專利名稱：突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括突變體肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎鏈球菌溶血素蛋白質(zhì)的免疫原性組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌為引起侵襲性疾病如肺炎、腦膜炎和菌血癥的重要病原體。甚至在可自由獲得有效抗生素療法的地區(qū)，住院患者中肺炎球菌性肺炎的死亡率可高達(dá)19％。發(fā)展中國(guó)家中，每年超過(guò)3百萬(wàn)5歲以下的兒童死于肺炎，其中肺炎鏈球菌為最常見(jiàn)的病原體。肺炎鏈球菌還引起不太嚴(yán)重，但非常普遍的感染如中耳炎和鼻旁竇炎，其對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家中的健康-護(hù)理費(fèi)用具有顯著的影響。中耳炎在幼童中尤其重要，而鼻旁竇炎感染兒童和成人。
來(lái)自Wyeth的七價(jià)多糖綴合物疫苗，在美國(guó)作為Prevnar銷售而在世界上其他國(guó)家作為Prevenar銷售，為目前有效預(yù)防肺炎鏈球菌感染的唯一有效的綴合物疫苗(Kyaw等.，2002；Hausdorff等.，2000)。該疫苗包括可能的90種中七種純化的鏈球菌莢膜多糖(血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F)(Kalin，1998)，每種都綴合至載體蛋白。所述疫苗的制備在美國(guó)專利4,673,574中描述(Anderson)。用于綴合莢膜多糖的蛋白質(zhì)為白喉類毒素CRM197，它提供嬰兒中該疫苗免疫原性的增強(qiáng)(Blum等.，2000；Katkocin，2000)。然而，每種肺炎鏈球菌血清型具有結(jié)構(gòu)不同的莢膜多糖，使得用一種血清型進(jìn)行的免疫趨向于不提供對(duì)大部分其他血清型的預(yù)防，雖然對(duì)疫苗相關(guān)的血清型存在一些交叉預(yù)防(Whitney等.，2003)。
血清型-特異性免疫的補(bǔ)充方法正在研究中。一種可能性為還利用物種共有的毒力因子如肺炎鏈球菌溶血素(Pneumolysin，PLY)，這是由所有肺炎鏈球菌的侵襲性株產(chǎn)生的53kD毒素(Paton等.，1993)。PLY可單獨(dú)使用或作為綴合至Prevnar中多糖的載體蛋白使用，提供增強(qiáng)的效力。Alexander等(1994)證實(shí)小鼠用PLY類毒素的免疫賦予對(duì)用9種不同肺炎鏈球菌血清型攻擊的免疫保護(hù)。已顯示PLY通過(guò)激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑(Paton等.，1984)以及誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡(Cockeran等.，2002；Kadioglu等.，2000)而刺激類似于肺炎鏈球菌感染的免疫應(yīng)答。
PLY屬于膽固醇結(jié)合性溶細(xì)胞素(CBC)組，其在形成產(chǎn)生溶解孔的大的30-50mer環(huán)狀結(jié)構(gòu)之前結(jié)合至宿主細(xì)胞膜的膽固醇(Palmer，2001；Jedrzejas，2001)?？仔纬傻臋C(jī)制不完全了解并且對(duì)事件的順序存在許多爭(zhēng)論(Boney等.，2000；Shepard等.，1998)。然而，形成孔的能力意味著天然的PLY為高毒性的，這對(duì)免疫原性組合物開(kāi)發(fā)是一個(gè)問(wèn)題。
雖然生產(chǎn)中所用的綴合方法使得PLY無(wú)毒，更好的是以無(wú)毒形式開(kāi)始。此外，有毒形式將難以用于非綴合免疫原性組合物的制備。PLY的毒性可通過(guò)定點(diǎn)誘變顯著降低以產(chǎn)生PLY類毒素，稱為Pneumolysoids(Paton，1996)。
存在各種這類類毒素并且已顯示其獨(dú)立或在綴合至多糖時(shí)給小鼠對(duì)有毒力的2型D39肺炎鏈球菌攻擊提供免疫保護(hù)(Paton等.，1991；Alexander等.，1994)。之前大多數(shù)突變?cè)诮咏麮′末端的高度保守的11個(gè)氨基酸區(qū)域中產(chǎn)生(Mitchell等.，1992；Berry等.，1995)。已顯示該位點(diǎn)參與結(jié)合宿主細(xì)胞(de los Toyos等.，1996)。國(guó)際專利申請(qǐng)WO 90/06951中描述了PLY許多這類突變形式；該出版物中描述的每一突變接近蛋白質(zhì)的C′末端。
PLY另外的問(wèn)題為其在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)聚集，這是PLY用于免疫原性組合物中必須解決的問(wèn)題。據(jù)信PLY的聚集與參與孔形成的PLY的寡聚化有關(guān)。本發(fā)明因此試圖降低或消除PLY-PLY的相互作用(寡聚化)，使得降低大規(guī)模生產(chǎn)期間的聚集可能性，由此產(chǎn)生PLY很容易純化的形式。
Toyos等(1996)描述了PLY不同區(qū)域單克隆抗體(mAb)的形成以及完整毒素和‘蛋白酶K切口’形式的探測(cè)。蛋白酶K切割PLY成37kD和15kD的片段?？贵wmAb PLY 4僅識(shí)別完整的PLY，而不識(shí)別這些片段，表明針對(duì)該mAb的PLY上的表位位于切口區(qū)域內(nèi)。當(dāng)PLY與mAb PLY 4預(yù)溫育，隨后添加至脂質(zhì)體中時(shí)，該毒素不再在脂質(zhì)體膜上形成孔。這暗示mAb PLY 4封閉的位點(diǎn)(認(rèn)為為天冬酰胺N143區(qū)域)為負(fù)責(zé)與其他PLY單體相互作用以形成寡聚體孔的位點(diǎn)。如Hugo等1986證實(shí)的，鏈球菌屬的鏈球菌溶血素O的寡聚化也可由mAb阻斷。是否抗體通過(guò)結(jié)合至寡聚化位點(diǎn)而直接阻止寡聚化或是否存在空間阻礙毒素單體相互作用的關(guān)聯(lián)是未知的。
單克隆抗體PLY 4已由Suarez-Alvarez等(2003)進(jìn)一步表征并且提示mAb PLY 4的表位比最初Toyos等在1996提議的N143區(qū)域更下游。目前看來(lái)識(shí)別位點(diǎn)是構(gòu)象依賴性的并且在氨基酸E151-Y247內(nèi)而非N143區(qū)域內(nèi)。
之前本發(fā)明人建立了PLY內(nèi)的N142N143缺失和N143D替代作為了解該區(qū)域以及其在寡聚化中的作用的第一步。兩種突變體在溶血作用和孔形成(Search，2002)方面顯示與天然PLY相同的行為，提示未阻斷寡聚化，以及突變體的毒性維持不變。因此，之前產(chǎn)生的突變體PLY形式不顯示降低的毒性或降低的寡聚化，提示這些突變無(wú)助于免疫原性組合物的生產(chǎn)。
發(fā)明概要本發(fā)明廣泛涉及包括突變體肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌溶血素蛋白質(zhì)的免疫原性組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。
因此在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得該突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。該突變可位于野生型序列的氨基酸144至151的區(qū)域內(nèi)。
該突變可以是在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代。
該突變體PLY蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
例如，該突變體PLY蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)，例如氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的缺失。
任何上述突變體PLY蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
分離的突變體PLY蛋白質(zhì)具有對(duì)哺乳動(dòng)物降低的毒性。此典型地為與野生型PLY蛋白質(zhì)相比具有降低的成孔活性的結(jié)果，其可與降低的溶血活性和/或降低的寡聚化活性有關(guān)。希望的但不是必須的是，該突變體PLY蛋白質(zhì)具有降低的寡聚化活性以利于純化和隨后的操作。
在另外的方面，本發(fā)明涉及免疫原性綴合物(conjugate)，其包括(a)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)；和(b)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得該突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。該突變可位于野生型序列的氨基酸144至151的區(qū)域內(nèi)。
該突變可以是野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失。
該免疫原性綴合物的突變體PLY蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
例如，該免疫原性綴合物的突變體PLY蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)，例如氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的缺失。
任何上述免疫原性綴合物的前述突變體PLY蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
免疫原性綴合物的糖、低聚糖或多糖可源于肺炎鏈球菌。
在另外的方面，本發(fā)明提供分離和純化的核酸序列，它包括核酸序列，該核酸序列a)編碼突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得該突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；或b)與a)中定義的核酸序列互補(bǔ)。
該突變可位于野生型序列的氨基酸144至151的區(qū)域內(nèi)。
該突變可以是野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失。
該核酸序列可編碼突變體PLY蛋白質(zhì)，其通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
例如，該核酸序列可編碼突變體PLY蛋白質(zhì)，其通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)，例如氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失。
