時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測(cè)對(duì)象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)。于是，在熒光強(qiáng)度的測(cè)量結(jié)果中，隨著觀測(cè)對(duì)象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間地存在而有意義的熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量變少。其結(jié)果，如上所述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光分析技術(shù)無法期望有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0017]在專利文獻(xiàn)5、6中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測(cè)方法中公開了以下內(nèi)容:不進(jìn)行如所述的與熒光強(qiáng)度波動(dòng)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)有無有意義的強(qiáng)度的突光信號(hào)的產(chǎn)生，能夠確定試樣中的成為觀測(cè)對(duì)象的突光分子等的有無。由此得到有意義的強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專利文獻(xiàn)6中，暗示了當(dāng)產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動(dòng)時(shí)檢測(cè)靈敏度提高。然而，即便是這些方法，也只停留在檢測(cè)通過擴(kuò)散或隨機(jī)流動(dòng)而概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等粒子的行為。未實(shí)現(xiàn)例如:粒子的計(jì)數(shù)、定量地計(jì)算粒子的濃度或數(shù)密度。此外，專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測(cè)流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)，而不是用于檢測(cè)試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用于對(duì)在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。因而，未實(shí)現(xiàn)定量地計(jì)算在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或者熒光粒子向基板上的固定化處理這類過程。因此可以認(rèn)為檢測(cè)所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)的情況，并且對(duì)實(shí)施者要求復(fù)雜且高難度的操作技術(shù)。
[0018]本發(fā)明是鑒于所述的問題點(diǎn)而想出的，其目的在于提供如下一種方法:通過不包含F(xiàn)CS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中實(shí)施那樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理而能夠?qū)τ^測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于這些光分析技術(shù)中處理水平的、試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的狀態(tài)或特性進(jìn)行檢測(cè)的新型的光分析技術(shù)，對(duì)在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子進(jìn)行定量。
_9] 用于解決問題的方案
[0020]本發(fā)明的
【發(fā)明者】們?yōu)榱私鉀Q所述問題而潛心研究的結(jié)果為一種對(duì)在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子進(jìn)行定量的方法，將從在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的觀測(cè)對(duì)象粒子(具體而言，是指與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針或者發(fā)光探針。以下相同。)發(fā)出的光作為標(biāo)識(shí)進(jìn)行檢測(cè)的情況下，發(fā)現(xiàn)以下兩點(diǎn)而完成了本發(fā)明。即，(I)通過使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)，由此即便在試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度非常低的情況下，也能夠高靈敏度地檢測(cè)出目標(biāo)粒子；以及(2)通過使用根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的測(cè)量結(jié)果制作出的檢量線，根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法求出的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)，能夠計(jì)算試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
[0021]在此，掃描分子計(jì)數(shù)法是在日本特愿2010-044714中由本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:提出的新型的光分析技術(shù)。
[0022]S卩，根據(jù)本發(fā)明的第I方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法，對(duì)在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子進(jìn)行定量，該方法具備以下工序:(a)調(diào)制包含所述目標(biāo)粒子和與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述試樣溶液中結(jié)合；(b)移動(dòng)工序，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；檢測(cè)工序，一邊使所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊檢測(cè)從所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，來直接或間接地逐個(gè)檢測(cè)所述目標(biāo)粒子；(C)計(jì)數(shù)工序，對(duì)在所述檢測(cè)工序中檢測(cè)出的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；以及計(jì)算工序，基于對(duì)所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度或量與所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)在所述工序(b)中計(jì)數(shù)出的所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的第2方式，是在所述第I方式中，優(yōu)選在所述移動(dòng)工序中以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的第3方式，是在所述第I方式或所述第2方式中，優(yōu)選在所述移動(dòng)工序中，以比擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置，所述擴(kuò)散移動(dòng)速度是所述發(fā)光探針或與所述發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的快的一方的擴(kuò)散移動(dòng)速度。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的第4方式，是在所述第I方式至所述第3方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選在所述檢測(cè)工序中，根據(jù)所檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，來檢測(cè)所述發(fā)光探針或與發(fā)光探針結(jié)合的所述目標(biāo)粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的第5方式，是在所述第I方式至所述第4方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選所述發(fā)光探針具有在相互接近時(shí)產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位，在所述發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的結(jié)合狀態(tài)和未與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的非結(jié)合狀態(tài)之間，所述能量供體部位與所述能量受體部位之間的距離不同，所述結(jié)合狀態(tài)與所述非結(jié)合狀態(tài)的從所述發(fā)光探針發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的第6方式，是在所述第I方式至所述第5方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選所述目標(biāo)粒子為核酸，所述發(fā)光探針是與所述目標(biāo)粒子特異地雜交且結(jié)合有熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)中的至少一個(gè)的單鏈核酸。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的第7方式，是在所述第I方式至所述第6方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選還具備以下工序(d)，在所述工序(a)之后，從所述試樣溶液中，分離未與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針來回收包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的第8方式，是在所述第7方式中，優(yōu)選還具備以下工序(e)，在從在所述工序(d)中回收的所述復(fù)合體離解出所述發(fā)光探針之后，將游離的發(fā)光探針和所述目標(biāo)粒子相互分離來回收。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的第9方式所涉及的光分析裝置，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的多個(gè)發(fā)光粒子的光，該光分析裝置包括:光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路，來使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測(cè)部，其檢測(cè)所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光粒子的光；信號(hào)處理部，其一邊使所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊逐個(gè)地檢測(cè)來自由所述光檢測(cè)部檢測(cè)出的各個(gè)所述發(fā)光粒子的所述光的光信號(hào)，對(duì)逐個(gè)地檢測(cè)出的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置移動(dòng)過程中檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；存儲(chǔ)部，其存儲(chǔ)對(duì)所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度或量與從所述試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線；濃度計(jì)算部，其基于所述檢量線，根據(jù)所述信號(hào)處理部所計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度；以及顯示部，其顯示由所述濃度計(jì)算部計(jì)算出的所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的所述濃度。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第10方式，是在所述第9方式中，優(yōu)選所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的第11方式，是在所述第9方式或所述第10方式中，優(yōu)選所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的第12方式，是在所述第9方式至所述第11方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選根據(jù)由所述光檢測(cè)部檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，所述信號(hào)處理部檢測(cè)所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的第13方式，是在所述第12方式中，優(yōu)選在檢測(cè)出強(qiáng)度大于規(guī)定的閾值的所述光信號(hào)時(shí)，所述信號(hào)處理部檢測(cè)出所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了所述光檢測(cè)區(qū)域。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的第14方式，是在所述第9方式至所述第13方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選所述信號(hào)處理部根據(jù)檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，來確定所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的第15方式，是在所述第9方式至所述第14方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選所述發(fā)光粒子是與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子，所述光檢測(cè)部進(jìn)行檢測(cè)的光是從與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。[0037]根據(jù)本發(fā)明的第16方式，是在所述第9方式至所述第14方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選所述光檢測(cè)部進(jìn)行檢測(cè)的光是從所述發(fā)光探針發(fā)出的光，該發(fā)光探針是從包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體中游離出的發(fā)光探針。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的第17方式所涉及的光分析用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的多個(gè)發(fā)光粒子的光，該光分析用計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:改變步驟，改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路以使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測(cè)步驟，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)的過程中檢測(cè)所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光粒子的所述光；光信號(hào)檢測(cè)步驟，逐個(gè)地檢測(cè)來自所述檢測(cè)出的各個(gè)所述發(fā)光粒子的所述光的光信號(hào)；發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)步驟，對(duì)來自所述逐個(gè)地檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的所述光的所述光信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置移動(dòng)過程中檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；以及濃度計(jì)算步驟，基于對(duì)所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度或量與從所述試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)所述計(jì)數(shù)出的多個(gè)發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的第18方式，是在所述第17方式中，優(yōu)選在所述改變步驟中，以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的第19方式，是在所述第17方式或所述第18方式中，優(yōu)選在所述改變步驟中，以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的第20方式，是在所述第17方式至所述第19方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選在所述光信號(hào)檢測(cè)步驟中，根據(jù)所檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，檢測(cè)所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的第21方式，是在所述第17方式至所述第20方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選在所述光信號(hào)檢測(cè)步驟中，在檢測(cè)出強(qiáng)度大于規(guī)定的閾值的所述光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)出所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了所述光檢測(cè)區(qū)域。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的第22方式，是在所述第17方式至所述第21方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選還包括以下步驟:根據(jù)所述檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)，來確定所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的第23方式，是在所述第17方式至所述第22方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選在所述光檢測(cè)步驟中，從所述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)出的光是從與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的第24方式，是在所述第17方式至所述第22方式中的任一個(gè)方式中，優(yōu)選在所述光檢測(cè)步驟中，從所述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)出的光是從所述發(fā)光探針發(fā)出的光，該發(fā)光探針是從包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體游離出的發(fā)光探針。
