專利名稱：通過使用外排泵抑制劑增加肽脫甲?；敢种苿┟舾行缘姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽基脫甲?；?peptidyl deformylase(PDF))抑制劑，并且特別涉及通過使用外排泵抑制劑增強PDF抑制劑對革蘭氏陰性菌的效力的方法。
背景技術(shù)：
對現(xiàn)有抗生素物質(zhì)持續(xù)出現(xiàn)和擴展的基于靶標(biāo)的抗性使得明顯需要旨在阻止這些機制的化合物修飾，或更優(yōu)的需要發(fā)現(xiàn)針對新的細(xì)胞功能的化合物，對于所述的細(xì)胞功能，不希望有預(yù)先存在的基于靶標(biāo)的抗性賦予其交叉抗性。抑制PDF至今未開發(fā)的功能的一類新的羥胺化合物在這方面表現(xiàn)出極大的前途，特別是針對革蘭氏陽性菌，其中包括對于常用抗生素具有特征明確的抗性機制的那些革蘭氏陽性菌。見WO 02/102790A1。PDF是在原核生物如細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的金屬肽酶。在原核生物中的蛋白質(zhì)合成以N-甲酰甲硫氨酸(fMet)開始。在蛋白質(zhì)合成起始后，甲酰基被PDF移除。該活性對于蛋白質(zhì)的成熟是關(guān)鍵的。已經(jīng)表明PDF是細(xì)菌生長所需的。由于在真核生物中的合成不依靠fMet起始，所以抑制PDF的制劑是新的抗微生物藥物和抗細(xì)菌藥物開發(fā)的有吸引力的候選物。
然而開發(fā)這些新制劑的主要潛在的障礙是那些一般機制，所述的機制是造成對大范圍結(jié)構(gòu)不相關(guān)化合物內(nèi)在抗性的原因。這些包括膜的非通透性和外排，這在革蘭氏陰性菌的情況中表現(xiàn)最強烈，其中已經(jīng)表明外膜和外排泵協(xié)同作用使得多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)化合物的細(xì)胞內(nèi)聚集最小化。見Nikaido，J Bacteriol，178卷，No.20，第5853-5859頁(1996)；Nikaido，Curr Opin Microbiol，1卷，No.5，第516-523頁(1998)；和Nikaido和Zgurskaya，J Mol Microbiol Biotechnol，3卷，No.2，第215-218頁(2001)。耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化(RND)家族的革蘭氏陰性外排泵看來具有最廣泛的底物范圍，并且因此與革蘭氏陰性的抗藥性最普遍相關(guān)。在構(gòu)造上，它們由內(nèi)膜質(zhì)子-藥物反向轉(zhuǎn)運蛋白、外膜通道和通稱的膜融合蛋白質(zhì)組成，認(rèn)為所述的膜融合蛋白質(zhì)作用為促進周質(zhì)中的內(nèi)膜成分和外膜成分相互作用。底物排出是通過質(zhì)子動勢推動的，并且近期的數(shù)據(jù)表明可以將底物從周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)小葉中泵出來。見Elkins和Nikaido，JBacteriol，184卷，No.23，第6490-6498頁(2002)；Li，Ma，Livermore和Nikaido，Antimicrob Agents Chemother，38卷，No.8，第1742-1752頁(1994)；和Yu等人，Science，300卷，No.5621，第976-980頁(2003)。
外排泵尤其是RND家族的那些外排泵所符合的廣泛的底物范圍是這樣的，即它們減少具有更高靶標(biāo)活性的新抗微生物劑有效性的潛力必須在對抗廣泛范圍或革蘭氏陰性范圍的藥物開發(fā)計劃中預(yù)見并且考慮到。此外，開啟或增加外排泵表達的調(diào)節(jié)突變可以為所給泵賦予針對一些或所有底物的增加的抗性，所述的調(diào)節(jié)突變大概通過暴露在抗微生物劑或殺生物劑下選擇。見Chuanchuen等人，Antimicrob Agents Chemother，45卷，No.2，第428-432頁(2001)。外排泵的過量表達子已經(jīng)被臨床分離出來[見Beinlich，Chuanchuen和Schweizer，F(xiàn)EMS Microbiol Lett，198卷，No.2，第129-134頁(2001)；Mazzariol等人，Antimicrob AgentsChemother，44卷，No.12，第3441-3443頁(2000)；和Ziha-Zarifi等人，Antimicrob Agents Chemother，43卷，No.2，第287-291頁(1999)]，并且泵的過量表達可以顯著的促成抗藥性的增加。因此，盡管對于新劑的交叉抗性以由其它抗生素所選擇的基于靶標(biāo)的突變形式預(yù)先存在，抗微生物劑暴露可以選擇具有對新劑減少的敏感性的泵的突變體。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是重要的新出現(xiàn)機會性病原體，代表了基于外排的抗性譜的一端，具有有重疊底物范圍的多種RND家族泵和明顯不可通透的外膜，已經(jīng)表明所述的外膜通過限制流入來顯著增加泵的效力。見Poole，J Mol Microbiol Biotechnol，3卷，No.2，第255-264頁(2001)?？赡艽砹硪欢说氖橇鞲惺妊?Haemophilus influenzae)，它是重要的呼吸病原體[見Dagan等人，Pediatr Infect Dis J，19卷，No.2，第95-104頁(2000)；Gotfried，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第25S-29S頁(2001)；Pfaller，Ehrhardt和Jones，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第4S-12S頁(2001)；和Sokol，Am J Med，111卷，Suppl.9A，第19S-24S頁(2001)]，僅具有一個已知的RND家族(acrAB同系物)泵[見Fleischmann等人，Science，269卷，No.5223，第496-512頁(1995)；和Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido，J Bacteriol，179卷，No.21，第6855-6857頁(1997)]，并且其特征是相對可通透的外膜。增加的外膜通透性參與限制外排泵對即使是相對較大的底物如紅霉素的效力。見Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido(1997)，見上。因此，流感嗜血菌可以代表革蘭氏陰性病原體的這種實例，即在其中可以希望基于內(nèi)在抗性和獲得抗性的外排引起較少的問題。除此之外，并且與紅霉素作為流感嗜血菌acrAB同系物的底物相符的是[見Sanchez，Pan，Vinas和Nikaido(1997)，見上]，在流感嗜血菌臨床分離菌中對大環(huán)內(nèi)酯的中等水平的內(nèi)在抗性也與外排相關(guān)。見Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum，Antimicrob Agents Chemother，47卷，No.3，第1017-1022頁(2003)。還發(fā)現(xiàn)流感嗜血菌臨床菌株對多種新的PDF抑制劑總體上表現(xiàn)出減少的敏感性。
總體上，上述討論表明，通過存在于細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌中的外排泵對抗細(xì)菌劑的主動外排是促成細(xì)菌對這些制劑抗性的重要因素。因此，開發(fā)和使用與抗細(xì)菌劑組合的細(xì)菌外排泵抑制劑可以增強細(xì)菌尤其是革蘭氏陰性菌對于多種抗細(xì)菌劑的敏感性，在所述的細(xì)菌中由于自細(xì)菌外排制劑，其對所述的抗細(xì)菌劑具有減少的敏感性。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了在所提供的哺乳動物中治療革蘭氏陰性菌感染的方法，所述方法包括施用有效量的式(I)化合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，X是-CH2-，或其鹽或其前體藥物；以及外排泵抑制劑。
在一種有用的實施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療由具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌引起的革蘭氏陰性菌感染的方法。此方法包括施用有效量的化合物 以及在革蘭氏陰性菌中抑制RND外排泵的外排抑制劑。
在另一方面中，本發(fā)明提供了增加革蘭氏陰性菌對式(I)化合物或其鹽或其前體藥物的敏感性的方法