由該核酸序列編碼的突變體PLY蛋白質(zhì)可以是上述任何蛋白質(zhì)，并且可進(jìn)一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供重組表達(dá)載體，其包括任何上述編碼突變體PLY蛋白質(zhì)的分離和純化的核酸序列，以及用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的重組宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)的方法，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得該突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低，該方法包括a)用如上所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細(xì)胞并且在允許所述突變體PLY蛋白質(zhì)被該宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)物回收突變體PLY蛋白質(zhì)。
仍然在另一個(gè)方面，提供免疫原性組合物，其包括a)未綴合形式或作為如上所述免疫原性綴合物一部分的分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
該突變可位于野生型序列的氨基酸144至151的區(qū)域內(nèi)。
該突變可以是野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失。
該組合物的分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
例如，該突變體PLY蛋白質(zhì)可通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的替代或缺失而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，例如氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失。
該免疫原性組合物可包含未綴合形式或作為如上所述免疫原性綴合物一部分的任何上述突變體PLY蛋白質(zhì)，其進(jìn)一步包括野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸的替代或缺失。
因此，該免疫原性組合物可包括a)免疫原性綴合物，它包括(i)源于鏈球菌屬，例如肺炎鏈球菌的糖、低聚糖或多糖；和(ii)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。該組合物可包括多個(gè)肺炎鏈球菌亞型的糖、低聚糖或多糖。
在另外的方面，本發(fā)明涉及用于哺乳動(dòng)物的預(yù)防方法，該方法包括給予受治療者哺乳動(dòng)物免疫原性組合物的步驟，該組合物包括a)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
該免疫原性組合物可包括a)免疫原性綴合物，它包括(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)；和(ii)如本文所述的分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明分離的突變體PLY蛋白質(zhì)或免疫原性綴合物在制備免疫原性組合物中的用途。本發(fā)明還提供制備免疫原性組合物的方法，包括將本發(fā)明的突變體蛋白質(zhì)或免疫原性綴合物與藥學(xué)可接受載體混合的步驟。
本發(fā)明的免疫原性組合物可用于細(xì)菌感染的預(yù)防或治療。尤其其可用于具有與PLY免疫交叉反應(yīng)的膽固醇結(jié)合性溶細(xì)胞素的細(xì)菌感染的預(yù)防或治療(參見(jiàn)例如Palmer，2001)；即該溶細(xì)胞素能被結(jié)合PLY的抗體結(jié)合。然而優(yōu)選細(xì)菌為鏈球菌，優(yōu)選肺炎鏈球菌。
在另外的方面，本發(fā)明提供用于醫(yī)學(xué)治療方法中的本發(fā)明的分離突變體PLY蛋白質(zhì)或免疫原性綴合物。
在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及免疫原性組合物的制備方法，該方法包括步驟提供如此處所述的分離的突變體PLY蛋白質(zhì)；和將該突變體蛋白質(zhì)綴合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)。上述方法中的突變體蛋白質(zhì)可綴合至肺炎鏈球菌多糖。該方法可包括另外的將由此獲得的綴合物與藥學(xué)可接受載體混合的步驟。
在另外的方面，本發(fā)明涉及篩選適合用于免疫原性組合物中的候選突變體PLY蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟提供突變體PLY蛋白質(zhì)；測(cè)試該突變體蛋白質(zhì)的溶血活性；測(cè)試該突變體PLY蛋白質(zhì)的寡聚化活性；和將該突變體PLY蛋白質(zhì)的溶血和寡聚化活性與非突變體蛋白質(zhì)的相比較。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示野生型肺炎鏈球菌溶血素的氨基酸序列；圖2顯示通過(guò)mAb PLY4檢測(cè)的PLY缺失突變體蛋白質(zhì)印跡；圖3顯示將WT PLY比較Δ6 PLY突變體的定量溶血測(cè)定的結(jié)果；圖4顯示將WT PLY比較Δ6 PLY突變體的細(xì)胞毒性測(cè)定的結(jié)果；圖5顯示W(wǎng)T PLY處理的紅細(xì)胞膜的電子顯微照片；圖6顯示用WT PLY或Δ6 PLY處理后肺組織中的IL-6水平；圖7顯示用WT PLY或Δ6 PLY處理后肺灌洗物中的IL-6水平；圖8顯示用WT PLY或Δ6 PLY處理后支氣管肺泡灌洗物中的總蛋白水平；圖9顯示響應(yīng)小鼠用WT PLY或Δ 6 PLY免疫的抗-PLY抗體水平；圖10顯示用WT PLY或缺失突變體ΔA146 PLY處理的SRBC(綿羊紅細(xì)胞)中與毒素濃度有關(guān)的溶血作用的程度。
圖11比較了WT PLY和突變體PLY W433F、Δ6 PLY、Δ7 PLY、Δ8 PLY和ΔA146 PLY的溶血活性；圖12顯示W(wǎng)T PLY和突變體PLY W433F、Δ6 PLY、Δ7 PLY、Δ8 PLY和ΔA 146 PLY對(duì)鼠L929成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性；圖1 3表明ΔA146 PLY不引起RBL-2H3肥大細(xì)胞的脫粒，而WT PLY引起脫粒；圖14顯示用野生型PLY或ΔA146 PLY處理后的中心體溫分析。
發(fā)明詳述
PLY為膽固醇結(jié)合性溶細(xì)胞素(CBC)組的成員。圖1中給出了野生型肺炎鏈球菌溶血素的氨基酸序列。圖1還顯示了該序列的GenBank標(biāo)識(shí)號(hào)，源于NCBI-GenBank Flat File Release 141.0，2004年4月15日。
本發(fā)明依賴許多PLY形式的鑒定，其在野生型PLY蛋白質(zhì)的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)具有突變，且如通過(guò)溶血活性和/或寡聚化的降低所反映的，其具有降低的毒性。該區(qū)域的共有序列如下VPARMQYEKITAHSMEQL(參見(jiàn)圖1)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及突變體PLY蛋白質(zhì)，其通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)的突變而不同于野生型蛋白質(zhì)。該區(qū)域的共有序列如下VPARMQYE(參見(jiàn)圖1)。
該突變體可在氨基酸144至161的區(qū)域內(nèi)，例如氨基酸144至151內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失。
因此在本發(fā)明的所有方面中，該突變體肺炎鏈球菌溶血素可在野生型序列氨基酸144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160或161中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，例如替代或缺失。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及突變體PLY蛋白質(zhì)，其通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。所述雙突變體的實(shí)例為包含氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145、丙氨酸146和精氨酸147、甲硫氨酸148和谷氨酰胺149或酪氨酸150和谷氨酸151的替代或缺失的那些。
這些突變體PLY蛋白質(zhì)自身與一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體一起用于免疫原性組合物中。
或者，這些突變體PLY蛋白質(zhì)綴合至來(lái)自相同或異種生物的糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)，以形成與一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體一起用于免疫原性組合物中的綴合物。因此，突變體PLY綴合的糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)可來(lái)自鏈球菌屬，例如肺炎鏈球菌。其可源于細(xì)菌莢膜。
以未綴合或綴合形式，包含在免疫原性組合物中的突變體PLY蛋白質(zhì)可用于預(yù)防或治療。
以未綴合或綴合的形式，該突變體PLY蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包含野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。這些進(jìn)一步的替代或缺失在Paton等的公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 90/06951中描述。
根據(jù)本發(fā)明的另外方面，提供包括如此處所述分離的突變體PLY蛋白質(zhì)的免疫原性組合物。在一實(shí)施方案中，該免疫原性組合物為肺炎鏈球菌免疫原性組合物。
該突變體PLY蛋白質(zhì)可保留在哺乳動(dòng)物中的免疫原性活性?！安溉閯?dòng)物中免疫原性的”指哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)將產(chǎn)生該突變體PLY蛋白質(zhì)的抗體，并且這些抗體將也識(shí)別野生型PLY蛋白質(zhì)。類似地，野生型PLY蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物抗體將也識(shí)別突變體PLY蛋白質(zhì)。優(yōu)選該突變體蛋白質(zhì)在人中為免疫原性的。優(yōu)選突變體PLY蛋白質(zhì)將刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生可結(jié)合野生型VPARMQYEKITAHSMEQL或VPARMQYE序列的抗體。
在一實(shí)施方案中，該突變位于參與野生型蛋白質(zhì)寡聚化的PLY蛋白質(zhì)的區(qū)域中。