[0046]發(fā)明的效果
[0047]在所述的目標(biāo)粒子的定量方法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)之類的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因而，通過所述的目標(biāo)粒子的定量方法，即便在作為解析對(duì)象的目標(biāo)粒子在試樣中僅極微量存在的情況下，也能夠求出試樣中的目標(biāo)粒子的濃度。進(jìn)一步，在所述的目標(biāo)粒子的定量方法中，通過使用基于目標(biāo)粒子濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣制作出的檢量線，能夠根據(jù)所計(jì)數(shù)出的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)更簡(jiǎn)單地求出試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0049]圖1B是共焦區(qū)組織(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0050]圖1C是改變反射鏡的方向來在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0051]圖2A是說明用于該掃描分子計(jì)數(shù)法的基于光分析技術(shù)的光檢測(cè)原理的示意圖。
[0052]圖2B是所測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0053]圖3A是觀測(cè)對(duì)象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的模型圖。
[0054]圖3B是表示圖3A中的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0055]圖4A是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的模型圖。
[0056]圖4B是表示圖4A中的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0057]圖5是以流程圖的形式顯示通過掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量出的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理過程的圖。
[0058]圖6A是示意性地表示與觀測(cè)對(duì)象粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的圖。
[0059]圖6B是說明根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量出的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理過程中檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0060]圖7表示通過掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量出的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例(柱狀圖)、將數(shù)據(jù)平滑化而獲得的曲線(虛線)和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。
[0061]圖8是示意性地表示使用了分離用探針和與所述分離用探針結(jié)合的固相載體的方式的圖。
[0062]圖9是表示在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的裝置的顯示部上顯示的數(shù)據(jù)的一個(gè)方式的圖。
[0063]圖10是表示在本發(fā)明的裝置的顯示部上顯示的數(shù)據(jù)的一個(gè)方式的圖。
[0064]圖11是以流程圖的形式顯示通過掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行的試樣溶液中的發(fā)光粒子(與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子)的計(jì)數(shù)直到試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度測(cè)定的處理過程的圖。
[0065]圖12是表示在參考例I中將橫軸設(shè)為試樣溶液中的熒光物質(zhì)ATT0633的濃度、將縱軸設(shè)為峰數(shù)來對(duì)各試樣溶液的計(jì)數(shù)值進(jìn)行繪制所制作出的檢量線的曲線圖(用對(duì)數(shù)刻度表不)。
[0066]圖13是表示在參考例I中將橫軸設(shè)為試樣溶液中的熒光物質(zhì)ATT0633的濃度、將縱軸設(shè)為峰數(shù)來對(duì)各試樣溶液的計(jì)數(shù)值進(jìn)行繪制所制作出的檢量線的曲線圖(用通?？潭缺聿?。
[0067]圖14是表示在實(shí)施例1中將橫軸設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液中的目標(biāo)核酸的濃度、將縱軸設(shè)為峰數(shù)來對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的計(jì)數(shù)值進(jìn)行繪制所制作出的檢量線的曲線圖。
[0068]圖15是表示在實(shí)施例1中將橫軸設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液中的目標(biāo)核酸的濃度、將縱軸設(shè)為峰數(shù)來對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的計(jì)數(shù)值進(jìn)行繪制所制作出的檢量線的曲線圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0069]首先，對(duì)于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說明。掃描分子計(jì)數(shù)法一邊通過微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。)橫穿微小區(qū)域內(nèi)時(shí)，檢測(cè)從微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光。由此，掃描分子計(jì)數(shù)法一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測(cè)試樣溶液中的多個(gè)發(fā)光粒子，能夠獲得與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，測(cè)定所需的試樣也可以是微量(例如，數(shù)十UL左右)的。另外，測(cè)定時(shí)間短，并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，對(duì)于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，能夠定量檢測(cè)其濃度或數(shù)密度等特性。
[0070]發(fā)光粒子是指通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法中，目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而成為發(fā)光粒子。
[0071]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡提供照明光時(shí)，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。在共聚焦顯微鏡中，該光檢測(cè)區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔(Pin hole)之間的位置關(guān)系確定。
[0072]在試樣溶液內(nèi)邊移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置，S卩，邊通過光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測(cè)。當(dāng)進(jìn)行光的檢測(cè)時(shí)，在移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測(cè)到來自發(fā)光探針的光。由此，檢測(cè)到一個(gè)粒子的存在。此時(shí)，可以直接檢測(cè)想要檢測(cè)的粒子(目標(biāo)粒子)的存在，也可以間接地檢測(cè)想要檢測(cè)的粒子(目標(biāo)粒子)的存在。直接檢測(cè)的情況是指通過檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針來進(jìn)行的檢測(cè)。間接檢測(cè)的情況是指通過檢測(cè)發(fā)光探針暫時(shí)與目標(biāo)粒子結(jié)合之后從粒子離解出的發(fā)光探針的光來進(jìn)行的檢測(cè)。在這些情況下，在逐次檢測(cè)到的光中逐個(gè)檢測(cè)來自發(fā)光探針的光信號(hào)，由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測(cè)粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在所述構(gòu)成中，可以對(duì)逐個(gè)檢測(cè)到的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)中檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)該構(gòu)成，通過組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是如果通過任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，則能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，也可以不是直接確定絕對(duì)數(shù)密度值或濃度值，而計(jì)算對(duì)于多個(gè)試樣溶液、或者對(duì)于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度的比。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的結(jié)構(gòu)。因此，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。由此，作為檢測(cè)對(duì)象的粒子不受力學(xué)的作用的影響而能夠以穩(wěn)定的狀態(tài)進(jìn)行光的測(cè)量。在試樣溶液中有振動(dòng)或流動(dòng)作用時(shí)，粒子的物理性質(zhì)有可能發(fā)生變化。并且，由于流通試樣溶液的結(jié)構(gòu)不是必需的，因此能夠與FCS、FIDA等情況同樣地以微量(I?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測(cè)量和分析。
[0073]在逐個(gè)地檢測(cè)所述的粒子的工序中，對(duì)于根據(jù)逐次檢測(cè)到的光信號(hào)判定發(fā)光探針是否進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測(cè)到的光信號(hào)的形狀而進(jìn)行。該發(fā)光探針包括一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況、多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況、以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的情況下的發(fā)光探針。以下相同。
[0074]本實(shí)施方式中，典型地，可以是當(dāng)檢測(cè)到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)為發(fā)光探針進(jìn)入到了光檢測(cè)區(qū)域。在此，規(guī)定的閾值是指預(yù)先設(shè)定的光強(qiáng)度的值，是通過實(shí)驗(yàn)或?yàn)榱朔戏治瞿康亩O(shè)定的值。
[0075]此外，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變?cè)嚇尤芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，從發(fā)光探針檢測(cè)到的光的形態(tài)可能會(huì)根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度快時(shí)，從發(fā)光探針得到的光量降低，因此，為了精度良好或靈敏度良好地測(cè)量來自發(fā)光探針的光，優(yōu)選適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0076]進(jìn)一步，在所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與作為檢測(cè)對(duì)象的目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)。如所述說明，通過掃描分子計(jì)數(shù)法，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域經(jīng)過存在有與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的位置時(shí)，檢測(cè)由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)移動(dòng)而多次出入光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，從一個(gè)發(fā)光探針多次檢測(cè)到表示希望檢測(cè)的粒子存在的光信號(hào)。其結(jié)果，難以將檢測(cè)到的光信號(hào)與一個(gè)檢測(cè)到的粒子的存在對(duì)應(yīng)起來。因此，如上所述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度。具體而言，設(shè)定為以快于與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度進(jìn)行移動(dòng)。另外，在檢測(cè)從發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)來間接地檢測(cè)目標(biāo)粒子的情況(也就是說，在觀測(cè)對(duì)象粒子是發(fā)光探針的情況)下，設(shè)定成以快于發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度進(jìn)行移動(dòng)。即，將光檢測(cè)區(qū)域的位置設(shè)定成以快于發(fā)光探針或與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度中的快的一方的速度進(jìn)行移動(dòng)。由此，能夠使發(fā)光探針對(duì)應(yīng)于一個(gè)(表示粒子的存在的)光信號(hào)。擴(kuò)散移動(dòng)速度隨著觀測(cè)對(duì)象粒子而改變，所以如上所述，優(yōu)選根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))，適當(dāng)改變光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0077]可以以任意方式進(jìn)行用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0078]例如，可以使用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路來改變光檢測(cè)區(qū)域的位置。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定。例如，能夠選自圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線即可。
