專利名稱：無氰化物溶血素及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定血樣中總血紅蛋白濃度(人工或自動(dòng))及用于同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的溶血素組合物以及使用方法。
背景技術(shù)：
總血紅蛋白的測定是血液攜氧量的重要指標(biāo)。迄今為止已經(jīng)在正常人和血液病患者中發(fā)現(xiàn)了300種以上的血紅蛋白，這些異常導(dǎo)致血紅蛋白濃度的改變或者血紅蛋白攜氧能力的改變，從而出現(xiàn)鐮狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血和血紅蛋白異常等疾病。
測定血樣中血紅蛋白的濃度是相關(guān)疾病診斷的十分重要的依據(jù)，對(duì)監(jiān)控血紅蛋白疾病的治療以及其他可能影響血紅蛋白水平改變的疾病的治療也是十分重要的。
在用人工或自動(dòng)測定血樣中總血紅蛋白濃度及用于同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的分析實(shí)驗(yàn)中，盡管通過標(biāo)準(zhǔn)的氰化正鐵血紅蛋白方法及其改良的自動(dòng)方法形成的色原穩(wěn)定可靠，然而，由于使用氰化鉀，試劑廢物會(huì)引起很大的環(huán)境污染。在過去十年中，人們付出了巨大的努力以開發(fā)不使用氰化物的自動(dòng)血紅蛋白分析方法。
Oshiro等[臨床生物化學(xué)(Clin.Biochem.)，1583(1982)]說明了用于血紅蛋白分析所使用的試劑，該試劑包含十二烷基硫酸鈉(SLS)和Triton X-100(非離子型表面活性劑)。SLS用于溶解紅細(xì)胞，并被認(rèn)為進(jìn)一步產(chǎn)生SLS-血紅蛋白復(fù)合物，它在539nm處具有最大吸光度并在572nm處有肩峰。SLS法現(xiàn)為世界公認(rèn)的一種比較穩(wěn)妥可靠的無氰化物的測定方法，然而使用oshiro方法不可能在進(jìn)行血紅蛋白測定的同時(shí)分析白細(xì)胞。因?yàn)楦邼舛鹊氖榛蛩徕c將白細(xì)胞破壞程度過深。
美國專利號(hào)5,242,832(屬Sakata)公開了用于對(duì)血樣白細(xì)胞計(jì)數(shù)并測定血紅蛋白濃度的無氰化物溶血素。該溶血素包含至少一種表面活性劑包括陽離子表面活性劑和兩性表面活性劑以及至少一種選自下列化合物的血紅蛋白穩(wěn)定劑Tiron、8-羥奎啉、聯(lián)吡啶、1，10-臨菲咯啉、酚類化合物、雙酚等等。Sakata說明了白細(xì)胞分級(jí)分離或三個(gè)組(包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的聚集體以及中性白細(xì)胞的聚集體)只有通過使用至少兩種適合的表面活性劑和嚴(yán)格控制表面活性劑濃度才能完成。Sakata也說明了溶血素優(yōu)選的PH值是5.0-8.0。如果PH值是3.0或更小，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加，這樣使白細(xì)胞的測定困難，如果PH值是9.0或更大，血紅蛋白的穩(wěn)定性隨時(shí)間變壞。
PCT/US95/02897(Kim)公開了用于測定全血樣中的血紅蛋白的無氰化物方法與試劑。該試劑包括配體(選自下列化合物咪唑及其衍生物、N-羥乙酰胺、H-羥胺、吡啶、惡唑，噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和異喹啉)以及一種強(qiáng)紅細(xì)胞溶解能力的表面活性劑(選自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。該分析方法快速，不到10秒。然而，該試劑僅在極端堿性pH值11-14條件下操作。此外，Kim沒有說明計(jì)數(shù)白細(xì)胞或分別白細(xì)胞亞群的能力。
上述的無氰化物血紅蛋白測定方法中，沒有一種可以在血紅蛋白測定的同時(shí)提供單核細(xì)胞和整個(gè)粒細(xì)胞的數(shù)量；然而，這兩個(gè)參數(shù)都是用于各種疾病臨床診斷的有價(jià)值的工具。這就需要更多用途的無氰化物血紅蛋白測定方法和多功能試劑以在單個(gè)自動(dòng)步驟中可以完成若干診斷分析。
