骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)、制備方法及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品，以及它們的制備和使用方法。骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)完整的保留了骨骼肌三維的、平行排列的骨骼肌基底膜超微結構，保留了血管基質(zhì)網(wǎng)絡和肌肉-肌腱接頭，保留了大量生長因子、透明質(zhì)酸、氨基葡聚糖、層連蛋白等生物活性成分，高度親和肌源性干細胞，具有一定的機械強度和韌性，脫細胞徹底、無明顯免疫排斥，無倫理道德問題，是迄今為止報道最多優(yōu)點的骨骼肌再生支架和平臺。所制備的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)，以及其各種衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品，可用作體外體內(nèi)構建和再生骨骼肌，適用于修復各個部位、各種范圍的骨骼肌缺損，有望解決目前臨床上仍十分棘手的、大范圍骨骼肌缺損修復和肌肉再生難題。
【專利說明】骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)、制備方法及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品
【技術領域】
[0001]本發(fā)明描述了骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)((Whole organ acellularmatrix, WOACM))及其衍生出的醫(yī)療產(chǎn)品如微粒、流體化組合物、凝膠和活性肽等的制備方法及其用途。涉及領域包括組織工程與再生醫(yī)學、外科學、生物材料學。
【背景技術】
[0002]骨骼肌缺損的治療，特別是大范圍肌肉缺損的功能重建，到目前為止仍是臨床難題。骨骼肌占人體重量的40-50%。骨骼肌系統(tǒng)創(chuàng)傷也是人體最常見的創(chuàng)傷之一，據(jù)統(tǒng)計30-55%的運動損傷、50-70%的戰(zhàn)傷均涉及到骨骼肌。輕微骨骼肌損傷，如各種挫傷或拉傷，骨骼肌組織能依靠成肌細胞(衛(wèi)星細胞)再生肌纖維實現(xiàn)自我修復。然而，缺損量超過20%的骨骼肌創(chuàng)傷難以實現(xiàn)功能性修復而伴有疤痕形成、遠心端肌肉失神經(jīng)支配萎縮、功能障礙。針對這些患者，目前臨床的標準治療是自體取材修復，包括各種肌皮瓣移植，雖能部分恢復損傷區(qū)功能，但存在可利用的肌肉來源有限、組織解剖結構和生物力學改變、供區(qū)損傷等不足；以“創(chuàng)傷修復創(chuàng)傷”也不符合外科微創(chuàng)化的發(fā)展方向?？傊?，骨骼肌缺損的治療，特別是大范圍肌肉缺損的功能重建，到目前為止仍是臨床難題。通過誘導組織再生實現(xiàn)大范圍骨骼肌缺損的功能重建符合醫(yī)學需要，該項技術具有廣闊的前景。
[0003]細胞外基質(zhì)具有迄今最好的體內(nèi)骨骼肌誘導再生效果，但仍有改進需要。骨骼肌是單一功能器官，理論上來說較肝臟、肺等臟器更容易通過組織工程和再生醫(yī)學技術實現(xiàn)其功能性再生。事實上，目前組織工程骨骼肌的進展已落后于肝臟和肺等領域，原因是骨骼肌具有復雜的超微結構，包括平行排列的、周期性的三維骨骼肌基底膜管結構，肌肉-肌腱接頭等，這些結構都非常難于人工模仿。此外骨骼肌具備功能的前提是受神經(jīng)支配以及足夠的血管網(wǎng)絡提供營養(yǎng)和氧分(肌細胞是物質(zhì)代謝非常旺盛、高耗氧細胞)，而目前各種體外構建環(huán)境，包括生物反應器在內(nèi)，均難以提供骨骼肌細胞生長發(fā)育所需的氧分和營養(yǎng)支持。此外有研究發(fā)現(xiàn)，酶消化獲得的骨骼肌成肌細胞(Myoblast)在分離和擴增過程中會喪失再生骨骼肌纖維的能力。直接將肌源性干細胞接種到受損部位至今未有接種的干細胞存活率達到1%的報道。上述困難驅(qū)使人們研究可否在體內(nèi)誘導骨骼肌組織再生，如僅提供生物化學信號調(diào)節(jié)局部微環(huán)境加速骨骼肌再生、減少疤痕形成。這方面國外學者已取得令人矚目的突破，即應用脫細胞基質(zhì)(Acellular matrix, ACM)支架材料，如豬小腸粘膜下層(Small intestinal submucosa, SIS)基質(zhì)、膀胱基質(zhì)(Urinarybladder matrix，UBM)，在體內(nèi)實現(xiàn)骨骼肌功能性再生。