[0079]對(duì)于掃描分子計(jì)數(shù)法，其光檢測(cè)機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，構(gòu)成為對(duì)來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)，因此，試樣溶液的量同樣地為微量即可。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，因此，掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)能夠適用于粒子的數(shù)密度或濃度大幅低于FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平的試樣溶液。
[0080]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，在溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子被逐個(gè)檢測(cè)出，因此，使用該信息，能夠定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過掃描分子計(jì)數(shù)法，使通過光檢測(cè)區(qū)域的粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)一對(duì)一地對(duì)應(yīng)而將粒子一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)出。由此，能夠進(jìn)行在溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的計(jì)數(shù)，相比于以往，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。根據(jù)逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針并對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來確定粒子濃度的、所述的目標(biāo)粒子的定量方法，即使試樣溶液中的發(fā)光探針的濃度是比根據(jù)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量到的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠定量地測(cè)定目標(biāo)粒子。
[0081]進(jìn)一步，通過改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、以光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，不對(duì)試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用，在使試樣溶液均一或使試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下觀察試樣溶液內(nèi)部。一般地說，在使樣本流動(dòng)的情況下，難以始終賦以一樣的流速并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜。另外，必要的試樣量大幅地增大，并且由于流動(dòng)導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用而溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)有可能變質(zhì)或變性。根據(jù)本實(shí)施方式，不對(duì)試樣溶液施加機(jī)械振動(dòng)和流體力學(xué)作用地進(jìn)行測(cè)量，因此，例如與使試樣發(fā)生流動(dòng)的情況相比較，定量檢測(cè)結(jié)果的可靠性提高。另外，對(duì)于試樣溶液中的成為檢測(cè)對(duì)象的粒子，能夠在沒有力學(xué)作用的影響或沒有人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。
[0082]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的結(jié)構(gòu)>
[0083]如圖1A中示意性的示例，能夠通過在基本結(jié)構(gòu)中組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而成的光分析裝置實(shí)現(xiàn)掃描分子計(jì)數(shù)法。如圖1A所示，光分析裝置I具備光學(xué)系統(tǒng)2?17和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同。自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端成為以固有的NA規(guī)定的角度發(fā)散的光而放射。放射的光通過準(zhǔn)直儀4成為平行光,該平行光在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚焦，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。在試樣溶液中分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子、與該粒子結(jié)合的發(fā)光探針、典型地是帶有熒光色素等發(fā)光標(biāo)記的分子。當(dāng)與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)施方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后從粒子解離出的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針在這期間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)經(jīng)過物鏡8、分色鏡5，在鏡子11處反射，在聚光鏡12處聚光。聚光的光通過小孔13，透過二次濾片14(在此，只選擇特定的頻帶的光成分)，被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測(cè)器(光檢測(cè)部)16。并且，在光檢測(cè)器16中轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號(hào)之后，輸入至計(jì)算機(jī)18，進(jìn)行用于后述的光分析的處理。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知那樣，在所述的結(jié)構(gòu)中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。因此，僅圖1B中示意地所示那樣從激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過小孔13，而來自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有I?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的大致橢球體的體積。)，被稱為共焦區(qū)組織。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測(cè)到來自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來自發(fā)光探針的光，例如，來自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光。因此，光檢測(cè)器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器。此夕卜，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(tái)(沒有圖示)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置改變裝置17a?？梢酝ㄟ^計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置改變裝置17a的動(dòng)作。通過該結(jié)構(gòu)，即便被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。[0084]進(jìn)一步，在所述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)的機(jī)構(gòu)，即，用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測(cè)區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。作為該用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。該鏡轉(zhuǎn)向器17可以與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同。另外，用于實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)模式的鏡轉(zhuǎn)向器17在計(jì)算機(jī)18的控制下，與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)地被驅(qū)動(dòng)。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合。即，能夠在計(jì)算機(jī)18的程序中選擇各種移動(dòng)模式即可。圖中沒有顯示，但也可以通過上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)。如上所述，通過不是移動(dòng)試樣溶液而是改變光學(xué)系統(tǒng)的光路來移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的結(jié)構(gòu)，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)的作用。其結(jié)果，能夠排除對(duì)觀測(cè)對(duì)象物的力學(xué)作用的影響，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的測(cè)量。
[0085]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過吸收多光子而發(fā)光時(shí)，所述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)中發(fā)出光，因此可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針不依賴激發(fā)光而通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用所述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。進(jìn)一步，在光分析裝置I中，如圖所示，可以設(shè)置有多個(gè)激發(fā)光源2，可以根據(jù)用于激發(fā)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針的光的波長(zhǎng)，能夠適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以為如下結(jié)構(gòu):可以還設(shè)置有多個(gè)光檢測(cè)器16，當(dāng)試樣中包含波長(zhǎng)不同的多種粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，根據(jù)波長(zhǎng)分別檢測(cè)來自它們的光。
[0086]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0087]FIDA等光譜分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是必需的試樣量非常少并且能夠快速實(shí)施檢查。然而，在FIDA等光譜分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度的波動(dòng)計(jì)算觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的測(cè)定結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測(cè)量中在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子，在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是檢測(cè)到有意義的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于所述時(shí)，例如，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子為只是偶爾進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測(cè)量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動(dòng)。此外，在觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度大幅地低于測(cè)量中在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的運(yùn)算易受背景的影響。進(jìn)一步，為了獲得對(duì)運(yùn)算而言為充分量的有意義的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)間延長(zhǎng)。與此相對(duì)，用掃描分子計(jì)數(shù)法，即便當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度低于FIDA等光譜分析技術(shù)要求的水平時(shí)，也能夠檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0088]作為在掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中實(shí)施的處理，直接了當(dāng)?shù)卣f，是驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部:鏡偏轉(zhuǎn)器17)而改變光路，如在圖2A中示意性地描述那樣，一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測(cè)。例如圖2A所示，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的期間(圖中為時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過存在一個(gè)粒子(在圖中，作為發(fā)光探針的熒光色素F與對(duì)象粒子T結(jié)合)的區(qū)域時(shí)(tl)，如圖2B所描述那樣檢測(cè)出有意義的光強(qiáng)度(Em)。通過實(shí)施所述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)并一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)在此期間出現(xiàn)的圖2B所例示的有意義的光強(qiáng)度，能夠逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針、或發(fā)光探針?biāo)Y(jié)合的目標(biāo)粒子。在本實(shí)施方式中，針對(duì)直接進(jìn)行檢測(cè)的情況、即檢測(cè)與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的情況進(jìn)行說明，但是也能夠是間接地進(jìn)行檢測(cè)的情況，即也能夠檢測(cè)發(fā)光探針暫時(shí)與目標(biāo)粒子結(jié)合之后從粒子離解出的發(fā)光探針的光。
[0089]通過對(duì)檢測(cè)出的粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。在該掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算這類統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理而一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)粒子。因此，即便是欲觀測(cè)粒子濃度低至無法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度 的信息。
[0090]另外，通過掃描分子計(jì)數(shù)法這類對(duì)試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)的方法，與根據(jù)通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度來測(cè)定被熒光標(biāo)記的粒子的濃度的情況相比，能夠以更低的濃度進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來測(cè)定被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被突光標(biāo)記的粒子的濃度充分低時(shí)，噪音信號(hào)的量相對(duì)于從被突光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號(hào)量變大(S/N比惡化)。其結(jié)果，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號(hào)量之間的比例關(guān)系瓦解，確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在根據(jù)被檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，從檢測(cè)結(jié)果中排除了噪音信號(hào)，只將對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)來計(jì)算濃度。因此，與假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度的情況相比較，能夠檢測(cè)至更低的濃度。