不受理論的束縛，認(rèn)為該突變體PLY蛋白質(zhì)具有降低的毒性，這是和野生型PLY蛋白質(zhì)相比降低的孔形成活性的結(jié)果。據(jù)認(rèn)為這與降低的寡聚化活性和/或降低的溶血活性有關(guān)?？芍苯訙y(cè)量毒性。或者，可測(cè)量孔形成、寡聚化和溶血作用中的一種或多種以提供可能毒性的指示。
缺失和替代是可用于提供具有降低毒性的PLY突變體蛋白質(zhì)的突變的實(shí)例。非保守替代可能尤其適于降低PLY突變體的毒性，因?yàn)榫哂蟹潜Ｊ赝蛔兊耐蛔凅w比具有保守替代的突變體保留野生型功能水平的可能性更低。
保守替代可定義為氨基酸類別內(nèi)的替代和/或在如下所示的BLOSUM62矩陣中得正分的替代，因此非保守替代可定義為氨基酸類別之間的替代，或在BLOSUM62矩陣中不得正分的替代。
根據(jù)一種分類，氨基酸類別為酸性、堿性、不帶電荷極性的和非極性的，其中酸性的氨基酸為Asp和Glu；堿性氨基酸為Arg、Lys和His；不帶電荷的極性氨基酸為Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr；以及非極性氨基酸為Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys。
根據(jù)另一種分類，氨基酸類別為小親水的、酸性的/酰胺/親水的、堿性的、小疏水的和芳香族的，其中小親水的氨基酸為Ser、Thr、Pro、Ala和Gly；酸性的/酰胺/親水的氨基酸為Asn、Asp、Glu和Gln；堿性的氨基酸為His、Arg和Lys；小疏水的氨基酸為Met、Ile、Leu和Val；以及芳香族氨基酸為Phe、Tyr和Trp。
在BLOSUM62矩陣中得正分的保守替代如下
本發(fā)明的突變體肺炎鏈球菌溶血素蛋白質(zhì)優(yōu)選具有與圖1中所示野生型序列至少80％的氨基酸同一性。該突變體可具有與該野生型序列至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。
相對(duì)于參照序列的氨基酸序列百分比(％)同一性定義為，在比對(duì)序列和引入缺口(如果需要的話)以獲得最大百分比序列同一性后候選序列中與參照序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，而不考慮任何保守替代作為序列同一性的一部分。％同一性值可通過(guò)WU-BLAST-2(Altschul等.，Methods in Enzymology，266460-480(1996))確定。WU-BLAST-2利用若干搜索參數(shù)，大多數(shù)設(shè)為缺省值?？烧{(diào)參數(shù)設(shè)為下列值重疊跨度(overlap span)＝1、重疊分?jǐn)?shù)(overlapfraction)＝0.125、字閥值(word threshold)(T)＝11。％氨基酸序列同一性值通過(guò)由WU-BLAST-2確定的匹配相同殘基的數(shù)目除以參照序列殘基的總數(shù)(忽略由WU-BLAST-2引入?yún)⒄招蛄兄幸宰畲蠡葘?duì)得分的缺口)，乘以100而確定。
氨基酸百分比(％)相似性以和同一性同樣的方式定義，不同只是計(jì)數(shù)BLOSUM62矩陣中得分為正值的殘基。因此，也計(jì)數(shù)了不相同但具有相似性質(zhì)的殘基(例如保守替代的結(jié)果)。
氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)，例如氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)的氨基酸插入也可用于降低PLY突變體的毒性。例如，可利用1、2、3、4、5、10、15、20或更多個(gè)氨基酸的插入。然而，通常缺失和替代相對(duì)于插入是更優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兤茐囊吧捅砦坏目赡苄暂^??；這種破壞可降低突變體蛋白質(zhì)的免疫原性，這在免疫原性組合物中為不想要的。
在本發(fā)明的另一方面，突變體PLY蛋白質(zhì)綴合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)以形成免疫原性綴合物。在該方面，突變體PLY蛋白質(zhì)可保留其免疫原性，或可消除免疫原性。無(wú)論哪種情況，突變體PLY蛋白質(zhì)可用以增強(qiáng)綴合物中糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性。
這些糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)每種以任何合適的方式綴合至突變體PLY蛋白質(zhì)，所述方式包括但不限于(1)通過(guò)蛋白質(zhì)官能團(tuán)直接偶聯(lián)(例如，硫醇-硫醇鍵合、胺-羧基鍵合、胺-醛鍵合；酶直接偶聯(lián))；(2)胺的同雙功能偶聯(lián)(例如利用雙醛)；(3)硫醇的同雙功能偶聯(lián)(例如利用雙馬來(lái)酰亞胺)；(4)通過(guò)光活化試劑的同雙功能偶聯(lián)；(5)胺至硫醇的異雙功能偶聯(lián)(例如利用馬來(lái)酰亞胺)；(6)通過(guò)光活化試劑(例如β-羰基重氮(β-carbonyldiazo)家族)的異雙功能偶聯(lián)；(7)通過(guò)溴化氰活化或羧甲基化作用將胺反應(yīng)性基團(tuán)引入多糖或低聚糖中；(8)通過(guò)異雙功能化合物例如Maleimido-hydrazide將硫醇反應(yīng)性基團(tuán)引入到多糖或低聚糖中；(9)通過(guò)將疏水基團(tuán)引入蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)-脂類綴合和(10)通過(guò)將反應(yīng)性基團(tuán)引入脂類中的蛋白質(zhì)-脂類綴合。此外，考慮異雙功能的“非共價(jià)偶聯(lián)”技術(shù)如生物素-抗生物素蛋白相互作用。對(duì)于綴合技術(shù)的全面綜述，參見(jiàn)Aslam和Dent(1998)，在下文中通過(guò)引用整體引入。
綴合肽、多肽或蛋白質(zhì)至蛋白質(zhì)的另外的方法在2003年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/530，480和60/530，481中描述，并且兩者通過(guò)引用整體引入。
另外，Kuo等的美國(guó)專利5,565,204描述了用于將這類多糖綴合至野生型PLY蛋白質(zhì)的方法；該方法也適于將這類多糖綴合至本發(fā)明的突變體PLY蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的免疫原性組合物可以是綴合的免疫原性組合物。每種免疫原性組合物可包括一種或多種糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)，其可來(lái)自野生型PLY蛋白質(zhì)的來(lái)源生物(肺炎鏈球菌)。在非限制性實(shí)例中，這類組分可源于該生物的莢膜。
在一實(shí)施方案中，糖、低聚糖或多糖源于一種以上肺炎鏈球菌血清型；特定的血清型將取決于免疫原性組合物的目的用途以及這些血清型在靶群體中的流行程度。
或者，糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)源于異種生物(即，不同于肺炎鏈球菌的生物)。就糖、低聚糖或多糖來(lái)說(shuō)，多個(gè)血清型可獲自但不限于腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(例如來(lái)自血清型A、C、Y和W135)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。
在本發(fā)明的某些方面，突變體PLY蛋白質(zhì)綴合至肺炎鏈球菌的另一種肽、多肽或蛋白質(zhì)?；蛘?，突變體PLY蛋白質(zhì)綴合至來(lái)自異種生物，包括人的肽、多肽或蛋白質(zhì)。例如，突變體PLY蛋白質(zhì)綴合至另一種肽、多肽或蛋白質(zhì)，后者來(lái)自致病病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)，或(2)來(lái)自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，或(3)來(lái)自過(guò)敏原以干擾IgE的產(chǎn)生而減輕對(duì)過(guò)敏原的變應(yīng)性應(yīng)答，或(4)來(lái)自淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)以預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物宿主中以淀粉樣蛋白沉積為特征的疾病。
綴合至突變體PLY蛋白質(zhì)的APP部分可以是β-淀粉樣蛋白肽(也稱為Aβ肽)，其為(APP)內(nèi)部的39-43氨基酸片段，通過(guò)APP經(jīng)β和γ分泌酶(secretase)的加工產(chǎn)生。所述肽的實(shí)例為Aβ1-42肽，其具有下列氨基酸序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly TyrGlu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly SerAsn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala。
Aβ組分可以另外以綴合至突變體PLY蛋白質(zhì)的片段形式給予。所述片段的非限制性實(shí)例包括Aβ1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、3-7、3-8、3-9、3-10、3-11、1-10和1-12。綴合至PLY以外的蛋白質(zhì)的Aβ和其片段的用途在公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/27944和WO 00/72880中描述，其在此通過(guò)引用引入。
本發(fā)明另外的方面提供用于哺乳動(dòng)物預(yù)防或治療的方法，該方法包括給予受治療者哺乳動(dòng)物免疫原性組合物的步驟，該組合物包含具有如此處所述突變的分離的PLY蛋白質(zhì)，其中如此處所述該突變體PLY蛋白質(zhì)為未綴合的或綴合的。典型地，該方法用于一種或多種細(xì)菌物種或株系感染的預(yù)防或治療，所述細(xì)菌具有可與野生型肺炎鏈球菌溶血素免疫交叉反應(yīng)的膽固醇結(jié)合性溶細(xì)胞素，尤其為鏈球菌屬，并且尤其為肺炎鏈球菌。其他物種，以及其溶細(xì)胞素，包括產(chǎn)氣莢膜梭菌(產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素(Perfringolysin)O)、中間鏈球菌(中間鏈球菌溶血素(Intermedilysin))、蜂房類芽胞桿菌(蜂房類芽胞桿菌溶血素(Alveolysin))、炭疽芽孢桿菌(炭疽桿菌溶血素(Anthrolysin))、蠟狀芽胞桿菌(蠟狀芽胞桿菌溶血素(Cereolysin))、伊氏利斯特氏菌(伊氏利斯特氏菌溶血素(Ivanolysin)O)、諾氏梭菌(諾氏梭菌溶血素(Novyilisin))、Arcanobacterium pyogenes(Pyolysin)、斯氏利斯特氏菌(斯氏利斯特氏菌溶血素(Seeligeriolysin)O)、敗毒梭菌(敗毒梭菌溶血素(Septicolysin))、S.pyogenes(鏈球菌溶血素O)、豬鏈球菌(豬鏈球菌溶血素(Suilysin))、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng)溶血素)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(利斯特溶血素(Listeriolysin)O)、似馬鏈球菌(鏈球菌溶血素O)、狗鏈球菌(鏈球菌溶血素O)、蘇云金芽孢桿菌(蘇云金菌溶素O)、側(cè)胞芽胞桿菌(側(cè)胞芽胞菌溶素(Latersporolysin)O)、肉毒梭菌(肉毒梭菌溶血素(Botulinolysin))、肖氏梭菌(肖氏梭菌溶血素(Chauveolysin))、雙酶梭菌(雙酶梭菌溶血素(Bifermentolysin))、索氏梭菌(索氏梭菌溶血素(Sordeliilysin))(參見(jiàn)例如Palmer 2001)。
