專利名稱：TGFβ1－抑制肽的制作方法
背景技術(shù)：
描述細胞生長由生長因子家族的各種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)(Schalch DS等(1979)內(nèi)分泌學(Endocrinology)1041143-1151)。參與細胞發(fā)育，并能夠由自分泌和旁分泌機制發(fā)揮作用的最重要生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)(Braun L.等(1988)細胞生物學(Cell Biol.)851539-1543；LyonsRM和Moses HL(1990)歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)187467-473)。
術(shù)語TGF首次用于描述由鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的細胞系產(chǎn)生的活性(deLarco JE和Todaro GJ(1978)國立科學院科學學報(Proc.Natl.Acad.Sci.)754001-4005；Mizel SB等(1980)國立科學院科學學報，772205-2208)。這些細胞的懸浮液能夠誘導需要固體支持物支持生長的細胞在軟瓊脂中正常生長。更具體的研究證明存在兩類TGF，稱之為TGFα和TGFβ，它們又包括相關(guān)蛋白質(zhì)家族。TGFβ家族由五個二聚體結(jié)構(gòu)(Schlunneger MP和Gmutter MG(1992)自然358430-434；Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.275-18)的同種型構(gòu)成(Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.275-18)。對從單一物種純化出來的成熟蛋白質(zhì)的研究表明它們的序列之間存在高度相同性(表1)。表1.不同型TGFβ之間的同源性。TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3來源于人，TGFβ4來源于雞，TGFβ5來源于狗。(Roberts AB和Sporn MB，1990)。
TGFβ1以一種具有390個氨基酸稱之為前-原-TGFβ1的前體合成。在第一次水解中，釋放出一種29個氨基酸的疏水片段，得到原-TGFβ1。然后在TGFβ1氨基末端之前的、由兩個精氨酸構(gòu)成的區(qū)域中的再次切割得到成熟TGFβ1，其為112個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為12KDa。為了形成生物活性形式，這兩種單體通過二硫鍵連接到一起，產(chǎn)生一種25KDa的二聚體。這種結(jié)構(gòu)的改變導致生物功能的喪失(Barnard JA等(1990)生物化學和生物物理學報(Biochem.Biophys.Acta)103279-87)。
已知TGFβ1結(jié)構(gòu)中存在多種結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域之一定位在氨基酸40-82之間，涉及TGFβ1與其細胞受體的結(jié)合(Quian SW等(1992)國家科學院科學學報896290-6294；Burmester JK等(1993)國家科學院科學學報908628-8632)。TGFβ1和其它結(jié)合蛋白質(zhì)的受體已經(jīng)鑒定了五種TGFβ1的特異性受體(Cheifetz S等(1988)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26317225-17228；Lopez Casillas F.等(1991)細胞(Cell)67785-795)。這些受體對不同型TGFβ1具有不同的親合性。I、II和III型受體目前了解最為清楚(Attisano L等的綜述(1994)生物化學和生物物理學報122271-80；Derynck R(1994)生物化學趨勢(Trends Biochem.Sci.)19548-553；Yingling等(1995)生物化學和生物物理學報1242.115-136)。IV型受體(MacKay K.和Danielpour D.(1991)生物化學雜志2669907-9911)和V型受體(Ichiji H.等(1991)生物化學雜志26622459-22464)也已有描述。還曾報道endoglin的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(Cheifetz S等(1993)生物化學雜志26719027-19030；Bellon T.等(1993)歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)2232340-2345；Yamashita等(1995)免疫學雜志(J.Immunol.)156564-573)與人和大鼠的III型受體具有約70％的相似性。