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，X是-CH2-；本方法包括使細(xì)菌接觸抑制革蘭氏陰性菌中的外排泵的有效量式(I)的化合物和外排泵抑制劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了增加具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌對下述化合物敏感性的方法 所述方法包括使革蘭氏陰性菌接觸抑制革蘭氏陰性菌中的RND泵的有效量的化合物和外排泵抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供了包含式(I)的化合物或其鹽或其前體藥物、外排泵抑制劑和可藥用的載體的藥物組合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-；其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，x是-CH2-。
附圖簡述

圖1.新PDF抑制劑LBM415和LBK611的結(jié)構(gòu)。
圖2.流感嗜血菌中acrAB外排泵基因的基因排列，其顯示了用于插入失活的卡那霉素抗性標(biāo)記(箭頭)的位置和方向。同時顯示的是插入在ORF HI1462(tolC)中的卡那霉素抗性標(biāo)記的位置和方向。
圖3.在臨床分離菌NB65062中缺失acrA的區(qū)域(黑色條)。顯示了用于PCR的引物位置。由于acrAHIF的位點在NB65062中缺失，引物對acrAHIF/acrAHIR不能生成產(chǎn)物。
圖4.對比截短的acrR基因和野生型的acrR，其中截短的acrR基因來自具有對LBM415和LBK611減少的敏感性的4個臨床流感嗜血菌分離菌。突變?nèi)缦翹B65016，在核苷酸442后插入1個堿基(C)(移碼)；NB65027，在核苷酸366后，缺失8bp-插入GTT(移碼)，下游插入另一個堿基；NB65051，在核苷酸322后缺失4bp(移碼)；NB65063，C252T替代(終止)。
發(fā)明詳述
本文引用的所有專利申請、專利和參考文獻在此全文引用作為參考。
除非另外說明，在說明書中用到的下列術(shù)語具有下列意思。
術(shù)語“環(huán)烷烴”或“環(huán)烷基”包含3環(huán)到7環(huán)碳原子，并且例如是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
術(shù)語“烷基”指的是飽和或不飽和的脂族基，如包括具有1-10個碳原子的直鏈、支鏈和環(huán)基的鏈烯基或炔基、環(huán)烷基或取代的烷基。當(dāng)存在“烷基”時，優(yōu)選的“烷基”是飽和脂族基或環(huán)烷基，更優(yōu)選的是C1-7烷基，特別是C1-4烷基?！巴榛钡膶嵗ǖ幌抻诩谆?、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基或正庚基、環(huán)丙基，并且特別是正丁基。
術(shù)語“取代的烷基”指的是用1個或多個取代基取代的烷基基團，優(yōu)選的是1-3個取代基，包括但并不限于，取代基如鹵素、低級烷氧基、羥基、巰基、羧基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基等。取代的烷基基團的實例包括但不限于-CF3-、-CF2-CF3、羥甲基、1-或2-羥乙基、甲氧基甲基、1-或2-乙氧基乙基、羧甲基、1-或2-羧乙基等。
術(shù)語“芳基”指的是具有單環(huán)的6-14個碳原子的芳香碳環(huán)基團，包括但不限于，基團如苯基；或多種稠環(huán)，包括但不限于，基團如萘基或蒽基；并且特別是苯基。
術(shù)語“雜芳基”指的是4元到7元的單環(huán)芳香雜環(huán)，或由4元到7元的單環(huán)芳香雜環(huán)和稠合苯環(huán)組成的二環(huán)。雜芳基在環(huán)中具有至少1個雜原子，優(yōu)選的1或2個雜原子，雜原子包括但不局限于，雜原子如N、O和S。優(yōu)選的雜芳基基團是吡啶基、嘧啶基或苯并二氧戊環(huán)基(benzdioxolanyl)。
芳基或雜芳基可以是未取代的或被1個或多個取代基取代，取代基包括但不限于C1-7烷基，特別是C1-4烷基如甲基、羥基、烷氧基、?；?、酸基、SCN、鹵素、氰基、硝基、烷硫基、苯基、雜烷基芳基、烷基磺?；图柞；?。
本文用到的術(shù)語“羰基胺”指的是-NHC(O)-基團，其中基團的氨基部分連接到芳基/雜芳基上，并且基團的羰基部分連接到氮雜環(huán)4-7烷、硫雜氮雜環(huán)4-7烷或imidazacyclo4-7烷。
術(shù)語“雜烷基”指的是上面定義的飽和或不飽和的C1-10烷基，并且特別是包含1或多個作為基團中主要支鏈或環(huán)狀鏈一部分的雜原子的C1-4雜烷基。雜原子可以獨立地選自其中R是氫或烷基的-NR-、-S-、-O-和-P-；優(yōu)選地其中R是氫或烷基的-NR-和/或-O-。雜烷基基團可以在雜原子(如果化合價可行)或在碳原子上連接到分子的其余部分上。雜烷基基團的實例包括但不限于，基團如-O-CH3、-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH3、-S-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)-S-CH3和-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-。
雜烷基可以是未取代的或是用1個或多個取代基取代，優(yōu)選的1-3個取代基，包括但不限于烷基、鹵素、烷氧基、羥基、巰基、羧基，并且特別是苯基?；鶊F的雜原子和碳原子可以被取代。雜原子還可以是氧化形式。
本文用到的術(shù)語“烷氧基”指的是連接到氧原子上的C1-10烷基，優(yōu)選的是C1-7烷氧基，更優(yōu)選的是C1-4烷氧基。烷氧基基團的實例包括但不限于，基團如甲氧基、乙氧基、正丁氧基、叔丁氧基和烯丙氧基。
本文用到的術(shù)語“?；敝傅氖腔鶊F-(O)CR，其中R是烷基，特別是C1-7烷基，如甲基。酰基基團的實例包括但不限于乙?；?、丙?；投□；?。
本文用到的術(shù)語“酸基”指的是基團-OC(O)R，其中如上所述R是氫或烷基，特別是C1-7烷基，如甲基或乙基；或苯基或取代的烷基。
本文用到的術(shù)語“烷氧羰基”指的是基團-COOR，其中R是烷基，優(yōu)選的是C1-7烷基，如甲基或乙基。
本文用到的術(shù)語“鹵素”指的是氯、溴、氟、碘，并且特別是氟。
本文用到的術(shù)語“烷硫基”指的是基團-SR，其中R是如上定義的烷基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基等。
本文用到的術(shù)語“雜烷基芳基”指的是如用芳基基團特別是苯基取代的雜烷基基團-O-CH2-。苯基基團自身還可以用1個或多個取代基取代，如鹵素特別是氟和氯；以及烷氧基如甲氧基。
本文用到的術(shù)語“烷基磺?；敝傅氖腔鶊F-SO2R，其中R是烷基，特別是C1-7烷基，如甲磺?；?。
術(shù)語“敏感性”指的是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌對于本文公開的PDF抑制劑的存在的敏感性。增加細(xì)菌對PDF抑制劑的“敏感性”指的是在細(xì)菌周圍的培養(yǎng)基中較低濃度的PDF抑制劑將會抑制細(xì)菌。
本文用到的術(shù)語“外排泵”指的是位于細(xì)菌細(xì)胞膜中的1個或多個蛋白質(zhì)組分組成的泵，它將底物分子如抗生素轉(zhuǎn)運出細(xì)菌。一些革蘭氏陰性菌中的外排泵以及所有革蘭氏陽性的多藥外排泵穿過一層細(xì)胞質(zhì)膜層運出底物，并且其由1個組分(位于細(xì)胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白)組成。在革蘭氏陰性菌中，大部分多藥外排泵包含3個組分位于細(xì)胞質(zhì)膜(內(nèi)膜)中的轉(zhuǎn)運蛋白、外膜通道以及連接這兩者的周質(zhì)連接蛋白質(zhì)。在該排列中，外排泵橫貫內(nèi)膜和外膜，并且因此將底物從胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)膜中運出到外部介質(zhì)中。3組分外排泵的轉(zhuǎn)運蛋白使用質(zhì)子動勢來排出底物交換質(zhì)子，并且屬于主要易化(MF)超家族或?qū)儆谀退幗Y(jié)節(jié)細(xì)胞分化(RND)家族。
本文用到的術(shù)語“RND外排泵”指的是具有屬于RND家族轉(zhuǎn)運蛋白的外排泵。RND轉(zhuǎn)運蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)包含12個跨膜螺旋，但是在跨膜螺旋1和2以及7和8之間還包含2個大的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。RND外排泵能夠泵出大范圍的底物，包括幾乎所有的親脂的和兩親的抗生素；化療劑；代謝抑制物如淺藍菌素；染料；去污劑如SDS、Triton X-100和膽汁鹽；以及溶劑。同源RND外排泵在大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)中發(fā)現(xiàn)。
本文用到的術(shù)語“外排泵抑制劑”指的是特異性干擾外排泵轉(zhuǎn)運底物如抗生素的能力的化合物。