本發(fā)明免疫原性組合物的給藥方式，不管是給藥單獨(dú)的突變體PLY蛋白質(zhì)或作為免疫原性綴合物一部分的該蛋白質(zhì)，可以是通過(guò)任何合適的途徑，其投遞蛋白質(zhì)的免疫保護(hù)量至受治療者。一種所述途徑為腸胃外途徑，如通過(guò)肌內(nèi)的或皮下給藥。按照所需，也可采用其他的給藥方式，如粘膜途徑，如通過(guò)口服、直腸、口腔或鼻內(nèi)給藥，或通過(guò)其他的腸胃外途徑，即真皮內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。
通常，免疫原性組合物一般作為藥物制劑呈現(xiàn)，其包括適合給藥至人的生理學(xué)可接受的載體或賦形劑，例如無(wú)菌水或無(wú)菌等滲鹽水，以及任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等等。合適的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的并且很大部分取決于給藥途徑。本發(fā)明的免疫原性組合物還可包括生理學(xué)可接受的稀釋劑如無(wú)菌水或無(wú)菌等滲鹽水?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)方法制備制劑。
然而，應(yīng)理解的是用于任何具體受體哺乳動(dòng)物的特定劑量水平取決于各種因素，包括年齡、常規(guī)健康情況和性別；給藥時(shí)間；給藥途徑；與任何其他所給藥物的協(xié)同效應(yīng)；以及所尋求的保護(hù)程度。當(dāng)然，如有必要可以以合適的時(shí)間間隔重復(fù)給藥。
哺乳動(dòng)物可以是人，或可以是非人哺乳動(dòng)物。免疫原性組合物可以任何方便的方式例如上述那些而給予。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑。當(dāng)與免疫原或抗原一起給予時(shí)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為佐劑。已顯示許多細(xì)胞因子或淋巴因子具有免疫調(diào)節(jié)活性，并且因此可用作佐劑，包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利No.5,723,127，其在此通過(guò)引用引入)、13、14、15、16、17和18(以及其突變體形式)、干擾素-α、β和γ、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF；參見(jiàn)例如，美國(guó)專利No.5,078,996，其在此通過(guò)引用引入，以及ATCC登錄號(hào)39900)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和腫瘤壞死因子α和β。還可用于本發(fā)明中的其他佐劑包括趨化因子，包括而不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子如選擇蛋白，例如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白也可用作佐劑。再其他有效的佐劑包括而不限于，粘蛋白樣分子，例如CD 34、GlyCAM-1和MadCAM-1、整聯(lián)蛋白家族成員如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95、免疫球蛋白超家族成員如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3、共刺激分子如CD40和CD40L、生長(zhǎng)因子，包括血管生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、受體分子包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。其他的佐劑分子包括Caspase(ICE)。也參見(jiàn)國(guó)際專利公開(kāi)No.W098/17799和WO99/43839，通過(guò)引用引入此處。
用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答的合適的佐劑進(jìn)一步包括而不限于，MPLTM(3-O-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A；Corixa，Hamilton，MT)，其在美國(guó)專利No.4,912,094中描述，在此通過(guò)引用引入。還適于用作佐劑的為合成的脂質(zhì)A類似物或氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，其可從Corixa獲得(Hamilton，MT)，并且其在美國(guó)專利No.6,113,918中描述，在此通過(guò)引用引入。一種所述AGP為2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦?；?3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四?；?氨基]-β-D-吡喃葡糖苷，其亦稱為529(以前稱為RC529)。該529佐劑配制為水相形式或?yàn)榉€(wěn)定的乳劑。
其它佐劑包括礦物油和水乳劑、鋁鹽類(alum)，如氫氧化鋁和磷酸鋁等，Amphigen、Avridine、L121/角鯊烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普盧蘭尼克多元醇、胞壁酰二肽、滅活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTMQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham，MA)，其在美國(guó)專利No.5,057,540中描述，在此通過(guò)引用引入，以及從此產(chǎn)生的顆粒如ISCOMS(免疫刺激復(fù)合物)、結(jié)核分枝桿菌、細(xì)菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(美國(guó)專利No.6,207,646，其在此通過(guò)引用引入)、百日咳毒素(PT)或大腸桿不耐菌熱毒素(LT)，特別是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；參見(jiàn)例如，國(guó)際專利公開(kāi)No.WO 93/13302和WO 92/19265，在此通過(guò)引用引入。
還可用作佐劑的為霍亂毒素和其突變體，包括公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 00/18434中所述的那些(其中氨基酸位置29的谷氨酸由另一種氨基酸(不同于天冬氨酸)，優(yōu)選組氨酸替代)。類似的CT毒素或突變體在公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/098368中描述(其中單獨(dú)或與氨基酸位置68的絲氨酸由另一種氨基酸替代相結(jié)合，氨基酸位置16的異亮氨酸由另一種氨基酸替代；和/或其中氨基酸位置72的纈氨酸由另一種氨基酸替代)。其他CT毒素在公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/098369中描述(其中氨基酸位置25的精氨酸由另一種氨基酸替代；和/或氨基酸在氨基酸位置49處插入；和/或兩個(gè)氨基酸在氨基酸位置35和36處插入)。
可以任何合適的方式測(cè)定突變體PLY蛋白質(zhì)的溶血活性。本發(fā)明中所用的一種具體方案如下。在1.5ml 1 x PBS(Oxoid)中制備系列稀釋的毒素。等體積2％(vol/vol)的SRBC(綿羊紅細(xì)胞)添加至每種稀釋物并且37℃溫育30分鐘。溶液隨后在3000rpm離心5分鐘以沉淀SRBC膜或整個(gè)細(xì)胞。在OD540nm讀取上清的血紅蛋白含量并且對(duì)毒素濃度畫(huà)出曲線以提供與毒素濃度有關(guān)的溶血程度。0.5的OD540nm＝50％溶解。
優(yōu)選突變體蛋白質(zhì)在大于1μg/ml濃度時(shí)是非溶血的；更優(yōu)選在大于5μg/ml濃度；更優(yōu)選在大于10μg/ml，大于25μg/ml或大于35μg/ml；并且最優(yōu)選在大于50μg/ml時(shí)是非溶血的?？扇缟线M(jìn)行溶血作用的測(cè)定。
可以任何合適的方式確定成孔活性的測(cè)定；優(yōu)選的方案基于SRBC膜通過(guò)電子顯微鏡的肉眼檢查；這允許目測(cè)孔數(shù)。該方案在底下更詳細(xì)地描述。
可采用一些方法以分析成孔毒素的寡聚化活性。例如，如Morgan等(1993)所述的分析性超速離心可用于研究溶液中毒素的寡聚化。蔗糖密度梯度可用于結(jié)合毒素的紅細(xì)胞，其中在高分子量部分中觀察到寡聚物并且與其他的紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)分離(Bhakdi等.，1985；Saunders等.，1989)比較溶液中突變體PLY與野生型PLY的寡聚化活性的一種具體方法為利用以Search(2002)所述的類似方式進(jìn)行的熒光測(cè)定法。簡(jiǎn)要地，ANS(8-苯氨基-1-萘-磺酸)(KodakLtd.)作為外來(lái)熒光劑結(jié)合PLY。水溶液中，ANS在490nm具有弱的熒光(用JASCO FP-750分光熒光計(jì)讀取)但在疏水環(huán)境中ANS熒光增強(qiáng)。該現(xiàn)象允許在溶液中追蹤結(jié)合ANS的PLY單體的運(yùn)動(dòng)。脫氧膽酸鈉(BDH Laboratory提供)可用于誘導(dǎo)肺炎鏈球菌溶血素的寡聚化。當(dāng)野生型PLY加ANS用脫氧膽酸鈉處理時(shí)觀察到熒光的增強(qiáng)，因?yàn)槎舅刈跃喓蠈NS從親水環(huán)境帶至疏水環(huán)境。衍生的PLY，即用二硫代(雙)硝基苯甲酸鹽化學(xué)修飾的PLY維持單體，當(dāng)用脫氧膽酸鈉處理時(shí)不引起490nm處熒光的增強(qiáng)。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)，預(yù)計(jì)突變體PLY如果維持單體，將提供與衍生的PLY相同的結(jié)果。如果發(fā)現(xiàn)突變體PLY與WT PLY相同程度地發(fā)熒光則可推斷突變體PLY寡聚化。