[0091]<利用掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定>
[0092]對(duì)于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)定，除了在測(cè)定中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17來在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度測(cè)定工序相同的方式實(shí)施光強(qiáng)度測(cè)定。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上之后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)定開始指示。計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒有圖示)存儲(chǔ)的程序，開始試樣溶液內(nèi)光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。該程序包括為了在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置而對(duì)光路進(jìn)行改變的過程(改變過程)、和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來自光檢測(cè)區(qū)域的光的過程(光檢測(cè)過程)。在該測(cè)量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18的程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動(dòng)鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)實(shí)施光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。與此同時(shí)，光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳送給計(jì)算機(jī)18。計(jì)算機(jī)18以任意方式從送達(dá)的光信號(hào)生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。典型地光檢測(cè)器16為能夠檢測(cè)到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測(cè)器，因此，光的檢測(cè)是以如下方式實(shí)施的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10μ秒逐次地測(cè)量到達(dá)光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)。按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0093]光強(qiáng)度測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意地、例如通過實(shí)驗(yàn)或以適合分析目的的方式設(shè)定的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過的區(qū)域的大小或體積是必需的。因此，以掌握移動(dòng)距離的方式實(shí)施光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。測(cè)量中的經(jīng)過時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測(cè)定結(jié)果，所以，移動(dòng)速度基本上優(yōu)選為恒定速度，然而，移動(dòng)速度不限定于此。
[0094]此外，對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了從測(cè)量到的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子，或以良好的精度定量實(shí)施觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將所述的移動(dòng)速度設(shè)定為比觀測(cè)對(duì)象粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。更嚴(yán)密地，觀測(cè)對(duì)象粒子是指粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，為與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，因此，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置隨時(shí)間而移動(dòng)。因此，在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖3A示意地描述那樣，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)。因此，光強(qiáng)度如圖3B所示那樣隨機(jī)地變化，難以確定對(duì)應(yīng)于各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子T的有意義的光強(qiáng)度的變化。具體來說，如上所述，光檢測(cè)區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。因此，優(yōu)選如圖4A所描述那樣粒子(熒光色素F以及對(duì)象粒子T)大致直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域。因此，在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4B例示那樣，對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的輪廓大致一樣。另外，為了能夠容易地確定各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子T與光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)，將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)。在此，在粒子大致直線地通過光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的輪廓與激發(fā)光強(qiáng)度分布大致相同。
[0095]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密地是粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體、或與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)經(jīng)過半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦區(qū)組織)時(shí)所需的時(shí)間At根據(jù)均方位移的關(guān)系式
[0096](2ffo)2 = 6DX At(I)
[0097]成為
[0098]At= (2ffo) 2/6D(2)
[0099]因此，觀測(cè)對(duì)象粒子通過布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大約是
[0100]Vdif = 2ffo/ Δ t = 3D/ffo(3)
[0101]此處，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考擴(kuò)散移動(dòng)速度Vdif而設(shè)定為與之相比足夠快的值。例如，在假定觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0X 10_V/s左右的情況下，如果將Wo設(shè)為0.62 μ m左右，則Vdif為1.0 X 10_3m/s，因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以設(shè)定為其大致10倍的15mm/s。當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，可以對(duì)光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度進(jìn)行各種設(shè)定，重復(fù)實(shí)施用于發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)度變化的輪廓成為預(yù)期輪廓(典型地是與激發(fā)光強(qiáng)度分布大致相同)的條件的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0102]<利用掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0103]經(jīng)所述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，通過按照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行的處理(從檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的過程)，實(shí)施如下所述的光強(qiáng)度的分析。
[0104](i) 一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)
[0105]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，在一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子經(jīng)過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示那樣大致直線狀時(shí)，與該粒子相對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A示意性地描述那樣，具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)決定的)光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布的輪廓(通常、大致吊鐘狀)。因此，在觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的手法之一中，可以對(duì)光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο，超過該閾值的光強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間寬度△ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為該光強(qiáng)度的輪廓與一個(gè)粒子通過光檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)而進(jìn)行一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)。對(duì)于光強(qiáng)度的閾值1以及對(duì)于時(shí)間寬度Λ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)預(yù)想為從觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度的輪廓而決定的，所述觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域以規(guī)定的速度相對(duì)地移動(dòng)。具體的值可以通過實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇性地決定。
[0106]此外，作為觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的其他方法，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布能夠假定為高斯分布:
[0107]I = AX exp (_2t2/a2)(4)
[0108]在對(duì)有意義的光強(qiáng)度的輪廓(可以明確判斷為非背景的輪廓)擬合式(4)而計(jì)算出的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，可判斷為該光強(qiáng)度的輪廓對(duì)應(yīng)于一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子經(jīng)過了光檢測(cè)區(qū)域而進(jìn)行一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)。當(dāng)強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時(shí)，可以作為噪音或異物而在分析中無視。
[0109](ii)觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)
[0110]對(duì)于觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)，可以是通過任意方法計(jì)數(shù)通過所述觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)(發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)過程)來進(jìn)行。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)大時(shí)，可以通過例如圖5和圖6B所示例的處理來進(jìn)行。
[0111]參照?qǐng)D5和圖6B，在根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的方法的一個(gè)例子中，在進(jìn)行上述說`明的光強(qiáng)度測(cè)定、即用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)而獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)，對(duì)該按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING(平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，在微小的時(shí)間內(nèi)可能產(chǎn)生數(shù)據(jù)值的欠缺，但是，通過平滑化處理，能夠無視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過移動(dòng)平均法而進(jìn)行?？梢愿鶕?jù)獲得光信號(hào)數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN TIME，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)、例如在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動(dòng)平均的次數(shù)
坐寸ο
[0112]然后，為了在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)存在有意義的信號(hào)的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，運(yùn)算平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間的一階微分值(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值如圖6B中下部分的“時(shí)間微分”所例示那樣，信號(hào)值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，因此通過參考該時(shí)間微分值能夠有利地確定有意義的信號(hào)(峰信號(hào))的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0113]之后，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)上，逐次檢測(cè)有意義的信號(hào)(峰信號(hào))，判斷檢測(cè)到的峰信號(hào)是否是與觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索并確定一個(gè)峰信號(hào)的始點(diǎn)和終點(diǎn)，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。當(dāng)確定了一個(gè)峰存在區(qū)域時(shí)，對(duì)該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行吊鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“吊鐘形函數(shù)擬合”)。然后，計(jì)算吊鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(fullwidth half maximum))W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。擬合的吊鐘形函數(shù)典型地是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。然后，判斷計(jì)算出的吊鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落入針對(duì)一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針經(jīng)過光檢測(cè)區(qū)域時(shí)檢測(cè)到的光信號(hào)所描述的吊鐘形輪廓的參數(shù)想定的范圍內(nèi)，即，峰強(qiáng)度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落入規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。如圖7左側(cè)所示，對(duì)于被判斷為計(jì)算出的吊鐘形函數(shù)的參數(shù)落入對(duì)與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對(duì)應(yīng)的光信號(hào)想定的范圍內(nèi)的信號(hào)，判定為是與一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。由此，檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。步驟160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將計(jì)算出的吊鐘形函數(shù)的參數(shù)不在想定范圍內(nèi)的峰信號(hào)(附加為“噪聲”的信號(hào))作為噪音或者異物所導(dǎo)致的信號(hào)而無視。