本文用到的術(shù)語“治療”包括但不限于，預(yù)防、減少和/或消除由細(xì)菌感染動物引起的臨床癥狀；預(yù)防、減少和/或消除細(xì)菌造成的動物感染；或預(yù)防、減少和/或消除細(xì)菌造成的動物染菌。涉及的細(xì)菌優(yōu)選是革蘭氏陰性菌，并且動物優(yōu)選是哺乳動物。
本文用到的術(shù)語“哺乳動物”包括人和其它靈長類、小鼠、大鼠、綿羊、牛、馬、狗、豬、貓、狗和其它物種。
本文用到的術(shù)語“有效量”指的是當(dāng)組合使用PDF抑制劑和外排泵抑制劑來治療動物中的細(xì)菌感染或增加細(xì)菌對PDF抑制劑的敏感性時，足以抑制PDF的單獨的PDF抑制劑和外排泵抑制劑的量。有效量根據(jù)下述而不同所使用的特定PDF抑制劑和外排泵抑制劑、所涉及的特定細(xì)菌、動物年齡、重量、性別和動物的醫(yī)學(xué)疾病(medical condition)、感染的類型和嚴(yán)重程度以及施用途徑，但是仍可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易的確定。要在治療細(xì)菌感染或增加細(xì)菌的敏感性中完全有效所需的PDF抑制劑的有效量大大低于PDF抑制劑在沒有外排泵抑制劑下施用所需的量。
本文用到的術(shù)語“可藥用載體”指的是賦形劑，其用于制備通常安全、無毒并且非生物學(xué)也非其它方面不希望的藥物組合物，所述的賦形劑包括獸醫(yī)用途和人類用途可接受的賦形劑。在說明書和權(quán)利要求中所用的“可藥用載體”包括1種或多于1種的所述載體。
本發(fā)明總體上涉及PDF抑制劑和這種發(fā)現(xiàn)，即在細(xì)菌(特別是革蘭氏陰性菌，如流感嗜血菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌和淋病奈瑟氏球菌)中，編碼RND外排泵組分的基因失活顯著性的增加了細(xì)菌對PDF抑制劑的敏感性。還發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性菌(如流感嗜血菌)中編碼抑制RND外排泵表達的阻抑蛋白的基因失活，會減少細(xì)菌對所公開的PDF抑制劑的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)和下列其它證據(jù)(見實施例)一起表明，外排泵特別是RND外排泵，在產(chǎn)生細(xì)菌(特別是革蘭氏陰性菌)對PDF抑制劑的內(nèi)在抗性中起到了主要的作用。這些發(fā)現(xiàn)還表明細(xì)菌中外排泵的抑制可以增加細(xì)菌(特別是革蘭氏陰性菌)對PDF抑制劑的敏感性。
為了此目標(biāo)，本發(fā)明涉及如下所述的PDF抑制劑和外排泵抑制劑組合的用途，其用于治療動物(特別是人和其它哺乳動物)中的細(xì)菌感染并且增加細(xì)菌對PDF抑制劑的敏感性。本發(fā)明還涉及包含PDF抑制劑和外排泵抑制劑的組合的藥物組合物。
本文用到的術(shù)語“PDF抑制劑”指的是式(I)的化合物
其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，X是-CH2-，或其鹽或其前體藥物。
在一個實施方案中，R1是式(II)的雜芳基 其中每個R6、R7、R8和R9獨立地是氫、烷基、取代的烷基、羥基、烷氧基、?；?、酸基、SCN、鹵素、氰基、硝基、烷硫基、苯基、雜烷基芳基、烷基磺?；蚣柞；?。
在另一個實施方案中，R1優(yōu)選的是式(II.1)的雜芳基 其中R6、R7、R8和R9如上述式(II)中所定義的，例如，其中a)R6是硝基、烷基、取代的烷基、苯基、羥基、甲酰基、雜烷基芳基、烷氧基、?；蛩峄瑑?yōu)選是烷基(特別是C1-7烷基)、羥基或烷氧基(特別是C1-7烷氧基)；并且R7、R8和R9是氫，或b)R6、R8和R9是氫；并且R7是烷基、取代的烷基、苯基、鹵素、烷氧基或氰基，優(yōu)選是烷基(特別是C1-7烷基)、取代的烷基(特別是取代的C1-7烷基如-CF3)、或烷氧基(特別是C1-7烷氧基)，或c)R6、R7和R9是氫；并且R8是烷基、取代的烷基、鹵素、硝基、氰基、烷硫基、酸基、苯基、烷基磺?；螋然榛?，優(yōu)選是烷基(特別是C1-7烷基)、取代的烷基(特別是-CF3)、鹵素或羧基烷基，或d)R6、R7和R8是氫；并且R9是烷基、鹵素或羥基，或e)R7和R9是氫；并且每個R6和R8獨立地是鹵素、烷基、取代的烷基、苯基或氰基，或f)每個R7和R9是烷基或取代的烷基；并且R6和R8是氫，或g)R6和R9是氫；R7是烷基或取代的烷基；并且R8是硝基，或h)R8和R9是氫；R6是氰基；并且R7是烷氧基，或i)R7和R8是氫；并且R6是烷基、取代的烷基、烷氧基或SCN；并且R9是烷基或取代的烷基，或j)R6和R7是氫；R8是硝基或鹵素；并且
R9是烷基或取代的烷基，或k)R6、R7、R8和R9是氫，或l)R6和R7，與它們連接的碳原子一起形成苯基基團，優(yōu)選的用羥基取代；并且R8和R9是氫，或m)R6和R7是氫；并且R8和R9，與它們連接的碳原子一起形成苯基基團，或n)n是0，或o)n是0；并且每個R6、R7、R8、R9獨立地是氫、烷基或鹵素，并且更特別地R6、R7、R8和R9是氫，或p)n是0；R6、R8和R9是氫；并且R7是烷基，或q)n是0；R6、R7和R9是氫；并且R8是烷基或鹵素。
在另一個實施方案中，R1是式(II.2)的基團 其中R6、R7、R8和R9如上述為式(II)所定義的，特別地，R7和R8以及與它們連接的碳原子一起形成苯基基團；并且R6和R9是氫。
而在另一個實施方案中，R1是式(III)的基團
其中每個R6、R7、R8和R9獨立地是氫、烷基、取代的烷基、苯基、鹵素、羥基或烷氧基，例如，其中a)R6和R8是氫；R9是氫或烷基；并且R7是烷基，取代的烷基或苯基，或b)R6、R7和R9是氫；并且R8是鹵素、烷基或取代的烷基，或c)R7、R8和R9是氫；并且R6是羥基。
在特別有用的實施方案中，雜芳基是式(III.1)的基團 其中R6、R7、R8和R9如為式(III)所定義的。
在另一個實施方案中，R1是未取代苯基或苯基用烷氧基(如甲氧基)、或芳氧基(如苯氧基)取代。
在特別有用的實施方案中，式(III.1)的化合物是
在另一個實施方案中，R1是式(IV)的基團 其中每個R10和R11獨立地是氫或鹵素，特別的，R10和R11都是氫或都是鹵素。
要意識到式(I)的化合物可以以旋光異構(gòu)體、外消旋物或非對映異構(gòu)體的形式存在。例如，當(dāng)式(I)的化合物中R2和R3是不同的殘基或其中R4和R5是不同的殘基，那么化合物是不對稱的并且可以具有R構(gòu)型或S構(gòu)型。可以理解的是式(I)的化合物包含所有的對映異構(gòu)體和它們的混合物。類似的考慮應(yīng)用在所述的表現(xiàn)出不對稱碳原子的原材料中。
式(I)的化合物可以以游離形式或鹽形式存在，例如，以可藥用鹽的形式?；衔锏摹翱伤幱名}”指的是生理學(xué)可接受和可藥用的鹽，其具有母體化合物的目的藥物活性并且不會引起不需要的毒物學(xué)作用。此類鹽包括(1)與無機酸形成的酸加成鹽，無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或與有機酸形成的酸加成鹽，有機酸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯代苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基磺酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)當(dāng)母體化合物中存在的酸性質(zhì)子被金屬離子(如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子)置換時形成的鹽；或與有機堿的配位物，有機堿如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、tromethamine、N-甲基葡糖胺等。
式(I)的化合物可以作用為前體藥物。“前體藥物”指的當(dāng)該前體藥物施用給哺乳動物對象時，在體內(nèi)釋放根據(jù)式(I)的活性母體藥的任何化合物。式(I)的化合物的前體藥物按照修飾可以在體內(nèi)切開以釋放母體化合物的方式通過修飾存在于式(I)的化合物中的官能團制備。前體藥物包括這樣的式(I)的化合物，其中的羥基、氨基或硫氫基基團結(jié)合到任何基團上，所述的任何基團可以在體內(nèi)被切割以分別生成游離的羥基、氨基或硫氫基基團。前體藥物的實例包括但不局限于，酯，如乙酸酯衍生物、甲酸酯衍生物和苯甲酸酯衍生物；碳酸酯，如N，N-二甲胺基-羰基；在式(I)的化合物中的羥基官能團的酯等。
式(I)的化合物可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知并且在例如WO02/102790 A1中所描述的合成化學(xué)方法得到。
一方面，本發(fā)明提供了治療動物(特別是哺乳動物)中細(xì)菌感染(特別是革蘭氏陰性菌感染)的方法。本方法包括施用有效量的PDF抑制劑(例如式(I)所包含的化合物或其鹽或其前體藥物)和外排泵抑制劑。