可通過(guò)將突變體給予非人試驗(yàn)哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類而直接確定本發(fā)明的蛋白質(zhì)和組合物的毒性。突變體的毒性可與野生型蛋白質(zhì)的相比較。合適的毒性指標(biāo)包括存活率、動(dòng)物行為和炎癥(其可通過(guò)測(cè)量例如在支氣管肺泡灌洗物中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)測(cè)定)。合適的方案在實(shí)施例中描述如下。
本發(fā)明進(jìn)一步提供免疫原性組合物的制備方法，該方法包括步驟提供具有本文所述突變并且與野生型PLY蛋白質(zhì)相比具有降低的溶血活性的分離的突變體PLY蛋白質(zhì)，該突變體蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中為抗原性的；和將該突變體蛋白質(zhì)綴合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明另外的方面，提供分離和純化的核酸序列，它包括編碼突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)的分離的核酸序列，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低，或其與這樣的核酸序列互補(bǔ)，該突變體蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中為免疫原性的。本發(fā)明另外的方面提供與這樣的序列互補(bǔ)的核酸序列。
基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性核酸序列可源于蛋白質(zhì)序列。
本發(fā)明的核酸序列可包括另外的調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子或阻遏子(repressors)。核酸序列可包括在表達(dá)載體，例如質(zhì)粒、人工染色體、表達(dá)盒等等內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供用包括表達(dá)如此處所述突變體PLY蛋白質(zhì)的分離和純化的核酸序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的重組宿主細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞為原核細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供篩選適合用于免疫原性組合物中的候選突變體PLY蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟提供突變體PLY蛋白質(zhì)；測(cè)定該突變體蛋白質(zhì)的溶血活性；測(cè)定該突變體PLY蛋白質(zhì)的寡聚化活性；和將該突變體PLY蛋白質(zhì)的溶血和寡聚化活性與非突變體蛋白質(zhì)的相比較。
和該蛋白質(zhì)的非突變體形式相比具有降低的溶血和寡聚化活性的那些突變體蛋白質(zhì)很可能是用于制備免疫原性組合物的優(yōu)良候選者。
該方法可進(jìn)一步包括測(cè)試突變體蛋白質(zhì)在目的哺乳動(dòng)物中免疫原性活性的步驟。此包括將突變體蛋白質(zhì)與非突變體蛋白質(zhì)的抗體接觸的步驟。此可在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
此處所述的本發(fā)明涉及肺炎鏈球菌溶血素的缺失突變體，其呈現(xiàn)降低的毒性、溶血作用和孔形成。數(shù)據(jù)證實(shí)，和2μg/劑WT PLY相比，7μg/劑的Δ6 PLY對(duì)小鼠無(wú)害。
然而，本發(fā)明人圍繞N143殘基建立和此處所述的各種突變?nèi)匀豢杀挥胢Ab PLY 4進(jìn)行的Western印跡法識(shí)別，表明PLY上的該高抗原性位點(diǎn)未改變。通過(guò)表位掃描已顯示該突變位點(diǎn)為高抗原性的并且該位點(diǎn)被人血清和兔超免疫血清識(shí)別(Salo等.，1993)。
已證實(shí)產(chǎn)生的所有突變體為肺炎鏈球菌溶血素的形式。mAb PLY4識(shí)別突變體的事實(shí)表明該表位沒(méi)有改變至其對(duì)該抗體不再特異的程度。該區(qū)域內(nèi)的更大缺失產(chǎn)生不被mAb PLY4識(shí)別的突變體。由于該區(qū)域已鑒定為高免疫原性的(Salo等.，1993)，在已產(chǎn)生用于免疫原性組合物中的缺失中該位點(diǎn)保留完整是有用的。
此處所述的無(wú)毒突變體在提議參與寡聚化的位點(diǎn)之內(nèi)(de losToyos等.，1996)。一種純化的類毒素Δ6 PLY進(jìn)一步的體外表征顯示其對(duì)鼠成纖維細(xì)胞或紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。這提示由于已阻止了寡聚化(孔形成)，宿主細(xì)胞膜不被Δ6 PLY裂解。很容易看見(jiàn)用WT PLY處理的SRBC膜上的孔，但在用Δ6 PLY處理的膜上沒(méi)有觀察到孔。將Δ6 PLY處理的膜固定至網(wǎng)格用于EM的顯像比較困難。此可能歸因于用Δ6 PLY的溶血測(cè)定法中所見(jiàn)的膜凝集。Δ6 PLY和SRBC的溶血測(cè)定法中觀察到的血細(xì)胞凝集作用提示Δ6 PLY單體仍結(jié)合宿主細(xì)胞膜。產(chǎn)生了Δ6 PLY的標(biāo)記形式，其允許結(jié)合宿主細(xì)胞膜的可視化。根據(jù)結(jié)合測(cè)定法(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)證實(shí)Δ6 PLY的確結(jié)合宿主細(xì)胞膜。Δ6PLY單體之間可能存在弱的親和力，允許單體的交聯(lián)但不是真正寡聚物的形成。除單體結(jié)合至紅細(xì)胞外，Δ6 PLY單體的交聯(lián)可產(chǎn)生96-孔平皿中觀察到的矩陣。認(rèn)為通過(guò)產(chǎn)生Δ6 PLY突變體，阻斷了寡聚化階段，但沒(méi)有消除宿主細(xì)胞的結(jié)合/識(shí)別。
該假設(shè)得到如下發(fā)現(xiàn)的支持如利用突變體和野生型蛋白質(zhì)的eGFP-標(biāo)記型所確定的，Δ146 PLY仍然能與細(xì)胞膜結(jié)合，而Δ146 PLY不在細(xì)胞膜中形成孔。反之，在細(xì)胞表面看到蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈，其可能是不能正確寡聚化形成孔的自締合蛋白質(zhì)。
用Δ6 PLY的體內(nèi)處理在處理后24小時(shí)不引起炎性細(xì)胞因子IL-6的增加。發(fā)現(xiàn)小鼠用WT PLY處理產(chǎn)生比鹽水對(duì)照和Δ6 PLY處理高10倍的IL-6。所述數(shù)據(jù)確定用Δ6 PLY的處理不誘導(dǎo)與天然PLY有關(guān)的炎性副作用。WT PLY處理在給藥部位產(chǎn)生局部的炎性反應(yīng)。支氣管肺泡灌洗物中該局部化IL-6的產(chǎn)生很可能來(lái)自募集的嗜中性粒細(xì)胞(Kadioglu，2000)和肺泡巨噬細(xì)胞，其比肺組織的上皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-6(Kerr，personal communication 2003)。
野生型PLY嚴(yán)重?fù)p傷肺完整性，但用Δ6 PLY處理的肺維持健康。WT PLY處理的小鼠導(dǎo)氣管中觀察到的大量總蛋白已表征為宿主蛋白質(zhì)的流入(Rubins & Janoff，1998)。之前PLY已參與緊密聯(lián)結(jié)的破壞(Rayner等.，1995)，允許宿主蛋白質(zhì)通過(guò)毛細(xì)管/導(dǎo)氣管屏障的破壞而‘滲漏’進(jìn)入導(dǎo)氣管。Δ6 PLY的低炎性應(yīng)答和對(duì)肺無(wú)破壞與Δ6PLY沒(méi)能力在宿主細(xì)胞膜中產(chǎn)生成孔性寡聚物相關(guān)聯(lián)。
還證實(shí)小鼠用WT PLY的處理引起持續(xù)的低體溫應(yīng)答，其在用Δ146PLY處理的動(dòng)物中未見(jiàn)到。
本發(fā)明的這些和其他方面將通過(guò)下列非限制性實(shí)施例以及參考附圖描述。
實(shí)施例實(shí)施例1肺類鏈球菌溶血素的定點(diǎn)誘變利用Quikchange位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene)產(chǎn)生野生型肺炎鏈球菌溶血素的八種雙氨基酸缺失。模板質(zhì)粒為高表達(dá)載體pKK233-3(Clontech Laboratories)，其中之前已插入PLY。用來(lái)缺失相關(guān)氨基酸(參見(jiàn)下面表1)的引物從Sigma-Genosys定購(gòu)。產(chǎn)生下列缺失以跨躍PLY的N143區(qū)域W134H135Q136D137Y138G139Q140U141N142N143V144P145A146R147M148Q149Y150E151；其中(Δ1)W134H135、(Δ2)Q136D137、(Δ3)Y138G139、(Δ 4)Q140V141、(Δ5)V144P145、(Δ6)A146R147、(Δ7)M148Q149(Δ8)Y150E151(參見(jiàn)表2)。N142N143為之前產(chǎn)生的缺失(Search(2000))，其中蛋白酶K將PLY切成兩個(gè)片段。
表1用于在PLY基因內(nèi)產(chǎn)生雙氨基酸缺失的引物
注意-反向引物[rev]為正向[fwd]引物的精確反向互補(bǔ)物，所要缺失的堿基從所述引物除去。
表2PLY基因內(nèi)每種突變?nèi)笔У膲A基和缺失的氨基酸。
實(shí)施例2蛋白質(zhì)表達(dá)和純化野生型(WT)和突變體PLY如之前所述在大腸桿菌中表達(dá)并且收集(Mitchell等.，1989)。利用臺(tái)式(benchtop)細(xì)胞破壞器(ConstantSystems Ltd)破碎細(xì)胞并且通過(guò)在13,000rpm離心30分鐘獲得胞質(zhì)蛋白質(zhì)。用BioCAD(RTM)700E Perfusion Chromatography工作站(Applied Biosystems)，用苯基醚基質(zhì)(PE20，Applied Biosystems)以疏水作用層析純化PLY。洗脫組分在SDS-PAGE上電泳并且利用標(biāo)準(zhǔn)的方案考馬斯染色并且合并包含純PLY的級(jí)分。