中國專利申請(qǐng)?zhí)?8801947屬于庫而特公司，公開了一種無氰化物試劑組合物，其中含有選自下列化合物的血紅蛋白配體三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4，6-二羥基-1，3，5三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹那啶酸、2-氨基-1，3，4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、異煙酰胺、鄰氨基苯甲晴、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的堿金屬和銨鹽、吡嗪及其衍生物的有機(jī)配體的水溶液。還有選自季銨鹽、吡啶鹽、有機(jī)磷酸酯和烷基磺酸的溶血性表面活性劑以溶解紅細(xì)胞釋放血紅蛋白。然而該方法仍然采用了具有一定毒性或者致癌的化合物，對(duì)環(huán)境依然有一定的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服以上所述溶血素的缺陷，提供一種不含有氰化物、沒有毒性的、能夠采用可靠方法測定血紅蛋白的溶血素，并且同時(shí)白細(xì)胞能被分成至少兩個(gè)亞群用于分別記數(shù)。
本發(fā)明的另一目的是提供使用該溶血素的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是所述的無氰化物溶血素含有可以和血色素配合的陰離子表面活性劑，選自烷基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽以及烷基硫酸鹽，以及能溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，選自季銨鹽、吡啶鹽、氧化胺型季胺鹽，還有起到增溶作用的非離子表面活性劑。此組合物在很寬的pH范圍內(nèi)可以使用。
本發(fā)明無氰化物溶血素的技術(shù)方案進(jìn)一步形式為至少一種足以溶解紅細(xì)胞并釋放量血紅蛋白的量的表面活性劑，該表面活性劑選自由下列物質(zhì)組成的組1)至少一種陽離子表面活性劑，該表面活性劑在合適的濃度范圍內(nèi)用特定的儀器能夠?qū)⑷祟惖募t細(xì)胞全部溶解并且將白細(xì)胞分成兩個(gè)亞群。包括季銨鹽、吡啶鹽、氧化胺型季銨鹽。

其中式中的R1、R5是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，R2、R3、R4都是碳原子數(shù)1-5的短鏈烷基、烯基、炔基或者氫原子，x-是任何一種陰離子。
2)至少一種陰離子表面活性劑，能在合適的濃度下和血紅蛋白結(jié)合形成一種色原，從而測定其濃度，該陰離子表面活性劑具有以下結(jié)構(gòu)R1-SO4-X+式中R1是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，x+是任何堿金屬的陽離子或者銨離子。
3)至少一種非離子表面活性劑，具有以下結(jié)構(gòu) 其中R1是碳原子數(shù)是6-8的長鏈烷基、烯基或炔基，n為4-40的整數(shù)。
在優(yōu)選的方式中，該組合可以用于同時(shí)提供總血紅蛋白濃度的測定、白細(xì)胞的計(jì)數(shù)和血樣中白細(xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)，其中所說的白細(xì)胞被區(qū)分成包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的三個(gè)亞群。
在溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑中，季銨鹽是優(yōu)選的。在溶血素組合物中的表面活性劑的濃度需要足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白、而同時(shí)保存白細(xì)胞核。為了對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，不需要使白細(xì)胞膜保持完整。一般來說，使用上述的本發(fā)明溶血素組合物中的溶血性表面活性劑時(shí)，當(dāng)紅細(xì)胞完全溶解和破壞時(shí)，白細(xì)胞膜部分溶解。白細(xì)胞留下的核使得可以使用直流阻抗方法計(jì)數(shù)白細(xì)胞并將白細(xì)胞亞群分別成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