PDF抑制劑和外排泵抑制劑的組合增加了革蘭氏陰性菌對PDF抑制劑的敏感性。因此，在使用PDF抑制劑和外排泵抑制劑的組合中，由在外排泵抑制劑缺乏時對特定的PDF抑制劑有抗性(例如具有減少的敏感性)的細(xì)菌引起的革蘭氏陰性感染可以用特定的PDF抑制劑治療。另外，細(xì)菌在沒有外排泵抑制劑時對PDF抑制劑敏感的革蘭氏陰性感染，可以使用較低劑量的PDF抑制劑，因此減輕使用高劑量的PDF抑制劑而發(fā)生的副作用的危險。
如上所述，大部分革蘭氏陰性菌具有3組分的外排泵，所述的外排泵由位于細(xì)胞質(zhì)膜(內(nèi)膜)中的轉(zhuǎn)運蛋白、外膜通道以及連接這兩者的周質(zhì)連接體蛋白質(zhì)組成。見Nikaido(1996)，見上；Nikaido，Clin Infect Dis，27卷(Supp.1)，第S32-S41頁(1998)；和Zgurskaya和Nikaido，Mol Microbiol，37卷，No.2，第219-225頁(2000)。在此排列中，外排泵橫貫內(nèi)膜和外膜，并且因此將底物如抗生素從胞質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)膜中運出到外部介質(zhì)中。見Zgurskaya和Nikaido(2000)，見上。3組分外排泵的轉(zhuǎn)運蛋白使用質(zhì)子動勢來排出底物交換質(zhì)子，并且屬于MF超家族或?qū)儆赗ND家族。見Nikaido(1998)，見上。
在一個實施方案中，要治療的革蘭氏陰性菌感染由具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌引起。如上所述，術(shù)語“RND外排泵”指的是具有屬于RND家族轉(zhuǎn)運蛋白的外排泵，其另外包括在根瘤菌(Rhizobium)中推定的結(jié)瘤信號分子的轉(zhuǎn)運蛋白。見Saier等人，F(xiàn)ASEB J，12卷，第265-274頁(1998)；和Saier等人，Mol Microbiol，11卷，第841-847頁(1994)。所有RND外排泵家族的成員具有相似的結(jié)構(gòu)。它們的預(yù)測結(jié)構(gòu)包含12個跨膜螺旋，并且在跨膜螺旋1和2以及7和8之間還包含2個大的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。見Nikaido(1998)，見上；和Zgurskaya和Nikaido(2000)，見上。RND外排泵能夠泵出大范圍的底物，所述的底物包括幾乎所有的親脂的和兩親的抗生素；化療劑；代謝抑制物如淺藍菌素；染料；去污劑如SDS、Triton X-100和膽汁鹽；以及溶劑。見Nikaido，Curr Opin Microbiol(1998)，見上；和Nikaido(1996)，見上。介導(dǎo)對臨床相關(guān)抗生素的抗性的大多數(shù)的外排轉(zhuǎn)運蛋白是RND家族的成員。見Saier等人，F(xiàn)ASEBJ(1998)，見上。具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌包括但不限于，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大腸桿菌、卡他莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌、淋病奈瑟氏球菌、burholderia cepacia、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、鮑曼不動桿菌(acinetobacter baumannii)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。同源的外排RND泵可以在革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌中找到。見Nikaido，Curr Opin Microbiol(1998)，見上。在特別有用的實施方案中，具有RND泵的革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
在治療革蘭氏陰性菌感染的方法的特別有用實施方案中，式(I)的化合物是
在革蘭氏陰性菌中對外排泵(特別是RND外排泵)特異性的外排泵抑制劑在本領(lǐng)域中眾所周知。例如，美國專利號6,114,310描述了一類常見的外排泵二肽抑制劑，其增強了大范圍的抗生素針對多種革蘭氏陰性菌的活性。在此常見類中的二肽外排泵抑制劑的實例是具有下列結(jié)構(gòu)的MC-04,124， 已經(jīng)表明它抑制RND外排泵并且增強一些抗生素針對多種革蘭氏陰性菌的活性，所述革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和鮑曼不動桿菌。見Cho等人，40th/CAAC(2000)；和Watkins等人，Bioorgan Med Chem Lett，第13卷，第4241-4244頁(2003)。增強抗生素針對革蘭氏陰性菌活性的RND外排泵抑制劑的其它實例包括具有下列結(jié)構(gòu)的二肽抑制劑MC-207,110
其如在Renau等人，J Med Chem，42卷，第4928-4931頁(1999)；和Lomovskaya等人，Antimicrob Agents Chem，45卷，No.1，第105-116頁(1991)中所描述的，以及具有下列結(jié)構(gòu)的二肽抑制劑MC-002,595 其如在Lomovskaya等人，Antimicrob Agents Chem(1991)，見上中所描述的。
增強唑烷酮抗細(xì)菌劑針對革蘭氏陰性菌的活性的RND外排泵抑制劑的另一實例是如在美國專利號6,251,869中所描述的精氨酸衍生物。
對革蘭氏陰性菌如銅綠假單胞菌中的RND外排泵特異性的外排泵抑制劑的另一個實例是由放線菌產(chǎn)生的貝那他汀(benastatin)A和B的硫酸鹽，例如具有下列結(jié)構(gòu)的MF-EA-371α
以及具有下列結(jié)構(gòu)的MF-EA-371δ 如在Lee等人，(2000)，40th/CAAC(2000)中所描述的。
對于在被診斷出具有革蘭氏陰性菌感染的人和其它動物(特別是人和其它哺乳動物)中革蘭氏陰性菌感染的治療，可通過任何常規(guī)途徑施用PDF抑制劑和外排泵抑制劑或者其藥物組合物，施用途徑如局部或全身的，例如口服、局部、腸胃外的、皮下的或通過吸入。途徑的選擇將取決于感染的類型、嚴(yán)重程度和位置、以及引起感染的細(xì)菌類型。
達到“有效量”的PDF抑制劑所需的劑量當(dāng)然將取決于上述多種因素，如施用方式、要治療的感染的類型和嚴(yán)重程度以及所需的效果。通常，例如對于人類治療，劑量的有效量的范圍是1-3000mg每天(例如1500mg每天)，取決于施用的途徑和頻率。此劑量相應(yīng)是大約0.015-50mg/kg體重每天。適當(dāng)?shù)膭┝渴抢绱蠹s5-20mg/kg體重每天。
所使用的特定的外排泵抑制劑的量將取決于多種因素，如革蘭氏陰性菌的類型、革蘭氏陰性菌對于特定PDF抑制劑的敏感性以及治療動物的吸收。應(yīng)當(dāng)使用足夠量的外排泵抑制劑來使得在治療動物中的革蘭氏陰性菌對可藥用水平的PDF抑制劑敏感。特定的外排抑制劑的足夠量可以通過這種方法容易的確定，即通過測試PDF抑制劑的最小抑制濃度(MIC)和對比單獨使用PDF抑制劑的MIC和與外排泵抑制劑組合使用的PDF抑制劑的MIC。通常，施用的外排泵抑制劑對PDF抑制劑的摩爾比大約是從0.01到10。適當(dāng)?shù)哪柋却蠹s是從0.1到1.0。因此，用于治療動物中革蘭氏陰性菌感染的外排泵抑制劑的每日劑量的范圍是大約0.0015-5mg/kg體重每天。適當(dāng)?shù)模咳談┝渴谴蠹s0.5-2mg/kg體重每天。外排泵抑制劑可以在PDF抑制劑施用前施用，或與PDF抑制劑同時施用。
另一方面，本發(fā)明提供了增加革蘭氏陰性菌對PDF抑制劑敏感性的方法，包括使細(xì)菌接觸這種量的PDF抑制劑和外排泵抑制劑，所述量能有效抑制革蘭氏陰性菌的外排泵。在用PDF抑制劑和外排泵抑制劑的組合治療時本方法增加了PDF抑制劑對表達外排泵的革蘭氏陰性菌細(xì)胞的效力。
在增加革蘭氏陰性菌對PDF抑制劑敏感性的方法的一個實施方案中，革蘭氏陰性菌的感染由具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌引起，所述的革蘭氏陰性菌如粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌、卡他莫拉氏菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌、淋病奈瑟氏球菌、burholderia cepacia、類鼻疽伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動桿菌和惡臭假單胞菌。在另一個實施方案中，具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。在特別有用的實施方案中，具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌?？梢杂糜诒痉椒ǖ挠绕溆杏玫腜DF抑制劑和外排泵抑制劑是如上所描述的。
