專利名稱：脂肪組織衍生的基質干細胞在治療瘺中的用途的制作方法
脂肪組織衍生的基質干細胞在治療瘺中的用途 相關申請參考本申請是2005年2月25日提交的美國專利申請11/065,461的部 分繼續(xù)申請以及2005年2月14日提交的美國專利申請11/056,241的 部分繼續(xù)申請，在此將這些申請的內容整體通過參考明確并入本文。發(fā)明背景一般而言，瘺是正常情況下不連接的器官或脈管之間的異常連接 或通道。瘺可以發(fā)生在身體的多個部位。例如，痿的種類，以它們在 身體中發(fā)生的區(qū)域命名，包括肛門直腸痿或肛瘺或糞瘺(直腸或其它肛 門直腸部位與皮膚表面之間)、動靜脈瘺或A-V瘺(動脈和靜脈之間)、 膽瘺(膽管和皮膚表面之間，通常由膽嚢手術造成)、子宮頸瘺(子宮頸 中的異常開口)、鼻腦脊液瘺(顱內腔和鼻旁竇之間)、腸腸瘺(腸的兩個 部位之間)、腸皮瘺(腸和皮膚表面之間，即從十二指腸或空腸或回腸 起)、腸陰道瘺(腸和陰道之間)、胃瘺(胃和皮膚表面之間)、子宮腹膜 瘺(子宮和腹膜腔之間)、外淋巴瘺(中耳和內耳之間的膜之間的裂口 )、 肺動靜脈瘺(肺的動脈和靜脈之間，導致血液分流)、直腸陰道瘺(直腸 和陰道之間)、臍瘺(臍和腸之間)、氣管食管瘺(呼吸和飼管之間)以及 膀胱陰道瘺(膀胱和陰道之間)。瘺的病因包括創(chuàng)傷、內科治療的并發(fā) 癥和疾病。瘺的治療隨病因和瘺的程度而變，但是一般涉及外科手術。多種 手術方法被經(jīng)常使用，最經(jīng)常的是瘺道切開術、放置泄液線(穿過瘺的 通道的繩索用于保持其開放而引流)、或直腸內瓣方法(其中健康組織 被拉過來置于瘺的內側以使糞便或其它物質不會再感染該通道)。對于 肛門直腸瘺的手術并非沒有副作用，包括復發(fā)、再感染和失禁。諸如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的炎性腸病為肛門直腸瘺、腸腸瘺、 腸皮膚瘺的主要病因。在克羅恩病中所報道的痿發(fā)生率為17%至50%。對克羅恩病患者中瘺的治療仍代表了極有挑戰(zhàn)性的問題，因為很多這 類瘺對可用的療法沒有反應。這類瘺以及它們的復發(fā)是非常讓人痛苦 的并發(fā)癥，它們顯著地降低了受累患者的生活質量。內科療法的最新改進(例如用Infliximab⑧治療)和專業(yè)的手術處理已經(jīng)減少了對復雜手 術的需要。然而，許多患者未被治愈。痿治愈失敗可能是由于受克羅 恩病影響的組織的非最佳質量。實際上，克羅恩瘺為一些最壞的可能 條件下的傷口愈合提供了模式系統(tǒng)。瘺的另 一主因是諸如由強奸或由分娩期間持續(xù)損傷引起的對陰道 和膀胱和/或直腸的創(chuàng)傷，導致直腸陰道瘺和膀胱陰道瘺。在發(fā)展中國 家每年大約有100,000婦女在梗阻性分娩期間遭受這類瘺(也稱為產科 瘺)。梗阻性分娩期間，嬰兒的頭對母親骨盆的壓力切斷了對該區(qū)域脆 弱組織的血液供應。死組織脫落，該婦女留下膀胱陰道瘺，有時還有 直腸陰道瘺。這種孔導致永久性的尿和/或糞便失禁。聯(lián)合國人口基金 會(UNFPA)估計產科瘺受害者的全球人數(shù)超過兩百萬。這個計算結果 可能是顯著的低估。首次手術修補的成功率在88%至93%，但隨后的 嘗試的成功率會降低。因此，大比例的婦女具有不能通過手術修復的 產科瘺。亟需瘺的新療法。發(fā)明內容除了其它方面以外，本發(fā)明提供新的含有脂肪組織衍生的基質干 細胞的組合物。本文描述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物 具有獨特的表型，并表現(xiàn)出比以前描述的脂肪組織衍生的基質干細胞 組合物更好的表型同質性，因此使得它們比以前描述的組合物更適合 用于治療瘺和傷口 。含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物可以與 溶液或其它物質一起配制，以用作藥物或醫(yī)療用具，例如縫線或粘合 劑。此外，還提供采用脂肪組織衍生的基質干細胞治療瘺和傷口的新 方法以及用于實施該方法的試劑盒。本發(fā)明的這些實施方案、其它實施方案以及它們的特點和特征將 會由于以下的說明、附圖和權利要求而顯而易見。附圖簡要說明圖l顯示了由實施例1的方法分離的細胞通過免疫熒光染色的表征結果。免疫陽性細胞的頻率表示如下-，小于5%; +/-， 6-15%; +, 16-50%; ++，51-85%;以及+++, 86陽100%。 P，傳代次數(shù)。圖2顯示了脂肪組織衍生的基質干細胞的間接免疫熒光表征。來 自患者#001的細胞在植入no.6后傳代6細胞。藍色表示DAPI染色的 核。(A)CD90;(B)c-Kit;(C)波形蛋白。圖3總結了采用本發(fā)明的一些方法和組合物獲得的臨床結果。F， 女性；M,男性；NI,未植入；NA，未分析。圖4顯示了脂抽吸物衍生的細胞在不同F(xiàn)BS濃度(0.5、2.5和10%， 如所指明的)時的生長曲線。人滑液成纖維細胞在5%或10。/。FBS存在 下培養(yǎng)。以595nm處的吸光度顯示細胞數(shù)目士SD。數(shù)據(jù)來自三個重復 孔的有代表性試驗。圖5顯示在靠近縫合的內開口處注射細胞后直腸粘膜中的泡。圖6顯示注射細胞之前(A)和8周后(B)瘺的照片。圖7A顯示了熒光免疫細胞計量的直方圖，其對應于從參與本項 研究的患者的吸脂樣品分離的細胞在傳代6次時獲得的表面標志物譜 (CD3、 CD9、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD14、 CD15、 CD16、 CD18、 CD19、 CD28、 CD29、 CD31、 CD34、 CD36、 CD38、 CD44、 CD45、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD49e和CD49f)。圖7B顯示了熒光免疫細胞計量的直方圖，其對應于從參與本項 研究的患者的吸脂樣品分離的細胞在傳代6次時獲得的表面標志物鐠 (CD50、 CD51、 CD54、 CD55、 CD56、 CD58、 CD59、 CD61、 CD62E、 CD62L、 CD62P、 CD90、 CD95、 CD102、 CD104、 CD105、 CD106、 CD133、 CD166、 glicoforina、 02微球蛋白、HLAI、 HLAII和NGFR)。發(fā)明詳細說明 1.定義用在本文時，以下的術語和短語應具有以下指出的意義。除非另有說明，在此使用的所有科技術語都與本發(fā)明所屬領域普通技術人員 所通常理解的意義相同。冠詞"a"和"an"指該冠詞語法對象的一個或多個(即至少一個)。 舉例而言，"an element"指一個或多個元件。"脂肪組織"指任何脂肪組織。脂肪組織可以是衍生自皮下、網(wǎng) 膜/內臟、乳房、生殖腺或其它脂肪組織部位的棕色或者白色脂肪組織。 優(yōu)選地，該脂肪組織為皮下白色脂肪組織。這類細胞可以包含原代細 胞培養(yǎng)物或永生細胞系。該脂肪組織可以來自任何具有脂肪組織的器 官。優(yōu)選地，該脂肪組織是哺乳動物脂肪組織，最優(yōu)選的脂肪組織是 人脂肪組織。方便的脂肪組織源來自吸脂手術，但是脂肪組織源或分 離脂肪組織的方法對本發(fā)明并不關4建。如果基質細胞為向個體自體移 植所需，則脂肪組織分離自該個體。"脂肪組織衍生的基質干細胞"指源自脂肪組織的間充質干細胞。術語"粘合劑"指將表面聯(lián)合或結合在一起的任何物質，例如膠。術語"細胞組合物"指細胞制劑，該制劑除了細胞之外還可以包 括非細胞組分，例如細胞培養(yǎng)基，如蛋白、氨基酸、核酸、核苦酸、 輔酶、抗氧化劑、金屬等等。此外該細胞組合物可具有不影響該細胞 組分生長或存活力的組分，但是它們用于將細胞以特定形式提供，例 如，作為聚合物基質用于包嚢或藥物制劑。術語"培養(yǎng)(culture)"指培養(yǎng)基中的細胞、生物體、多細胞實體或 組織的任何生長。術語"培養(yǎng)(culturing)"指實現(xiàn)這種生長的任何方法， 可以包括多個步驟。術語"進一步培養(yǎng)(furtherculturing)"指培養(yǎng)細胞、 生物體、多細胞實體或組織至某個生長階段，然后用另一培養(yǎng)方法使 所述細胞、生物體、多細胞實體或組織達到另一生長階段。"細胞培 養(yǎng)，，指細胞在體外生長。在這種培養(yǎng)中，細胞增殖，但是它們本身不 組織成組織。"組織培養(yǎng)，，指組織的維持或生長，例如原始器官或成 體器官的體外外植體，以便保持其結構和功能。"單層培養(yǎng)，，指這樣 的培養(yǎng)細胞在適合的培養(yǎng)基中增殖，但主要是相互附著并附著到基 底。此外，"懸浮培養(yǎng)"指細胞增殖但懸浮在合適培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。類似地，"連續(xù)流動培養(yǎng)"指在新鮮培養(yǎng)基的連續(xù)流中培養(yǎng)細胞或外 植體以維持細胞生長，例如存活力。術語"條件培養(yǎng)基，，指在與培養(yǎng) 細胞接觸一段時間以便培養(yǎng)基被改變而包括某些由所述細胞產生并分 泌到培養(yǎng)物中的旁分泌和/或自分泌因子后得到的上清液，例如不含培 養(yǎng)細胞/組織。"會合培養(yǎng)"指所有細胞都接觸因而培養(yǎng)容器的整個表 面都被覆蓋的細胞培養(yǎng)，其意味著細胞已經(jīng)達到了它們的最大密度， 但是會合不一定指分裂停滯或群體在體積上不會增加。術語"培養(yǎng)基(culture medium)"或"培養(yǎng)基(medium)"在本領域 中是普遍接受的， 一般指用于培養(yǎng)活細胞的任何物質或制劑。當結合 細胞培養(yǎng)使用時，術語"培養(yǎng)基"包括圍繞細胞的環(huán)境組分。培養(yǎng)基 可以是固體、液體、氣體或多相和物質的混合物。培養(yǎng)基包括液體生 長培養(yǎng)基以及不支持細胞生長的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還包括凝膠狀培 養(yǎng)基，如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原基質。示例性的氣體培養(yǎng)基包括 生長在培養(yǎng)亞或其它固體或半固體支持物上的細胞暴露在其中的氣 相。術語"培養(yǎng)基"還指打算用在細胞培養(yǎng)中的物質，即使其還沒有 和細胞接觸。換言之，為細菌培養(yǎng)制備的富營養(yǎng)液是培養(yǎng)基。類似地，為"粉末培養(yǎng)基"。"確定成分培養(yǎng)基"指由化學上明確(通常純化的) 成分組成的培養(yǎng)基。"確定成分培養(yǎng)基"不含有未充分表征的生物提 取物，例如酵母提取物和牛肉汁。"豐富培養(yǎng)基"包括被設計用來支 持特定物種的大多數(shù)或所有活體形式的生長的培養(yǎng)基。豐富培養(yǎng)基經(jīng) 常包括復雜的生物提取物。"適合于高密度培養(yǎng)物的生長的培養(yǎng)基"為 任何在其它條件(例如溫度和氧轉移率)允許的情況下使得細胞培養(yǎng)物 OD600達到3或以上的培養(yǎng)基。術語"基礎培養(yǎng)基"指促進不需要任 何特殊營養(yǎng)補充的多種微生物的生長的培養(yǎng)基。