RIII可能是一種具有下述功能的受體，其結(jié)合TGFβ1并將它呈遞給RII(其可能又與RI形成復合物)(Yamashita等(1994)生物化學雜志26920172-20178)或者復合物(其中各種RI分子與RII結(jié)合)(Weiss G.和Massague J.(1996)EMBO J 15276-289)。RII-RI的相互作用將促進RI的磷酸化，隨后激活其絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，該激酶將使類似MADR2蛋白的第二信使磷酸化(Macias-Silva M等(1996)細胞871215-1224)。TGFβ1在肝分化和再生中的作用根據(jù)發(fā)育時段和細胞類型產(chǎn)生的作用是不同的。
·增大胞外基質(zhì)，作用于肝星狀細胞(Ito細胞)——基質(zhì)蛋白質(zhì)的基本來源(Mustoe TA等(1987)科學2371333-1336)。
·使上皮細胞和肝細胞分化(Florini JR等(1986)生物化學雜志26116509-16513)。
·在肝再生過程中抑制細胞生長。該作用對于維持細胞體外休眠十分重要(Kato Y等(1988)國家科學院科學學報859552-9556)。
·抑制上皮生長因子(EGF)受體的胞吞作用，如在胎鼠肝細胞培養(yǎng)中觀察到的那樣(Noda M.和Rodan GA(1987)細胞生理學雜志(J.Cell Physiol.)133426-437)。TGFβ1在肝纖維化中的作用發(fā)現(xiàn)TGFβ1與肝纖維化進程有關(guān)(Czaja MJ等(1989)細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)1082477-2482；Annoni G.等(1992)J.Hepatol.14259-264)，其導致通過肝星狀細胞(肝細胞或Ito細胞)上它們的受體使胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加，并抑制使基質(zhì)降解的蛋白水解酶的合成(Ignotz RA和Massague J.(1986)生物化學雜志2614337-4345)。在肝臟中，TGFβ1誘導肝臟星狀細胞中膠原蛋白和粘連蛋白的合成(Weiner FR(1990)肝臟學(Hepatology)11111-117)。還通過誘導其mRNA，增加其自身合成，實現(xiàn)自動調(diào)節(jié)。
還發(fā)現(xiàn)TGFβ1涉及由肝細胞和激活的肝星狀細胞合成的α2-巨球蛋白的合成增加。據(jù)稱α2-巨球蛋白通過與TGFβ1結(jié)合并使其滅活(BachemMG(1994)Ann NY Acad.Sci.737421-424)，從胞外空間消除TGFβ1。
對慢性肝病患者的研究表明，在TGFβ1表達與I型原膠原蛋白的mRNA表達和原膠原蛋白III型肽的血清水平之間存在相關(guān)性(Castilla A.等(1991)N.Engl.J.Med.324933-940)。
肝硬化患者由于疾病過程產(chǎn)生的并發(fā)癥，例如門靜脈高壓或肝功衰竭，使他們的存活期比正常生命期限短。TGFβ1對胞外基質(zhì)的影響TGFβ1與細胞受體的相互作用導致·激活原膠原蛋白、粘連蛋白(Ignotz RA等(1987)生物化學雜志2626443-6446)和相關(guān)蛋白質(zhì)，包括能夠與胞外基質(zhì)成分相互作用的膜蛋白(Carter WG(1982)生物化學雜志25713805-13815)的合成。
·抑制能夠降解基質(zhì)的蛋白水解酶的合成(Fukamizu H.和GrinellF.(1990)實驗細胞研究(Exp.Cell Res.)190276-282)。
·刺激蛋白水解酶抑制劑的合成(Fukamizu H.和Grinell F.(1990)實驗細胞研究190276-282)。