這些ACM的成分為細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM),主要由I型和III型膠原纖維組成,含少量V型和VI型膠原纖維，有一定孔隙率，其余部分主要為糖蛋白、纖維粘蛋白、氨基葡聚糖(硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素等)，易于細胞粘附并能促進粘附的細胞生長增殖；含有多種細胞因子，包括成纖維細胞生成因子(FGF)-2、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等；還有良好的可降解性和降解速率可控性，無抗原作用。ECM修復骨骼肌缺損的機理是“內(nèi)源性組織再生”:植入后ECM能夠?qū)崿F(xiàn)快速再血管化，其中的生物活性信號蛋白和生長因子吸引干細胞遷移進入支架材料，并誘導干細胞分化形成位置特異性主質(zhì)細胞如骨骼肌成肌細胞、血管前體細胞；隨著持續(xù)的ECM材料的降解和持續(xù)的宿主細胞新生基質(zhì)沉積，功能性骨骼肌組織開始形成，恢復成它的起源結構、功能性和生理性狀態(tài)。實驗動物骨骼肌缺損區(qū)使用ECM填充修復，雖然未接種干細胞，但也能夠再生出功能性骨骼肌。Valentin等使用SIS修復大鼠腹壁缺損，6個月后在修復區(qū)看到島嶼狀功能性骨骼肌組織，其產(chǎn)生的收縮力可達到正常腹肌的80 %。同樣，Turner等在犬8 X 4cm大小部分肌肉缺失模型中，6個月后同樣觀察到SIS修復區(qū)有血供良好、受神經(jīng)支配、有收縮功能的骨骼肌新生，幾乎與修復區(qū)周圍正常肌肉組織難以區(qū)分。當然，預接種干細胞會進一步加快組織再生速度；ConConi等發(fā)現(xiàn)大鼠腹肌ECM體外接種成肌細胞后重新植入修復大鼠腹壁缺損，僅9天即可形成具有復雜結構、可收縮、血管化的骨骼肌組織。上述研究結果國外已轉(zhuǎn)化為臨床應用，即植入ECM材料促進遭受中等范圍骨骼肌損失的患者實現(xiàn)肌肉功能重建，改善肢體殘疾。已有的報道均來自于美國軍方。第I例臨床應用是采用UBM為一名自阿富汗戰(zhàn)場返回的右下肢腓腸肌部分被炸飛的士兵實現(xiàn)了肌肉再生，受傷部位的骨骼肌肌力恢復到對側(cè)的70%。我國的報紙《參考消息》也轉(zhuǎn)載了這一成果(第19120期，2011年6月21日)。第2例是一名右大腿根部部分骨骼肌缺失的士兵，他接受多層SIS植入治療時距他受傷已有3年。在這3年中，他的受傷區(qū)是疤痕修復，雖經(jīng)多年康復治療，他仍一直有明顯的右膝伸直困難。接受SIS植入后4月，他的這一癥狀明顯改善，受傷區(qū)肌力提高了 30%。不過值得注意的是，這一方法目前仍存在一些局限性，包括①操作繁瑣，上述研究中所用的ECM材料是UBM和SIS，雖然來源方便，但因為UBM和SIS的平均厚度不到100 μ m，要達到缺損骨骼肌的體積需要層疊數(shù)百層的材料；②再生骨骼肌并不是真正意義上具有全部收縮功能的骨骼肌:骨骼肌物質(zhì)代謝非常旺盛，骨骼肌劇烈運動時其內(nèi)的血流量能達到平靜狀態(tài)時的20-80倍，故正常人體骨骼肌均有較粗直徑的支配血管且每平方毫米肌肉中有1350-3000條毛細血管；而UBM和SIS植入?yún)^(qū)再生骨骼肌的血供均由周圍組織侵入的毛細血管提供，無明顯支配血管、毛細血管密度也不足，無法提供劇 烈收縮時需要的血流量；③UBM和SIS未能反映出天然骨骼肌基質(zhì)的復雜結構，再生骨骼肌的肌纖維排列不理想?？傊瓻CM誘導骨骼肌功能性再生是一項非常有前景的技術，但目前仍有值得深入研究改進措施的地方。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的特征在于獲得了骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)(W0ACM)，具有高組織相容性，保留了骨骼肌三維超微結構和血管基質(zhì)網(wǎng)絡以及肌肉-肌腱接頭結構等，保留有骨骼肌特異性細胞外基質(zhì)成分，較迄今已有的各種支架材料更好的模擬了天然骨骼肌細胞外基質(zhì)的物理和生物特性。
[0005]在舉例的一個具體實施方案中，本發(fā)明詳細的敘述了骨骼肌WOACM這種生物活性骨骼肌再生支架材料的制備方法，包括取材對象的選擇、原料骨骼肌組織的獲取和準備、前置處理、脫細胞、消毒保存、體外評估等。