大多數(shù)基礎培養(yǎng)基通 常包括四個基本的化學組氨基酸、碳水化合物、無機鹽和維生素。 基礎培養(yǎng)基通常用作更復雜培養(yǎng)基的基礎，向其中加入補充物，例如 血清、緩沖劑、生長因子、脂質等等?；A培養(yǎng)基的例子包括但不限 于Eagles基本培養(yǎng)基、基本必需i咅養(yǎng)基(Minimum Essential Medium)、 Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、Medium 199、 Nutrient Mixtures Ham'sF-10 and Ham's F-12、 Mc Coy's 5A、 Dulbecco's MEM/F-I 2、 RPMI 1640 和Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)。術語"包含(comprise)"和"包含(comprising)"在開》文式包4舌的意 義上使用，意味著其它的元素可以被包括進來。術語"分化"指表達標志物的細胞的形成，這些標志物已知與更 特化的和更接近成為不能進一 步分裂或分化的終末分化細胞有關。例 如，在胰臟方面，可在含有升高比例的/3上皮細胞的島樣細胞簇的產 生中看到分化，其產生更大量的胰島素。術語"進一步"或"更"分 化指與從其培養(yǎng)而來的細胞相比，更特化和更接近成為不能進一步分 裂或分化的終末分化細胞的細胞。術語"最終分化"指已經(jīng)成為不能 進一步分裂或分化的終末分化細胞的細胞。術語"瘺"指任何異常的通道或連通或連接，通常是兩內臟器官 之間或從內臟器官到身體表面。痿的實例包括但不限于肛門直腸痿或 肛瘺或糞瘺、動靜脈瘺或A-V瘺、膽瘺、子宮頸瘺、鼻腦脊液瘺、腸 腸瘺、腸皮瘺、腸陰道瘺、胃瘺、子宮腹膜瘺外淋巴、肺動靜脈瘺、 直腸陰道瘺、臍瘺、氣管食管瘺以及膀胱陰道瘺。術語"包括"用在本文中是指"包括但不限于"。"包括"和"包 括但不限于"可互換使用。"標志物"指這樣的生物分子，其存在、濃度、活性或磷酸化狀 態(tài)可以被;險測并用于鑒定細胞表型。"貼片(patch)"指用來覆蓋或保護創(chuàng)傷或其它傷口的敷料或覆蓋物。待用本發(fā)明方法治療的"患者"、"個體"或"宿主，，可以指人 或非人動物。用在本文的短語"藥物上可接受的"指那些化合物、材料、組合 物和/或劑型，在合理的醫(yī)學判斷范圍內，它們適合用于與人和動物的 組織接觸，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥， 與合理的利益/風險比相稱。用在本文時，短語"藥物可接受的載體"指藥物可接受的材料、 組合物或介質，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包嚢材料，涉及將題述化合物從身體的一個器官或部分攜帶至或輸送至身 體的另一器官或部分。每種載體就與制劑的其它成分相容而言必須是 "可接受的"并且對患者無害。術語"表型"指可觀測到的細胞特征， 例如大小、形態(tài)、蛋白表達等。術語"祖細胞"指有能力產生比其分化程度更高的后代的細胞。 例如，該術語可以指未分化的細胞或未分化至最終分化程度的細胞， 其能夠增殖并產生更多能夠產生大量母細胞的祖細胞，母細胞能夠接 著產生分化的或可分化的子代細胞。在優(yōu)選的實施方案中，術語祖細 胞指一般化的母細胞，其后代(子代)通過分化(例如通過獲得完全個體 特征)通常向多個方向特化，如同在胚細胞和組織的逐步多樣化中所發(fā) 生的。細胞分化是復雜的過程，通常通過許多次細胞分裂發(fā)生。分化 的細胞可能衍生自多能細胞，該多能細胞自身衍生自多能細胞，等等。 盡管這些多能細胞的每一種都可能被認為是干細胞，但是每一種可以 產生的細胞類型可以有相當大的變化。
一些分化的細胞也具有產生具 有更大發(fā)育潛力的細胞的能力。這種能力可以是天然的，或者在用多 種因子處理后人工誘導。就此定義而言，干細胞也可以是祖細胞以及 更接近終末分化細胞的前體。"增殖"指細胞數(shù)量的增加。"增殖(proliferating)"和"增殖 (proliferation)"指細胞經(jīng)歷有絲分裂。用在本文時，術語"溶液"包括藥物可接受的載體或稀釋劑，在 其中本發(fā)明的細胞保持存活力。就脂肪組織衍生的干細胞群而言，術語"基本上純的，，指相對于 組成全部細胞群的脂肪組織衍生的基質干細胞來說，脂肪組織衍生的 干細胞群為至少約75%、優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90%、最優(yōu) 選至少約95%純。換言之，術語"基本上純的"指這樣的本發(fā)明的脂 肪組織衍生的基質干細胞群，其在隨后的培養(yǎng)和擴增之前的最初的未 擴增和分離群中含有少于約20%、更優(yōu)選少于約10%、最優(yōu)選少于約 5%的譜系定型細胞。用在本文時，"支持物"指可以用作脂肪組織衍生的基質干細胞 的生長基礎或基質的任何裝置或材料。術語"縫線"指能用于縫合傷口的線、纖維或其它扎緊材料。 用在本文時，"治療"指修復瘺或傷口以及防止瘺或傷口的惡化 或復發(fā)。"治療劑(therapeutic agent)"或"治療劑(therapeutic)"指能夠對 宿主具有期望的生物學效果的試劑?；焺┖瓦z傳毒劑為治療劑的實 例，它們普遍已知為化學來源而非生物來源，或者分別通過特定的作 用機制產生治療效果。生物來源的治療劑的實例包括生長因子、激素 和細胞因子?，F(xiàn)有技術中已知多治療劑，且可以通過它們的效果而 被鑒定。某些治療劑能夠調節(jié)細胞增殖和分化。實例包括化療核苷酸、 藥物、激素、非特異性(非抗體)蛋白、寡核苷酸(如結合靶核酸序列(例 如mRNA序列)的反義寡核苷酸)、肽以及模擬肽。"傷口"是物理手段引起的對組織的損傷或損害，導致組織的正 常連續(xù)性的中斷。2.新的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物一方面，本發(fā)明涉及含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物，其具有某些特征，例如特定表型。例如，本發(fā)明細胞組合物中該脂肪組織衍生的基質干細胞可以通過細胞表面標志物表達、大小、葡萄糖消耗、乳酸鹽產生和細胞產量/存活力來表征。本發(fā)明的另一方面關注含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物，其包括作為細胞組分的具有特定表型的脂肪組織衍生的基質干細胞或其后代的基本上純的制劑。本發(fā)明的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物不僅包括基本上純的祖細胞群，還可以包括細胞培養(yǎng)組分，例如包括氨基酸、金屬、輔酶因子以及其它小基質細胞群的培養(yǎng)基，例如，該小基質細胞群中 的一些可以通過本發(fā)明細胞的隨后分化而產生。此外，其它的非細胞組分可包括在特定環(huán)境下使得細胞組分適合于支持物的那些物質，例 如植入，例如連續(xù)培養(yǎng)，或者使得細胞組分適合于用作生物材料或藥 物組合物的那些物質。在某些實施方案中，含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物通 過部分4中和例證中描述的培養(yǎng)方法來產生。在一個實施方案中，提供了含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物，其中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至 少約85%、至少約90%、至少約95%、或優(yōu)選至少約96%、 97%、 98% 或99。/。的干細胞表達CD9、 CDIO、 CD 13、 CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 CD90和/或CD105標志物。在 含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物的某些實施方案中，少于約 15%、約10%、約5%以及優(yōu)選約4%、 3%、 2%或1%的干細胞表達 CD34CDllb、 CD14、 CD15、 CD16、 CD31、 CD34、 CD45、 CD49f、 CD102、 C畫4、 CD106和/或CD133標志物。在另一實施方案中，提供了含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組 合物，其中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至 少約85%、至少約90%、至少約95%、或優(yōu)選至少約96%、 97%、 98% 或99。/。的干細胞表達c-Kit、波形蛋白和/或CD90標志物。在含有脂肪 組織衍生的基質干細胞的組合物的某些實施方案中，少于約15%、約 10%、約5%以及優(yōu)選約4%、 3%、 2%或1%的干細胞表達CD34、因 子VIII、 a肌動蛋白、結蛋白(desmin)、 S-100和/或角蛋白標志物。還 提供表達c-Kit、波形蛋白和CD90標志物但不表達CD34、因子VIII、 a肌動蛋白、結蛋白、S-100和角蛋白標志物的脂肪組織衍生的基質干 細胞群。通過表面標志物對細胞群的表型表征可以通過對細胞的單獨染色 (流式細胞術)或通過對該細胞群的原位組織學切割來進行，根據(jù)標準 方法進行。通過抗體來確定表面標志物的表達i普，免疫表型表征，可 以是采用標記的抗體直接的，或采用針對細胞標志物的初級特異抗體 的第二標記抗體間接的，由此實現(xiàn)信號放大。另一方面，存在或不存 在對抗體的結合可以通過不同方法來確定，包括但不限于免疫熒光顯 微技術和放射顯影。類似地，有可能通過流式細胞術對抗體結合水平 進行監(jiān)測，其中流式細胞術是使得熒光染料的水平與存在于細胞表面 特異結合標記抗體的抗原的量相關的技術。細胞群上一系列表面標志 物的差異表達提供了鑒定和分離所述群的方法。在某些實施方案中，含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物為脂肪組織衍生的基質干細胞在各種溶液或材料中的懸浮液，例如用作 藥物或生物材料，如下文進一步詳述的。在一個實施方案中，該細胞 組合物包含題述脂肪組織衍生的基質干細胞的林格氏溶液懸浮液和HAS。在另一實施方案中，該細胞組合物包含題述脂肪組織衍生的基 質干細胞在例如聚合物、膠、凝膠等材料中的懸浮液。這類懸浮液例 如可以通過從培養(yǎng)基沉淀出題述脂肪組織衍生的基質干細胞并將它們 在合適的溶液或材料中重懸浮而制得。例如可以通過離心、過濾、超 濾等將細胞沉淀和/或交換出培養(yǎng)基。題述脂肪組織衍生的基質干細胞在包含題述脂肪組織衍生的基質 干細胞的組合物中的濃度可以是至少約5 x 1(^細胞/mL、至少約10 x 106細胞/mL、至少約20 x 106細胞/mL、至少約30 x 106細胞/mL或至 少約40x 1()6細胞/mL。相應地，本發(fā)明的另 一方面涉及題述脂肪組織衍生的基質干細胞 的子代，例如從脂肪組織衍生的基質干細胞衍生的那些細胞。這些子 代可包括脂肪組織衍生的基質干細胞的后代以及鐠系定型細胞，其中 譜系定型細胞通過在將題述脂肪組織衍生的基質干細胞從外植體分離 后誘導其分化產生，例如體外誘導。