在上述溶血素組合物中的陽離子表面活性劑濃度是大約2g/L至大約100g/L，優(yōu)選地是大約15g/L至大約60g/L。
在溶血素中陰離子表面活性劑的濃度要足以使所有的血紅蛋白都形成陰離子表面活性劑-血紅蛋白復(fù)合物。如果陰離子表面活性劑的量不足，使形成的復(fù)合物色原不穩(wěn)定。
本發(fā)明無氰化物溶血素中陰離子表面活性劑的濃度在0.1-10g/L范圍，優(yōu)選0.5-3g/L，最為合適。
本發(fā)明無氰化物溶血素，非離子表面活性劑的濃度范圍可以在0.5-5g/L范圍內(nèi)。
本發(fā)明無氰化物溶血素，所述陽離子表面活性劑濃度可以是25g/L，陰離子表面活性劑的濃度可以為1.5g/L，非離子表面活性劑的濃度可以為0.58g/L。
本發(fā)明無氰化物溶血素，所述陽離子表面活性劑為十二烷基三甲基溴化銨其濃度是25g/L，陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SLS)其濃度為1.5g/L，非離子表面活性劑為乳化劑OP其濃度為0.58g/L。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種使用該溶血素的方法，和適當(dāng)?shù)难合♂寗┡浜嫌糜跍y定血液中的血紅蛋白濃度或同時(shí)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)。
該方法包括用適合的血液稀釋劑稀釋血樣、將足量的溶血素組合物與稀釋的樣品混合、在預(yù)定的用于血紅蛋白濃度測定的波長下用光度法測定該樣品、同時(shí)在裝備有直流阻抗測定裝置的血液分析儀上計(jì)數(shù)白細(xì)胞或分別別計(jì)數(shù)白細(xì)胞至少兩個(gè)亞群。
將抗凝血或毛細(xì)血通過合適的稀釋液稀釋，將合適量的上述溶血素與稀釋后的樣品混合(手工或者儀器自動(dòng))，根據(jù)儀器的需要，稀釋比從125∶1(總試劑量相對(duì)于血液)到大約500∶1，然后在添加溶血素4秒以后，在儀器的光度計(jì)上以特定的波長測定樣品混合物的吸光度，也可以通過手工引入裝備有光度計(jì)和具有阻抗測定裝置的血液分析儀中，測定血紅蛋白濃度或者同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。
更優(yōu)選的是在進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)根據(jù)所獲得體積大小直方圖進(jìn)行白細(xì)胞亞群分類。
在最優(yōu)選的方式下，白細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，包括淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞和粒細(xì)胞，其中的中間細(xì)胞包含單核細(xì)胞嗜酸細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。
采用以上的方案，實(shí)現(xiàn)了使用不含有氰化物、沒有毒性的溶血素、能夠采用可靠方法測定血紅蛋白，并且同時(shí)白細(xì)胞能被分成至少兩個(gè)亞群用于分別記數(shù)。


圖1是用本發(fā)明溶血素的光譜圖。
圖2是本發(fā)明的溶血素在邁瑞公司生產(chǎn)的BC-3000+血液分析儀上所得到的白細(xì)胞直方圖。
圖3是本發(fā)明的溶血素以作為稀釋液時(shí)的紫外-可見吸收光譜圖。
圖4是本發(fā)明實(shí)施例2的溶血素在邁瑞公司生產(chǎn)的BC-3000+血液分析儀上所得到的白細(xì)胞直方圖。
具體實(shí)施例方式
一般來說，要用光度測定法測定血樣中的總血紅蛋白濃度，必須使用溶血試劑溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白，然后把血紅蛋白轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的色原，這種色原可以在預(yù)定的波長白紫外光譜發(fā)現(xiàn)和測定。對(duì)于定量和精確的測定，所形成的復(fù)合物要穩(wěn)定，至少在測定的時(shí)間范圍內(nèi)穩(wěn)定。紅細(xì)胞的溶解可以通過酸溶解、滲透溶解和使用各種天然以及合成的表面活性劑完成。