這些作用導致細胞與胞外基質(zhì)相互作用的增強，其與基質(zhì)的組成蛋白質(zhì)的較高識別結(jié)合，導致胞外基質(zhì)總量增加(Roberts CJ等(1988)生物化學雜志2634586-4592)。這些結(jié)果證實TGFβ1參與愈合過程(Fukamizu H.和Grinnell F.(1990)實驗細胞研究190276-282；Bamard JA等(1990)生物化學和生物物理學報103279-87)。肽作為配體-受體相互作用的抑制劑存在這樣的可能性，即用小分子、合成肽作為體內(nèi)存在分子的類似物，用于模擬體內(nèi)分子的功能。LeSateur等進行的研究證實了應用神經(jīng)生長因子(NGF)的環(huán)狀類似物模擬β回文區(qū)，使其結(jié)合受體的可能性(LeSateur L.等(1996)天然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)141120-1122)。還可能應用肽作為這些分子的拮抗劑，通過該肽介導的封閉作用阻止天然因子與其受體的相互作用(Lasate JJ等(1994)獲得性免疫缺陷綜合癥雜志(J.Acquired Immune Deficiency Syndromes)7129-134；LeSateur等(1995)生物化學雜志2706564-6569)。早期研究證明了合成肽作為配體-受體相互作用的抑制劑的有用性，甚至當識別表位不連續(xù)時同樣如此(Daniels AJ等(1995)分子藥理學(Mol.Pharmacol.)48425-432)。其它有關(guān)TGFβ1的II型受體和胎球蛋白，一種II型受體家族中的糖蛋白的研究，證明了應用環(huán)狀肽作為TGFβ1與RII相互作用抑制劑的可能性(Demetriou M.等(1996)生物化學雜志27112755-12761)。通過這種環(huán)化，即可能獲得具有類似于體內(nèi)可能獲得肽結(jié)構(gòu)的肽。發(fā)明詳述由于前面陳述的原因，我們認為來源于TGFβ1和其受體，或者來源于能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)的肽，能夠作為TGFβ1活性的抑制劑。因此我們決定開發(fā)該可能性。待合成肽的選擇根據(jù)肽來源于TGFβ1還是來源于其受體，按照不同方式選擇用于合成的肽。
對于TGFβ1序列的情況，從包括TGFβ1全序列的15個氨基酸合成肽。每個肽具有與它的兩個直接鄰居相同的10個氨基酸。
對于TGFβ1受體序列的情況，基于我們實驗室設(shè)計的軟件選擇肽。用一種計算機程序比較兩個氨基酸序列，旨在于預測部分互補區(qū)。也應用了其它程序，它們能夠基于構(gòu)成這些序列的氨基酸的疏水性和親水性，預測暴露最多的蛋白質(zhì)區(qū)域。肽的合成通過固相法(Merrifield(1963)美國化學協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)852149-54)，應用芴基甲氧羰基(Fmoc)作為alpha-氨基的臨時保護基(Atherton等(1989)Journal of Chemical Society Perkins Transaction1538-546)合成肽。對于多種肽的少量合成，應用多重合成儀，其允許96個肽的同步合成(Borras-Cuesta等(1991)生物學(Biologicals)19187-190)。將肽在-80℃以固體狀態(tài)儲藏，直到使用。通過HPLC純化肽通過高效液相色譜(HPLC)，應用Waters600E-900系統(tǒng)(MilliporeCorp.，Bedford，USA)分析和純化合成的肽。
應用Waters Radial-PakTMC18300 15μm，8×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)通過分析型HPLC分析肽。將肽溶解于0.1％TFA的蒸餾水溶液，至最大濃度為1mg/ml。將肽溶液(100μl)注射到柱中，在水/乙腈梯度中洗脫(

圖15)(Romid Ltd.，Cambridge，USA)，均用0.1％TFA，流速為1ml/min。通過220nm和280nm處的肽吸收度檢測含肽的組分(光敏二極管陣列檢測儀，Waters 991，Millipore Corp.，Bedford，USA)。
應用Waters Delta-PakTMC18300 15μm，25×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)進行肽的純化。溶解肽，并在與前面程序同樣的條件下注射(2ml)，應用同樣的梯度，流速為5ml/min。將含純化肽的組分收集到一個燒瓶中。肽活性的體外實驗研究細胞系使用來自貂肺上皮細胞的細胞系MV-1-Lu(CCL-64，美國典型細胞培養(yǎng)中心(American Type Cell Culture)，Virginia，USA)。細胞在162cm2的培養(yǎng)瓶(Coster Corporation，Cambridge，USA)中，在37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱中生長，直到獲得亞匯合。