實(shí)施例3定量溶血測(cè)定法采用基于Walker等(1987)報(bào)道的測(cè)定法利用1x磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(Oxoid)中2％(vol/vol)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)(E&O實(shí)驗(yàn)室)溶液評(píng)估純化的蛋白質(zhì)的溶血活性。利用minicon B15臨床樣品濃縮器(Millipore)濃縮合并的級(jí)分。在1.5ml 1x PBS(Oxoid)中制備連續(xù)稀釋的毒素。等體積2％(vol/vol)的SRBC添加至每種稀釋物中并且37℃溫育30分鐘。溶液隨后在3000rpm離心5分鐘以沉淀SRBC膜或整個(gè)細(xì)胞。在OD540nm讀取上清的血紅蛋白含量并且對(duì)毒素濃度畫(huà)出曲線以提供與毒素濃度有關(guān)的溶血作用程度。0.5的OD540nm＝50％溶解。
粗略的溶血分析揭示這些突變體的四種，缺失體5-8，為非溶血的。在定量溶血測(cè)定法中純化的Δ6 PLY(A146R147)的進(jìn)一步分析(圖3)揭示其在50μg/ml濃度時(shí)為非溶解性的而＜1μg/ml的WT PLY對(duì)SRBC為溶血的。觀察到純化的Δ5 PLY和Δ6 PLY的制劑在96-孔微量滴定平皿中凝集紅細(xì)胞而不裂解所述細(xì)胞；該作用為濃度依賴性的。
實(shí)施例4
電子顯微鏡檢查200μl 2％(v/v)sRBC溶液與等體積0.2mg/ml WT PLY或Δ6 PLY在37℃溫育20分鐘隨后用臺(tái)式離心機(jī)離心以沉淀SRBC膜。膜用dH2O洗滌3次并且重懸于100μl dH2O中。5μl懸浮液置于碳涂布的網(wǎng)格上并且用pH6.8的1％磷鎢酸負(fù)染。放大倍數(shù)為x25000，利用LEO 912Energy Filter Transmission電子顯微鏡。
在用0.2mg/ml WT PLY處理的紅細(xì)胞膜上顯現(xiàn)30-40μm的孔(圖5)。相反，用0.2mg/mlΔ6 PLY處理的膜上未顯現(xiàn)孔。
實(shí)施例5Western印跡法利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的PLY突變體。斑點(diǎn)與來(lái)自兔的多克隆抗-PLY血清或來(lái)自小鼠的單克隆PLY 4抗-PLY血清溫育(de los Toyos等.，1996)并且隨后與相關(guān)的HRP-連接的抗體(Amersham Life sciences)溫育和顯影。
在八種產(chǎn)生的雙氨基酸缺失物中，所有的缺失物都通過(guò)Western印跡法被多克隆抗-PLY血清(未顯示)以及由de los Toyos等(1996)制備的mAb PLY 4(圖2)識(shí)別。
實(shí)施例6L929殺死測(cè)定法L929鼠成纖維細(xì)胞(ECACC，no.85011425)在RPMI 1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清(FBS)(Gibco)中培養(yǎng)、傳代并且轉(zhuǎn)入96-孔平皿以及在37℃、5％CO2中溫育24h。在來(lái)自0.05mg/ml貯藏濃度的RPMI 1640培養(yǎng)基中制備純化的WT PLY和突變體Δ6 PLY毒素的連續(xù)稀釋物并且添加至L929成纖維細(xì)胞。利用MTT(溴化3-[4，5-二甲噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)(sigma)(其通過(guò)線粒體活性降解為紫色的甲 沉淀)評(píng)估與PLY溫育24h后的細(xì)胞存活力?？字兴兰?xì)胞的MTT將維持黃色。用MRX平皿讀數(shù)器(Dynatech Laboratories)在540nm讀取光密度。
進(jìn)行用L929鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定法以評(píng)估突變體Δ6PLY相比于WT PLY的毒性(圖4)。Δ6 PLY在30μg/ml濃度對(duì)成纖維細(xì)胞無(wú)毒，而＜500pg/ml的WT PLY為細(xì)胞毒性的。
實(shí)施例7體內(nèi)細(xì)胞因子分析八周大小的MF-1小鼠(Harlan)用2％氟烷/1.5％氧(1.5升/min)(Zeneca)稍微麻醉。純化的無(wú)LPS的WT PLY以2μg/劑經(jīng)鼻給予并且Δ6 PLY以50μl體積的7μg/劑(9.928ng LPS/劑)給予，鹽水組作為對(duì)照(每種處理n＝4)。利用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)Kinetic-QCL Kit(BioWhittaker)并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行而確定純化的毒素的脂多糖(LPS)含量。小鼠監(jiān)視至24h終點(diǎn)?；厥昭?、支氣管肺泡灌洗物和肺組織樣品并且如之前所述處理(Kerr等.，2002)。用商品化的細(xì)胞因子ELISA試劑盒測(cè)量白介素(IL)-6、干擾素(IFN)-γ(Pharmigen)和腫瘤壞死因子(TNF)-α(R&D systems，UK)的細(xì)胞因子水平。利用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford測(cè)定法測(cè)量灌洗物中的總蛋白水平。
使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)的非參數(shù)分析測(cè)量細(xì)胞因子和總蛋白水平，其中p＜0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。值利用Statview(AbacusConcepts)表示為中位值±1中位值絕對(duì)偏差(MAD)。
作為體內(nèi)毒性研究的一部分，確定總體癥狀。除了一只來(lái)自WT PLY組的小鼠外所有小鼠在處理后24小時(shí)存活。用Δ6 PLY和鹽水處理的小鼠比給予WT PLY的小鼠從麻醉狀態(tài)恢復(fù)得更快。Δ6 PLY處理小鼠的行為類似于鹽水對(duì)照的，但WT PLY處理的小鼠在6-小時(shí)期間呈現(xiàn)豎毛、呼吸困難和弓背姿勢(shì)，在24-小時(shí)時(shí)間范圍內(nèi)恢復(fù)。
然后，進(jìn)行炎性細(xì)胞因子的分析。IL-6的產(chǎn)生作為PLY對(duì)宿主毒性的標(biāo)記物而測(cè)量。相比Δ6 PLY處理(p＜0.05)和鹽水對(duì)照(p＜0.05)，WT PLY處理的小鼠支氣管肺泡灌洗物中存在超過(guò)10倍的IL-6水平提高(圖7)。用WT PLY的處理誘導(dǎo)宿主導(dǎo)氣管中的炎癥而用Δ6 PLY的處理沒(méi)有。WT處理的支氣管肺泡灌洗物中中位值IL-6水平為416pg/ml(335-2225pg/ml的范圍)而本底IL-6水平很低(59pg/ml)，用Δ6 PLY處理的小鼠中沒(méi)有提高(36pg/ml)(參見(jiàn)下面表3)。相比鹽水對(duì)照，WT處理的小鼠肺組織中觀察到IL-6水平的提高(p＜0.05)(圖6)。相比鹽水處理，Δ6處理的小鼠肺組織中沒(méi)有顯著的IL-6提高。給藥后24h各處理之間IFN-γ和TNF-α的測(cè)量不顯著(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
表3處理后24h支氣管肺泡灌洗物中IL-6的中位值(最小值-最大值)水平
測(cè)量支氣管肺泡灌洗物中的總蛋白水平(圖8)以評(píng)估肺完整性。相比健康的灌洗樣品，Δ6 PLY處理的小鼠未觀察到蛋白水平的提高。相比鹽水對(duì)照組0.23mg/ml的本底總蛋白水平，WT PLY處理的小鼠導(dǎo)氣管具有大量的蛋白質(zhì)(3.57mg/ml)(圖8)。
實(shí)施例8小鼠免疫原性研究進(jìn)行小鼠免疫原性研究以比較野生型PLY蛋白質(zhì)與Δ5、6和7突變體蛋白質(zhì)的應(yīng)答。所有免疫原性組合物在佐劑AlPO4(0.2mg)和MPL-SE(50μg)的組合存在下制備為5μg rPLY/劑。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的AlPO4(0.2mg)和MPL-SE(50μg)用作陰性對(duì)照。
每組5只的幾組雌性CD-1小鼠(6-8周大)經(jīng)腹膜免疫并且以2周時(shí)間間隔接受2次加強(qiáng)劑量。在第0、2、4和6周眶后收集血液。分析各個(gè)血清并且GMTs代表0.3的終點(diǎn)。第0周的抗體全部＜50。如表4所示，三種PLY突變體在小鼠中產(chǎn)生抗體，其可與野生型PLY產(chǎn)生的那些相比。
表4小鼠中對(duì)突變體重組肺炎鏈球菌溶血素(rPLY)的血清IgG抗體應(yīng)答
實(shí)施例9抗-PLY抗體的產(chǎn)生用野生型PLY或Δ6 PLY免疫的小鼠中產(chǎn)生的抗-PLY抗體的水平通過(guò)用20μg WT PLY或Δ6 PLY，每種和100μg Alum/100μl劑量一起最初的皮下注射來(lái)免疫M(jìn)F-1小、鼠而確定。小鼠隨后用相同的劑量加強(qiáng)兩次。在所述免疫方案的第47天收集血清并且分析抗-PLY IgG抗體?？贵w稀釋曲線作為針對(duì)血清系列稀釋的組平均值0D490nm±SEM而在圖9中顯示。血清最初稀釋至1/1000，因?yàn)楦鼭饪s的樣品導(dǎo)致所述底物完全飽和。圖9證實(shí)了響應(yīng)Δ6 PLY+Alum以及WT PLY+Alum產(chǎn)生了高水平的抗體，但僅Alum的對(duì)照組則沒(méi)有。
然后，評(píng)估抗-PLY抗體中和溶血活性的能力。觀察到Δ6 PLY和野生型PLY處理組中抗-PLY抗體完全中和2.5溶血單位(HU)PLY至溶血分析中1000-2400的滴度(其中中和能力表示為完全中和2.5HUPLY的抗體稀釋度的倒數(shù))(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。此證實(shí)PLY上的中和位點(diǎn)被響應(yīng)用Δ6 PLY+Alum和WT PLY+Alum免疫而產(chǎn)生的抗體所識(shí)別并且結(jié)合。由于Δ6 PLY為無(wú)毒的并且不誘導(dǎo)用野生型PLY處理觀察到的體內(nèi)水平細(xì)胞因子產(chǎn)生，因此用作免疫原性載體蛋白時(shí)，Δ6 PLY為比野生型PLY更有利的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例10單個(gè)氨基酸缺失的影響產(chǎn)生突變體PLY，其具有單氨基酸缺失氨基酸146的丙氨酸缺失(ΔA146 PLY)。如圖10所示，該單缺失(ΔA146)也產(chǎn)生PLY的非溶血形式。ΔA146 PLY在到達(dá)濃度＞100μg/ml時(shí)對(duì)SRBC為不溶血的，而野生型PLY在濃度＜1μg/ml為溶血的。該突變體的產(chǎn)生通過(guò)測(cè)序以及通過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)用多克隆抗-PLY血清的Western印跡得到證實(shí)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
實(shí)施例11PLY突變體與PLY W433F相比的溶血活性將缺失突變體Δ6、Δ7、Δ8 PLY和ΔA146 PLY對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性與WT PLY以及帶有替代W433F的PLY突變體相比，PLY W433F之前描述具有WT PLY僅1％的溶血活性(參見(jiàn)WO 90/06951)。