釋放的血紅蛋白包含各種形式，如氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、碳氧血紅蛋白等、大多數(shù)把血紅蛋白轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定包原的有效方法是提供配體，該配體對(duì)血紅素鐵具有高親和性以形成穩(wěn)定的血紅蛋白復(fù)合物。這已用氰化正鐵血紅蛋白方法成功地證明，其中氰陰離子對(duì)血紅素鐵具有極高的親和性。術(shù)語血紅蛋白復(fù)合物和血紅蛋白色原在本發(fā)明上下文中可以互換使用。通常，在缺少高親和性配體的情況下，所形成的血紅蛋白色原不十分穩(wěn)定。其吸光度有變化，并且在大多數(shù)情況下隨時(shí)間衰減。在這種情況下，分析方法不可靠(即使很好地監(jiān)控并校正降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)因?yàn)樯赡軐?duì)環(huán)境(如溫度和樣品制備條件等)十分敏感、當(dāng)提供了適合的血紅蛋白配體時(shí)，血紅蛋白轉(zhuǎn)變可以是定量的，形成的血紅蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性確保分析方法的可靠性。
配體的選擇取決于要完成的分析，例如，僅用于血紅蛋白測定，或用于多個(gè)診斷分析(如血紅蛋白測定同時(shí)結(jié)合白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群分別計(jì)數(shù))。如果配體不與其它分析相容，對(duì)于血紅蛋白測定來說極好的配體可能不適合于后者的應(yīng)用。Sakata在其文獻(xiàn)中提供了一種可以準(zhǔn)確測定血紅蛋白的方法，用陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑溶解紅細(xì)胞釋放血紅蛋白，并且試劑中的陰離子表面活性劑SLS和血紅蛋白形成SLS-血紅蛋白復(fù)合物，在539nm處和572nm處有峰值而且具有很高的時(shí)間穩(wěn)定性，但是其一個(gè)很大的缺點(diǎn)是不能同時(shí)分類計(jì)數(shù)白細(xì)胞，因?yàn)橛梅请x子表面活性劑溶解紅細(xì)胞的時(shí)候也很大程度上將白細(xì)胞破壞了。另一個(gè)缺點(diǎn)就是時(shí)間很長，據(jù)其文獻(xiàn)需要5-10分鐘，這在用儀器測定的方法中是不可容忍的。
一般來說，陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑是不可配合使用的，因?yàn)樗鼈儠?huì)形成陰離子-陽離子復(fù)合物，降低溶解性，在溶液里形成沉淀或者乳化，從而無法使用。但是在本發(fā)明中，通過適當(dāng)?shù)膬烧叩谋壤?，形成的?fù)合物不至于形成沉淀，而且加入增溶劑以后復(fù)合物溶解，在陽離子表面活性劑溶解紅細(xì)胞釋放血紅蛋白以后，由于選定陰離子表面活性劑和血紅蛋白的親和力要高得多，奪取了陰陽離子表面活性劑復(fù)合物中的陰離子表面活性劑，形成新的表面活性劑-血紅蛋白復(fù)合物，通過精密控制兩者的濃度，可以實(shí)現(xiàn)血紅蛋白測定。另一方面陽離子表面活性劑破壞白細(xì)胞膜，使白細(xì)胞核裸露，通過體積測定的儀器來進(jìn)行大小分群。
試驗(yàn)還表明，非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的加入，使得陰離子表面活性劑-血紅蛋白復(fù)合物形成的速度大大增加，在3-5秒內(nèi)形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，使得用儀器測定成為可能。
本發(fā)明無氰化物溶血素為至少一種足以溶解紅細(xì)胞并釋放量血紅蛋白的量的表面活性劑，該表面活性劑選自由下列物質(zhì)組成的組1)至少一種陽離子表面活性劑，該表面活性劑在合適的濃度范圍內(nèi)用特定的儀器能夠?qū)⑷祟惖募t細(xì)胞全部溶解并且將白細(xì)胞分成兩個(gè)亞群。包括季銨鹽、吡啶鹽、氧化胺型季銨鹽。
其中式中的R1、R5是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，R2、R3、R4都是碳原子數(shù)1-5的短鏈烷基、烯基、炔基或者氫原子，x-是任何一種陰離子。