[0114]所述的步驟130~160的處理中的峰信號(hào)的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)區(qū)域內(nèi)重復(fù)地實(shí)施，每檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，就作為粒子而計(jì)數(shù)。然后，在結(jié)束對(duì)按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的全部區(qū)域的峰信號(hào)搜索后(步驟170)，將到此為止所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)。
[0115](iii)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0116]進(jìn)行了觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的過程中光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過的區(qū)域的總體積，確定觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的實(shí)際體積依賴于激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變，因此，通常難以從設(shè)計(jì)值算出光檢測(cè)區(qū)域的實(shí)際體。因此，計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過的區(qū)域的總體積也不簡(jiǎn)單。在此，典型地是，在與欲要檢查的試樣溶液的測(cè)定相同的條件下，對(duì)已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說明的光強(qiáng)度測(cè)定、粒子的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。也可以根據(jù)檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過的區(qū)域的總體積，即確定觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0117]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測(cè)對(duì)象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合后游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的參照溶液，當(dāng)將其粒子的檢測(cè)數(shù)設(shè)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)
[0118]Vt = N/C(5)
[0119]而得到。另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，對(duì)各參照溶液實(shí)施測(cè)定，將計(jì)算出的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過區(qū)域的總體積Vt而采用。并且，當(dāng)?shù)玫絍t值時(shí)，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度C根據(jù)
[0120]c = n/Vt(6)
[0121]而獲得。可以不通過所述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所經(jīng)過區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置也可以是如下結(jié)構(gòu):對(duì)于想定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子數(shù)N之間的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)能夠適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0122]〈目標(biāo)粒子的定量方法〉
[0123]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法是對(duì)在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子進(jìn)行定量的方法，使發(fā)光探針結(jié)合試樣溶液中的目標(biāo)粒子來對(duì)其進(jìn)行標(biāo)識(shí)。其特征在于，之后，根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)出的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)，基于使用目標(biāo)粒子的濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣制作出的檢量線，計(jì)算該試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度(濃度計(jì)算過程)。掃描分子計(jì)數(shù)法是在分子離散的狀況下能夠按每一個(gè)粒子測(cè)量發(fā)光粒子的測(cè)定方法，因此針對(duì)PM數(shù)量級(jí)以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測(cè)定。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法，即便在試樣溶液中的解析對(duì)象的目標(biāo)粒子的濃度非常低的情況下，也能夠高靈敏度地對(duì)目標(biāo)粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。并且，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法通過將目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合來檢測(cè)目標(biāo)粒子，但是由于使用檢量線，因此能夠更簡(jiǎn)單且容易地求出試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
[0124]另外，目標(biāo)粒子的定量方法也可以包括根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來確定試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度的過程。
[0125]具體而言，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式所涉及的目標(biāo)粒子的定量方法具有下述工序
(a)?(C)。
[0126](a)調(diào)制包含所述目標(biāo)粒子和與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述試樣溶液中結(jié)合。
[0127](b)對(duì)在所述工序(a)中調(diào)制出的溶液中存在的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0128](c)根據(jù)對(duì)所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度或量與所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，基于在所述工序(b)中計(jì)數(shù)出的所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
[0129]并且，所述工序(b)具有以下工序:移動(dòng)工序，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；以及檢測(cè)工序，一邊使所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊檢測(cè)從所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，來逐個(gè)地檢測(cè)所述目標(biāo)粒子。下面，按各工序進(jìn)行說明。
[0130]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含目標(biāo)粒子和與該目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在該試樣溶液中結(jié)合。
[0131]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的粒子和不發(fā)光的粒子中的任一者)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0132]目標(biāo)粒子為在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，是定量該試樣溶液中的濃度的目的粒子。作為目標(biāo)粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對(duì)象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)。[0133]核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:交聯(lián)核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、妝核酸(PNA)等。
[0134]另外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針為與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)，只要是在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)和單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的物質(zhì)，就沒有特別地限定。例如，也可以為使發(fā)光物質(zhì)結(jié)合在與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)上。作為發(fā)光物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長(zhǎng)的光照射而發(fā)出熒光的物質(zhì)，則沒有特別地限定，能夠從用于FCS或FIDA等的熒光色素中適當(dāng)?shù)剡x擇使用。
[0135]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，發(fā)光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的色素分子等。作為寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)，也可以包含部分或全部核酸類似物質(zhì)，所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對(duì)。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為發(fā)光探針，可以使用將目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體用熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記了的物質(zhì)。與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)同發(fā)光物質(zhì)的結(jié)合能夠通過常規(guī)方法進(jìn)行。
[0136]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，但是從目標(biāo)粒子的檢測(cè)/定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的發(fā)光探針，只要是相比于物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)而更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)，則不需要是與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，被作為發(fā)光探針使用的發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與該目標(biāo)粒子的堿基序列錯(cuò)配的堿基序列。
[0137]另外，在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)光探針的發(fā)光特性不同是指在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下，特定的波長(zhǎng)的光強(qiáng)度不同。使發(fā)光探針在單獨(dú)存在的狀態(tài)以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下特定波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度不同(例如，使熒光強(qiáng)度不同)，由此能夠在掃描分子計(jì)數(shù)法中區(qū)別地檢測(cè)出兩者。
[0138]目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周圍環(huán)境時(shí)熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類的熒光色素)能夠作為發(fā)光探針使用。另外，發(fā)光探針也可以其自身不發(fā)光。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，使用與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為發(fā)光探針，在試樣溶液中與發(fā)光探針一起添加與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)。由此，能夠在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)(非結(jié)合狀態(tài))以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)(結(jié)合狀態(tài))下使發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑等。[0139]其他的，也可以使用例如由至少兩個(gè)構(gòu)成要素形成的、通過與目標(biāo)粒子結(jié)合使前述的至少兩個(gè)構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為發(fā)光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出與某粒子結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強(qiáng)的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過該結(jié)構(gòu)，在所有情況下，單獨(dú)的發(fā)光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光也由于與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體的波長(zhǎng)不同而能夠選擇地檢測(cè)從目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0140]另外，通過利用熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使試樣溶液中單獨(dú)存在的發(fā)光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的發(fā)光特性不同。例如，使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))以在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET且在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的條件結(jié)合在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上。由此，該結(jié)合物質(zhì)能夠用作發(fā)光探針。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針不再產(chǎn)生FRET，所以從成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另外，從單獨(dú)存在的發(fā)光探針中，檢測(cè)不到從成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測(cè)到的熒光是減弱的。因此，通過檢測(cè)從成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針區(qū)別地檢測(cè)與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0141]例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，以在單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET且在與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的條件，使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)結(jié)合在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時(shí)形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上來形成分子信標(biāo)探針。能夠優(yōu)選使用該分子信標(biāo)探針作為發(fā)光探針。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中優(yōu)選的是:3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補(bǔ)的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對(duì)由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對(duì)的彼此互補(bǔ)的區(qū)域，夾著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在即可，3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，對(duì)于形成堿基對(duì)的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列，為所形成的堿基對(duì)的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體的穩(wěn)定性、且在測(cè)定條件下能夠形成堿基對(duì)的程度即可。