[0006]本發(fā)明制備的骨骼肌WOACM起始原料是異體異種骨骼肌，如人體，豬，狗等的骨骼肌，優(yōu)選的骨骼肌是血供明顯的骨骼肌，最優(yōu)的是帶獨立支配血管的骨骼肌。取材范圍優(yōu)選的包括骨骼肌支配血管的上級血管，最優(yōu)的是來自于供體軀體的主干血管，以期相應血管脫細胞后能方便用于外科縫合。供體的年齡以年輕為佳，因為年輕供體骨骼肌的細胞外基質(zhì)中各種促干細胞粘附成分、生長因子等較豐富，所含脂肪組織較少。取材時間應于供體死亡后30分鐘內(nèi)，優(yōu)選方案是在取材部位骨骼肌仍具備有效血液循環(huán)時取材。
[0007]本發(fā)明涉及的原材料準備指骨骼肌在獲取時應有較好的保存液灌注，其標準是確保骨骼肌內(nèi)動靜脈系統(tǒng)均得到充分灌注、血液成分被排出而不會在骨骼肌小血管中凝結致微循環(huán)阻塞，此外灌注未導致骨骼肌內(nèi)血管網(wǎng)絡破壞；優(yōu)選的方案是供體有預先全身肝素化，最佳的是供體預先全身肝素化聯(lián)合局部保存液充分灌注，充分灌注的標準是經(jīng)支配動脈灌入保存液，支配動脈伴行的靜脈中無粘稠血性液流出。經(jīng)充分灌注后，原材料可反復冷凍、復溫。[008]本發(fā)明涉及的前置處理指明確所插管動脈支配的骨骼肌范圍、支配動脈有無解剖學變異，插管支配動脈的伴行靜脈，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪組織；
[0009]本發(fā)明涉及的脫細胞方法包括將插管血管接入生物反應器，經(jīng)支配血管按序列分批灌注不同處理液，所述處理液可包括酶處理液和化學藥物處理液，所述酶處理液可選自如胰蛋白酶(Trypsin)、核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶如脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)、α -半乳糖苷酶等的一種或幾種,所述化學藥物處理液可選自離子型、非離子型和兩性表面活性劑、螯合劑、高低滲溶液的一種或幾種，例如乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、乙二酉享雙四乙酸(Ethylene glycoltetraacetic acid, EGTA)、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X)、脫氧膽酸(Deoxycholic acid)等,上述酶處理液和化學藥物處理液可選擇匹配組成多種方案用于骨骼肌脫細胞，不同方案間可在藥物選用、藥物使用順序、藥物濃度和藥物作用時間上有差異，但目標一致，即以最溫和的方式實現(xiàn)徹底脫細胞并同時最大限度保留骨骼肌細胞外基質(zhì)中的生物活性成分，至少需保留骨骼肌細胞外基質(zhì)中80%以上的生物活性成分。
[0010]脫細胞方案所用胰蛋白酶的終濃度為0.01~0.25%，EDTA或EGTA的終濃度為
0.02~0.5%, DNase的終濃度為30_50U/ml，α -半乳糖苷酶的終濃度為10_25U/ml，SDS的終濃度為0.01~0.1%、Triton-X的終濃度為0.1~1%、Deoxycholate acid的終濃度為
0.5 ~2%。
[0011]脫細胞方案中，所述分批灌注的處理液可選自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸、脫氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚和脫氧膽酸的幾種，其中所用胰蛋白酶/EDTA或EGTA的作用時間1_3小時，DNase和α -半乳糖苷酶的作用時間0.4-1小時，SDS的作用時間4-24小時、Triton-X的作用時間8-24小時、Deoxycholate的作用時間4-24小時。
[0012]本發(fā)明涉及的消毒技術可選自全灌注系統(tǒng)預滅菌、全程使用滅菌液體灌注、制備后消毒液灌注，或輻射滅菌，具體可包括經(jīng)支配血管灌注過氧乙酸(Peroxyaceticacid，PAA)/乙醇(ETOH)混合液或Y射線輻射滅菌等。其中PAA的終濃度(V/V)為
0.1-0.5%,乙醇的終濃度(V/V)為2-10%，PAA/乙醇混合液的作用時間2_3小時。制備的骨骼肌WOACM可選擇水化保存，或經(jīng)真空冷凍干燥形成干燥體保存。
[0013]在舉例的一個具體實施方案中，本發(fā)明詳細的敘述了骨骼肌WOACM這種生物活性骨骼肌再生支架材料體外生物活性的檢測方法和結果，包括檢測骨骼肌WOACM的組織學、超微結構，檢測脫細胞的徹底性(包括殘留核酸、內(nèi)毒素含量和生物負載如真菌、病毒含量，殘留核酸鏈的大小，殘留脫細胞化合物含量)，檢測骨骼肌基底膜特異成分的存在如IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白等，測定促干細胞粘附、增殖和分化成分的含量如透明質(zhì)酸、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAGs)、硫酸類肝素、各種生長因子如血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growthfactor, bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growthfactor- β , TGF- β )等。