2)至少一種陰離子表面活性劑，能在合適的濃度下和血紅蛋白結(jié)合形成一種色原，從而測定其濃度，該陰離子表面活性劑具有以下結(jié)構(gòu)R1-SO4-X+式中R1是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，x+是任何堿金屬的陽離子或者銨離子。
3)至少一種非離子表面活性劑，具有以下結(jié)構(gòu) 其中R1是碳原子數(shù)是6-8的長鏈烷基、烯基或炔基，n為4-40的整數(shù)。
在優(yōu)選的方式中，該組合可以用于同時(shí)提供總血紅蛋白濃度的測定、白細(xì)胞的計(jì)數(shù)和血樣中白細(xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)，其中所說的白細(xì)胞被區(qū)分成包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的三個(gè)亞群。
在溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑中，季銨鹽是優(yōu)選的。在溶血素組合物中的表面活性劑的濃度需要足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白、同時(shí)保存白細(xì)胞核不至于被破壞。為了對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，不需要使白細(xì)胞膜保持完整。一般來說，使用上述的本發(fā)明溶血素組合物中的溶血性表面活性劑時(shí)，當(dāng)紅細(xì)胞完全溶解和破壞時(shí)，白細(xì)胞膜部分溶解。白細(xì)胞留下的核使得可以使用直流阻抗方法計(jì)數(shù)白細(xì)胞并將白細(xì)胞亞群分別成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞、在溶血素組合物中的表面活性劑濃度是大約2g/L至大約100g/L，優(yōu)選地是大約15g/L至大約60g/L。
在溶血素中陰離子表面活性劑的濃度要足以使所有的血紅蛋白都形成陰離子表面活性劑-血紅蛋白復(fù)合物。如果陰離子表面活性劑的量不足，使形成的復(fù)合物色原不穩(wěn)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中陰離子表面活性劑的濃度在0.1-10g/L范圍，優(yōu)選0.5-3g/L，最為合適。
在本發(fā)明中，我們使用的非離子表面活性劑的濃度范圍視所采用的具體的種類而定，但范圍在0.5-5g/L范圍內(nèi)，經(jīng)過試驗(yàn)證明低于0.5g/L時(shí)，起不到應(yīng)有的作用，而高于5g/L時(shí)，就會(huì)對(duì)白細(xì)胞的分類測定，甚至血色素的測定產(chǎn)生顯著影響，甚至無法分類。
本發(fā)明還涉及使用上述無氰化物溶血素組合物測定血樣中的總血紅蛋白濃度、或同時(shí)對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)或?qū)Π准?xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)的方法。
將抗凝血或外周血通過合適的稀釋液稀釋，將合適量的上述溶血素與稀釋后的樣品混合(手工或者儀器自動(dòng))，根據(jù)儀器的需要，稀釋比從125∶1(總試劑量相對(duì)于血液)到大約500∶1，然后在添加溶血素4秒以后，在儀器的光度計(jì)上以特定的波長測定樣品混合物的吸光度，也可以通過手工引入裝備有光度計(jì)和具有阻抗測定裝置的血液分析儀中，測定血紅蛋白濃度或者同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，更優(yōu)選的是在進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)根據(jù)所獲得體積大小直方圖進(jìn)行白細(xì)胞亞群分類。在最優(yōu)選的方式下，白細(xì)胞可以分成三個(gè)亞群，包括淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞和粒細(xì)胞，其中的中間細(xì)胞包含單核細(xì)胞嗜酸細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。
具體來說，我們采用邁瑞公司生產(chǎn)BC-3000血液分析儀，取13ul靜脈抗凝血，經(jīng)過3.5ml稀釋液稀釋以后，加入0.5ml本發(fā)明所述的溶血素，在白細(xì)胞通道進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白分析，得出的結(jié)果的直方圖如附圖2所示。