例如，可以在體外使用如在Lorian編著的Antibiotics in LaboratoryMedicine，3rdEd.，432頁，Williams&Wilkins，Baltimore，MD中所描述的棋盤法，評估特定的外排泵抑制劑在增加革蘭氏陰性菌對特定PDF抑制劑的敏感性中的功效。
另一方面，本發(fā)明提供了在動物如哺乳動物中，有效治療細(xì)菌感染特別是革蘭氏陰性菌感染的藥物組合物。組合物包含如上所述的PDF抑制劑和外排泵抑制劑以及可藥用的載體。
此組合物可以是本領(lǐng)域已知的任何形式，包括但不限于片劑、膠囊劑、糯米紙囊劑、快速溶解劑(無糯米紙囊)、粉劑、顆粒劑、錠劑、乳膏劑或液體制品，如口服或無菌的腸胃外溶液劑或混懸劑。PDF抑制劑和外排泵抑制劑還可以以微脂粒制劑、微團制劑或微乳劑制劑施用。存在于組合物中的PDF抑制劑還可以作為前體藥物施用，其中施用的前體藥物在所治療的哺乳動物中生物轉(zhuǎn)化以形成具有生物活性的藥物。
本發(fā)明的局部制劑可以作為下列存在，如軟膏劑、乳膏劑或洗劑、溶液劑、油膏劑、乳劑、硬膏劑、眼軟膏劑和眼或耳的滴劑、浸泡敷料、透皮貼片、噴霧劑和氣霧劑；并且可以包含適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)添加劑，如防腐劑、協(xié)助藥物穿透的溶劑、以及軟膏劑和乳膏劑中的潤滑藥。
制劑還可以包含相容的常規(guī)載體，如乳膏劑基質(zhì)或軟膏劑基質(zhì)以及乙醇；或用于洗劑的油醇。例如此類載體的存在是制劑的大約1％到大約99％。例如，它們可以形成高達大約制劑的80％。
口服施用的片劑和膠囊劑可以是單位劑量的存在形式，并且可以包含常規(guī)的賦形劑，如結(jié)合劑，如糖漿劑、金合歡膠、明膠、山梨糖醇、西黃蓍膠、聚乙烯吡咯烷酮；填充料，如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨糖醇或甘氨酸；片劑潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解劑如馬鈴薯淀粉；或可接受的濕潤劑，如十二烷基硫酸鈉。片劑可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物專業(yè)中已知的方法包被。
口服液體制品可以是以如下形式，如水或油的混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑，或作為在使用前要用水或其它溶媒重組的干燥產(chǎn)物存在。此類液體制品可以包含常規(guī)添加劑，例如助懸劑，如山梨糖醇、甲基纖維素、葡萄糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化的食用脂肪；乳化劑如磷脂酰膽堿、山梨聚糖單油酸酯(sorbitanmonooleate)或金合歡膠；非水的溶媒(可以包括食用油)，如杏仁油；油酯，如甘油、丙二醇或乙醇；防腐劑如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，以及常規(guī)的增香劑或著色劑(如果需要)。
對于腸胃外施用，利用化合物和無菌溶媒(優(yōu)選是水)制備流體單位劑型。取決于所使用的載體和濃度，PDF抑制劑和外排泵抑制劑可以在載體或其它適當(dāng)?shù)娜軇┲谢鞈一蛉芙?。在制備溶液劑中，可以將PDF抑制劑和外排泵抑制劑溶解在水中用于注射并且在充入到適當(dāng)?shù)男∑炕虬碴城斑^濾滅菌并封口。優(yōu)選的，制劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑可以溶解在溶媒中。為了增強穩(wěn)定性，組合物可以在充入小瓶后冷凍并且在真空下將水移除。之后將干燥的凍干粉末密封在小瓶中，并且提供用于注射的一瓶附加水以在使用前重新組成液體。腸胃外混懸劑用基本一樣的方法制備，除了PDF抑制劑和外排泵抑制劑是混懸而不是溶解在溶媒中，并且不能通過過濾滅菌。PDF抑制劑和外排抑制劑可以通過在混懸在無菌溶媒之前暴露在環(huán)氧乙烷下來滅菌。優(yōu)選的，在組合物中包含表面活性劑和潤濕劑以促進化合物的均衡分布。
例如如上所說明的，PDF抑制劑可以以游離形式或可藥用鹽的形式施用。此類鹽可以以常規(guī)方法制備并且表現(xiàn)出和游離化合物相同級別的活性。
下列實施例用來說明本發(fā)明但不以任何方式限制其范圍。
實施例方法和材料細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和生長培養(yǎng)基本研究中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒在下表1中列出。L-肉湯或L-瓊脂(Difco)用于大腸桿菌的常規(guī)生長。巧克力瓊脂板(Remel)用于流感嗜血菌的常規(guī)生長。補充了10μg/mL的β-NAD(Fluka)和10μg/mL的氯高鐵血紅素/維生素K溶液(sBHI)(Remel)的腦心浸液肉湯(Remel)用于流感嗜血菌的液體肉湯培養(yǎng)。如前所述，使用M-IV培養(yǎng)基引起營養(yǎng)下調(diào)用于流感嗜血菌中天然感受態(tài)的誘導(dǎo)。見Poje和Redfield，Methods MolMed，71卷，No.，第57-70頁(2003)。按照所需，向生長培養(yǎng)基中加入50μg/mL(大腸桿菌)或5μg/mL(流感嗜血菌)的卡那霉素。
表1本研究中所用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
*見Fleischmann等人，(1995)，見上。
**見Hoang，Karkhoff-Schweizer，Kutchma和Schweizer，Gene，212卷，No.1，第77-86頁(1998)。
抗微生物劑敏感性測試按照National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)所建立的方法，在HTM中通過使用2倍稀釋的肉湯微量稀釋來確定抗生素和底物的MIC。見NCCLS，Approved standard M7-A5，Wayne，PA(2003)。PDF抑制劑在Novartis Institutes for BioMedical Research，Cambrdge，MA合成。所有保存的抗生素從Sigma(St.Louis，MO)得到。
DNA操作根據(jù)說明，使用來自Gentra Systems Inc.(Minneapolis，MN)的Puregene tissue kit分離流感嗜血菌基因組DNA。用于PCR和測序的寡核苷酸從Genelink(Hawthorne，NY)得到，并且根據(jù)提供的說明，使用Molecular Bio-Products Inc.(San Diego，CA)的Easystart mix-in-a-tubesystem實現(xiàn)PCR反應(yīng)。從分離的菌落中制備的基因組DNA或細(xì)胞在PCR反應(yīng)中用作模板。根據(jù)和酶一起提供的說明書使用限制性內(nèi)切核酸酶和修飾酶。如在說明中所詳細(xì)說明的，使用Qiagen Inc.(Valencia，CA)的QIAquick PCR純化或凝膠提取試劑盒，在瓊脂糖凝膠電泳后純化或分離DNA片段。通過Agencourt Inc.(Waltham，MA)進行核苷酸測序。
體外誘變和基因替換為了在流感嗜血菌中構(gòu)建acrB同系物的插入敲除，使用引物acrBHIF(5’-CCACTTTAATGTATGAGGAAATCCG-3’)(SEQ ID NO.1)和acrBHIR3(5’-CGAATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3’)(SEQ IDNO.2)以生成包含acrB基因的3.1kb PCR片段，其中使用了流感嗜血菌NB65001基因組模板DNA。根據(jù)和試劑盒一起提供的說明書，將acrB PCR產(chǎn)物連接到Invitrogen(Carlsbad，CA)的PCR2.1-Topo中，之后使用EcoRI將acrB片段切除并連接到pEX18Tc中。之后將此構(gòu)建體在acrB片段中唯一的MfeI位點處線性化，用T4 DNA聚合酶使其成為平端并且連接到1.2kb平端PCR片段上以給出質(zhì)粒pCDBKm，所述的PCR片段包含使用引物TN903KanF(5’-GCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG-3’)(SEQ ID NO.3)和TN903KanR(5’CCAGTGTTACAACCAATTAACCAA-3’)(SEQ ID NO.4)從pACYC177中生成的TN903卡那霉素抗性決定子。包含流感嗜血菌DNA攝取序列的177bp DNA片段是使用前面所述的引物從NB65044基因組DNA中PCR擴增的。見Akerler等人，Proc Natl Acad Sci USA，99卷，No.2，966-971頁(2002)。根據(jù)說明書，將產(chǎn)物克隆到Invitrogen的PCR2.1-Topo中，之后用KpnI切出并連接到pCDBKm的多克隆位點中的KpnI位點以給出pCDBKmUS。已經(jīng)表明攝取序列的參與會促進更高水平的轉(zhuǎn)化，這可用于將DNA引入不能通過天然轉(zhuǎn)化有效攝取線性DNA的多種分離菌。見Akerley等人(2002)，見上。