[0014]在舉例的一個具體實施方案中，本發(fā)明詳細的敘述了骨骼肌WOACM較其他支架材料在促血管和肌源性干細胞趨化、促血管和肌源性干細胞增殖、促肌源性干細胞成肌分化和肌管生成方面的優(yōu)勢。
[0015]本發(fā)明所制備的骨骼肌WOACM可衍生出微粒、流體化組合物、凝膠和活性肽等醫(yī)療產(chǎn)品。微粒產(chǎn)品為將骨骼肌WOACM真空冷凍干燥后的干燥體經(jīng)高速旋轉(zhuǎn)粉碎所得，包括多個產(chǎn)品等級(≤38 μ m，38-100 μ m, 100-250 μ m)，可用作骨骼肌創(chuàng)面覆蓋、骨骼肌缺損充填材料等。流體化組合物為將骨骼肌WOACM微粒在酸性環(huán)境中使用胃蛋白酶消化所得。凝膠產(chǎn)品為均勻流體化組合物再濃縮、中性化處理所得，包括不同濃度等級，可用作骨骼肌創(chuàng)面覆蓋、注射用充填骨骼肌缺損、治療肌營養(yǎng)不良等。制備上述衍生產(chǎn)品的技術均是本領域技術人員所熟知的。
[0016]本發(fā)明涉及的骨骼肌WOACM活性肽的制備:將骨骼肌WOACM流體化組合物經(jīng)超高速離心13000rpm)后，上清液真空冷凍干燥，所得干燥體即為骨骼肌WOACM的活性肽，體外測試證實其促骨骼肌成肌細胞趨化、增殖和分化的能力遠較骨骼肌WOACM流體化組合物更高效。
[0017]由本文的描述，本發(fā)明的另外的方面以及特征和優(yōu)點對于本領域普通技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為豬下腹直肌的支配血管解剖和取材范圍示例圖；
圖2為原始骨骼肌以及由該塊肌肉制備的骨骼肌示意圖；
圖3為骨骼肌WOACM結構完整，保留有血管網(wǎng)絡的示例圖；
圖4為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM的橫斷面、沿長軸面的掃描電鏡圖；
圖5為骨骼肌WOACM的可見保留的毛細血管網(wǎng)絡的橫斷面掃描電鏡圖；
圖6為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM橫斷面的HE染色、基底膜蛋白免疫組化染色(200X)示例圖；
圖7為天然骨骼肌和骨骼肌WOACM沿長軸面的HE染色、基底膜蛋白免疫組化染色(200X)示例圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌ECM更利于骨骼肌再生，其中骨骼肌WOACM具有最佳的理論優(yōu)勢。近年來越來越多的研究顯示，特定組織的ECM均擁有該組織獨特的成分和結構，同樣骨骼肌ECM也具備骨骼肌特異性的成分和結構①高IV型膠原含量，主要存在于骨骼肌基底膜中，利于成肌細胞粘附、遷移和激活復雜的、具有啟動功能的三維超微結構，包括平行排列的肌內(nèi)膜管結構、殘存的神經(jīng)和血管通路，可促進成肌細胞的調(diào)整和融合，并刺激神經(jīng)血管生長；③富含生長因子、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、硫酸肝素、硫酸蛋白聚糖等，生物相容性極佳；④降解產(chǎn)物具有強有力的促肌肉干細胞的有絲分裂和趨化作用，且這些降解產(chǎn)物形成的微環(huán)境，對維持肌細胞和衛(wèi)星細胞的活力非常重要。因此，骨骼肌ECM應較其他材料更適合于重建骨骼肌，骨骼肌ECM修復骨骼肌缺損時也應具有更好的誘導再生效果。
[0019]制備骨骼肌ECM—直是組織工程和再生醫(yī)學領域的難題。通常認為骨骼肌結構致密，組織間有多重結締組織分隔，脫細胞液體于其中難以彌散，故迄今僅有大鼠四肢小塊骨骼肌ECM和豬骨骼肌薄片的ECM制備成功的報道，但這些骨骼肌ECM不能用于修復臨床上的大范圍骨骼肌缺損。2008年國際頂級醫(yī)學期刊《Nature Medicine》首先報道了一項革命性技術，灌注法脫細胞制備整器官的細胞外基質(zhì)用于構建相應的組織工程器官。美國學者Ott HC等應用此法制備出大鼠心臟的全器官脫細胞基質(zhì)，接種干細胞體外構建8天后成功獲得一人工心臟，其泵血功能達到正常成年大鼠心臟的2%，16周胎鼠心臟的25%。受到此項技術啟發(fā)，人們先后獲得了肝、腎、肺等臟器的全器官脫細胞基質(zhì)，相關文章均發(fā)表在《Science》、《!fepatology》等頂級期刊。與此同時，國際知名的組織工程中心也一直在開展骨骼肌WOACM的制備工作，因為從理論上來說，骨骼肌WOACM較目前國內(nèi)外已報道的各種骨骼肌再生平臺，包括無機生物材料如可溶性磷酸鹽玻璃纖維支架等、生物可降解合成高分子材料如聚羥基乙酸、聚乳酸以及和各類酯單體共聚物如聚乳酸-乙醇酸等，天然可降解生物材料如殼聚糖、膠原、SIS和UBM等，具有許多無可比擬的優(yōu)勢:
A.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌復雜的、具有啟動功能的三維平行排列、周期性的肌內(nèi)膜(基底膜)管結構，這樣的超微結構目前尚不能人工模仿，特別利于肌源性干細胞定向遷移、延伸和融合，也 能引導新生肌管的方向；
B.骨骼肌WOACM保留有生物活性成分(維持肌源性干細胞活性的生物信號):包括骨骼肌基底膜特異成分(IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白)、促干細胞粘附、增殖和分化成分(透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、硫酸類肝素和生長因子如bFGF、TGF-β 1、IGF、VEGF等)；
C.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌完整的血管基質(zhì)網(wǎng)絡，包括終末動脈、靜脈和毛細血管系統(tǒng)；用于系統(tǒng)性接種干細胞可確保干細胞均勻分布到整個基質(zhì)內(nèi)并且所有接種的細胞在血管周圍150-200 μ m內(nèi)，能良好存活；此外,血管基質(zhì)網(wǎng)絡若能連通至受體的循環(huán)系統(tǒng)則可為干細胞持續(xù)提供營養(yǎng)；
D.骨骼肌WOACM保留了主要供應血管的基質(zhì)，有機會再生出新的大直徑供應血管來支配新生骨骼肌成為全功能骨骼??；
E.骨骼肌WOACM保留了肌肉-肌腱接頭結構，可直接傳導力學；
F.骨骼肌WOACM具有一定的機械強度和韌性；
G.骨骼肌ECM較其他材料更容易實現(xiàn)新生骨骼肌的再神經(jīng)化。研究顯示，輕度骨骼肌損傷機體實現(xiàn)自我修復時，超過95%的神經(jīng)-肌肉接頭還是再生于基底膜和肌內(nèi)膜上的原位(衛(wèi)星細胞龕)，而骨骼肌WOACM保留了肌衛(wèi)星細胞龕的成分和結構。本發(fā)明的骨骼肌WOACM的制備方法適用于制備所有生物、各個部位的骨骼肌W0ACM，如人體、豬、狗的腹直肌、背闊肌。以下將以豬腹壁下腹直肌為例進行詳細說明。以下實施例中所提到的所有具體參數(shù)，僅用于舉例說明，本領域技術人員可由下述公開的內(nèi)容得到多種簡單變化的方案，這些簡單變換的方案也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0020]原材料(豬腹壁下腹直肌)的獲取和準備:選擇供體為16-20周齡雌性Yorkshaire豬，體重25-30kg，預先經(jīng)外周靜脈全身肝素化(10000U/只)，采用從劍突直至下腹近肛門的腹正中切口，切開腹白線至腹膜前間隙，向頭部方向推開腹膜，暴露腹膜后結構，包括腹主動靜脈、髂總血管、髂外血管。切開髂外動脈，置入14-20G套管至腹壁下動脈，灌注泵驅(qū)動向腹壁下動脈內(nèi)注入肝素化(l_5U/ml)的生理鹽水，保持動脈內(nèi)壓力在活體正常血壓水平(100-120mmHg)。充分灌注直至腹壁下靜脈中無濃稠血性液流出。繼續(xù)沿髂外血管暴露陰部腹壁血管干(該血管干由三條血管組成:腹壁下動脈，上腹尾淺動脈和陰部外動脈)和股動脈(圖1左)。沿腹直肌前表面剝離腹直肌前鞘，沿后表面剝離腹橫筋膜(弓狀線下方)和腹直肌后鞘(弓狀線上方)，直至臍水平(第3或第4腱劃)，特征是可見腹壁下深動脈穿支(Deep inferior epigastric perforator, DIEP)。沿恥骨弓表面切斷腹直肌腱和恥骨接頭，切斷髂外動靜脈、股動靜脈、陰部外動靜脈和上腹尾淺動靜脈，沿臍水平切斷腹直肌，完成下腹直肌的獲取和準備(圖1右)。 [0021]前置處理:獲取的豬下腹直肌置于灌注反應器中，髂外動脈插管連通灌注泵，低壓(約60mmHg)灌注IX的磷酸鹽緩沖液(PBS)。使用染料明確腹壁下動脈支配范圍，檢查有無供應下腹直肌的異常血管，若有，則需置管入該血管用于灌注(圖2左)。進一步清除肌組織表面的脂肪組織，結扎髂外動脈除腹壁下動脈以外的所有分支，包括上腹尾淺動脈、陰部外動脈和股動脈，確保經(jīng)髂外動脈灌注液完全流入腹壁下動脈。結扎髂外靜脈除腹壁下靜脈(有2支)以外的所有分支，包括上腹尾淺靜脈(2支)、陰部外靜脈和股靜脈，髂外靜脈內(nèi)置入套管。