在某些實施方案中，在親本群傳 代約2代、約3代、約4代、約5代、約6代、約7代、約8代、約 9代、或約IO代后獲得子代細胞。但是，子代細胞可以在從親本群傳 代任何次后獲得。在某些實施方案中，本發(fā)明的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的 組合物將作為藥物組合物的一部分提供，例如無菌、不存在不想要的 病毒、細菌和其它病原體以及無熱原的制劑。即，對于向人給藥，該 題述組合物應該滿足無菌、無熱原以及一般的安全和純度標準，如 FDA生物標準部門所要求的。在某些實施方案中，這類含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物可用于移植進動物，優(yōu)選哺乳動物，并更優(yōu)選人。所述細胞可優(yōu)選 相對于移植宿主而言是自體的，但也可為同種異體的或異種的。由于 在獲得足夠的自體干細胞方面有困難，來自同種異體供者的脂肪組織 衍生的基質干細胞組成了用于治療用途的有價值的另 一干細胞源。現(xiàn)有技術中已知骨髓基質干細胞和脂肪組織衍生基質細胞在體外不會引 起同種異體淋巴細胞的應答，因此，來自供者的同種異體脂肪組織衍生的基質干細胞理論上可用于任何患者，不考慮MHC不相容。在本文有詳細說明的將含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物向個體，尤其是人類個體，給藥的方法包括將細胞注射或植入個體中 的靶部位，細胞可被插入遞送裝置中，該裝置通過注射或植入有助于 將細胞引入該個體。這類遞送裝置包括用于將細胞和液體注射進接受 個體體內的管，如導管。在優(yōu)選的實施方案中，所述管還具有針頭， 例如注射器，通過其可將含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物在 期望部位引入個體。含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物可以不 同形式被插入到這種遞送裝置，如注射器中。例如，當容納在這種遞 送裝置中時，含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物包括懸浮在溶 液或包埋在支持基質中的脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物。藥物可接受的載體和稀釋劑包括鹽水、緩沖水溶液、溶劑和/或分 散介質。這些載體和稀釋劑的使用是現(xiàn)有技術中已知的。該溶液優(yōu)選 是無菌的且流動性達到易于注射。優(yōu)選地，所述溶液在制備和儲存條 件下是穩(wěn)定的，并通過使用例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、 抗壞血酸、硫柳汞等來防止微生物如細菌和真菌的污染作用。是本發(fā) 明的脂肪組織衍生的基質干細胞組合物的溶液可通過將本文描述的脂 肪組織衍生的基質干細胞并入藥物可接受的載體或稀釋劑以及，如果 需要的話，以上列舉的其它成分中，隨后過濾滅菌而制備?？捎米魉幬锟山邮茌d體的材料和溶液的一些實例包括(l)糖，如 乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素 及其衍生物，如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)西 黃蓍膠粉；。)麥芽；(6)明膠；C0滑石；(8)賦形劑，如可可脂和栓劑 蠟；(9)油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油 和大豆油；(IO)二醇類，例如丙二醇；(ll)多元醇，如甘油、山梨醇、 甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂； (14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原水； (17)等張鹽水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH緩沖溶液；(21)聚酯、聚碳酸脂和/或聚酐；以及(22)其它在藥物制劑中采用的無毒的可配伍 物質。在某些實施方案中，含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物還 包含粘合劑。在某些實施方案中，該粘合劑為基于纖維蛋白的粘合劑， 例如纖維蛋白凝膠或纖維蛋白膠或基于纖維蛋白的聚合物或粘合劑， 或其它組織粘合劑或手術膠，例如氰基丙烯酸酯、膠原、凝血酶和聚 乙二醇。其它可用的材料包括但不限于藻酸4丐，瓊脂糖，I、 II、 IV型 或其它亞型膠原，聚乳酸/聚乙醇酸、透明質酸衍生物或其它材料(Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR et al. C1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497)。在其它實施方案中，所述粘合劑為液體繃帶，其中 該方法的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物與液體繃帶材料混 合。"液體繃帶"為包含化合物如聚合材料的溶液，其被噴霧器或刷 子涂到傷口上，然后通過蒸發(fā)除去溶劑以在傷口上提供保護性膜。本文還提供用于制備含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物的 方法，該組合物包含用于》務復瘺或傷口的化合物或材料。在一個實施 方案中，制備這類材料的方法包括將題述細胞組合物的脂肪組織衍生 的基質干細胞與該材料一起懸浮。在一個實施方案中，脂肪組織衍生 的基質干細胞從培養(yǎng)基被沉淀出并被重懸浮在纖維蛋白膠或凝膠中。 纖維蛋白膠和凝膠和其它基于纖維蛋白的聚合物和粘合劑在現(xiàn)有技術 中是公知的，并可購得。例如，可購得的纖維蛋白膠試劑盒為Tissucol Duo 2.0，其它的可購得的纖維蛋白密封劑包括Crossea傾、TISSEEL VH Fibrin Sealant⑧等。本發(fā)明含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物也可以用于包被 支持物，如醫(yī)學裝置。例如，該支持物可以為縫線、線、半月板修復 裝置、鉚釘、大頭釘、吻合器、螺絲釘、骨板、骨板系統(tǒng)、外科網(wǎng)、 貼片(例如修復貼片、心血管貼片或心包貼片)、懸?guī)?、矯形針、粘合 屏障(adhesionbarrier)、支架、引導的組織修復/再生裝置、關節(jié)軟骨修 復裝置、神經(jīng)導管、腱修復裝置、房中隔缺損修復裝置、膨脹或填充劑、血管瓣、骨髓支架、半月板再生裝置、韌帶和腱移植物、眼細胞 植入物、脊柱融合籠、皮膚替代物、硬脊膜替代物、骨移植物替代物、骨樁(bone dowel)、傷口輔料、膠、聚合物或止血鉗?？稍谄渲胁⑷牖蚯度牒兄窘M織衍生的基質干細胞的組合物或 可在其上包被含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物的支持物包括 基質(matrice)，其為接受者相容的并被降解成對接受者無害的產物。 天然和/或合成生物可降解基質為這類基質的實例。天然生物可降解的 基質包括血漿凝塊和膠原基質，該血漿凝塊例如來自哺乳動物。合成 的可生物降解基質包括合成聚合物，例如聚酐、聚酯和聚乳酸。合成 聚合物的其它實例和將細胞并入或嵌入這些基質的方法是現(xiàn)有技術中 已知的。參見，例如美國專利4,298,002和美國專利5,308，701。這些 基質在體內為脆弱細胞提供支持和保護。所述支持物可用本領域技術人員已知的任何方式以細胞包被，例 如通過浸泡、噴霧、涂抹、印刻等。在一個實施方案中，所述支持物為縫線、吻合器、可吸收線、不 可吸收線、天然線、合成線、單絲線或多絲線(也稱為編織物)。制備 包被有脂肪組織衍生的基質干細胞的縫線和其它用于封閉傷口的支持 物的優(yōu)選方法公開在2005年2月14日遞交的美國專利申請11/056,241 "縫合用生物材料，，中，將其整體通過參考并入本文。本文公開的含 有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物代表了新的可用于美國專利申 請11/056,241公開的方法的組合物。此外，在任何含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中，至少 一種治療劑可以纟皮并入該組合物。例如，組合物可以含有止痛劑來協(xié) 助治療瘺或傷口部位的炎癥或疼痛，或者含有抗感染劑來防止用該組 合物治療部位的感染。鎮(zhèn)痛劑，如非甾體類抗炎藥、阿片激動劑和水楊酸鹽；抗感染劑，如 驅蟲劑、抗厭氧菌劑、抗生素、氨基糖苷類抗生素、抗真菌抗生素、 頭孢菌素抗生素、大環(huán)內酯類抗生素、多種^-內酰胺類抗生素、青霉 素抗生素、喹諾酮抗生素、氨苯磺胺抗生素、四環(huán)素抗生素、抗分枝桿菌劑、抗結核抗分枝桿菌劑、抗原生動物劑、抗疾抗原生動物劑、 抗病毒劑、抗逆轉錄病毒劑、殺芥螨劑、抗炎劑、皮質類固醇抗炎劑、 止癢劑/局部麻醉劑、局部抗感染劑、抗真菌局部抗感染劑、抗病毒局部抗感染劑；電解質和腎臟試劑，如酸化劑、堿化劑、利尿劑、碳酸 酐酶抑制劑利尿劑、髓袢利尿劑、滲透壓性利尿劑、保鉀利尿劑、p塞 嗪類利尿劑、電解質替代物和排尿酸劑；酶，例如胰酶和血栓溶解酶； 胃腸劑，例如止瀉藥、止吐藥、胃腸抗炎劑、水楊酸鹽胃腸抗炎劑、 抗酸抗?jié)儎?、胃酸泵抑制劑抗?jié)儎?、胃粘膜抗?jié)儎?、H2阻斷劑 抗?jié)儎?、膽石溶解劑、消化劑、催吐藥、緩瀉藥、多庫酯鈉膠嚢劑 (stool softener)以及促運動劑；全身麻醉劑，例如吸入麻醉劑、面代吸 入麻醉劑、靜脈內麻醉劑、巴比妥酸鹽靜脈內麻醉劑、苯并二氮卓類 靜脈內麻醉劑、以及阿片激動劑靜脈內麻醉劑；激素和激素調節(jié)劑， 如墮胎藥、腎上腺藥、皮質類固醇腎上腺藥、雄激素、抗雄激素；免 疫生物學劑，如免疫球蛋白、免疫抑制劑、類毒素和疫苗；局部麻醉 劑，例如酰胺局部麻醉劑和酯局部麻醉劑；肌骨骼劑，如抗通風抗鹽 劑、皮質類固醇抗炎劑、金化合物抗炎劑、免疫抑制抗炎劑、非甾體 類抗炎藥(NSAID)、水楊酸鹽抗炎劑、礦物；維生素，例如維生素A、 維生素B、維生素C、維生素D、維生素E和維生素K。以上類別中優(yōu)選的有用治療劑種類包括(l)通用鎮(zhèn)痛劑，例如利 多卡因或其衍生物，以及非甾體抗炎藥物(NSAIDs)鎮(zhèn)痛藥，包括雙氯 芬酸、布洛芬、酮基布洛芬和萘普生；(2)阿片激動劑麻醉劑，例如可 待因、芬太尼、氫嗎啡酮和嗎啡；(3)水楊酸鹽鎮(zhèn)痛劑，例如阿司匹林 (ASA)(腸溶衣包被ASA); (4)H廣阻斷劑抗組胺劑，例如克立馬丁和特 非那定；(5)抗感染劑，例如莫匹羅星；(6)抗厭氧菌抗感染劑，例如氯 霉素和林大霉素；(7)抗真菌抗生素抗感染劑，例如兩性霉素b、克霉 唑、氟康唑和酮康唑；(8)大環(huán)內酯類抗生素抗感染劑，如阿齊紅霉素 和乙琥紅霉素；(9)多種iS-內酰胺類抗生素抗感染劑，例如氨曲南和亞 胺培南；(10)青霉素抗生素抗感染劑，例如萘夫西林、苯唑西林、青 霉素G和青霉素V; (11)喹諾酮抗生素抗感染劑，例如環(huán)丙沙星和氟 哌酸；(12)四環(huán)素抗生素抗感染劑，如脫氧土霉素、米諾環(huán)素和四環(huán)素；(13)抗結核抗分枝桿菌抗感染劑，如異煙肼(INH)和利福平；(14) 抗原生動物抗感染劑，例如阿托伐醌和氨苯-風；(15)抗疾抗原生動物 抗感染劑，例如氯喹和乙胺嘧啶；(16)抗逆轉錄病毒抗抗感染劑，例 如利托那韋和齊多夫定；(17)抗病毒抗感染劑，例如阿昔洛維、更昔 洛韋、干擾素a和金剛乙胺；(18)抗真菌局部抗感染劑，如兩性霉素B， 克霉唑、咪康唑和制霉素；(19)抗病毒局部抗感染劑，例如阿昔洛維； (20)電解質和腎臟試劑，例如乳果糖；(21)髓袢利尿劑，例如利尿磺胺； (22)保鉀利尿劑，例如三氨蝶呤；(23)噻嗪類利尿劑，例如氫氯噻"秦 (HCTZ); (24)排尿酸劑，例如丙磺舒；(25)酶，例如RNA酶和DNA 酶；(26)止吐藥，例如丙氯拉嗪；(27)水楊酸鹽胃腸抗炎劑，例如柳氮 磺吡啶；(28)胃酸泵抑制劑抗?jié)儎?