為了構(gòu)建可讀框(ORF)HI1462(tolC)的插入敲除[見Trepod和Mott，Antimicrob Agents Chemother，48卷，No.4，第1416-1418頁(2004)]，使用引物HI1462IF (5’-CACGCTTGCTTTGTTGATGTCTGGTGC-3’)(SEQ ID NO.5)和HI1462IR(5’-TCCCGCCATTGAGCTATATACCGCA-3’)(SEQ ID NO.6)，以生成包含來自NB65001基因組DNA模板的絕大部分HI1462的1.3kb PCR片段并且根據(jù)說明書將其直接連接到Invitrogen的PCR 2.1-Topo。之后將插入片段作為EcoRI片段回收并且連接到pBluescriptSK的EcoRI位點上。之后，將TN903卡那霉素抗性決定子連接到HI1462中唯一的MluI位點中(已經(jīng)變成平端)，以生成pCD14Km，所述的TN903卡那霉素抗性決定子是來自pBAD18Tc的1.8kbHaeII片段，并且用T4DNA聚合酶變成了平端。此構(gòu)建體具有和HI1462處于相同方向的卡那霉素抗性決定子。見圖1。
為了構(gòu)建ORF HI0893的插入突變(acrR的同系物以及acrAB表達的推定的阻抑物)，使用引物acrRHIF2(5’-TAATGATGAAAAGTGCGGTTAATT-3’)(SEQ ID NO.7)和acrRHIR(5’-TTTCTGAATCGCACGCCAAGAGCGT)(SEQ ID NO.8)以生成包含來自NB65001基因組DNA的ORF HI0893的752bp PCR片段。根據(jù)和試劑盒一起提供的說明書，將此PCR產(chǎn)物連接到Invitrogen的PCR 2.1Topo中，之后作為EcoRI片段切出并克隆到EcoRI切開的pBluescriptSK中。之后用SfuI將此構(gòu)建體線性化并且連接到包含TN903卡那霉素抗性決定子的1.2kb平端PCR片段上以生成質(zhì)粒pCDRKm，所述的TN903卡那霉素抗性決定子使用上述引物從pACYC177中生成。
為了將acrB∷Km和acrR∷Km插入引入到基因組中，按照Poje和Redfield(2003)(見上)中所描述的，流感嗜血菌菌株在sBHI中生長到早期對數(shù)期(OD600大約是0.2)，并且通過營養(yǎng)下調(diào)在M-IV培養(yǎng)基中誘導(dǎo)天然感受態(tài)。按照前面描述的[見Poje和Redfield(2003)，見上]，感受態(tài)細(xì)胞用pCDBKmUS(用XbaI線性化)或pCDRKm(用ScaI線性化)轉(zhuǎn)化，并且鋪于巧克力瓊脂上，所述的巧克力瓊脂包含用于選擇基因組中含有卡那霉素抗性標(biāo)記細(xì)胞的5μg/mL卡那霉素。為了將HI1462∷Km插入物引入到菌株NB65044的基因組中，如前所述，感受態(tài)細(xì)胞用pCD14Km(用ScaI線性化)轉(zhuǎn)化并且在巧克力瓊脂板上選擇。為了將此插入物引入菌株NB65027和NB65051中，如前所述使受體細(xì)胞成為感受態(tài)，用分離自NB65044-CDS0001的基因組DNA轉(zhuǎn)化，并且在包含5μg/mL卡那霉素的巧克力瓊脂板上選擇。插入物通過PCR證實并且測序使用插入位點側(cè)翼的引物產(chǎn)生的片段。
超敏感性菌株NB65062的PCR分析和acrA缺陷的補償為了得到包含菌株中NB65062中的acrA基因的區(qū)域，使用引物acrRHIF1(5’-GTGCGGTGCCACCGCAAGGACATA-3’)(SEQ ID NO.9)和acrAHIR(5’-TGCAGGCTCTATTGCACCCACAATG-3’)(SEQ IDNO.10)以生成來自NB65062基因組DNA的PCR片段。見圖2。將片段凝膠純化并且確定核苷酸序列。
對于acrA缺陷的補償，使用上述營養(yǎng)下調(diào)法，將包含功能性的acrAB泵、來自NB65044的基因組DNA用于轉(zhuǎn)化NB65062。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于包含4μg/mL LBM415或2μg/mL紅霉素(都是acrAB外排泵的底物)的巧克力瓊脂上。
實施例1acrAB泵在減少對LBM415內(nèi)在敏感性中的作用在實驗室菌株NB65044中acrB的插入失活(見圖1)顯著性的增加了對LBM415的敏感性，表現(xiàn)為LBM415的MIC從對母體菌株為4μg/mL下降到對acrB-缺陷的衍生物NB65044-CDS0001為0.25μg/mL。見下表2。插入還增加了對LBK611和已知的泵底物紅霉素的敏感性[見Sanchez、Pan、Vinas和Nikaido(1997)，見上]，并且更顯著的增加了對另一大環(huán)內(nèi)酯(氯林肯霉素)的敏感性，但是沒有顯著性的影響對泵的非底物四環(huán)素的敏感性[見Sanchez、Pan、Vinas和Nikaido(1997)，見上]。見表2。另一個已知的泵的非底物氯霉素也沒有受到acrB喪失的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。這證明了流感嗜血菌AcrAB泵是對LBM415減少的敏感性的主要驅(qū)動者。
表2流感嗜血菌中AcrAB外排泵對針對LBM415、LBK611、和大環(huán)內(nèi)酯的內(nèi)在抗性的貢獻
ERM＝紅霉素CLD＝氯林肯霉素TET＝四環(huán)素ND＝未做與敏感性菌株相比，抗性菌株中相對缺乏放射性標(biāo)記的紅霉素聚集，基于此，先前已經(jīng)表明了外排在流感嗜血菌臨床分離菌中參與介導(dǎo)適度水平的大環(huán)內(nèi)酯抗性，而針對大環(huán)內(nèi)酯的高水平的抗性與靶突變相關(guān)。見Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum(2003)，見上。一小部分先前檢測的臨床分離菌[見Peric，Bozdogan，Jacobs和Appelbaum(2003)，見上]對大環(huán)內(nèi)酯具有超敏感性并且不會聚集放射性標(biāo)記的紅霉素，這說明它們沒有外排泵。還要注意的是少數(shù)分離菌對大環(huán)內(nèi)酯和PDF抑制劑都具有超敏感性。使用PCR診斷，得到了這些菌株中一些菌株的來自acrR-、acrA-或acrB的片段，表明泵基因即使在超敏感性的菌株中都廣泛分布。但是對于超敏感性的菌株NB65062中(見表2)，沒有得到acrA的產(chǎn)物，這表明存在基因缺失。使用側(cè)翼引物(見圖3)生成包含acrA區(qū)域的PCR片段，得到了尺寸明顯小于所預(yù)測的2kb的片段。片段的核苷酸測序表明了導(dǎo)致acrA絕大部分喪失的873bp的缺失(見圖3)。用來自NB65044的具有完整的acrAB基因座的基因組DNA轉(zhuǎn)化NB65062，并且在包含LBM415(4μg/mL)或紅霉素(2μg/mL)的巧克力瓊脂上選擇，得到了這種分離菌，其對兩類抗生素都具有減少的敏感性，并且對泵的非底物菌株NB65062-CDS0038和NB65044-CDS0039而言在敏感性上沒有變化。見表2。轉(zhuǎn)化體的脈沖凝膠電泳分析給出了和NB65062的限制圖譜一樣的限制圖譜，但是PCR和測序表明全長acrA恢復(fù)，證明了超敏感性確實是菌株NB65062中acrAB泵缺乏的結(jié)果。這與AcrAB泵提供對PDF抑制劑和大環(huán)內(nèi)酯的內(nèi)在抗性的作用一致，并且表明了大環(huán)內(nèi)酯和LBM415超敏感性菌株可以由外排泵成分的突變喪失產(chǎn)生，這優(yōu)于如先前所提出的使其不能獲得外排泵來得到這些菌株[見Peric、Bozdogan、Jacobs和Appelbaum(2003)，見上]。來自這些菌株的acrR基因的測序也沒有顯示與母體菌株不同，這說明了在選擇性平板中暴露在LBM415或紅霉素期間也沒有選出acrR突變。提供預(yù)測的多種acr基因PCR產(chǎn)物的其余超敏感性菌株可能具有其它較不明顯的損害泵功能的突變，但這還需要證實。
由于至今在流感嗜血菌中僅鑒定了一個RND家族的泵，可以預(yù)期它對于流感嗜血菌在已知的流感嗜血菌唯一的天然環(huán)境-人宿主中存活起到重要的功能。在某些臨床分離菌中該泵的喪失是奇怪的，因為該泵通常存在于流感嗜血菌中但是顯然可以在某些情況下喪失，這表明它的作用不是不可缺少的。
實施例2acrAB同系物外排泵的外膜成分的鑒定已經(jīng)證明了acrAB泵是流感嗜血菌中對PDF抑制劑和大環(huán)內(nèi)酯的內(nèi)在抗性的主要貢獻者，感興趣的是鑒定泵的外膜通道成分以完成泵的三層型構(gòu)造(Tripartire architecture)。使用大腸桿菌中acrAB的伙伴TolC外膜通道進行流感嗜血菌基因組的蛋白質(zhì)同源性檢索，表明它和ORFHI1462顯著性的相似性(期望值2.9×10-6)。有趣的是，銅綠假單胞菌的mexAB-oprM泵的oprM成分產(chǎn)生和HI1462更接近的匹配，其期望值為2.8×10-22，這說明HI1462是外膜通道的好的候選。與此相符的是，在流感嗜血菌NB65044中HI1462的失活(見圖1)增加了對紅霉素、氯林肯霉素和LBM415、acrAB泵所有底物的敏感性，但是不影響對泵的非底物四環(huán)素NBS65044-CDS0022的敏感性。見表2。近來，另一個組[見Trepod和Mott(2004)，見上]也報道鑒定了HI1462作為此泵的外膜通道。因此在此包括的數(shù)據(jù)支持了此發(fā)現(xiàn)并且將此通道成分的作用擴展到介導(dǎo)對LBM415的抗性中。