[0142]另外，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便該熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨(dú)存在的發(fā)光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為FRET的能量受體。從單獨(dú)存在的發(fā)光探針檢測(cè)到由標(biāo)記該發(fā)光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對(duì)，與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以從結(jié)合體能夠檢測(cè)到由于FRET而發(fā)出的熒光，結(jié)果是能夠與單獨(dú)存在的發(fā)光探針相區(qū)別來進(jìn)行檢測(cè)。
[0143]此外，當(dāng)進(jìn)入發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對(duì)之間的熒光性嵌入劑的量過多時(shí)，檢測(cè)由于FRET而發(fā)出的熒光時(shí)的背景變得過高，有可能影響檢測(cè)精度。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計(jì)成在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域?yàn)?00bp以下。
[0144]其他的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，也可以使用兩種發(fā)光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，將兩種發(fā)光探針設(shè)計(jì)成相對(duì)于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交。并且，將一者的發(fā)光探針用FRET中的成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一者的發(fā)光探針用該FRET中的成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨(dú)存在的發(fā)光探針不產(chǎn)生FRET，而通過與目標(biāo)粒子結(jié)合，所述兩種發(fā)光探針相互接近(例如，兩種發(fā)光探針的間隔約為Inm?IOnm)而產(chǎn)生FRET。因此，通過檢測(cè)由于FRET而發(fā)出的熒光，能夠檢測(cè)出目標(biāo)粒子。
[0145]具體而言，工序(a)首先將目標(biāo)粒子和發(fā)光探針添加到適當(dāng)?shù)娜軇┲衼碚{(diào)制試樣溶液。該溶劑如果是不妨礙從發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測(cè)以及利用掃描分子計(jì)數(shù)法對(duì)發(fā)光探針的檢測(cè)的溶劑，就不特別地進(jìn)行限定，能夠從在本【技術(shù)領(lǐng)域】中一般使用的緩沖液中適當(dāng)?shù)剡x擇使用。作為該緩沖液，例如有PBS (磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0146]在只是使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針共存于相同的溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制試樣溶液之后，只需根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育該試樣溶液，就能使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針在試樣溶液中結(jié)合。
[0147]另一方面，在目標(biāo)粒子、發(fā)光探針為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸或者核酸類似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使試樣溶液中的核酸等變性之后使兩者締合?！笆购怂峄蚝怂犷愃莆镔|(zhì)變性”是指使堿基對(duì)解離。例如，是指使分子信標(biāo)探針中彼此互補(bǔ)的堿基序列所形成的堿基對(duì)解離而解開分子內(nèi)結(jié)構(gòu)成為單鏈結(jié)構(gòu)，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。當(dāng)發(fā)光探針是包含PNA等核酸類似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即便目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也能夠形成包含該發(fā)光探針和目標(biāo)粒子的締合體。
[0148]作為變性處理，可列舉出利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。其中，熱變性對(duì)于熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的影響比較小且操作簡(jiǎn)便，所以優(yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性中，能夠通過對(duì)試樣溶液實(shí)施高溫處理而使該試樣溶液中的核酸等變性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保溫?cái)?shù)秒至2分鐘左右，能夠使之變性，但根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長(zhǎng)度等進(jìn)行變性的溫度不同，只要能夠變性，就對(duì)其溫度沒有限定。另一方面，通過低鹽濃度處理進(jìn)行變性能夠通過例如利用純水等稀釋而將該試樣溶液的鹽濃度調(diào)整至足夠低來進(jìn)行。
[0149]根據(jù)需要進(jìn)行了變性之后，使前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針締合。當(dāng)進(jìn)行了熱變性時(shí)，在高溫處理后，使該試樣溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的溫度，由此能夠使該試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。另外，當(dāng)通過低鹽濃度處理進(jìn)行了變性時(shí)，通過添加鹽溶液等使該試樣溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的濃度，由此能夠使該試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。
[0150]能夠根據(jù)兩者形成的締合體的熔解曲線求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如能夠使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測(cè)定該溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，能夠?qū)淖冃缘膬蓷l單鏈核酸分子開始形成締合體的溫度至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度，作為兩者能夠特異地雜交的溫度。通過代替溫度而使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化，同樣能夠確定熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0151]通常能夠用Tm值(熔解溫度)代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等，根據(jù)發(fā)光探針的堿基序列信息，能夠計(jì)算與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0152]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，能夠按0.050C /秒以上的降溫速度降低該試樣溶液的液溫。
[0153]此外，為了抑制非特異地雜交，優(yōu)選預(yù)先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠防止非特異地雜交的發(fā)生。
[0154]之后，作為工序(b)，通過掃描分子計(jì)數(shù)法對(duì)調(diào)制出的試樣溶液中的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體而言，將使目標(biāo)粒子與標(biāo)識(shí)用探針結(jié)合之后的試樣溶液設(shè)置在用于前述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置中，通過所述方法，檢測(cè)從標(biāo)識(shí)用探針發(fā)出的光并進(jìn)行解析。由此計(jì)算目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。
[0155]在工序(a)之后，作為工序(d)，從所述試樣溶液中，與未與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針相分離來回收所述復(fù)合體。在使用逐個(gè)檢測(cè)用發(fā)光探針標(biāo)識(shí)的目標(biāo)粒子的光分析技術(shù)的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的方法中，如果來自以游離的發(fā)光探針為代表的未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的光沒有與來自發(fā)光探針的光區(qū)分開而被檢測(cè)到，則導(dǎo)致目標(biāo)粒子的檢測(cè)精度變差。因此，在工序(d)中，從所述復(fù)合體中去除以游離的發(fā)光探針為代表的未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針。
[0156]對(duì)于與未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針相分離來回收所述復(fù)合體的方法，沒有特別地進(jìn)行限定，在利用大小或分子量、針對(duì)任意的物質(zhì)的親和性、帶電狀態(tài)等的差異來將多個(gè)物質(zhì)物理分離時(shí)，能夠從所述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常進(jìn)行的物質(zhì)分離方法中適當(dāng)?shù)剡x擇實(shí)施。作為所述分離方法，例如列舉出包含吸附、抽出或清洗的操作。具體地說，列舉有色譜(親水/疏水性色譜、親和色譜、離子交換色譜等)、超濾、電泳、相分離、離心分離、溶劑抽出、過濾吸附等。
[0157]也能夠利用與發(fā)光探針相獨(dú)立地與目標(biāo)粒子結(jié)合的分離用探針，與未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針相分離來回收所述復(fù)合體。具體地說，在工序(a)中，在所述試樣溶液中還添加分離用探針，形成包含目標(biāo)粒子、發(fā)光探針以及分離用探針的復(fù)合體。接著，在工序
(d)中，利用所述復(fù)合體中的分離用探針與其它物質(zhì)的相互作用，將所述復(fù)合體與未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針相分離來進(jìn)行回收。
[0158]分離用探針只要是獨(dú)立于發(fā)光探針而與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)，就不特別地進(jìn)行限定。所述分離用探針也可以通過其它的物質(zhì)間接地與目標(biāo)粒子結(jié)合，但是優(yōu)選與目標(biāo)粒子直接結(jié)合的物質(zhì)。作為能夠用作分離用探針的直接與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)，與發(fā)光探針中所列舉的物質(zhì)中的發(fā)光物質(zhì)結(jié)合之前的物質(zhì)相同。例如在目標(biāo)粒子是核酸分子或核酸類似物質(zhì)的情況下，是與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸，在目標(biāo)粒子是蛋白質(zhì)的情況下，是目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體。
[0159]作為在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中使用的分離用探針，優(yōu)選具有與固相載體結(jié)合的部位，在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下進(jìn)一步與固相載體直接或間接結(jié)合。在使用所述分離用探針的情況下，通過使用與分離用探針直接或間接結(jié)合的固相載體的固液分離處理，能夠更簡(jiǎn)單地進(jìn)行工序(d)中的復(fù)合體的回收以及以后的工序(e)中的游離的發(fā)光探針的回收。
[0160]作為固相載體，只要是具備與分離用探針結(jié)合的部位的固體，其形狀、材質(zhì)等就不特別地進(jìn)行限定。例如可以是珠粒等能夠懸浮于水且通過通常的固液分離處理能夠與液體分離的粒子，也可以是薄膜，還可以是容器、芯基板等。作為固相載體，具體而言，例如列舉有磁珠、硅珠、瓊脂糖凝膠珠、聚丙烯酰胺樹脂珠、乳膠珠、聚苯乙烯珠等塑膠珠、陶瓷珠、氧化鋯珠、硅膠模、硅膠過濾器、塑膠板等。
[0161]例如在分離用探針是寡核苷酸的情況下，能夠使用表面結(jié)合有與所述寡核苷酸中的與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域以外的區(qū)域雜交的寡核苷酸的珠粒、過濾器作為固相載體。另外，在分離用探針具有生物素(biotin)作為與固相載體結(jié)合的部位的情況下，能夠使用表面結(jié)合有抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白的珠粒、過濾器來作為固相載體。另外，在分離用探針中的與固相載體結(jié)合的部位是谷胱甘肽(Glutathione)、DNP(dinitorophenol)、地高辛配基(digoxigenin、Dig)、地高辛(digoxin)、由兩個(gè)以上的糖構(gòu)成的糖鏈、由四個(gè)以上的氨基酸構(gòu)成的多肽、生長(zhǎng)素、赤霉素、類固醇、蛋白質(zhì)、親水性有機(jī)化合物以及它們的類似物等的情況下，能夠使用表面結(jié)合有這些物質(zhì)的抗體、抗原、配體、或受體的珠粒、過濾器作為固相載體。此外，固相載體可以與分離用探針非特異地結(jié)合等，但是從目標(biāo)粒子的檢測(cè)、定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等。
[0162]具體而言，使固相載體接觸所述試樣溶液,并根據(jù)需要進(jìn)行孵育，由此所述試樣溶液中的包含目標(biāo)粒子、發(fā)光探針以及分離用探針的復(fù)合體通過所述復(fù)合體中的分離用探針來與固相載體結(jié)合。之后，通過進(jìn)行固液分離處理，能夠?qū)⑴c固相載體結(jié)合的復(fù)合體分離于游離的發(fā)光探針等未與以液相存在的目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針來進(jìn)行回收。