，例如奧美拉唑；(29)112-阻斷劑 抗?jié)儎?，例如西米替丁、法莫替丁、尼扎替丁和雷尼替丁?(30)消 化劑，例如胰脂酶；(31)促運動劑，例如乙琥紅霉素；(32)酯局部麻醉 劑，例如苯佐卡因和普魯卡因；(33)肌骨骼皮質類固醇抗炎劑，例如 倍氯米松、倍他米松、可的松、地塞米松、氫化可的松和潑尼松；(34) 肌骨骼抗炎免疫抑制劑，例如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺和氨曱喋呤；(35) 肌骨骼非甾體抗炎藥物(NSAIDs)，例如雙氯芬酸、布洛芬、酮基布洛 芬、酮咯酸(ketorlac)和曱氧萘丙酸；(36)礦物，例如鐵、釣和鎂；(37) 維生素B化合物，例如氰鈷維他命(維生素B^)和煙酸(維生素B3); (38) 維生素C化合物，例如抗壞血酸；以及(39)維生素D化合物，例如4丐 三醇。在某些實施方案中，所述治療劑可以是生長因子或其它影響細胞 分化和/或增殖的分子。誘導最終分化狀態(tài)的生長因子在現(xiàn)有技術中是 公知的，可以選自已經(jīng)被證實誘導最終分化狀態(tài)的任何這種因子。用 在本文描述的方法中的生長因子在一些實施方案中可以是天然產生的 生長因子的變體或片段。例如，可以通過進行保守氨基酸改變產生變 體，并在上述功能測定之一或其它現(xiàn)有技術中已知的功能測定中測試 得到的變體。保守氨基酸置換指具有類似側鏈的殘基的可互換性。例 如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側鏈的一組氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側 鏈的一組氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組 氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及具有含硫側鏈的一組氨基酸 為半胱氨酸和曱硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸置換組為纈氨酸-亮氨酸 -異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬 酰胺-谷氨酰胺。本領域技術人員應理解的是，多肽生長因子的變體或片段可以采 用常規(guī)技術產生，例如誘變，包括產生離散的點突變或者通過截短。 例如，突變可產生變體，與其來源多肽生長因子的生物活性相比，該 變體保留了基本上相同的生物活性或僅僅部分生物活性。3.制備新的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物的方法還提供制備包含在上述含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物 中的脂肪組織衍生的基質干細胞的方法。在一個實施方案中，方法包 括(a)從個體收集脂肪組織；(b)通過酶消化獲得細胞懸浮液；(c)沉淀 細胞懸浮液并在培養(yǎng)基中重懸浮細胞；(d)培養(yǎng)細胞至少約10天；以 及(g)至少傳代兩次擴張細胞。優(yōu)選地，脂肪組織衍生的基質干細胞分離自個體脂肪組織，該個 體是最終的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物要被引入的個 體。但是，基質干細胞也可以分離自與該個體相同或不同種的任何生 物體。任何具有脂肪組織的生物體均可以是潛在候選者。優(yōu)選地，該 生物體為哺乳動物，更優(yōu)選地，該生物體為人。在某些實施方案中，所述細胞被培養(yǎng)至少約15天、至少約20天、 至少約25天或至少約30天。優(yōu)選將細胞在培養(yǎng)中擴張更長時間以改 善細胞群中細胞表型的同質性。在某些實施方案中，所述細胞在培養(yǎng)中擴張傳代至少三次或"傳 代至少三次，，。在另一實施方案中，細胞傳代至少四次、至少五次、 至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。優(yōu)選地，細 胞傳代超過三次以改善細胞群中細胞表型的同質性。實際上，細胞可 以在培養(yǎng)中無限擴展，只要細胞表型的同質性被改善以及分化能力被保持。細胞可以通過現(xiàn)有技術中任何已知用于培養(yǎng)干細胞的技術來培養(yǎng)。對各種培養(yǎng)技術的討論以及它們的擴大可以在Freshney, R丄, Cw/^/re o/^lw/ma/ Ce〃s:爿JVfawwa/ 。/5(XS7'c r(gc/jm々we(動4勿纟田月包培養(yǎng)基 本技術手冊)，々/ 五A"o"， Wiley-Liss 2000中找到。在某些實施方案中， 細胞通過單層培養(yǎng)來培養(yǎng)。在一個實施方案中，細胞如下文實施例1 所述進行培養(yǎng)和傳代?？梢允褂萌魏文軌蛟诮M織培養(yǎng)中支持基質細胞的培養(yǎng)基。支持成 纖維細胞生長的培養(yǎng)基制劑包括但不限于Dulbecco改良的Eagle'培養(yǎng) 基(DMEM)、 a改良的基本必需培養(yǎng)基(.alpha.MEM)、以及Roswell Park Memorial Institute Media 1640 (RPMI Media 1640)等。通常，向上述培 養(yǎng)基中加入0至20。/。胎牛血清(FBS)或1-20%馬血清以支持基質細胞和 /或軟骨細胞的生長。但是，如果FBS中基質細胞和軟骨細胞所必需的 生長因子、細胞因子和激素被鑒定出來并以合適的濃度提供在培養(yǎng)基 中，則也可使用確定成分培養(yǎng)基?？稍诒景l(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基可 以含有一種或多種感興趣的化合物，包括但不限于用于基質細胞的抗 生素促有絲分裂或分化的化合物。所述細胞培養(yǎng)在31攝氏度和37攝 氏度之間的加濕孵育箱中。二氧化碳含量維持在2%至10%，氧含量 在1%至22%,細胞可以被保留在這種環(huán)境中多至4周?？裳a充到培養(yǎng)基中的抗生素包括但不限于青霉素和鏈霉素。在化 學上成分確定培養(yǎng)基中青霉素的濃度為約10單位/ml至約200單位 /ml。在化學上成分確定培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度為約10/xg/ml至約200 Mg/ml。采用質粒、病毒或其它載體策略，脂肪組織衍生的基質干細胞可 以被目的核酸穩(wěn)定或瞬時轉染或轉導。目的核酸包括但不限于這樣的 核酸，其編碼的基因產物增加例如腸壁或陰道壁的待修復組織類型中 存在的細胞外基質成分的產生?？捎猛ㄟ^氯化銫帶或其它方式純化的病毒載體(腺病毒、逆轉錄病 毒、腺相關病毒或其它載體)以10:1至2000:1的感染復數(shù)(病毒單位 細胞)將攜帶調節(jié)基因的病毒載體轉導進基質干細胞。細胞在無血清或含血清培養(yǎng)基中、在不存在或存在諸如聚乙烯亞胺或Lipofectamine.TM的陽離子去垢劑時暴露于病毒1-24小時(Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49)。/DNA復合物,例如描述在美國專利5,578,475; 5,627,175; 5，705，308; 5,744,335; 5,976,567; 6,020,202;和6,051,429中的那些。適合的試劑 包括lipofectamine,聚陽離子脂2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺羧基酰胺) 乙基]-N，N-二曱基-l-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)(化學文摘登記名 N-[2-(2，5-雙[(3-氨基丙基)氨基]-l-oxpentyU氨基)乙基]-N,N-二曱基 -2,3-雙(9-十八烯基氧基)-1-丙銨三氟乙酸鹽)與中性脂二油酰磷脂酰乙 醇胺(DOPE)以3:1 (w/w)的比例在膜過濾水中的脂質體制劑。實例為 制劑Lipofectamine 2000TM (可從Gibco/Life Technologies得到，# 11668019)。其它的試劑包括FuGENETM 6轉染試劑(非脂質體形式 的脂類和其它化合物在80%乙醇中的混合物，可從Roche Diagnostics Corp.得到，弁1814443);和LipoTAXITM轉染試劑(來自Invitrogen Corp.的脂質制劑，#204110)。轉化干細胞可通過電穿孔進行，例如 M. L. Roach and J. D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185: 1中所 描述的。用于產生帶有穩(wěn)定遺傳改變的干細胞的適合的病毒載體系統(tǒng) 可以基于腺病毒和逆轉錄病毒，并且可以采用可購得的病毒組件制備。 將帶有調節(jié)基因的質粒載體轉染進基質干細胞中可通過采用磷酸 4丐DNA沉淀或陽離子去垢劑方法(Lipofectamine.TM., DOTAP)被引入 單層培養(yǎng)細胞或者通過直接將質粒DNA載體并入生物相容性聚合物 而被引入三維培養(yǎng)細胞中(Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759)。為了示蹤和檢測這些基因編碼的功能蛋白，病毒或質粒DNA載 體將含有容易檢測的標志物基因，例如綠色熒光蛋白或/3半乳糖苷酶， 這二者都可通過組織化學手段示蹤。4.治療瘺和傷口的方法本發(fā)明的另 一 方面涉及采用脂肪組織衍生的基質干細胞治療瘺和 傷口的新方法。在優(yōu)選的實施方案中，脂肪組織衍生的基質干細胞源 自待治療個體的脂肪組織。在其它優(yōu)選的實施方案中，脂肪組織衍生 的基質干細胞構成本文所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物。但是，脂肪組織衍生的基質干細胞的其它制劑可以用于本文所述方法，例如描述在美國專利6,777,231和6,555,374以及2005年2月 25日遞交的美國專利申請11/065,461 "Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue(從非骨 軟骨間充質組織鑒定和分離多能干細胞)"中的那些。