有趣的是，HI1462在其編碼一半的C端上表現(xiàn)出和另一個ORFHI1340完全的同一性。除了此相似性，喪失HI1462對于針對泵的底物的特異性敏感性的顯著影響證明了其作為通道的作用，這可能伴隨著少量臨床相關(guān)的來自HI1340的貢獻。至少在NB65044中，HI1462和HI1340在它們N端部分的不同可以說明與不同的泵相互作用。實際上，存在僅通過一個基因ftsN分別分離自acrAB的emrAB泵的同系物HI0898和HI0899可以與HI1340作用。在流感嗜血菌中emrAB泵的失活不會影響對大范圍化合物的敏感性[Trepod和Mott(2004)，見上]，表明那個家族泵典型的該泵不會有效的排出抗生素。然而，在排出化合物優(yōu)于emrAB泵的acrAB泵存在時它會被滅活，所以在那種情況下該泵的缺乏不能顯示出它泵出一些或所有測試底物的能力。備選的，HI1340能與acrAB泵作用但是不會顯著性表達。HI1340作為外排泵成分的潛在的作用仍需確定。
實施例3acrAB和在流感嗜血菌臨床菌株中對PDF抑制劑減少的敏感性在一些細(xì)菌的臨床分離菌中對抗生素減少的敏感性與外排泵的過量表達相關(guān)。歷史上，臨床分離菌中阻抑物突變和/或泵基因的過量表達的鑒定已經(jīng)足夠?qū)p少的抗性歸因于外排，這可能是通常的情況，但是在阻抑物基因突變和/或泵的表達狀態(tài)與對特定抗生素的抗性之間并不總是存在明確的關(guān)聯(lián)。見Sobel、McKay和Poole，Antimicrob Agents Chemother，47卷，No.10，第3202-3207頁(2003)。因此，為了直接說明acrAB泵是否在那些對PDF抑制劑具有最低敏感性的臨床菌株中在介導(dǎo)減少的敏感性中起到重要作用，在菌株NB65016、NB65027、NB65051、NB65063、NB65069和NB65076中滅活acrB(見圖1)，所有所述的菌株表現(xiàn)出對LBM415、LBK611和氯林肯霉素減少的敏感性。所有情況中泵的喪失顯著增加了對兩類抗微生物劑的敏感性，而對泵的非底物沒有影響(見下表3)，這為acrAB泵廣泛分布并且是這些菌株所表現(xiàn)出的減少的敏感性的主要貢獻者提供了直接的證明。此外，在菌株NB65027和NB65051中HI1462的失活(見圖1)類似的增加了特異性的對泵的底物的敏感性(見表3)，進一步證明了在臨床分離菌中作用的acrAB泵中此外膜通道的作用。
表3在多種流感嗜血菌臨床分離菌中acrAB外排泵對針對LBM415和LBK611的減少的敏感性的貢獻和acrR在調(diào)節(jié)抗性中的作用
ERM＝紅霉素CLD＝氯林肯霉素TET＝四環(huán)素注意●菌株NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014是在含有8μg/mLLBM415的巧克力瓊脂板上選擇的acrR突變體。
●NB65044-CDS0011 acrR在位置253上具有C→T核苷酸改變，引入了終止子。
●NB65044-CDS0014在位置164上具有T→C的核苷酸改變，以得到L→P的氨基酸置換。
實施例4acrR是acrAB泵的表達的阻抑物在具有對LBM415和大環(huán)內(nèi)酯減少的敏感性的流感嗜血菌臨床分離菌中，acrAB外排泵是對于針對這些制劑的減少的敏感性的主要貢獻者，該證明表明了增加的泵的表達導(dǎo)致敏感性的減少。盡管外排泵調(diào)節(jié)新出現(xiàn)的描述變得越來越復(fù)雜，仍有很多情形是泵的過量表達是調(diào)節(jié)基因簡單突變的結(jié)果。例如，銅綠假單胞菌nalB菌株過量表達mexAB-oprM是由于在mexR基因中的突變來，所述的mexR基因編碼阻抑物，其緊接著位于mexAB-oprM基因的上游。見Poole等人，Antimicrob AgentsChemother，40卷，No.9，第2021-2028頁(1996)。在流感嗜血菌中，緊接著位于acrAB上游的ORF HI0983(見圖1)編碼參與調(diào)控acrAB表達的acrR/tetR家族阻抑物。對來自NB65016、NB65027、NB65051和NB65063的HI0893的核苷酸測序顯示出插入/缺失或點突變的存在導(dǎo)致移碼或終止子的引入。見圖4。對來自NB65069和NB65076的acrR基因測序顯示出點突變導(dǎo)致相對于acrR基因的公開序列的氨基酸改變(數(shù)據(jù)未顯示)。acrR突變的此優(yōu)勢強烈的表明由于acrR阻抑物功能的喪失，這些菌株中acrAB外排泵過量表達。
實施例5流感嗜血菌acrR在調(diào)節(jié)對LBM415和大環(huán)內(nèi)酯的敏感性中的作用為了進一步檢測acrR是否是acrAB泵表達的負(fù)調(diào)節(jié)物，以及acrR功能的喪失是否因此導(dǎo)致對LBM415和大環(huán)內(nèi)酯的減少的敏感性，將acrR基因在實驗室菌株NB65044中插入滅活。見圖1。這導(dǎo)致對LBM415敏感性減少了2倍，并且對LBK611和氯林肯霉素的敏感性減少了4倍，但是沒有改變對泵的非底物四環(huán)素NB65044-CDS0008的敏感性。見表3。這說明acrR作用為acrAB基因表達的負(fù)阻抑物。但是卡那霉素盒(cartridge)以與下游acrAB基因座相同方向存在于acrR中(見圖1)，并且不能排除由于極性作用產(chǎn)生acrAB增加的表達。因此，為了進一步闡明acrR突變在減少對LBM415和大環(huán)內(nèi)酯的敏感性中的作用，測試了NB65044暴露在8μg/mL的LBM415下時是否會選擇出具有改變的acrR基因的突變體。在包含8μg/mL的LBM415的巧克力瓊脂上選擇出了菌株NB65044的突變體(頻率；10-8-10-9)，并且對來自10個分離的突變體的acrR基因的檢測顯示在所有10個分離菌中acrR突變(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些突變體中的兩個(NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014，分別具有引入的終止子和氨基酸改變)的敏感性測試(見表3的說明)顯示對LBM415和LBK611的敏感性減少了8倍，以及對氯林肯霉素的敏感性減少了4倍，另外對四環(huán)素的敏感性沒有改變。見表3。此外，表達模式顯示出在兩種突變體以及acrR失活的菌株NB65044-CDS0008中，acrAB轉(zhuǎn)錄物的多度增加(大約2.5倍)，這證明了泵的表達增加。還觀察到了acrR轉(zhuǎn)錄物的多度類似的增加，表明了acrR的自身調(diào)節(jié)，該自身調(diào)節(jié)是對許多外排泵調(diào)節(jié)基因如銅綠假單胞菌中的mexZ和mexR所觀察到的現(xiàn)象。在所選擇的acrR突變體NB65044-CDS0011和NB65044-CDS0014以及菌株NB65044-CDS0008之間抗藥性模式的相似性表明，在菌株NB65044-CDS0008中泵的過量表達不是由來自TN903盒啟動子的極性作用產(chǎn)生的，其中acrR的失活是通過插入與下游acrAB基因座相同方向的TN903卡那霉素抗性決定子?？偨Y(jié)起來，這些數(shù)據(jù)表明對LBM415減少的敏感性可以通過由acrR突變引起acrAB外排泵過量表達的形式突變得到。這和先前在流感嗜血菌中acrR失活的報告形成對比，在先前的報告中在acrR敲除的菌株中沒有觀察到對大范圍化合物的敏感性改變。見Trepod和Mott(2004)，見上。增加的泵的表達并不總是同樣地影響所有的泵的底物，特別是在泵的表達適度增加的情況下，所述的泵如已經(jīng)以顯著水平表達的mexAB-oprM或acrAB。由于泵的效力可能特異性的與個體底物性質(zhì)相關(guān)，所以由適度的泵過量表達產(chǎn)生的敏感性的顯著改變只能對某些集合的泵的底物觀察到，所述的泵的底物在典型水平的泵的表達下被有效排出，在此情形中包括LBM415、LBK611和氯林肯霉素。
實施例6在流感嗜血菌和大腸桿菌中通過PABN和利血平對LBM415的增強流感嗜血菌NB65044-CDS0011用于流感嗜血菌測試。此菌株具有增加的泵的表達，認(rèn)為這能導(dǎo)致對泵抑制的更靈敏的檢測。
對于大腸桿菌測試，使用菌株NB27006。此菌株缺乏天然的AcrAB泵(在H Okusu等人，J.Bacteriol.1996 178306-308中描述)并且是克隆流感嗜血菌acrAB泵基因的適當(dāng)宿主。
流感嗜血菌MIC測定在96孔無菌平板中操作，所述的無菌平板沿著一個軸是LBM415的范圍，沿著另一個軸是外排抑制劑的范圍。所使用的培養(yǎng)基是HTM(Remel)。使用BBL prompt system將接種物設(shè)置為每孔大約10-5個細(xì)菌。