本發(fā)明的溶血素組合物和使用該組合物的方法提供了精確的血紅蛋白測定、精確的白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及白細(xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)。表1說明了該溶血素在使用邁瑞公司生產(chǎn)BC-3000血液分析儀測定血紅蛋白濃度方面和五分類血液分析儀GENS的結(jié)果高度相關(guān)性。在BC-3000上獲得的血紅蛋白濃度和在相同的儀器上使用經(jīng)典的溶血素所獲得的結(jié)果之間具有極好的相關(guān)性。表3說明了在BC-3000上獲得的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和在相同的儀器上使用該儀器配套的溶血素所獲得的結(jié)果之間具有極好的相關(guān)性。
表1本發(fā)明的溶血素結(jié)果和Coulter公司的GENS結(jié)果的相關(guān)系數(shù)。

每次試驗(yàn)的樣本數(shù)目在40-50之間。
本發(fā)明的溶血素組合物提供了不同的病人樣本的精確的血紅蛋白測定。在我們使用的樣本中，有70％是來自各科的臨床病人，有感染內(nèi)科、血液科、腫瘤科等其中有的來自血液科病人的血樣含有不同類型的異常血紅蛋白，然而用本發(fā)明的溶血素和方法測定結(jié)果與用常用的氰化物一Hgb方法也有著高度的相關(guān)性(在邁瑞公司BC-3000上測定相關(guān)系數(shù)為0.99以上見表1)，這表明各種臨床樣品的總血紅蛋白濃度都可以通過使用本發(fā)明的溶血素組合物測定。
一般來說，包含上述陰離子表面活性劑配體和表面活性劑的本發(fā)明溶血素組合物可以在非常大范圍的pH值內(nèi)測定血樣的總血紅蛋白濃度。優(yōu)選地，一種或幾種季按鹽與任何有機(jī)配體的結(jié)合用于提供通過DC阻抗測定方法測定血樣中的總血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。更優(yōu)選地，一種或幾種季按鹽與和白細(xì)胞差別分析相容的有機(jī)配體的結(jié)合用于提供血樣的總血紅蛋白濃度的測定、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞亞群的分別計(jì)數(shù)。在最優(yōu)選的方式中，白細(xì)胞被分成三個(gè)亞群，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
無氰化物溶血素組合物和使用該組合物的方法與現(xiàn)有技術(shù)的血紅蛋白測定方法相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明使得可以在無氰化物的條件下精確測定血樣中的血紅蛋白濃度，并確定白細(xì)胞數(shù)量或?qū)准?xì)胞亞群分別成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。溶血素組合物將存在于血樣中的血紅蛋白在大約5秒后迅速轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的色原，使得可以進(jìn)行快速自動(dòng)分析。血紅蛋白復(fù)合物一旦形成，在測定時(shí)期是很穩(wěn)定的。
本發(fā)明的溶血素組合物可以與許多適合的血液稀釋劑一起使用。我們采用配方陽離子表面活性劑為十二烷基三甲基溴化銨其濃度是25g/L，陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SLS)其濃度為1.5g/L，非離子表面活性劑為乳化劑OP其濃度為0.58g/L的溶血素，使用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖鹽溶液和商業(yè)血液稀釋劑由邁瑞公司生產(chǎn)的M30稀釋液，由上述方法處理的全血樣，如圖3所示的圖譜。用這兩種稀釋劑，基本上形成了相同的血紅蛋白色原，可以在540nm下測定。
