一種海豚鏈球菌細菌素及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，具體的說是一種海豚鏈球菌細菌素的免疫應(yīng)用。細菌素為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。該細菌素蛋白對魚類免疫細胞的免疫活性具有顯著抑制作用。
【專利說明】一種海豚鏈球菌細菌素及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，具體的說是一種海豚鏈球菌細菌素及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細菌素(Bacteriocin)是由細菌在代謝過程中通過核糖體合成產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物。細菌素通常由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生并可以抑制其他的革蘭氏陽性菌，如乳球菌、葡萄桿菌、利斯特氏桿菌等，對大多數(shù)的革蘭氏陰性菌、真菌等均沒有抑制作用。這些廣譜抗菌的細菌素對抑制食品、乳制品在保藏及發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的有害菌有著重要的作用。細菌素可以和敏感細菌的膜表面受體分子相互作用，在細胞膜上形成小孔，進而殺死細菌。然而，細菌素對動物免疫應(yīng)答方面的調(diào)控作用則尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種海豚鏈球菌細菌素的免疫調(diào)控應(yīng)用。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種海豚鏈球菌細菌素，細菌素為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
[0006]海豚鏈球菌細菌素的應(yīng)用，所述細菌素蛋白用于制備抑制魚類免疫細胞的免疫活性抑制劑。
[0007]所述細菌素蛋白用于制備抑制大菱鲆免疫細胞的免疫活性抑制劑。
[0008]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明的海豚鏈球菌細菌素能夠明顯抑制魚類免疫細胞的活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明實施例提供的純化的細菌素蛋白。其中，泳道1，分子量標準；泳道2，細菌素。
[0010]圖2為本發(fā)明實施例提供的細菌素對魚類免疫細胞(即大菱鲆單核細胞)的免疫抑制效應(yīng)圖。其中，A為細胞的呼吸爆發(fā)活性；B為細胞的酸性磷酸酶活性。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
[0012]在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法:
[0013]1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。
[0014]2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Co ld Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母轉(zhuǎn)化按Invitrogen公司的方法(Catalog n0.V175-20);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS — PAGE)按照Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannua1.Cold Spring HarborLaboratory Press2001o
[0015]3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。
[0016]實施例1
[0017]本發(fā)明的海豚鏈球菌細菌素(命名為Sil)為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。
[0018]序列表SEQ ID N0.1 為:
[0019]MKKISKIffAVGLVAASLSFGSIAYAESISVAGGTWNYGYGVGQAYSHYKHDYNNHGAKVVNSNNGVKDYKNAGPGVffAKASIGTVffDPATFYYNPTGFYSN
[0020](a)序列特征:
[0021]?長度:101
[0022]?類型:氨基酸序列
[0023]籲鏈型:單鏈
[0024]?拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0025](b)分子類型:蛋白質(zhì)
[0026](C)假設(shè):否
[0027](d)反義:否
[0028](e)最初來源:海豚鏈球菌
[0029]結(jié)構(gòu)特點:該蛋白預期含有一個信號肽(氨基酸I 一 25)。
[0030]實施例2
[0031]細菌素Sil重組蛋白的制備
[0032]I)表達Sil重組蛋白的質(zhì)粒pSil的構(gòu)建:
[0033]以海豚鏈球菌為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為:94 V 60s預變性模板DNA，然后94 °C 40s, 55 V 60s, 72 V 60s, 5個循環(huán)后改為94 V 40s, 63 V 60s, 72 V 60s, 30 個循環(huán)后再在 72 °C 延伸反應(yīng) 7 — IOmin0 PCR 產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達載體PET259 (pET259構(gòu)建過程參見Hu YH, Zhengffff, Sun L.1dentification and molecular analysis of a ferritin subunit from reddrum(Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol2010; 28:678-86)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pSil。DNA測序表明pSil含有編碼序列表SEQ ID N0.1中序列的基因。
[0034]所述LB組成成分按重量百分比計:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGGAATCAATTAGTGTAGCCG-3’ ；R1 為 5’ -GATATCGTTAGAATAAAATCCAGTTGG-3’。
[0035]2)重組Sil蛋白的誘導表達和純化
[0036]將上述的質(zhì)粒pSil用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，挑取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pSil[0037]將BL21/pSil于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入100ml新鮮的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，加入終濃度為0.4mM的IPTG，30°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)4-5h，而后以5000g，4°C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1-2小時，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min，回收上清。將上清中的蛋白用親和層析柱His Trap HP Columns (購于美國GE Healthcare公司)回收純化，將純化的蛋白懸浮于PBS緩沖液。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(8v/cm電壓下電泳25 - 30min,隨后15v/cm電壓下電泳2 — 2.5h)，測定其分子量大小(參見圖1)。將純化的蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)它的蛋白質(zhì)質(zhì)量與Sil相同，證實其為具有Sil序列的蛋白。
[0038]所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8M尿素，pH8.0。
[0039]所述PBS 組成成分按重量百分比計:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量為水。
[0040]實施例3
[0041]細菌素Sil的免疫應(yīng)用
[0042]利用單核細胞提取試劑盒(購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)制備大菱鲆頭腎單核細胞。將細胞置于含有L 一 15培養(yǎng)基(購于Thermo Scientific HyClone,北京)的96 —孔平板(每孔IO5個細胞)，每孔加入上述實施例2步驟2)制備的細菌素Sil至終濃度為20μΜ。對照細胞加入同樣體積的PBS。將細胞于22°C保溫lh。隨后用常規(guī)方法檢測細胞的呼吸爆發(fā)(具體參見文獻Chung S, Secombes CJ.Analysis of eventsoccurring within teleost macrophages during the respiratory burst.Comp BiochemPhysioll988 ;89:539 - 544)。同時,用酸性磷酸酶檢測試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研究所，北京)檢測細胞的酸性磷酸酶活性。結(jié)果表明，與對照細胞相比，用細菌素Sil處理的細胞的呼吸爆發(fā)活性和酸性 磷酸酶活性皆顯著降低(參見圖2)，說明細菌素Sil對單核細胞的免疫活性有顯著抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.一種海豚鏈球菌細菌素，其特征在于:細菌素為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述海豚鏈球菌細菌素的應(yīng)用，其特征在于:所述細菌素蛋白用于制備抑制魚類免疫細胞的免疫活性抑制劑。
3.按權(quán)利要求2所述海豚鏈球菌細菌素的應(yīng)用，其特征在于:所述細菌素蛋白用于制備抑制大菱鲆免 疫細胞的免疫活性抑制劑。
【文檔編號】A61P37/06GK103804475SQ201410067698
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】孫黎, 李墨非 申請人:中國科學院海洋研究所