[0163]作為固液分離處理，只要是能夠?qū)⒃嚇尤芤褐械墓滔噍d體與液體成分相分離來進(jìn)行回收的方法，就不特別地進(jìn)行限定，能夠從使用于固液分離處理的公知的處理中適當(dāng)?shù)剡x擇使用。例如在固相載體是珠粒等粒子的情況下，也可以針對(duì)包含固相載體的懸浮液進(jìn)行離心分離處理，使固相載體沉淀來去除上清液。另外，也可以利用濾紙或過濾器對(duì)所述試樣溶液進(jìn)行過濾，將殘留在濾紙等的表面的固相載體回收。另外，在固相載體是磁珠的情況下，使磁鐵接近放入有所述試樣溶液的容器，在使固相載體會(huì)聚至所述容器的最接近所述磁體的面之后，去除上清液。在內(nèi)壁被與分離用探針結(jié)合的物質(zhì)覆蓋的容器是固相載體的情況下，將包含所述復(fù)合體的試樣溶液注入到所述容器內(nèi)，并根據(jù)需要進(jìn)行孵育，之后將所述容器內(nèi)的液體排出。此外，在固相載體是薄膜、過濾器的情況下，通過使包含所述復(fù)合體的試樣溶液透過所述固相載體，能夠通過一個(gè)操作進(jìn)行固相載體與所述復(fù)合體的結(jié)合以及所述復(fù)合體與未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的分離和回收。
[0164]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在工序(a)中，也可以將固相載體與目標(biāo)粒子、發(fā)光探針以及分離用探針一起預(yù)先添加到試樣溶液中，形成與固相載體結(jié)合的包含目標(biāo)粒子、發(fā)光探針以及分離用探針的復(fù)合體，之后進(jìn)行固液分離處理，由此將與固相載體結(jié)合的所述復(fù)合體分離于未與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針并回收。另外，在工序(a)中，也可以預(yù)先添加與固相載體結(jié)合的狀態(tài)下的分離用探針、目標(biāo)粒子以及發(fā)光探針來調(diào)制試樣溶液。此外，此時(shí)使用的分離用探針與固相載體可以可逆結(jié)合，也可以不可逆結(jié)合。
[0165]通過針對(duì)所回收的固相載體添加適當(dāng)?shù)娜軇?，來調(diào)制包含與固相載體結(jié)合的復(fù)合體的試樣溶液。對(duì)于所回收的固相載體，以包含其的試樣溶液的方式提供給工序(e)。所述溶劑只要是在后面的工序中不妨礙從發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測(cè)的溶劑，就不特別地進(jìn)行限定。能夠從在所述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適當(dāng)?shù)剡x擇使用。作為所述緩沖液，例如有PBS (磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0166]所回收的固相載體也可以在工序(e)之前通過適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行清洗。通過清洗，能夠?qū)⒂坞x的發(fā)光探針更嚴(yán)格地分離于與固相載體結(jié)合的復(fù)合體而去除。清洗固相載體的溶劑只要不破壞復(fù)合體與固相載體的結(jié)合，就不進(jìn)行限定，可以與調(diào)制包含與提供給工序
(e)的固相載體結(jié)合的復(fù)合體的試樣溶液時(shí)使用的溶劑相同，也可以是不同的溶劑。
[0167]之后，作為工序(e)，從在工序(d)中所回收的復(fù)合體離解出所述發(fā)光探針，之后將游離的發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子相互分離來進(jìn)行回收。
[0168]使復(fù)合體中的發(fā)光探針離解出的方法只要是能夠解除所述復(fù)合體中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合的方法，就不特別地進(jìn)行限定。
[0169]例如目標(biāo)粒子是由核酸分子或核酸類似物質(zhì)構(gòu)成的寡核苷酸，在發(fā)光探針中的與目標(biāo)粒子結(jié)合的部位是由核酸分子或核酸類似物質(zhì)構(gòu)成并與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸的情況下，使包含所述復(fù)合體的試樣溶液的溫度充分地高于目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的特異地締合條件，或者使包含所述復(fù)合體的試樣溶液的鹽濃度充分地低于目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的特異地締合條件。由此，能夠解除發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的結(jié)合，使發(fā)光探針從所述復(fù)合體離解出。
[0170]將離解出的發(fā)光探針與單體或形成復(fù)合體的目標(biāo)粒子相互分離來進(jìn)行回收的方法不特別地進(jìn)行限定，考慮到發(fā)光探針與單體的目標(biāo)粒子或包含目標(biāo)粒子的復(fù)合體的大小差異、針對(duì)任意物質(zhì)的親和性的差異等，能夠從所述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常進(jìn)行的物質(zhì)分離方法中適當(dāng)?shù)剡x擇實(shí)施。具體地說，例舉出色譜(親水/疏水性色譜、親和色譜、離子交換色譜等)、超濾、電泳、相分離、離心分離、溶劑抽出、過濾吸附等。
[0171]圖8是示意性地表示使用分離用探針D和與所述分離用探針D結(jié)合的固相載體S的方式的圖。首先，目標(biāo)粒子T、發(fā)光探針E以及分離用探針D結(jié)合而形成復(fù)合體C。在使所述復(fù)合體C通過分離用探針D與固相載體S結(jié)合之后，通過清洗去除游離的發(fā)光探針E，之后使發(fā)光探針E從復(fù)合體C離解出，將游離的發(fā)光探針E和通過分離用探針D與固相載體S結(jié)合的目標(biāo)粒子T分離回收。
[0172]最后，作為工序(C)，基于對(duì)溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度或量與從溶液計(jì)數(shù)出的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)所述工序(b)中計(jì)數(shù)出的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用檢量線，能夠根據(jù)通過發(fā)光探針檢測(cè)出的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)，容易地求出試樣溶液中的目標(biāo)粒子的濃度。
[0173]關(guān)于檢量線，具體而言，首先調(diào)制目標(biāo)粒子的濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)試樣系列。例如能夠用水、緩沖液等溶劑階段性地稀釋目標(biāo)粒子的濃度已知的溶液來調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)試樣系列。構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)試樣系列的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的個(gè)數(shù)不特別地進(jìn)行限定，優(yōu)選為3?20種左右。另外，各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的目標(biāo)粒子的濃度也不特別地進(jìn)行限定，能夠考慮目標(biāo)粒子的種類、發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的親和性、解析對(duì)象的試樣溶液中的所期望的目標(biāo)粒子的濃度等來適當(dāng)?shù)卣{(diào)制。就標(biāo)準(zhǔn)試樣系列而言，可以將各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的目標(biāo)粒子的濃度設(shè)定為等間隔，也可以設(shè)定為不等間隔。
[0174]接著，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)試樣系列的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液，以針對(duì)作為解析對(duì)象的試樣溶液的相同的條件進(jìn)行工序(a)和(b)，對(duì)在各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液中存在的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。即，通過在與解析對(duì)象的試樣溶液同種的溶劑中添加各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液和濃度與該試樣溶液相同那樣的發(fā)光探針來調(diào)制測(cè)定用溶液。然后，通過進(jìn)行與工序(a)相同的處理，來在各測(cè)量用溶液中使目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針結(jié)合。之后，利用與工序(b)相同的裝置、程序來進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)量，計(jì)算與標(biāo)識(shí)用探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。針對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的一系列的測(cè)定可以與工序(a)和(b)實(shí)質(zhì)上同時(shí)地進(jìn)行，也可以在工序(a)之前預(yù)先進(jìn)行，還可以在工序(b)之后進(jìn)行。
[0175]能夠根據(jù)針對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液計(jì)數(shù)出的與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)和所述標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的目標(biāo)粒子的濃度，求出對(duì)兩者的關(guān)系進(jìn)行近似的可連續(xù)微分的函數(shù)。使用所得到的可連續(xù)微分的函數(shù)作為檢量線。檢量線的制作方法不特別地進(jìn)行限定，通?？梢允褂迷谥谱鲀煞N定量數(shù)據(jù)的關(guān)系的近似線時(shí)使用的運(yùn)算解析方法中的任一個(gè)來進(jìn)行制作。例如在將橫軸作為目標(biāo)粒子的濃度、將縱軸作為目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)得到的曲線圖中，對(duì)從各標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制。通過針對(duì)各標(biāo)繪點(diǎn)進(jìn)行最小二乘法等，能夠制作檢量線。在多數(shù)情況下，通過在對(duì)目標(biāo)粒子的濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)顯示的單對(duì)數(shù)曲線圖上繪制測(cè)量值，能夠制作近似于S形曲線的檢量線。
[0176]<本實(shí)施方式的裝置和程序>
[0177]通過使用對(duì)用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置和用于該裝置的程序進(jìn)一步追加了用于進(jìn)行工序(C)的結(jié)構(gòu)和過程的裝置等，能夠通過所述裝置進(jìn)行工序(b)?(C)。
[0178]具體而言，一種在所述的掃描分子計(jì)數(shù)法中使用的光分析裝置，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析裝置具有:光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路，來使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測(cè)部，其檢測(cè)來自所述光檢測(cè)區(qū)域的光；以及信號(hào)處理部，其一邊使所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)一邊逐個(gè)地檢測(cè)由所述光檢測(cè)部檢測(cè)出的來自各個(gè)所述發(fā)光粒子的光信號(hào)，對(duì)所述逐個(gè)地檢測(cè)出的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置移動(dòng)中檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。光分析裝置還具備:存儲(chǔ)部，其存儲(chǔ)對(duì)試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度或量與從該試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線；濃度計(jì)算部，其基于所述檢量線，根據(jù)所述信號(hào)處理部所計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度；以及顯示部，其顯示由所述濃度計(jì)算部計(jì)算出的所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的所述濃度。
[0179]例如，計(jì)算機(jī)18也可以具備所述信號(hào)處理部、存儲(chǔ)部、濃度計(jì)算器。
[0180]在所述顯示部中，用數(shù)值、表、曲線圖等不問形式地顯示基于檢量線計(jì)算出的試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度。另外，還優(yōu)選顯示檢量線自身、或者所述信號(hào)處理部所計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)。在圖9和圖10中示出該顯示部顯示的數(shù)據(jù)的一個(gè)方式。在該顯示部中，除此之外還可以顯示檢測(cè)來自光檢測(cè)區(qū)域的光的條件(試樣溶液的量、測(cè)定環(huán)境時(shí)的溫度、從光學(xué)系統(tǒng)發(fā)射的光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度、光檢測(cè)區(qū)域的位置、光信號(hào)數(shù)據(jù)獲取時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)等)。作為該顯示部，能夠使用液晶顯示器等公知的圖像顯示裝置。
[0181]通過對(duì)例如圖1所示那樣的使用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置進(jìn)一步設(shè)置存儲(chǔ)檢量線的存儲(chǔ)裝置、根據(jù)檢量線計(jì)算試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度的運(yùn)算裝置以及顯示所計(jì)算出的試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度的顯示器(顯示部)19的裝置，能夠進(jìn)行工序
(b)~(C)。該存儲(chǔ)裝置和運(yùn)算裝置能夠利用圖1A所示的計(jì)算機(jī)18。
[0182]另外，如以圖11所示的流程圖所表示的那樣，能夠根據(jù)以下程序通過所述裝置進(jìn)行工序(b)~(C)，該程序除用于基于通過掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量出的光子計(jì)數(shù)光強(qiáng)度的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理步驟，還具有參照對(duì)試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度(或量)與從試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)計(jì)數(shù)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)計(jì)算該溶液中的目標(biāo)粒子的濃度的步驟。
[0183]實(shí)施例
[0184]接著，示出實(shí)施例等來更詳細(xì)地說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是本發(fā)明的實(shí)施方式不限定于下面的實(shí)施例。
[0185][參考例I]
[0186]進(jìn)行了表示利用濃度不同的熒光色素能夠制作基于掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)量值的檢量線的實(shí)驗(yàn)。
[0187]在測(cè)量中，作為光分析裝置，使用了具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)定裝置MF20 (奧林巴斯株式會(huì)社)。