使用完全培養(yǎng)基添加5％胎牛血清(FCS，Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)、10mM HEPES(1M HEPES緩沖液，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)的含L-谷氨酰胺(GibcoBRL，LifeTechnologies Ltd.，Paisley，Scotland)的RPMI1640。MV-1-Lu細胞系的生長抑制實驗用5ml胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)從培養(yǎng)瓶的底部除下如上述生長的MV-1-Lu細胞，重懸浮于完全培養(yǎng)基，以1500rev/min離心8分鐘。離心后，將細胞以50000個細胞/ml的濃度重懸浮于完全培養(yǎng)基。進行實驗時，取10ml細胞懸浮液分散于96孔、平底培養(yǎng)板(Costar Corporation，Cambridge，USA)，每孔加100μl，在37C和5％CO2下培養(yǎng)過夜，使細胞附著到孔的底面。在培養(yǎng)結(jié)束時，在存在RPMI(R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)中濃度為200pg/ml TGFβ1的情況下，將待實驗的肽加入RPMI至終濃度為200μg/ml。每孔中FCS的終濃度為2.5％。培養(yǎng)24小時后，向每孔加入1μCi的氚代胸苷(25 Ci/mmol [甲基-3H]-胸苷，Amersham Life Science，Buckinghamshire，UK)再次培養(yǎng)12小時(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)83764-770；Brennan FM等(1990)臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)81278-285)。
在培養(yǎng)結(jié)束時，用胰蛋白酶-EDTA從孔底除下細胞，通過人工收獲儀(Titertek細胞收獲儀，Skatron Instruments Inc.，Sterling，USA)收集細胞，并破碎細胞，在硝酸纖維素濾紙(Filter MAT 11731，Skatron InstrumentsInc.，Sterling，USA)上收集固定于其上的DNA。將濾紙分別置于5ml聚丙烯試管，象其中加入4ml發(fā)光液體(Biogreen-11，Reactivos Scharlau S.A.，Barcelona，Spain)。在βLKB發(fā)光記錄儀上90秒定量檢測各管的活性(Betaplate system，LKB，Uppsala，Sweden)。TGFβ1與細胞受體結(jié)合的抑制研究細胞受體的選擇性標記(親合性標記)從培養(yǎng)瓶取出MV-1-Lu細胞，將它們與10ml溶液1(128mM NaCl、25mM 4-(2-羥基)-1-哌嗪乙基磺酸鹽pH7.5、5mM葡萄糖和1mMEDTA)在37℃培養(yǎng)10分鐘。然后將取出的細胞重懸浮于溶液2(128mMNaCl、5mM KCl、50mM 4-(2-羥基)-1-哌嗪乙基磺酸鹽pH7.5、1.2mMMgSO4和5mg/ml BSA)，通過1000×g離心5分鐘收集細胞。細胞離心后，以106個細胞/ml的濃度重懸浮于溶液2。
從該細胞懸浮液，取0.5mL置于24-孔平板(Greiner GmbH、Frickenhausen，Germany)，加入50μl 0.8mg/ml的肽溶液，然后在4℃保溫2小時同時攪拌。接下來，加入終濃度為277.2pM的125I-TGFβ1(2μCi)(125I-TGFβ1人重組800-2200Ci/mmol，Amersham Lift Science，Buckinghamshire，UK)，再次在4℃攪拌下保溫2小時。