圖11表明，正如所料，W433F突變體顯示野生型PLY約1％的溶血活性。然而該缺失突變體完全不引起人紅細(xì)胞的裂解。
實(shí)施例12GFP-標(biāo)記的PLY結(jié)合紅細(xì)胞膜使用熒光顯微鏡檢查顯現(xiàn)用WT PLY和Δ6 PLY的eGFP-標(biāo)記形式處理的紅細(xì)胞。
通過(guò)用蒸餾水反復(fù)洗滌從人血液制備血影。從0.1ml人血液產(chǎn)生的血影與1ml 1x PBS中的50μg EGFP-PLY或50μg Δ6EGFP-PLY在37℃溫育30分鐘。沉淀影膜，在PBS中洗滌3次并且利用ZeissAxioscop20通過(guò)熒光顯微鏡檢查法顯象。
結(jié)果(未顯示)證實(shí)Δ6 PLY和膜的結(jié)合基本上與WT PLY和膜的結(jié)合相同。
實(shí)施例13利用透射電子顯微鏡檢術(shù)分析孔形成對(duì)負(fù)染的用0.2mg/ml野生型肺炎鏈球菌溶血素、0.2mg/ml W433FPLY和0.2mg/ml ΔA146 PLY處理的馬紅細(xì)胞膜如上進(jìn)行電子顯微鏡檢查(實(shí)施例4)。
在用wt PLY和W433F處理的膜上觀察到孔，但在用ΔA146 PLY處理的膜上沒(méi)有觀察到孔。反之，ΔA146 PLY的處理導(dǎo)致長(zhǎng)鏈的形成，認(rèn)為包含不能寡聚化形成孔的自締合的毒素(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
因此Δ6 PLY保留野生型PLY的膜結(jié)合性質(zhì)但不在細(xì)胞膜中形成孔。
實(shí)施例14肺炎鏈球菌溶血素突變體對(duì)鼠L929成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性如實(shí)施例6中所述確定WT PLY、PLY W433F和缺失突變體Δ6、Δ7、Δ8 PLY和ΔA146 PLY對(duì)鼠L929成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性。人紅細(xì)胞與WT PLY的比較。
發(fā)現(xiàn)該分析中W433F PLY突變體在10μg/ml和以上時(shí)為細(xì)胞毒性的，而缺失突變體為無(wú)毒的(圖12)。
實(shí)施例15
肺炎鏈球菌溶血素突變體ΔA146 PLY對(duì)RBL-2H3肥大細(xì)胞的細(xì)胞毒性利用脫粒分析評(píng)估ΔA146 PLY對(duì)大鼠RBL-2H3肥大細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
如Stassen等(2003)所述，利用104細(xì)胞/孔，與野生型PLY或ΔA146 PLY溫育90分鐘進(jìn)行該分析。
測(cè)量β-氨基己糖苷酶從肥大細(xì)胞顆粒的釋放，其給出該細(xì)胞響應(yīng)毒素的脫粒的直接測(cè)量。ΔA146 PLY不引起肥大細(xì)胞的脫粒(圖13)。
實(shí)施例16用wt PLY或ΔA146 PLY處理后的鼠中心體溫分析在Balb/c小鼠中植入遙測(cè)芯片，這使得可以獲得中心體溫(Tc)。小鼠用1μg wt PLY、1μgΔA 146 PLY或僅鹽溶液處理。如圖14所示，用WT PLY的處理導(dǎo)致嚴(yán)重的低體溫應(yīng)答，Tc降至28℃。該Tc維持6小時(shí)，其后Tc以約0.6℃/小時(shí)提高并且24小時(shí)后與對(duì)照組的Tc相似，盡管仍然是統(tǒng)計(jì)上顯著的。用ΔA146 PLY的處理不導(dǎo)致低體溫并且中位值Tc與鹽水對(duì)照組相當(dāng)。
因此，小鼠用WT PLY處理導(dǎo)致持續(xù)的低體溫應(yīng)答，這種應(yīng)答在用相同量的ΔA146 PLY處理后未觀察到。
雖然已結(jié)合上述例證性的實(shí)施方案描述本發(fā)明，當(dāng)給予本說(shuō)明書(shū)時(shí)許多同等的改進(jìn)和改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員為顯而易見(jiàn)的。因此，認(rèn)為本發(fā)明的例證性實(shí)施方案為說(shuō)明性的和非限制性的?？稍诓槐畴x本發(fā)明的精神和范圍的條件下產(chǎn)生對(duì)所述實(shí)施方案的各種改變。此處引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用明確地引入。
參考文獻(xiàn)Alexander，J.E.，Lock，R.A.，Peeters，C.C.A.M.，Poolman，J.T.，Andrew，P.W.，Mitchell，T.J.，Hansman，D.and Paton，J.C.(1994)Immunization of mice with pneumolysin toxoid confersa significant degree of protection against at least nineserotypes of Streptococcus pneumoniae.Infect.Immun.625686-5688Aslam and Dent(1998)，″BioconjugationProtein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，″Macmillan ReferenceLtd.，London，EnglandBerry，A.M.，Alexander，J.E.，Mitchell，T.M.，Andrew，P.W.，Hansman，D，and Paton，J.C.(1995)Effect of defined pointmutations in the pneumolysin gene on the virulence ofStreptococcus pneumoniae.Infect.Immun.631969-1974Bhakdi，S.，Tranum-Jensen，J.and Sziegoleit，A.(1985)Mechanism of membrane damage by StreptolysinO.Infect.Immun.4752-60Blum，M.D.，Dagan，R，Mendelman，P.M.，Pinsk，V.，Giordani，M.，Li，Shu，Bohidar，N.and McNeely，T.B.(2000)A comparisonof multiple regimens of pneumococcalpolysaccharide-meningococcal outer membr ane protein complexconjugate vaccine and pneumococcal polysaccharide vaccine intoddlers.Vaccine182359-2367Bonev B.，Gilbert，R.and Watts，A.(2000)Structuralinvestigations of pneumolysin/lipid complexes.MolecularMembrane Biology17229-235Cockeran，R.，Anderson，R.and Feldman，C.(2002)The roleof pneumolysin in the pathogenesis of Streptococcus pneumoniaeinfection.Current Opinion in Infectious Diseases15235-239Hausdorff，W.P.，Bryant，J.，Paradiso，P.R.and Siber，G.R.(2000)Which pneumococcal serogroups cause the most invasivediseaseimplications for conjugate vaccine formulation & use，partI.Clinical Infect.Dis.30100-121
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1.分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中該突變 體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè) 或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中丙氨酸146被替代或缺失。
6.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145被缺失。
8.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
9.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
10.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
11.權(quán)利要求1至10任何一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
12.免疫原性綴合物，其包含(a)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)；和(b)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。
13.權(quán)利要求12的免疫原性綴合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求12的免疫原性綴合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求13的免疫原性綴合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的免疫原性綴合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
17.權(quán)利要求15的免疫原性綴合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的免疫原性綴合物，其中PLY蛋白質(zhì)的氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145被缺失。
19.權(quán)利要求17的免疫原性綴合物，其中PLY蛋白質(zhì)的氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
20.權(quán)利要求17的免疫原性綴合物，其中PLY蛋白質(zhì)的氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
21.權(quán)利要求17的免疫原性綴合物，其中PLY蛋白質(zhì)的氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
22.權(quán)利要求12至21任何一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中糖、低聚糖或多糖來(lái)自于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。
23.權(quán)利要求12至22任何一項(xiàng)的免疫原性綴合物，其中該蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