不同于以前的試劑，本發(fā)明的溶血素組合物具有寬范圍的pH值，以前的中性和堿性試劑不可能使用這種化學(xué)物質(zhì)用于血紅蛋白的測定。Sakata在美國專利號(hào)5,242,832中說明如果pH值是3.0或更低，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加，這樣使白細(xì)胞的測定變得困難。圖2顯示了按照本發(fā)明的方法使用實(shí)施例的溶血素組合物(M30作為稀釋劑)所獲得的白細(xì)胞亞群分布直方圖。
白細(xì)胞清楚地分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
另一種使用表面活性劑穩(wěn)定血紅蛋白的功能的方式是，將其作為一個(gè)獨(dú)立的成分添加到稀釋后的血液中，提前或者然后加入可以溶血的陽離子表面活性劑，釋放出的血紅蛋白仍然可以和陰離子表面活性劑結(jié)合形成復(fù)合物而測定。
如果不使用稀釋液直接使用溶血素溶解血樣，那么可以在一定比例下大范圍調(diào)節(jié)溶血素各化學(xué)成分的濃度，并且可以認(rèn)為加入合適的電解質(zhì)使之達(dá)到合適的電導(dǎo)率，適合特定的粒子分析儀器使用，如果這樣使用，組合物的濃度范圍應(yīng)該和溶血素與稀釋血樣配合后的最終濃度相同。
溶血素可以包含其他可有可無的添加劑，例如無機(jī)和有機(jī)的鹽類，防腐劑，抗氧化劑以及其他所有不影響血紅蛋白測定和白細(xì)胞記數(shù)或分類記數(shù)的化學(xué)成分。
另一種使用表面活性劑穩(wěn)定血紅蛋白的功能的方式是，將其作為一個(gè)獨(dú)立的成分添加到稀釋后的血液中，提前或者然后加入可以溶血的陽離子表面活性劑，釋放出的血紅蛋白仍然可以和陰離子表面活性劑結(jié)合形成復(fù)合物而測定。
實(shí)施例1按照下列比例配成溶液1、十二烷基硫酸鈉 5g2、十二烷基三甲基溴化銨 25g3、聚乙二醇辛基苯基醚 5ml4、蒸餾水 11以G4砂濾器循環(huán)過濾，以適合的血液分析儀，或者其他的粒子分析儀器監(jiān)控空白記數(shù)值使之符合空白記數(shù)要求。
移取13ul全血加入到3.5ml稀釋液中，攪拌均勻后加入0.5ml溶血素，在BC系列血液分析儀上測定。
圖1是稀釋血加入溶血素后馬上進(jìn)行掃描的紫外-可見吸收光譜圖。在540nm處有吸收峰。
圖2是本發(fā)明的溶血素在邁瑞公司生產(chǎn)的BC-3000+血液分析儀上所得到的白細(xì)胞直方圖。
圖3是本發(fā)明的溶血素以作為稀釋液時(shí)的紫外-可見吸收光譜圖。
實(shí)施例2按照下列比例配成溶液1、十六烷基三甲基氯化銨 10g2、十二烷基硫酸鈉 1.5g3、乳化劑OP 0.58g4、雙蒸水 11以G4砂濾器循環(huán)過濾，以適合的血液分析儀，或者其他的粒子分析儀器監(jiān)控空白記數(shù)值使之符合空白記數(shù)要求。
以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋劑稀釋血樣，加入上述配方的溶血素，測定吸收紫外-可見吸收光譜如圖3所示，同時(shí)以預(yù)稀釋的模式用血液分析儀進(jìn)行分析，得出的直方圖如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種無氰化物溶血素，為包含表面活性劑物質(zhì)的水溶液，其特征在于該表面活性劑為由下列物質(zhì)組成的組1)可以和血色素配合的陰離子表面活性劑，選自烷基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽以及烷基硫酸鹽，2)能溶解紅細(xì)胞的陽離子表面活性劑，選自季銨鹽、吡啶鎓鹽、氧化胺型季銨鹽，3)起到增溶作用的非離子表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無氰化物溶血素，其特征在于該無氰化物溶血素水溶液中表面活性劑選自由下列物質(zhì)組成的組1)至少一種陽離子表面活性劑，該表面活性劑在合適的濃度范圍內(nèi)用特定的儀器能夠?qū)⑷祟惖募t細(xì)胞全部溶解并且將白細(xì)胞分成兩個(gè)亞群；包括季銨鹽、吡啶鎓鹽、氧化胺型季銨鹽等； 式a 式b 式c其中式a、式b、式c中的R1、R5是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，式a、式c中R2、R3、R4都是碳原子數(shù)1-5的短鏈烷基、烯基、炔基或者氫原子，x-是任何一種陰離子。2)至少一種陰離子表面活性劑，能在合適的濃度下和血紅蛋白結(jié)合形成一種色原，從而測定其濃度，該陰離子表面活性劑具有以下結(jié)構(gòu)R1-SO4-X+式中R1是碳原子數(shù)是8-18的長鏈烷基、烯基或炔基，x+是任何堿金屬的陽離子或者銨離子。