[0188]首先，將ATTO (注冊(cè)商標(biāo))633(ATT0_TEC公司產(chǎn))利用磷酸緩沖液(包含0.1%的PluronicF-127)分別調(diào)制成ΙΟΟρΜ、10pM、lpM、IOOfM或10fM。接著，在進(jìn)行了光分析裝置的光學(xué)調(diào)整之后，針對(duì)所述各試樣溶液進(jìn)行測(cè)量，獲取按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此時(shí)，利用633nm的激光照射ImW的激發(fā)光,利用帶通濾波器使檢測(cè)光波長(zhǎng)成為660nm~710nm。試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為15mm/秒，將BIN --ΜΕ設(shè)為10μ秒，對(duì)于lOOpMUOpM以及IpM的試樣，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為2秒，對(duì)于IOOfM和IOfM的試樣，將測(cè)定時(shí)間設(shè)為20秒(在2秒內(nèi)對(duì)曲線圖中的峰數(shù)進(jìn)行換算)。另外，對(duì)各試樣進(jìn)行5次測(cè)定，計(jì)算出其平均。在測(cè)定出光強(qiáng)度之后，根據(jù)關(guān)于各試樣溶液獲取到的按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)來對(duì)在按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)中檢測(cè)出的光信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在利用數(shù)據(jù)的移動(dòng)平均法的平滑中，一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)設(shè)為9個(gè)，將移動(dòng)平均處理重復(fù)進(jìn)行5次。另外，在擬合時(shí)，通過最小二乘法使高斯函數(shù)擬合按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)，確定(高斯函數(shù)中的)峰強(qiáng)度、峰寬度(半高全寬)、相關(guān)系數(shù)。并且，在峰的判斷處理中，只將滿足下述條件的峰信號(hào)判定為對(duì)應(yīng)于觀測(cè)對(duì)象分子的光信號(hào)，
[0189]20 μ s〈峰寬度〈400 μ s
[0190]峰強(qiáng)度>1 [光子/10 μ s]
[0191]相關(guān)系數(shù)>0.95。
[0192]另一方面，將不滿足所述條件的峰信號(hào)作為噪聲而無視，對(duì)判斷為是對(duì)應(yīng)于觀測(cè)對(duì)象分子的光信號(hào)的信號(hào)的個(gè)數(shù)作為“峰數(shù)”來進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0193]圖12是將橫軸設(shè)為試樣溶液中的熒光物質(zhì)ATT0633的濃度、將縱軸設(shè)為峰數(shù)并對(duì)各試樣溶液的計(jì)數(shù)值進(jìn)行繪制得到的曲線圖(用對(duì)數(shù)刻度表示)。其結(jié)果，確認(rèn)出ATT0633的濃度與峰數(shù)的關(guān)系具有比例關(guān)系。[0194]另外，圖13是將圖12的曲線圖用普通刻度表示的曲線圖。其結(jié)果可知，溶液中的熒光物質(zhì)ATT0633的濃度和所計(jì)數(shù)出的峰數(shù)具有強(qiáng)的正相關(guān)，通過使用根據(jù)各測(cè)定值求出的檢量線(圖13內(nèi)所示。)，能夠容易地確定濃度未知的試樣的濃度。例如在測(cè)定濃度未知的試樣時(shí)的峰數(shù)為100的情況下，該試樣的ATT0633的濃度能夠計(jì)算為2.5pM。
[0195][實(shí)施例1]
[0196]作為目標(biāo)粒子，使用了由序列編號(hào)I表示的堿基序列構(gòu)成的核酸。下面，在本實(shí)施例中，將該核酸稱為目標(biāo)核酸。另外，作為與該目標(biāo)核酸結(jié)合的發(fā)光探針，使用了在由用序列編號(hào)2表示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸的5’末端附加Alexa Fluor488、在3’末端附加BHQ-1的分子信標(biāo)探針。這些寡核苷酸委托Sigma-Genosys株式會(huì)社合成得到。表1示出目標(biāo)核酸和分子信標(biāo)探針的堿基序列。在表1中，分子信標(biāo)探針中的附加有下劃線的堿基是在形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體時(shí)彼此雜交的區(qū)域。
[0197][表1]
【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的定量方法，對(duì)在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子進(jìn)行定量，具備以下工序: (a)調(diào)制包含所述目標(biāo)粒子和與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的試樣溶液，使所述目標(biāo)粒子與所述發(fā)光探針在所述試樣溶液中結(jié)合； (b)移動(dòng)工序，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)； 檢測(cè)工序，一邊使所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊檢測(cè)從所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光探針發(fā)出的光信號(hào)，來直接或間接地逐個(gè)檢測(cè)所述目標(biāo)粒子； (C)計(jì)數(shù)工序，對(duì)在所述檢測(cè)工序中檢測(cè)出的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；以及 計(jì)算工序，基于對(duì)所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度或量與所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)在所述工序(b)中計(jì)數(shù)出的所述目標(biāo)粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 在所述移動(dòng)工序中以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 在所述移動(dòng)工序中，以比擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置，所述擴(kuò)散移動(dòng)速度是所述發(fā)光探針或與所述發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子的快的一方的擴(kuò)散移動(dòng)速度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 在所述檢測(cè)工序中，根據(jù)所檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，來檢測(cè)所述發(fā)光探針或與發(fā)光探針結(jié)合的所述目標(biāo)粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 所述發(fā)光探針具有在相互接近時(shí)產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的能量供體部位和能量受體部位， 在所述發(fā)光探針與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的結(jié)合狀態(tài)和未與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的非結(jié)合狀態(tài)之間，所述能量供體部位與所述能量受體部位之間的距離不同， 所述結(jié)合狀態(tài)與所述非結(jié)合狀態(tài)的從所述發(fā)光探針發(fā)出的光的發(fā)光特性不同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 所述目標(biāo)粒子為核酸， 所述發(fā)光探針是與所述目標(biāo)粒子特異地雜交且結(jié)合有熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中的成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)中的至少一個(gè)的單鏈核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 還具備以下工序(d)，在所述工序(a)之后，從所述試樣溶液中，分離未與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針來回收包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的目標(biāo)粒子的定量方法，其特征在于， 還具備以下工序(e)，從在所述工序(d)中回收的所述復(fù)合體離解出所述發(fā)光探針之后，將游離的發(fā)光探針和所述目標(biāo)粒子相互分離來進(jìn)行回收。
9.一種光分析裝置，使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析裝置包括: 光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路來使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)； 光檢測(cè)部，其檢測(cè)所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光粒子的光； 信號(hào)處理部，其一邊使所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)，一邊逐個(gè)地檢測(cè)來自由所述光檢測(cè)部檢測(cè)出的各個(gè)所述發(fā)光粒子的所述光的光信號(hào)，對(duì)逐個(gè)地檢測(cè)出的來自所述發(fā)光粒子的所述光信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置移動(dòng)過程中檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)； 存儲(chǔ)部，其存儲(chǔ)對(duì)所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度或量與從所述試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線； 濃度計(jì)算部，其基于所述檢量線，根據(jù)所述信號(hào)處理部所計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度；以及 顯示部，其顯示由所述濃度計(jì)算部計(jì)算出的所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的所述濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于， 所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部 以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的裝置，其特征在于， 所述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
12.根據(jù)權(quán)利要求9~11中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于， 根據(jù)由所述光檢測(cè)部檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，所述信號(hào)處理部檢測(cè)所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于， 在檢測(cè)出強(qiáng)度大于規(guī)定的閾值的所述光信號(hào)時(shí)，所述信號(hào)處理部檢測(cè)出所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了所述光檢測(cè)區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求9~13中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于， 所述信號(hào)處理部根據(jù)檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)，來確定所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
15.根據(jù)權(quán)利要求9~14中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于， 所述發(fā)光粒子是與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子， 所述光檢測(cè)部進(jìn)行檢測(cè)的光是從與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
16.根據(jù)權(quán)利要求9~14中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于， 所述光檢測(cè)部進(jìn)行檢測(cè)的光是從發(fā)光探針發(fā)出的光，該發(fā)光探針是從包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體中游離出的發(fā)光探針。
17.一種光分析用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來自在試樣溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的多個(gè)發(fā)光粒子的光，該光分析用計(jì)算機(jī)程序使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 改變步驟，改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路以使所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)； 光檢測(cè)步驟，在使所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)的過程中檢測(cè)所述光檢測(cè)區(qū)域中的所述發(fā)光粒子的所述光； 光信號(hào)檢測(cè)步驟，逐個(gè)地檢測(cè)來自所述檢測(cè)出的各個(gè)所述發(fā)光粒子的所述光的光信號(hào); 發(fā)光粒子數(shù)計(jì)數(shù)步驟，對(duì)來自所述逐個(gè)地檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的所述光的所述光信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來對(duì)在所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置移動(dòng)過程中檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；以及 濃度計(jì)算步驟，基于對(duì)所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的濃度或量與從所述試樣溶液計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行近似的檢量線，根據(jù)計(jì)數(shù)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)來計(jì)算所述試樣溶液中的所述目標(biāo)粒子的濃度。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述改變步驟中，以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述改變步驟中，以比所述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的所述位置。
20.根據(jù)權(quán)利要求17~19中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述光信號(hào)檢測(cè)步驟中，根據(jù)所檢測(cè)出的按照時(shí)間順序的所述光信號(hào)的形狀，檢測(cè)所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到所述光檢測(cè)區(qū)域的情形。
21.根據(jù)權(quán)利要求17~20中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述光信號(hào)檢測(cè)步驟中，在檢測(cè)出強(qiáng)度大于規(guī)定的閾值的所述光信號(hào)時(shí)，檢測(cè)出所述發(fā)光粒子中的一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入到了所述光檢測(cè)區(qū)域。
22.根據(jù)權(quán)利要求17~21中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還包括以下步驟:根據(jù)所述檢測(cè)出的所述發(fā)光粒子的所述個(gè)數(shù)，來確定所述試樣溶液中的所述發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
23.根據(jù)權(quán)利要求17~22中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述光檢測(cè)步驟中，從所述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)出的光是從與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的所述發(fā)光探針發(fā)出的光。
24.根據(jù)權(quán)利要求17~22中的任一項(xiàng)所述的計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在所述光檢測(cè)步驟中，從所述光檢測(cè)區(qū)域檢測(cè)出的光是從所述發(fā)光探針發(fā)出的光，該發(fā)光探針是從包含所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針的復(fù)合體游離出的發(fā)光探針。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103620389SQ201280029689
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】中田秀孝 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社