在一個實施方案中，在個體中治療瘺的方法包括(a)用縫線封閉 內孔和(b)向封閉縫合的內孔遞送至少約10x 106、至少約20xl06、至 少約30x 106或至少約40x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如處于 本發(fā)明含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中。在某些實施方案 中，例如其中第一次遞送的細胞不足，該方法還可以包括(c)向封閉 縫合的內孔遞送第二劑至少約20x 106、至少約30xl06、或至少約40 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如處于本發(fā)明含有脂肪組織衍生 的基質干細胞的組合物中。在另一實施方案中，用在該方法中的含有脂肪組織衍生的基質干 細^^的組合物中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%或優(yōu)選至少約96%、 97%、 98% 或99Q/o的干細胞表達CD9、 CD10、 CD13、 CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 CD90和/或CD105標志物。在另一實施方案中，用在該方法中的含有脂肪組織衍生的基質干 細胞的組合物中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%或優(yōu)選至少約96%、 97%、 98% 或99%的干細胞表達c-Kit、波形蛋白和/或CD90標志物。將本發(fā)明的細胞向個體尤其是人類個體給藥的常用方法， 一些方 法在本文有詳細"i兌明，包括將細胞注射或植入個體靶部位，本發(fā)明的 細胞可被插入遞送裝置，該裝置通過注射或植入有助于將細胞引入該 個體。這類遞送裝置包括用于將細胞和液體注射進接受個體體內的管，如導管。在優(yōu)選的實施方案中，所述管還具有針頭，例如注射器，通 過其本發(fā)明的細胞可在期望部位被引入個體。本發(fā)明的細胞可以不同 形式被插入這種遞送裝置，如注射器中。例如，當容納在這種遞送裝 置中時，所述細胞被懸浮在溶液或包埋在支持基質中。藥物可接受的 載體和稀釋劑包括鹽水、緩沖水溶液、溶劑和/或分散介質。這些載體和稀釋劑的使用是現(xiàn)有技術中已知的。該溶液優(yōu)選是無菌的且流動性 達到易于注射。優(yōu)選地，所述溶液在制備和儲存條件下是穩(wěn)定的，并 通過使用例如對羥基苯曱酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞 等來防止微生物如細菌和真菌的污染作用。本發(fā)明的溶液可通過將本 文描述的祖細胞并入藥物可接受的載體或稀釋劑以及，如果需要的話， 以上列舉的其它成分中，隨后過濾滅菌而制備。在其它實施方案中，治療個體中瘺的方法包括(a)用包含例如來 自本發(fā)明含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物的脂肪組織衍生的 基質干細胞的縫線封閉內孔。這類被含有題述脂肪組織衍生的基質干 細胞的組合物中的細胞包被的縫線在2005年2月14日遞交的美國專 利申請11/056,241中有詳細描述，將其通過參考并入本文。在一些實施方案中所述方法還可以包括(d)深入刮除至少一個瘺 道和(e)用材料填充所述瘺道。在某些實施方案中，所述方法還可以包 括向所述材料遞送至少約10 x 106脂肪組織衍生的基質千細胞，例如 來自題述細胞組合物。優(yōu)選地，所述材料為基于纖維蛋白的聚合物或 粘合劑，例如纖維蛋白膠或凝膠。在某些實施方案中，至少約10xl06 脂肪組織衍生的基質千細胞已經(jīng)被包裹在所述材料中，例如使得該材 料包含含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物。在另一實施方案中，治療個體中瘺的方法包括(i) 深入刮除至少一個瘺道(ii) 用縫線封閉刮除瘺道的內孔(iii) 向所述封閉縫合的內孔遞送至少約10x106、至少約20xl06、 至少約30xl06、或至少約40x 1()S脂肪組織書f生的基質千細胞，例如 處于本發(fā)明含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中。在某些實施方案中，例如，其中第一次遞送的細胞不足，該方法還包括(iv)向所述封閉縫合的內孔遞送第二劑至少約20x 106、至少約30 x 106、或至少約40 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如處于本發(fā) 明含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中。步驟(i)優(yōu)選通過深入刮除所有的待治療瘺道來進行，例如，刮除 針被引入瘺道，并通過刮除瘺道壁而產生誘導出血以獲得天然纖維蛋 白，其將填充該瘺道。本發(fā)明人最近的臨床研究提示通過這種刮除方 法產生的天然纖維蛋白相對于使用人工纖維蛋白密封劑是優(yōu)選的，因 而在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中待治療瘺道不會填充這種材料。步驟(iv)優(yōu)選通過沿瘺道注射進瘺道壁局部遞送細胞，例如含有脂 肪組織衍生的基質干細胞的組合物來進行。例如，沿3cm的瘺道兩次 注射一千萬細胞。本發(fā)明的方法可被用于治療任何瘺，包括但不限于肛門直腸瘺或 肛瘺或糞瘺、動靜脈瘺或A-V瘺、膽瘺、子宮頸瘺、鼻腦脊液瘺、腸 腸瘺、腸皮瘺、腸陰道瘺、胃瘺、子宮腹膜瘺外淋巴、肺動靜脈瘺、 直腸陰道瘺、臍瘺、氣管食管瘺以及膀胱陰道瘺。優(yōu)選地，所述方法 可用于治療腸瘺，例如連接腸與其自身或另一器官的瘺，例如直腸陰 道瘺、腸腸瘺、腸皮瘺和腸陰道瘺。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述 方法可用于治療陰道或子宮瘺，例如連接陰道或子宮與其自身或另一 器官的瘺，例如子宮頸瘺、直腸陰道瘺、腸陰道瘺和膀胱陰道瘺。可以通過現(xiàn)有技術中任何已知的方法如切口、導管等接近瘺，用 于手術修復。在另一實施方案中，治療患者中傷口的方法包括(a)用縫線封閉 傷口和(b)向封閉縫合的傷口遞送至少約10x 106、至少約20xl06、至 少約30 x 106或至少約40 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如處于 含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中。在某些實施方案中，例 如其中第一次遞送的細胞不足，該方法還可以包括(c)向封閉縫合的 傷口遞送第二劑至少約20 x 106細胞、至少約30xl06、或至少約40x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如處于含有脂肪組織衍生的基質干 細胞的組合物中。在其它實施方案中，傷口可以用本發(fā)明的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物填充，例如， 一劑包裹在材料中的至少約10 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞，例如使得所述材料包含該 細胞組合物，其中所述材料例如為粘合劑或膠。在其它實施方案中， 治療個體傷口的方法包括(a)用包含例如來自題述含有脂肪組織衍生 的基質干細胞的組合物的脂肪組織衍生的基質干細胞的縫線封閉傷 口 。這類被來自題述含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中的細 胞包被的縫線在2005年2月14日遞交的美國專利申請11/056,241中 有詳細描述，將其通過參考并入本文。上述方法還可以包括向待治療個體給予治療劑，例如全身性地或 在縫合部位的局部。在某些實施方案中，脂肪組織衍生的基質干細胞 被配制在含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中，該組合物含有 如上所述的治療劑。在其它實施方案中，治療劑被單獨給藥，例如與 所述方法同時，在進行所述方法之前，或在進行所述方法之后。在一 些實施方案中，在對個體進行所述方法之前、之間和之后向所述個體 給予治療劑。示例性治療劑在上文有述。在優(yōu)選的實施方案中，向所 述個體給予用于治療克羅恩病的治療劑。示例性的克羅恩病治療劑為 抗炎劑，例如包含馬沙拉。秦(mesalamine)的試劑，免疫抑制劑，如6-巰基噪呤和石危唑噤呤；生物試劑，如英夫利昔單抗(Remicade⑧)、抗生 素和止瀉藥例如地芬諾酯、氯苯哌酰胺和可待因。在使用同種異體干細胞的實施方案中，可能需要支持性治療。例 如，根據(jù)現(xiàn)有技術中已知的方法，可能會在治療之前、之中和/或之后 給予免疫抑制劑以防止GVHD。在給藥之前，還可以根據(jù)現(xiàn)有技術中免疫反應。任何治療劑的計量都將隨患者的癥狀、年齡和體重，待治療或預 防的病癥的性質和嚴重性，給藥途徑，以及試劑的形式而變化。任何 題述制劑都可以以單次劑量或以多次劑量給藥。治療劑的劑量可通過 本領域技術人員已知的或本文所說明的技術容易地確定。此外，可以 給予多種治療劑的混合物或者在分開的組合物中給予多種治療劑。治療劑可以口服給藥、胃腸外給藥、通過吸入噴霧、局部地、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、含服、經(jīng)陰道或經(jīng)植入儲庫給藥。用在本文時，術語胃 腸外包括皮下、靜脈內、肌內、關節(jié)內、滑膜內、胸骨內、鞘膜內、 損傷內以及顱內注射或輸注技術。任何特定治療劑的對給定患者產生最有效治療的精確給藥時間和 量將取決于特定化合物的活性、藥物動力學和生物利用度，患者的生 理條件(包括年齡、性別、疾病類型和階段、總體健康狀況、對給定劑 量和藥物類型的應答情況)、給藥途徑等等。這里提供的指導可以用于 優(yōu)化治療，例如，確定給藥的最佳時間和/或量，其僅需要由監(jiān)測個體 并調整劑量和/或時間構成的常規(guī)試驗。在個體治療期間，患者的健康可以通過在24小時中的預定時間測 量一個或多個相關指標來監(jiān)測?？梢愿鶕?jù)這種監(jiān)測的結果優(yōu)化治療， 包括補充物、量、給藥時間以及制劑?？梢酝ㄟ^測量相同參數(shù)對患者 進行定期再評估來確定改善程度，第一次這種再評估常常在從治療開 始的第四周結束時進行，隨后的再評估在治療期間每四至八周進行， 隨后每三月進行一次。治療可以持續(xù)幾個月或甚至幾年，最少一月是 對人進行治療的典型長度?？梢曰谶@些再評估進行對治療劑的給藥 量的調整以及可能的對給藥時間的調整。治療可以以少于化合物最佳劑量的較小劑量開始。之后，通過小 增量增加劑量，直至獲得最佳的治療效果。幾種治療劑的組合使用可以減少任何單個組分所需的劑量，因為 不同組分的作用起始和持續(xù)時間可以是互補的。在這種聯(lián)合治療中， 不同活性試劑可以一起遞送或分開遞送并在一天中同時或在不同時間 遞送。題述化合物的毒性和療效可以通過標準藥物方法在細胞培養(yǎng)物或 試驗動物中確定，例如確定LDso和ED5。。顯示大治療指lt的組合物 是優(yōu)選的。