[0022]脫細胞處理:將髂外動靜脈套管接入生物反應器，灌注時注意標本須同時浸沒于與灌注液同樣的液體中。附表1和表2示出了常用的2種優(yōu)化的脫細胞方案，其中方案I操作時間長于方案2，但更容易實現(xiàn)超大體積(如大于50 X 40 X 5cm)的原材料骨骼肌的脫細胞。骨骼肌脫細胞后呈透明狀，可清晰顯示其內(nèi)的血管、神經(jīng)網(wǎng)絡(圖2右)，染色灌注確認其結構完整、無液體滲漏(圖3)。除表1和表2所示脫細胞方案外，本發(fā)明還可使用其它任何使用上述描述的試劑及不同處理時間的合適的脫細胞方案。
[0023]消毒和保存:自0.1%PAA/4%ET0H灌注后,所有灌注的液體,包括去離子水,均為已滅菌液體。最終獲得骨骼肌WOACM保存于組織保存液中，Y射線輻射滅菌。組織保存液成分為:乳糖醒酸IOOmmol,磷酸氫鉀25mmol,硫酸鎂5mmol,氫氧化鈉(5mmol/L) 5ml,氫氧化鉀(5mmol/L) 20ml,鹿糖 60mmol, pH 7.45±0.10,滲透壓(310±10) m0sm/L。
[0024]骨骼肌WOACM的超微結構:HE染色和掃描電鏡確認骨骼肌WOACM保留了天然骨骼肌細胞外基質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結構，骨骼肌基底膜成分貼附于肌內(nèi)膜內(nèi)面(圖4)，這樣的結構最利于肌源性干細胞的粘附、遷移、增殖、分化和融合?？梢娗逦谋Ａ舻拿氀芫W(wǎng)絡(終末動脈和伴行的2條終末靜脈，圖5)。
[0025]脫細胞徹底性測定:組織學染色未見細胞核結構，DAPI染色陰性。提取骨骼肌WOACM中的全部DNA，使用Picogreen法測定骨骼肌WOACM干重中殘留DNA的含量低于50ng/mg。殘留DNA鏈的長度200-500bp。
[0026]生物活性測定:經(jīng)ELISA法測定，骨骼肌WOACM干重中GAGs含量是645土 40ng/mg、VEGF 含量是 186 ±22ng/mg，bFGF 含量是 1375 ±230ng/mg，TGF-β 含量是 293±8ng/mg。骨骼肌基底膜主要成分蛋白免疫組化染色證實骨骼肌WOACM中含有IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白(圖6和圖7)。
[0027]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更趨化血管和肌源性干細胞:所制備的骨骼肌WOACM流體化組合物經(jīng)中性化后，以不同濃度(1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml UOO μ g/ml,50 μ g/ml,25 μ g/ml UOy g/ml,5 μ g/ml)比較與 SIS、UBM、PLGA 對骨骼肌成肌細胞、MJK/PJK的趨化作用(Boyden chamber法)，結果發(fā)現(xiàn)骨骼肌WOACM具有最佳的促干細胞趨化作用，且在濃度25 μ g/ml時即達到最佳作用。
[0028]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更促進血管和肌源性干細胞增殖:使用 BrdU 法檢測不同濃度(1000 μ g/ml>500 μ g/ml、250 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml)的骨骼肌 WOACM、SIS、UBM、PLGA 對骨骼肌成肌細胞、MJK/PJK的促增殖作用，結果發(fā)現(xiàn)骨骼肌WOACM具有最佳的促干細胞增殖作用，且在濃度50 μ g/ml時即達到最佳作用。
[0029]骨骼肌WOACM較其他ECM和合成高分子材料更促進血管和肌源性干細胞分化:接種5X IO5骨骼肌成肌細胞至I X Icm骨骼肌WOACM薄片、SIS、UBM、PLGA支架表面，使用全培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清)培養(yǎng)7天后改用誘導培養(yǎng)液(DMEM+10%馬血清)培養(yǎng)3天，比較骨骼肌成肌細胞的分化和肌生成，檢測骨骼肌調(diào)節(jié)因子的表達(MyoD，Myogenin, MRF4, Myf5),激光共聚焦顯微鏡檢測新生肌管的量、尺寸和有序性。結果發(fā)現(xiàn)在骨骼肌WOACM表面成肌細胞最容易形成新生肌管，且新生肌管排列最為有序。
[0030]殘留化學物測定:脫細胞方案I制備的骨骼肌WOACM采用亞甲藍結合殘留物中的十二烷基硫酸鈉，Picogre en法測定吸光度,測定骨骼肌WOACM干重中殘留十二烷基硫酸鈉的含量低于100ng/mg，未檢測到Triton-X殘留；脫細胞方案2制備的骨骼肌WOACM中未檢測到Triton-X和脫氧膽酸殘留。