大腸桿菌MIC測定按照上述操作，但是使用Mueller-Hinton測試培養(yǎng)基。
編碼流感嗜血菌AcrAB泵的成分的基因從NB65044基因組DNA中PCR擴增，使用引物acrA prom F1(5’-AATTACGTAAGATAACCTAAGTGCG-3’)(SEQ ID NO.11)和在流感嗜血菌和大腸桿菌中通過MC-207,110和利血平對LBM415的acrBR3增強(5’-TATTAGCGGAATTATCTGAAG-3’)(SEQ ID NO.12)。將含有acrAB的產(chǎn)物克隆到Topo PCR2.1(Invitrogen)中并且轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中(Invitrogen)。將具有插入片段的質(zhì)粒分離并且測序以確保在PCR和克隆期間沒有引入突變。之后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到缺乏其天然AcrAB-TolC泵功能的大腸桿菌株NB27006中。由于已知LBM415被AcrAB-TolC泵出，通過MC-207,110對LBM415的活性增強與所報道的此化合物妨礙RND家族泵功能的能力相符合。還觀察到MC-207,110增強了在流感嗜血菌中被AcrAB-TolC相對有效排出的另一個底物氯林肯霉素。對于非泵底物四環(huán)素不存在于MC-207,110對LBM415增強中所觀察到的增強?？偨Y(jié)起來，數(shù)據(jù)(未顯示)表明對LBM415的作用確實是MC-207,110干擾AcrAB-TolC外排泵排出的總體能力產(chǎn)生的。但是利血平不會增強LBM415或氯林肯霉素(數(shù)據(jù)未顯示)。利血平是基于例如ABC轉(zhuǎn)運蛋白的外排的明確的抑制劑，但是對RND家族泵幾乎沒有活性。
實施例7在大腸桿菌中針對流感嗜血菌AcrAB外排成分的MC-207,110的活性MC-207,110的這種活性，即在過量表達AcrAB泵成分的流感嗜血菌中增強兩種泵的底物氯林肯霉素和LBM415但是不影響泵的非底物四環(huán)素的活性，表明MC-207,110在流感嗜血菌中較弱的作用為AcrAB-TolC泵的抑制劑。為了進一步檢測此作用，將流感嗜血菌的acrAB基因克隆到大腸桿菌NB27006中并且用于反式互補其中的AcrAB泵的缺陷。已經(jīng)表明大腸桿菌天然的AcrAB-TolC泵能賦予針對LBM415的顯著性的內(nèi)在抗性(MIC一般為128μg/ml以及更高)。相應(yīng)的，AcrAB-TolC泵功能的缺陷菌株是敏感的(MIC一般為約1μg/ml)。使用流感嗜血菌acrAB基因?qū)Υ竽c桿菌菌株NB27006中泵缺陷的補償導(dǎo)致對LBM415抗性顯著性的增加(MIC 32μg/ml)。這表明acrAB基因在大腸桿菌中有功能并且它們能和大腸桿菌TolC外膜通道形成功能性單元。
由于外排泵被此類因素如外膜通透性所影響，并且認(rèn)為大腸桿菌具有比流感嗜血菌通透性小的外膜(可能引起外排對抗藥性影響的增加)，推論出流感嗜血菌AcrAB泵的抑制的檢測在大腸桿菌的背景中更加敏感。與此相符，在用流感嗜血菌acrAB基因反式補償?shù)拇竽c桿菌NB2007中，觀察到了MC207,110對于LBM415和氯林肯霉素的活性增強。另外，沒有檢測到四環(huán)素的增強。這是令人感興趣的，因為天然大腸桿菌AcrAB-TolC泵不排出四環(huán)素。這表明流感嗜血菌泵的抗生素底物模式在大腸桿菌菌株中被保存。此數(shù)據(jù)另外支持了這種觀點，即MC-207,110能干擾流感嗜血菌AcrAB-TolC泵對LBM415的外排。
權(quán)利要求
1.在哺乳動物中治療革蘭氏陰性菌感染的方法，其包括施用有效量的式(I)化合物或其鹽或其前體藥物以及外排泵抑制劑； 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，X是-CH2-。
2.權(quán)利要求1的方法，其中雜芳基是式(III)的殘基 其中每個R6、R7、R8和R9獨立地是氫、烷基、取代的烷基、苯基、鹵素、羥基或烷氧基。
3.權(quán)利要求11的方法，其中式(III)的化合物是
4.權(quán)利要求2的方法，其中細(xì)菌感染由具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌引起。
5.權(quán)利要求4的方法，其中革蘭氏陰性菌選自大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、流感嗜血菌(H.influenzae)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
7.用于治療在哺乳動物中由具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌引起的革蘭氏陰性菌感染的方法，所述方法包括施用有效量的化合物 以及在革蘭氏陰性菌中抑制RND外排泵的外排抑制劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中革蘭氏陰性菌選自大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
9.權(quán)利要求8的方法，其中革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
10.增加革蘭氏陰性菌對式(I)的化合物或其鹽或其前體藥物的敏感性的方法 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且n是0-3，條件是當(dāng)n是0時，X是-CH2-；所述方法包括使細(xì)菌接觸有效量抑制革蘭氏陰性菌中的外排泵的式(I)的化合物和外排泵抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中雜芳基是式(III)的殘基 其中每個R6、R7、R8和R9獨立地是氫、烷基、取代的烷基、苯基、鹵素、羥基或烷氧基。
12.權(quán)利要求11的方法，其中式(III)的化合物是
13.權(quán)利要求10的方法，其中革蘭氏陰性菌中的外排泵是RND外排泵。
14.權(quán)利要求13的方法，其中革蘭氏陰性菌選自大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
15.權(quán)利要求14的方法，其中革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
16.用于增加具有RND外排泵的革蘭氏陰性菌對下述化合物的敏感性的方法， 包括使革蘭氏陰性菌接觸有效量抑制革蘭氏陰性菌中的RND泵的化合物和外排泵抑制劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中革蘭氏陰性菌選自大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
18.權(quán)利要求17的方法，其中革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
19.藥物組合物，其包含式(I)的化合物或其鹽或其前體藥物、外排泵抑制劑和可藥用的載體； 其中X是-CH2-、-S-、-CH(OH)-、-CH(OR)-、-CH(SH)-、-CH(SR)-、-CF2-、-C＝N(OR)-或-CH(F)-，其中R是烷基；R1是芳基或雜芳基；每個R2、R3、R4和R5獨立地是氫或烷基，或R2或R3和R4或R5共同形成C4-7環(huán)烷基；并且N是0-3，條件是當(dāng)n是0時，x是-CH2-。
20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中式(I)的化合物的雜芳基是式(III)的殘基 其中每個R6、R7、R8和R9獨立地是氫、烷基、取代的烷基、苯基、鹵素、羥基或烷氧基。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中式(III)的化合物是
22.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中外排抑制劑抑制革蘭氏陰性菌中的RND外排泵。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中革蘭氏陰性菌選自大腸桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血菌和淋病奈瑟氏球菌。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中革蘭氏陰性菌是流感嗜血菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過使用外排泵抑制劑增加PDF抑制劑對革蘭氏陰性生物的敏感性的方法和組合物。
文檔編號A61P31/04GK1976703SQ200580022039
公開日2007年6月6日 申請日期2005年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者C·R·德昂, N·S·賴德 申請人:諾瓦提斯公司