盡管可以使用顯示毒副作用的化合物，但是應注意設計將 治療劑靶向期望位點的遞送系統(tǒng)以減少副作用。從細胞培養(yǎng)測定和動物試驗獲得的數(shù)據(jù)可以用于形成人用劑量的 范圍。任何治療劑或其中任何組分的劑量優(yōu)選位于包括ED5o的循環(huán)濃 度的范圍內，幾乎沒有或沒有毒性。在此范圍內劑量可以隨釆用的劑型和所用的給藥途徑而變化。對于本發(fā)明的治療劑，治療有效劑量可 以最初從細胞培養(yǎng)測定評估?？梢栽趧游锬Ｐ椭行纬蓜┝恳詫崿F(xiàn)包括ICso(即，實現(xiàn)對癥狀的最大抑制的 一半的測試化合物濃度)的循環(huán)血漿 濃度范圍，如在細胞培養(yǎng)中所確定的。這些信息可以用于更精確地確 定人體內的有用劑量。例如，可以通過高效液相色鐠測量血漿中的水平。5.試劑盒在其它實施方案中，本發(fā)明關注試劑盒，其包括含有脂肪組織衍 生的基質干細胞的組合物和任選地關于其使用的說明書。包括本發(fā)明 藥物組合物和生物材料的試劑盒也位于本發(fā)明范圍內。試劑盒組分可 以包裝為用于手動或部分或全部自動實施前述方法。這類試劑盒可以 具有多種用途，例如包括治療、修復、制備生物材料和其它應用。例證本發(fā)明已經(jīng)被概要說明，并將通過參考以下實施例更容易被理解， 包括這些實施例僅用于解釋本發(fā)明的某些方面和實施方案，無意限制 本發(fā)明。實施例1:從脂抽吸物制備具有改善的同質性的干細胞在局部麻醉和全身鎮(zhèn)靜情況下，通過吸脂作用獲得脂肪組織。將 空的鈍尖插管經(jīng)小切口(直徑小于0.5 cm)導入皮下空間。輕輕抽吸， 插管在脂肪組織腹壁區(qū)室移動以便機械破碎脂肪組織。將鹽水溶液和 血管收縮劑腎上腺素注射進脂肪組織區(qū)室以使血液喪失減至最低。依 此方式，從每個待治療患者獲得80至100ml粗脂抽吸物。將粗脂抽吸物用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; Gibco BRL， Paisley, Scotland, UK)充分洗滌以除去血細胞、鹽水和局部麻醉劑。在37。C下 用II型膠原酶(0.075%; Gibco BRL)溶液在平衡鹽溶液(5 mg/ml; Sigma， St. Louis, USA)中消化細胞外基質30分鐘，以釋放細胞組分。然后， 通過加入等體積的含有10。/。胎牛血清(FBS; Gibco BRL)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM; Gibco BRL)使膠原酶失活。以250 x g離心細 胞懸浮液10分鐘。將細胞重懸在0.16 M NH4C1中，讓其在室溫(RT) 下靜置IO分鐘以溶解紅細胞。混合物以250 xg離心，并將細胞重懸 在加有10% FBS和1。/。氨千青霉素/鏈霉素混合物(Gibco， BRL)的 DMEM中，隨后以10-30 x 103細胞/cm2的濃度接種在100-mm組織培 養(yǎng)皿中。將細胞在37。C、 5%(:02下培養(yǎng)24小時。接著，將培養(yǎng)皿用PBS 洗滌以除去非粘附細胞和細胞碎片。將細胞在相同培養(yǎng)基和相同條件 下維持培養(yǎng)，直至它們達到大約80%匯合，其中每3至4天更換一次 培養(yǎng)基。然后將細胞用胰蛋白酶-EDTA (Gibco BRL)以1:3的稀釋度 傳代，這對應大約5-6x 103細胞/ 112的細胞密度。對于移植，我們使 用傳代1和3次之間的細胞，其中已經(jīng)傳代兩次以上的細胞是優(yōu)選的， 以便分離高同質性的細胞群。采用傳代1至9次的細胞進行細胞表征。實施例2,對來自脂抽吸物的、具有改善的同質性的干細胞的表征為了通過免疫熒光染色表征細胞，將細胞以低密度接種在24孔板 中玻璃蓋玻片上加有10% FBS的DMEM中。對于免疫組化研究，以 PBS洗滌細胞并在-20。C在丙酮中固定10分鐘。對于a肌動蛋白的染 色，將細胞在室溫下在4%多聚曱醛中固定10分鐘。用含有4%山羊 血清和0.1% TritonX-100的PBS封閉后，將細胞在4°C與所指明稀釋 度的針對以下細胞標志物的第一抗體孵育過夜[(i)ce肌動蛋白；Dako, Glostrup， Denmark; 1/50; (ii)波形蛋白；Sigma, St. Louis, USA; 1/200; (iii) CD 90; CYMBUS, Biotechnology LTD, Chandlers Ford， Hants, UK; 1/50; (iv)因子VIII; Dako; 1/100; (v) CD 34; Chemicon， CA， USA; 1/100; (vi) c-Kit; Chemicon; 1/100; (vii)結蛋白；Dako; 1/100; (viii)細胞 角蛋白；Dako; 1/100 and (ix) S-100; Dako; 1/50]。然后用適當?shù)漠惐賣氰 酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的或四曱基若丹明異硫氰酸鹽酸鹽(TRITC)偶聯(lián) 的第二抗體(Sigma;l/50)在室溫下孵育細胞45分鐘。對于陰性對照， 我們省略了第一抗體。細胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染。 然后將細月包包埋進Mobiglow (MoBiTec, Gottingen, Germany)并用落射熒光顯微鏡Eclipse TE300 (Nikon, Tokyo, Japan)觀察。在每種情況下， 我們確定了不同視野中免疫陽性細胞的數(shù)量并將它們與染色的細胞核 ft目進行比4交。隨才幾選擇的一見野通過Spotl相才幾(Diagnostic Instruments Inc., Tampa, FL, USA)輸出到計算機(Macintosh G3; Apple Computer Ink" Cupertino, Ca， USA)。人動月永平滑肌細胞、人臍靜月永內皮細月包 (HUVEC)和人滑液成纖維細胞被用作各種抗體免疫染色的陽性對照。在傳第1代，高比例(90-95%)的脂肪衍生基質干細胞表達波形蛋 白， 一種間充質細胞骨架細胞的標志物(

圖1)。波形蛋白的表達維持在 相同水平，直至并包括傳第9代。但是其它標志物的水平隨時間下降。 例如，傳第l代中在17。/。LPA衍生細胞中發(fā)現(xiàn)的a肌動蛋白在傳第7 代中未再發(fā)現(xiàn)。內皮細胞的標志物血管性血友病因子(因子VIII)和也 在內皮細胞表面發(fā)現(xiàn)的CD34僅在傳第1代至傳第3代被檢測到(分別 為7%和12%的免疫陽性細胞)。相反，細胞增殖標志物c-Kit(CD 117) 的表達隨時間增加，從傳第4代起有99%的免疫陽性細胞(圖2)。起初 在約80%的LPA衍生細胞中表達的成纖維細胞標志物CD90從第6次 傳代起在99%的細胞中發(fā)現(xiàn)(圖3)。任何時間在任何LPA衍生細胞中 都沒有觀察到神經(jīng)外胚層標志物S100或外胚層標志物角蛋白的表達。 當傳代次數(shù)增加時觀察到的標志物變化表明所獲得的細胞制劑的同質 寸生i曽力口。為了對細胞生長進行定量，將細胞以5 x 103細胞/ 112的濃度接種 在24孔板中。在細胞附著到基底后(3小時)，用補充了 1%抗生素和 0.5%、 2%、 5%或10% FBS的DMEM更換培養(yǎng)基。作為測試每批血 清的陽性對照，也培養(yǎng)人滑液成纖維細胞并確定它們的生長速率。每 兩天更換一次培養(yǎng)基。以24小時的間隔，將細胞用1%戊二醛固定并 確定每孔的細胞數(shù)目，通過在結晶紫核染色后監(jiān)測595 nm處的吸光度 來進行。構建了標準曲線來建立每孔細胞數(shù)量和595 nm處的吸光度的 關系(r、0.99)。從所有7個脂抽吸物(LPAs)成功分離并培養(yǎng)了有存活力的脂肪組 織衍生基質細胞。這些細胞在培養(yǎng)中生長并以7至10天的間隔傳代。 在一些情況下，細胞^皮冷藏保存，在植入前融化。脂肪組織衍生的基質干細胞(ADSC)的生長速率取決于血清濃度，在5%和10。/。FBS之間 增殖最大(圖4)。在這些血清濃度下的平均細胞群倍增時間是37.6士0.6 小時，這與相同條件下培養(yǎng)的人滑液成纖維細胞的細胞群倍增時間無 顯著差異(35.6士1.4小時；p>0.05; t檢驗;結果來自三個獨立實驗)。為了以更加標準化和較少主觀性的方式分析細胞，使細胞也接受 熒光激活細胞分選(FACS)分析。通常，流式細胞分析允許通過抗體才全 測表面抗原，這些抗體直接(共價地)或者間接地(第二熒光標記抗體) 連接到熒光標記。另一方面，上述免疫組化分析需要透化細胞并隨后 用抗體染色。因此，后者需要依據(jù)靶蛋白和抗體的單獨優(yōu)化方法。此 外，由于細胞膜的透化，不可能區(qū)分內部(非膜結合的)和細胞外標志 蛋白。即，采用免疫組化分析，可能知道蛋白標志物是否被表達，但 是不可能區(qū)分是在細胞表面還是在細胞內表達。用在免疫細胞計量中的檢測表面抗原的方法是標準化的，僅需要 適當?shù)年幮詫φ?。此外，F(xiàn)ACS分析使得能夠評估陽性細胞(表達表面 抗原的細胞)百分比和表達水平(一個細胞上有很少或許多表面抗原)。 釆用免疫組化時這些評估僅是主觀性的，并隨不同實驗變化，但這不 發(fā)生在FACS分析中。所述細胞的這類免疫表型表征可以在新鮮分離的細胞上進行，以 及在培養(yǎng)一段時間后進行，例如在培養(yǎng)的第7天、培養(yǎng)4周后和培養(yǎng) 3個月后。在不同時間進行細胞標志物的分析使得能夠評估培養(yǎng)期間 表型的同質性。在2005年2月25日遞交的美國專利申請11/065,461 中詳細地描述了這種分析的實例和數(shù)據(jù)，證實在0至3個月的培養(yǎng)期 間從得自3個健康供者的樣品中獲得的表型，通過參考將其并入本文。通過上述方法分離后，在功能上對來自一個患者的脂肪組織衍生 的基質干細胞就一 系列表面標志物的存在/不存在進行了表征。為此， 通過流式細胞術監(jiān)測了以下表面標志物的表達整合素CDllb， CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f， CD51，CD61， CD 104。造血標志物CD3， CD9, CD10, CD13, CD16， CD14, CD19, CD28, CD34, CD38， CD45， CD90, CD133, glicoforine。生長因子受體CD105，NGFR。細胞外基質受體CD15， CD31, CD44, CD50， CD54， CD62E, CD62L， CD62P, CD102, CD106, CD146, CD166。其它CD36， CD55, CD56， CD58, CD59, CD95， HLA-I， HLA-II， j82-微球蛋白。通過胰蛋白酶的溫和消化收集待表征的細胞、用PBS洗滌并在 4°C用針對每一個待分析表面標志物的熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE) 標記的抗體標記物孵育30分鐘。洗滌細胞標志物并立即釆用Epics-XL 細胞計數(shù)器(Coulter)進行分析。作為對照，使用以FITC或PE標記的 對應同種型的非特異抗體染色的細胞。從對表面標志物表達i普的分析(圖7A/7B),用于確定哪些標志物定 義了細胞群并能夠使其相對于其它細胞類型被鑒別和區(qū)分的標準如 下1. 