[0031]生物負載測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細胞方案I和脫細胞方案I制備的骨骼肌WOACM均不攜帶真菌、病毒在內(nèi)的生物負載。
[0032]滅菌測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細胞方案I和脫細胞方案I制備的骨骼肌WOACM均滅菌徹底，內(nèi)毒素含量<15Eu/mg干重。
[0033]機械強度和韌性、彈性測定:經(jīng)常規(guī)方法測定，脫細胞方案I和脫細胞方案I制備的骨骼肌W0ACM，保留有其來源骨骼肌30%以上的機械強度，以及90%以上的韌性和彈性。
應用領域
本發(fā)明制備的骨骼肌WOACM及其衍生醫(yī)療產(chǎn)品的應用領域包括用于組織工程和再生醫(yī)學領域體外構建、體內(nèi)再生骨骼肌，可修復各種范圍的骨骼肌缺損包括覆蓋骨骼肌創(chuàng)面、填充肌缺損、注射治療肌營養(yǎng)不良、解剖修復大范圍缺損，也可用于心肌梗死的治療。
以上公開的僅為本申請的一個具體實施例,但本申請并非局限于此,任何本領域的技術人員能思之的變化，都應落在本申請的保護范圍內(nèi)。
附表、【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]表1.脫細胞方案1:
【權利要求】
1.一種骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟:取材對象的選擇、原材料的獲取和準備、前置處理、脫細胞、消毒保存、體外評估。
2.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述取材對象的選擇為，選擇血供明顯的異種異體骨骼??；取材范圍包括骨骼肌支配血管的上級血管；取材時間為取材部位骨骼肌仍具備有效血液循環(huán)時取材。
3.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述原材料的獲取和準備，其標準是確保骨骼肌內(nèi)動靜脈系統(tǒng)均得到充分灌注、血液成分被排出而不會在骨骼肌小血管中凝結致微循環(huán)阻塞，此外灌注未導致骨骼肌內(nèi)血管網(wǎng)絡破壞。
4.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述前置處理指明確所插管動脈支配的骨骼肌范圍、支配動脈有無解剖學變異，插管支配動脈的伴行靜脈，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪組織。
5.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述脫細胞步驟包括:將插管血管接入生物反應器，經(jīng)支配血管按序列分批灌注不同處理液，標準是達到脫細胞要求、保留骨骼肌細胞外基質(zhì)中80%以上的生物活性成分；其中，所述處理液包括酶處理液和化學藥物處理液。
6.根據(jù)權利要求5所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述酶處理液選自胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶或核酸外切酶/核酸內(nèi)切酶中的一種或幾種；所述化學藥物處理液選自離子型、非離子型和兩性表面活性劑、螯合劑、高低滲溶液的一種或幾種。
7.根據(jù)權利要求6所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述核酸外切酶/核酸內(nèi)切酶為脫氧核糖核酸酶，所述脫氧核糖核酸酶的終濃度為30-50U/ml ;所述胰蛋白酶的終濃度為0.01~0.25% ； α -半乳糖苷酶的終濃度為10-25U/ml ； 所述化學藥物處理液選自乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、脫氧膽酸的一種或幾種，其中所述乙二胺四乙酸或乙二醇雙四乙酸的終濃度為0.02~0.5%，所述十二烷基硫酸鈉的終濃度為0.01~0.1%，所述聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為0.1~1%，所述脫氧膽酸的終濃度為0.5~2%。