3)至少一種非離子表面活性劑，具有以下結(jié)構(gòu) 其中R1是碳原子數(shù)是6-8的長鏈烷基、烯基或炔基，n為4-40的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無氰化物溶血素，其特征在于陽離子表面活性劑濃度是大約2g/L至大約100g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無氰化物溶血素，其特征在于陽離子表面活性劑濃度是大約15g/L至大約60g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無氰化物溶血素，其特征在于陰離子表面活性劑的濃度在0.1-10g/L范圍。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無氰化物溶血素，其特征在于陰離子表面活性劑的濃度優(yōu)選0.5-3g/L，最為合適。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無氰化物溶血素，其特征在于非離子表面活性劑的濃度范圍在0.5-5g/L范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無氰化物溶血素，其特征在于陽離子表面活性劑濃度是25g/L，陰離子表面活性劑的濃度為1.5g/L，非離子表面活性劑的濃度為0.58g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的無氰化物溶血素，其特征在于陽離子表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨的濃度是25g/L，陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SLS)的濃度為1.5g/L，非離子表面活性劑乳化劑OP的濃度為0.58g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無氰化物溶血素，其使用方法為1)將抗凝血或毛細(xì)血通過合適的稀釋液稀釋；2)用手工或者自動(dòng)儀器，將合適量的上述溶血素與稀釋后的樣品混合，將紅細(xì)胞溶解并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，根據(jù)儀器的需要；3)稀釋比即總試劑量相對(duì)于血液從125∶1到大約500∶1；4)然后在添加溶血素4秒以后，在儀器的光度計(jì)上以特定的波長測定樣品混合物的吸光度，也可以通過手工引入裝備有光度計(jì)和具有阻抗測定裝置的血液分析儀中，測定血紅蛋白濃度或者同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；5)更優(yōu)選的是在進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)根據(jù)所獲得體積大小直方圖進(jìn)行白細(xì)胞亞群分類。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測定血樣中總血紅蛋白濃度(人工或自動(dòng))及用于同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的溶血素組合物以及使用方法。提供了一種采用可靠方法測定血紅蛋白的溶血素，并且同時(shí)白細(xì)胞能被分成至少兩個(gè)亞群用于分別記數(shù)。本發(fā)明的另一目的是提供使用該溶血素的方法。本發(fā)明無氰化物溶血素的技術(shù)方案為至少一種足以溶解紅細(xì)胞并釋放量血紅蛋白的量的表面活性劑組至少一種陽離子表面活性劑；至少一種陰離子表面活性劑；至少一種非離子表面活性劑。采用以上的方案，實(shí)現(xiàn)了使用不含有氰化物、沒有毒性的溶血素、能夠采用可靠方法測定血紅蛋白，并且同時(shí)白細(xì)胞能被分成至少兩個(gè)亞群用于分別記數(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1490622SQ0314021
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月20日
發(fā)明者徐祖越 申請(qǐng)人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司