拋棄實驗中在樣品間或在培養(yǎng)期間隨時間變化的標志物，該實 驗為在2005年2月25日遞交的美國專利申請11/065,461中用健康供 者的脂肪組織衍生的基質干細胞進行的實驗。2. 選擇作為它們生物學相關性函數(shù)的標志物，拋棄表征特定細胞 類型的標志物(例如，CD3是淋巴細胞的專有標志物)。采用這個標準，多能干細胞群^皮表征為CD9+， CD10+, CD13+, CD29+， CD44+， CD49A+， CD51+， CD54+, CD55+, CD58+， CD59+， CD90+和CD105+陽性；并缺乏CDllb, CD14， CD15， CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106和CD133的表達。實施例3:包含纖維蛋白膠的干細胞制劑用于治療瘺對于臨床用途，如上制備的細胞可以在傳代3次或更少次數(shù)后使 用(圖3),但是如上所述優(yōu)選在傳代兩次或更多次后使用，以便提供具 有更高同質性的細胞制劑。用于臨床用途的細胞培養(yǎng)物在37。C下胰蛋 白酶消化3分鐘。通過加入加有FBS的DMEM終止胰蛋白酶消化， 并將懸浮液以110 x g離心5分鐘。在PBS中洗滌細胞，將懸浮液以 150 x g再離心5分鐘。細胞以3至30 x106細胞/ml重懸于1至2 ml的林格乳酸鹽溶液，并置于適合的注射器中。可以任選地向林格乳酸鹽溶液中加入人血清白蛋白(HSA)。在某些情況下，在合并纖維蛋白膠試劑盒(Tissuco1⑧Duo 2.0; Baxter, Madrid, Spain)的兩組分之前，將一半的細胞重懸浮于該試劑盒 的凝血酶組分中，目的是改善瘺道的密閉。使用纖維蛋白膠填充瘺道 口在現(xiàn)有技術中是已知的；但是其作為瘺的單獨治療不是有效的。向 本文所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中添加纖維蛋白 膠是用于將細胞保留在局部，并且我們觀察到細胞在纖維蛋白膠和凝 膠中生長良好。實施例4:改善的手術方法以采用來自脂抽吸物的干細胞制劑修復瘺 我們進行了釆用上述脂肪組織基質干細胞組合物治療克羅恩瘺的 I期臨床試驗，其設計用來測試自體干細胞移植的可行性和安全性。該 方案在2002年4月12日得到La Paz Hospital的臨床試驗和倫理委員 會的批準，并形成了詳細的知情同意表用于患者簽字。在整個臨床試 驗期間倫理委員會一直被告知研究進度。方法根據(jù)以下選擇標準選擇患者年齡超過18歲；在試驗前至少5 年診斷出克羅恩?。淮嬖谝粋€或多個復雜克羅恩瘺(腸皮瘺、上括約肌 瘺和/或直腸陰道瘺)，其已經(jīng)對內科治療無反應并且被常規(guī)手術不成 功的治療至少兩次；同意參加，簽署知情同意表。淘汰標準如下沒 有達到選擇標準；精神殘疾；太瘦；對局部麻醉過每文；之前診斷出癌 癥；以及AIDS。5名患者(編號001-005)參加了這項研究。三名男性和兩名女性， 平均年齡是35.1 ±2.4歲(范圍31.2至37.5歲)。進行了 9次細胞植入 直腸陰道瘺中三次；腸皮瘺中5次(一個患者四個不同的瘺)；上括約 肌肛周痿中l(wèi)次。所有的腸皮瘺具有低流動，少于每天50cc，并處于 腹壁中(表l)。沒有患者在該過程中同時用完全胃腸外營養(yǎng)、Remicaid 或奧曲肽治療。由于在第一次吸脂后，沒有干細胞在冷藏保存中存活，患者001和002需要兩次吸脂過程。由于培養(yǎng)細胞的細菌污染， 一名患者被排除在外。我們用第三次 傳代或更早的自體脂肪組織衍生的基質干細胞(ADSC)接種四個患者 中的9個瘺。8個接種的瘺每周觀察，持續(xù)至少8周。在第8周結束 時，在6個瘺中，外部開口被上皮細胞覆蓋，因此這些瘺被認為治愈 (75%)。在另兩個瘺中，外部開口僅不完全封閉，排出的液流減少(沒 有治愈；25%)。在隨訪期結束時(至少6個月，不超過兩年)，沒有在任 何患者中觀察到副作用。對于腸皮瘺，所有的瘺道都被深入刮除。對于直腸陰道瘺，我們 采用了陰道途徑，分離后陰道壁。缺口被完全分開并用3/0可吸收縫 線封閉直腸開口。直腸粘膜已經(jīng)被克羅恩病破壞，極其脆弱。對于缸 周瘺，主瘺道被取出核心，直腸孔用3/0可吸收縫線通過硬化粘膜封 閉。對于腸皮瘺，我們利用針將細胞注射進瘺道壁。對于直腸陰道瘺 和肛周瘺，我們將細胞注射進直腸粘膜，接近縫合的內部開口。所有 情況下，注射后我們都觀察到注射區(qū)域上的液體填充泡(圖5)。注射的 細胞數(shù)量為3至30 x106，這取決于培養(yǎng)細胞的生長情況(圖3)。從制備接種物開始到注射結束的時間在所有情況下都少于90分 鐘。對于腸皮瘺，用纖維蛋白膠填充瘺道，然后縫合皮膚。對于直腸 陰道瘺，構建了前徙陰道瓣。當檢查到副瘺道時，也用纖維蛋白膠填 充。手術后沒有使用繃帶。在該過程結束12小時后開始液體攝入，固 體食物在隨后的6小時后攝入。手術后的1至3天，解散患者，在門 -珍部定時隨訪。獲得兩個組織病理學樣品。 一個樣品(患者號002)從腸皮瘺(植入 #2后7個月和植入#3后IO天)的區(qū)域獲得。另一個樣品(患者號001) 在第一次植入后l年，(植入#1)，在與植入#6有關的手術過程期間從 直腸陰道壁獲得。將樣品包埋進石蠟，切片，用蘇木精和伊紅染色， 并評估。手術后每周定期隨訪，持續(xù)8周。當外部開口的總體上皮形成在8周后是明顯的時，則認為患者治愈，與之前的觀察相獨立。8周后， 每月隨訪，持續(xù)至少6個月但不超過兩年。結果這項研究包括5名患者，進行了 7次吸脂(圖3)。在植入過程中將 患者003號從這項試驗中排除，因為發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的脂提取物細胞被革蘭 氏陽性細菌污染。細菌被鑒定為OeAoWa jcflw"/weo/j;"ca。將患者002 的腸皮瘺從研究中排除，因為對導致極性膿毒癥的新膀胱腸瘺進行了 緊急腹部手術。剖腹術需要切除植入?yún)^(qū)域。因而，這種情況下我們無 法堅持最小8周的隨訪安排。用傳代3次或更少次的ADSC接種四名患者的9個瘺(圖3)。 8個 瘺被認為適合保留在這項研究中，并隨訪至少8周(圖3)。在6個瘺中， 在第8周時外部開口已形成上皮，這些瘺被認為治愈(75%)(圖6)。另 兩個在外部開口僅有不完全封閉，排出流量減小，如患者所報告的 (25%;沒有治愈;圖3)。注射的細胞數(shù)量或培養(yǎng)時間和過程的成功沒有 直接關系?；颊咝詣e或年齡與治愈也沒有直接關系。我們已經(jīng)進行的 隨后研究表明最初的20乂106細胞的劑量是合適的。我們已經(jīng)確定在第 一劑失敗時可以使用第二劑40xl0"田胞。優(yōu)選更大量的細胞，因為我 們已經(jīng)觀察到更大量的細胞在組織修復方面有更好的療效。手術和植入過程在所有9個治療的瘺中沒有其它技術困難。在研 究的任何病例中都沒有觀察到直接副反應(例如，過敏反應、變應性反 應)。在手術后的7個月(腸皮瘺)和1年(直腸陰道瘺)時獲得兩個組織病 理學樣品。在完整系列的組織病理學切片中沒有檢測到細胞學轉化。討論在以前的報道中，我們描述了對患有復發(fā)直腸陰道瘺的年輕婦女 的成功的基于細胞的治療，其中該復發(fā)直腸陰道瘺已經(jīng)對內科療法無 反應。因此，我們設計了當前的I期臨床試驗來評估這種自體脂肪組 織基質干細胞移植(在起始方案中有改進)用于治療無應答克羅恩瘺的可行性和安全性，以及測試脂肪組織基質干細胞與纖維蛋白膠的聯(lián)合 使用。我們選擇脂肪組織作為干細胞源是因為它們的生肌分化能力和瘺 對肌肉移植反應良好的事實。此外，吸脂作用的脂肪可大量獲得，并 且可在對患者具有最小副作用的情況下收集。其它小組曾用骨髓衍生 的干細胞，但是這些情況下，需要細胞動員過程，其對一些患者可能 是危險的，例如對患有心肌梗塞的患者。在我們的研究中，所有的吸 脂過程都產生了臨床上有用數(shù)量的具干細胞特征的細胞。我們根據(jù)預定程序對我們的患者進行隨訪，我們觀察到8個過程 中的6個完全治愈。值得注意的是，克羅恩病對瘺的手術方法提供了 最差條件，這是由于這些患者中組織脆弱以及與治愈有關的諸多問題。 我們的患者被選擇是因為他們已經(jīng)對內科治療和至少兩次之前的手術 過程無應答，但是我們的治療看起來相當有效。然而，在任何給定患 者中克羅恩病的新發(fā)作可能仍會產生新瘺，它們需要采用來自該患者 的冷藏保存自體細胞再次治療。ADSC移植治療成功背后的生物學機制是未知的。干細胞可能分 化為結締組織、肌肉組織或瘢痕組織。或者，干細胞分泌的生長因子 可能促進了傷口愈合。我們在組織病理學檢查的瘺中看到典型的瘢痕 組織，但是我們沒有辦法區(qū)分移植的和局部的結締組織細胞。采用我 們的療法在75%的病例中觀察到完全痊愈。參考文獻除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分 子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學中的常規(guī) 技術，它們由本領域技術人員所掌握。這些技術在文獻中有充分說明。 參見，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實 -險 室手冊)，2nd Ed., ed. by Sambrook， Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); 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N. Glover ed.， 1985); Oligonucleotide Synthesis (寡核香酸合 成)(M. J. Gait ed" 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; NucleicAcid Hybridization (核酸雜交)(B, D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (轉錄和翁3譯)(B. D. Hames & S, J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (動物細胞培養(yǎng))(R. I. Freshney, Alan R. Liss， Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (固 定的細胞和酶)(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (分子克隆的實踐指南)(1984);論文，Methods In Enzymology (酶學方法)(Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (基因傳遞用于哺乳動物細胞的載體)(J. H. Miller and M. P. Calos eds" 1987， Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology (酶學方法)，Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (細胞和分子 生物學中的免疫化學方法)(Mayer and Walker, eds" Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology (實-驗免疫學手 冊)，Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. 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權利要求