8.根據(jù)權利要求7所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述分批灌注的處理液選自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸、脫氧核糖核酸酶/ α -半乳糖苷酶、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚和脫氧膽酸的幾種，其中所述胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇雙四乙酸的作用時間為1-3小時，脫氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶的作用時間為0.4-1小時，十二烷基硫酸鈉的作用時間為4-24小時、聚乙二醇辛基苯基醚的作用時間為8-24小時、脫氧膽酸的作用時間4-24小時。
9.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述消毒保存中的消毒方法選自全灌注系統(tǒng)預滅菌、全程使用滅菌液體灌注、制備后消毒液灌注，或輻射滅菌的一種或幾種；所述消毒保存中的保存技術選自水化保存或干燥體保存。
10.根據(jù)權利要求1所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述體外評估包括:檢測骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的組織學、超微結構，檢測殘留核酸、內(nèi)毒素含量和殘留核酸鏈的長度，測定生物負載以及殘留脫細胞化合物含量，檢測骨骼肌基底膜特異性成分的存在，測定促干細胞粘附、增殖和分化成分的含量。
11.根據(jù)權利要求10所述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于，所述骨骼肌基底膜特異成分包括IV型膠原、層連蛋白、纖連蛋白，所述促干細胞粘附、增殖和分化成分包括透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、硫酸類肝素和生長因子。
12.一種骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)，是一種骨骼肌再生支架，其特征在于， A.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留了骨骼肌復雜的、具有啟動功能的三維平行排列、周期性的肌內(nèi)膜管超微結構，該超微結構特別利于肌源性干細胞定向遷移、延伸和融合，也能引導新生肌管的方向；和 B.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留了骨骼肌完整的血管基質(zhì)網(wǎng)絡，包括終末動脈、靜脈和毛細血管系統(tǒng)；和 C.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留有用于維持肌源性干細胞活性的生物信號的生物活性成分，所述生物活性成分包括骨骼肌基底膜特異成分，以及促干細胞粘附、增殖和分化成分；和 D.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留有肌肉-肌腱接頭結構，以直接傳導力學；和 E.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留有其來源骨骼肌30%以上的機械強度，以及90%以上的韌性和彈性；和 F.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)保留有神經(jīng)通路，以達到較其他材料更容易實現(xiàn)新生骨骼肌的再神經(jīng)化；和 G.所述骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)脫細胞徹底，其DNA含量低于50ng/mg干重，殘留DNA鏈長度為200-500bp，不攜帶真菌、病毒在內(nèi)的生物負載；滅菌徹底，內(nèi)毒素含量<15Eu/mg干重，植入后無免疫排斥反應、不傳播疾病，可異體異種移植。
13.由權利要求12所 述的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)或權利要求1-11中任一所述的制備方法制備的骨骼肌全器官脫細胞基質(zhì)制備的衍生醫(yī)療產(chǎn)品。
【文檔編號】A61P21/00GK103805555SQ201410067736
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2013年2月26日
【發(fā)明者】張劍, 斯蒂芬·巴迪拉克, 胡志前, 王強, 職康康, 王妍妍, 周海洋 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學