24.分離和純化的核酸序列，包含核酸序列，該核酸序列a)編碼突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；或b)與a)中定義的核酸序列互補(bǔ)。
25.權(quán)利要求24的分離和純化的核酸序列，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求24的分離和純化的核酸序列，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
27.權(quán)利要求26的分離和純化的核酸序列，其中丙氨酸146被替代或缺失。
28.權(quán)利要求26的分離和純化的核酸序列，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代或缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求28的分離和純化的核酸序列，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
30.權(quán)利要求29的分離和純化的核酸序列，其中氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145被缺失。
31.權(quán)利要求29的分離和純化的核酸序列，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
32.權(quán)利要求29的分離和純化的核酸序列，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
33.權(quán)利要求29的分離和純化的核酸序列，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
34.權(quán)利要求24至33任何一項(xiàng)的分離和純化的核酸序列，其中該蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
35.重組表達(dá)載體，包含權(quán)利要求24至34任何一項(xiàng)的包含核酸序列的分離和純化的核酸序列。
36.用權(quán)利要求35的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的重組宿主細(xì)胞。
37.產(chǎn)生分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)的方法，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得該突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低，該方法包括a)用權(quán)利要求35的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細(xì)胞并且在允許所述突變體PLY蛋白質(zhì)被該宿主細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)物回收突變體PLY蛋白質(zhì)。
38.免疫原性組合物，其包含a)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
39.權(quán)利要求38的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
40.權(quán)利要求38的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
41.權(quán)利要求40的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求41的免疫原性組合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
43.權(quán)利要求41的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
44.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145被缺失。
45.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
46.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
47.權(quán)利要求43的免疫原性組合物，其中氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
48.權(quán)利要求38至47任何一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中該蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
49.免疫原性組合物，其包含a)免疫原性綴合物，包含(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)；和(ii)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
50.權(quán)利要求49的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
51.權(quán)利要求49的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)。
52.權(quán)利要求51的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或替代而不同于野生型蛋白質(zhì)。
53.權(quán)利要求52的免疫原性組合物，其中丙氨酸146被替代或缺失。
54.權(quán)利要求52的免疫原性組合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失而不同于野生型蛋白質(zhì)。
55.權(quán)利要求54的免疫原性組合物，其中該P(yáng)LY蛋白質(zhì)的氨基酸纈氨酸144和脯氨酸145被缺失。
56.權(quán)利要求54的免疫原性組合物，其中該P(yáng)LY蛋白質(zhì)的氨基酸丙氨酸146和精氨酸147被缺失。
57.權(quán)利要求54的免疫原性組合物，其中該P(yáng)LY蛋白質(zhì)的氨基酸甲硫氨酸148和谷氨酰胺149被缺失。
58.權(quán)利要求54的免疫原性組合物，其中該P(yáng)LY蛋白質(zhì)的氨基酸酪氨酸150和谷氨酸151被缺失。
59.權(quán)利要求49至58任何一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中糖、低聚糖或多糖來(lái)自于肺炎鏈球菌。
60.權(quán)利要求59的免疫原性組合物，其中存在多種肺炎鏈球菌血清型。
61.權(quán)利要求49至60任何一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中該蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含在野生型序列的氨基酸257-297、367-397或424-437至少一個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)氨基酸替代或缺失。
62.用于哺乳動(dòng)物的預(yù)防方法，該方法包括給予受治療者哺乳動(dòng)物免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含a)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
63.用于哺乳動(dòng)物的預(yù)防方法，該方法包括給予受治療者哺乳動(dòng)物免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含a)免疫原性綴合物，包含(i)糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)；和(ii)分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和b)一種或多種生理學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或載體。
64.突變體PLY蛋白質(zhì)或其免疫原性綴合物在制備用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染的免疫原性組合物中的用途，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。
65.用于醫(yī)學(xué)治療方法中的分離的突變體PLY蛋白質(zhì)或其免疫原性綴合物，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。
66.免疫原性組合物的制備方法，該方法包括步驟提供分離的突變體PLY蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低；和將該突變體蛋白質(zhì)綴合至糖、低聚糖、多糖、肽、多肽或蛋白質(zhì)。
67.權(quán)利要求66的方法，其中該突變體蛋白質(zhì)綴合至肺炎鏈球菌多糖。
68.篩選適合用于免疫原性組合物中的候選突變體PLY蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟提供突變體PLY蛋白質(zhì)；測(cè)定該突變體蛋白質(zhì)的溶血活性；測(cè)定該突變體PLY蛋白質(zhì)的寡聚化活性；和將該突變體PLY蛋白質(zhì)的溶血和寡聚化活性與非突變體蛋白質(zhì)的那些活性相比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含突變體肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌溶血素蛋白質(zhì)的免疫原性組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的突變體肺炎鏈球菌溶血素(PLY)蛋白質(zhì)，其中該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在野生型序列的氨基酸144至161區(qū)域內(nèi)存在突變而不同于野生型PLY蛋白質(zhì)，使得突變體的毒性相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的毒性而言降低。在具體的實(shí)施方案中，該突變體PLY蛋白質(zhì)通過(guò)在該區(qū)域內(nèi)氨基酸的替代或缺失，包括野生型序列的氨基酸144至151區(qū)域內(nèi)兩個(gè)相鄰氨基酸的缺失，而不同于野生型蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101018863SQ200580022076
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月7日
發(fā)明者利-安·柯卡姆, 蒂莫西·約翰·米切爾 申請(qǐng)人:利-安·柯卡姆, 蒂莫西·約翰·米切爾