1.含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的至少約50％表達CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105標志物。
2. 如權利要求1所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的至少約 85。/。表達CD9、 CDIO、 CD13、 CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 CD90和CD105標志物。
3. 如權利要求2所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的至少約 95。/o表達CD9、 CDIO、 CD13、 CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 CD90和CD105標志物。
4. 如權利要求3所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的至少約 99。/。表達CD9、 CDIO、 CD13、 CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 CD90和CD105標志物。
5. 如權利要求4所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的少于約 50/o表達CD34、 CDllb、 CD14、 CD15、 CD16、 CD31、 CD34、 CD45、 CD49f、 CD102、 CD104、 CD106和/或CD133標志物。
6. 如權利要求1所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其還包含林才各溶液和HSA。
7. 如權利要求6所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的濃度為 至少約10x 1()6細月包/mL。
8. 如權利要求7所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述組合物包含的所述脂肪組織衍生的基質干細胞的濃度為 至少約20 x 1()6細胞/mL。
9. 如權利要求1所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其還包含粘合劑。
10. 如權利要求9所述的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合 物，其中所述粘合劑為纖維蛋白膠或凝膠。
11. 包含權利要求1的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物 的支持物。
12. 如權利要求11所述的支持物，其中所述支持物為縫線。
13. 如權利要求11所述的支持物，其中所述支持物為貼片。
14. 制備權利要求1的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物 的方法，包括(a)從個體收集脂肪組織；(b)通過酶促消化獲得細胞懸 浮液；(c)沉淀所述細胞懸浮液并在培養(yǎng)基中重懸所述脂肪組織衍生的 基質干細胞；(d)培養(yǎng)所述脂肪組織衍生的基質干細胞至少約10天； 以及(g)使所述脂肪組織衍生的基質干細胞傳代至少兩次。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述脂肪組織衍生的基質 干細胞被培養(yǎng)至少20天。
16. 如權利要求14所述的方法，包括將所述脂肪組織衍生的基質 干細胞傳代至少三次。
17. 制備用于瘺修復的粘合劑的方法，包括用基于纖維蛋白的聚 合物懸浮權利要求1的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物。
18. 治療個體中瘺的方法，包括(a)用縫線封閉內孔和(b)向所述 封閉縫合的內孔遞送至少約10x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞包括在權利要求1的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物 中。
20. 如權利要求18所述的方法，還包括(d)深入刮除至少一個瘺 道；(e)用粘合劑填充所述瘺道。
21. 如權利要求20所述的方法，還包括(f)向所述粘合劑遞送至 少約10 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
22. 如權利要求20所述的方法，其中所述粘合劑為纖維蛋白膠或 凝膠。
23. 如權利要求21所述的方法，其中所述粘合劑還包含權利要求 1的含有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物。
24. 如權利要求18所述的方法，其中所述方法還包括(c)遞送第 二劑至少約20x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
25. 如權利要求18所述的方法，其中所述方法包括遞送至少約20 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
26. 如權利要求25所述的方法，其中所述方法還包括(c)遞送第 二劑至少約40x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
27. 如權利要求18所述的方法，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞源自所述個體的脂肪組織。
28. 如權利要求18所述的方法，其中所述瘺為肛門直腸瘺、腸腸 瘺、腸皮瘺、直腸陰道瘺或膀胱陰道瘺。
29. 如權利要求18所述的方法，其還包括向所述個體給予治療劑。
30. 如權利要求29所述的方法，其中所述治療劑被局部給藥至所 述封閉縫合的內孔。
31. 如權利要求30所述的方法，其中所述治療劑被全身給藥至所 述個體。
32. 治療個體中傷口的方法，包括(a)用縫線封閉所述傷口和(b) 向所述封閉縫合的傷口遞送至少約10 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
33. 如權利要求23所述的方法，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞包含在權利要求1的細胞組合物中。
34. 脂肪組織衍生的基質干細胞，其表達c-Kit、波形蛋白和CD90 標志物，不表達CD34、因子VIII、 ce肌動蛋白、結蛋白、S-100和角蛋白標志物。
35. 脂肪組織衍生的基質干細胞，其表達CD9、 CDIO、 CD13、CD29、 CD44、 CD49A、 CD51、 CD54、 CD55、 CD58、 CD59、 C畫 和CD105標志物，不表達CD34、 CDllb、 CD14、 CD15、 CD16、 CD31、 CD34、 CD45、 CD49f、 CD102、 CD104、 CD106和/或CD133標志物。
36. 脂肪組織衍生的基質干細胞在制備用于治療個體中瘺的藥物 組合物中的用途。
37. 如權利要求36所述的用途，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞源自所述待治療個體的脂肪組織。
38. 如權利要求36所述的用途，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞包括包含在權利要求1至10、 34或35中任一權利要求定義的含 有脂肪組織衍生的基質干細胞的組合物中。
39. 如權利要求36所述的用途，其中所述藥物組合物包含至少約 10 x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
40. 如權利要求36所述的用途，其中在用縫線封閉瘺道內孔后將 所述藥物組合物作為第 一劑被遞送至所述封閉的內孔。
41. 如權利要求36所述的用途，其中在用縫線封閉瘺道內孔后將 所述藥物組合物作為第一劑被遞送至所述瘺道壁的一個或多個部位。
42. 如權利要求40或41所述的用途，其中所述藥物組合物包含 至少約10x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
43. 如權利要求40或41所述的用途，其中在所述第一劑所述藥 物組合物之后，向所述封閉縫合的內孔或瘺道壁的 一個或多個部位遞 送第二劑所述藥物組合物。
44. 如權利要求43所述的用途，其中所述第二劑所述藥物組合物 包含至少約20x 106脂肪組織衍生的基質干細胞。
45. 如權利要求36所述的用途，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞被包含在縫線中。
46. 如權利要求36所述的用途，其中所述脂肪組織衍生的基質干 細胞凈皮遞送至用于填充瘺道的材料。
47. 如權利要求46所述的用途，其中所述材料為基于纖維蛋白的 聚合物或粘合劑，例如纖維蛋白膠或凝膠。
48. 如權利要求36所述的用途，其中所述瘺為肛門直腸瘺、肛瘺、 糞瘺、動靜脈瘺、膽瘺、子宮頸瘺、鼻腦脊液瘺、腸腸瘺、腸皮瘺、 腸陰道瘺、胃瘺、子宮腹膜瘺外淋巴、肺動靜脈瘺、直腸陰道瘺、臍 瘺、氣管食管瘺或膀胱陰道瘺。
49. 如權利要求48所述的用途，其中所述瘺為肛門直腸瘺、腸直 腸瘺、腸皮瘺、直腸陰道瘺或膀胱陰道瘺。
50. 如權利要求36所述的用途，其中所述藥物組合物與治療劑被 聯(lián)合給藥至所述治療中的個體。
51. 如權利要求50所述的用途，其中所述治療劑被全身給藥或在 縫合部位局部給藥。
52. 如權利要求51所述的用途，其中所述藥物組合物包含所述治療劑。
53. 如權利要求50所述的用途，其中所述治療劑相對于所述包含所述脂肪組織衍生的基質干細胞的藥物組合物被分開給藥。
54.如權利要求50所述的用途，其中所述治療劑為抗炎劑、免疫 抑制劑、生物試劑、抗生素或止瀉劑。
55.治療個體中瘺的方法，包括以下步驟(i) 深入刮除至少一個瘺道(ii) 用縫線封閉經(jīng)刮除的瘺道的內孔(iii) 向所述封閉縫合的內孔遞送至少約10x 106脂肪組織衍生的 基質千細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供采用脂肪組織衍生的基質干細胞治療瘺的新方法和組合物。
文檔編號A61K35/36GK101263224SQ200680030622
公開日2008年9月10日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權日2005年6月24日
發(fā)明者曼努埃爾安赫爾·岡薩雷斯德拉培尼亞, 羅薩阿尼婭·加西亞卡斯特羅, 達米安·加西亞奧爾莫, 馬里亞諾·加西亞阿蘭斯, 馬里亞赫馬·費爾南德茲米格爾 申請人:塞勒里克斯有限公司;馬德里自治大學