保溫后，將細胞轉(zhuǎn)移到一個離心管中，然后在12000 xg下冷卻離心1分鐘。然后在0.5ml冷溶液2、5μl二甲亞砜(DMSO99.5％，SigmaChemical Co.，St.Louis，USA)和DSS終濃度為0.25mM的二琥珀酰辛二酸酯(DSS，Pierce Chemical Co.，Rockford，USA)中重懸浮。通過稀釋、離心和用含0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA的溶液(pH7.4)沖洗中止反應。細胞沉淀重懸浮于0.5ml Triton X-100(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)1％v/v、10mM Tris(pH7.0)、1mM EDTA、0.1mM氟化苯甲基磺酸鹽、1μg/ml抑肽素和1μg/ml亮肽素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，并在4℃保溫40分鐘。在去污劑中不溶的部分通過在12000×g離心15分鐘分離出去。在去污劑中溶解的部分(上清液)和不溶部分(沉淀)在-20℃冷凍(Massague J.和Like B.(1985)生物化學雜志2602636-2645)。在聚丙烯酰胺十二烷基磺酸鈉凝膠中電泳蛋白質(zhì)通過在7.5％丙烯酰胺/二丙烯酰胺凝膠中，220伏電壓下電泳5-6小時，分析在去污劑中的可溶組分和不溶組分。
用考馬斯亮藍 R250(Serva Feinbiochemica GmbH，Heidelberg，Germany)的甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸餾水溶液染色蛋白質(zhì)30分鐘。然后第一次漂洗用甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸餾水溶液沖洗15分鐘，隨后用甲醇(2.5％)、乙酸(0.5％)和蒸餾水進行隨后的漂洗，直到背景顏色除去。流動細胞記數(shù)通過直接免疫熒光法測定由肽介導的TGFβ1與細胞受體結(jié)合的抑制作用。其中應用了一種免疫熒光試劑盒(Fluorokine rh TGFβ-生物素，R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)。具體地說，該實驗基于生物素?；疶GFβ1結(jié)合細胞受體的能力，以及隨后生物素與熒光標記抗生物素蛋白的相互作用，因此信號強度將依賴于與細胞受體結(jié)合的TGFβ1的量。
用溶液1(前面描述的)除下在162cm2培養(yǎng)瓶中生長的MV-1-Lu細胞，重懸浮于生理鹽水，在500×g離心5分鐘。離心后，細胞再次以4×106個細胞/ml的濃度懸浮于生理鹽水。將25μl細胞懸浮液加入12×75mm硼硅酸鹽試管，向其中加入在40μl RPMI 1640培養(yǎng)基中的待實驗肽，使其終濃度為0.42μg/ml，和10μl生物素酰化的TGFβ1。作為特異性對照，加入10μl試劑盒中提供的生物素酰化試劑，加入10μl生物素?；腡GFβ1作為陽性對照，加入20μl抗-TGFβ1的阻斷抗體作為陰性對照。向所有對照中加入生理鹽水，至總體積為75μl。所有試管在4℃黑暗條件下保溫1小時。
在保溫結(jié)束時，加入10μl熒光素標記的抗生物素蛋白，在4℃黑暗條件下保溫30分鐘，之后加入2ml清洗液(RDF1)，然后在500×g下離心6分鐘。細胞沉淀重懸浮于0.2ml冷PBS，用于細胞記數(shù)(FACScan，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，California，USA)。當一束激光偶爾照射到孔上時，該方法能夠應用一種計算機程序(LisysTMII，BectonDickinson Immunocytometry Systems，California，USA)測定各細胞發(fā)射的熒光。圖16顯示了一副通過流動細胞記數(shù)分析得到的典型圖像。
為了得到TGFβ1與其受體結(jié)合抑制的數(shù)據(jù)，應用實驗的陽性對照，以劃出相當于結(jié)合TGFβ1-生物素(M2)和結(jié)合未標記細胞(M1)的標記細胞的范圍。一旦劃出該范圍，則可計算定位在它們之中每一個上的細胞百分數(shù)。對于當肽與TGFβ1-生物素或與細胞(根據(jù)肽是否分別來源于受體還是TGFβ1)共同保溫時得到的數(shù)據(jù)，進行同樣的操作。利用這些數(shù)據(jù)，同時應用下列算式計算各肽的抑制百分率100-((M2肽-M2陰性)×100/(M2陽性-M2陰性))。在纖維癥模型中的體內(nèi)實驗使用來自同一窩(5周±1.5周)的白色雄性大鼠(albino Wistar品系)，為了得到年齡和初始重量均一的一組動物。整個實驗過程中，動物保持在恒溫(22℃)和12小時光照和黑暗循環(huán)條件下。它們可以隨意取水和食物。
通過吸入四氯化碳共11周，每周兩次，誘導肝硬化(HC)(Lopez NovoaJM等(1976)Patologia IX223-240；Camps J.等(1987)胃腸病學(Gastroenterology)93498-505)。通過經(jīng)一個氣體洗瓶，以3升/分鐘的流速吹進壓縮空氣，實現(xiàn)接觸CCl4。最初接觸1分鐘，之后每周增加1分鐘，直到第四周達到4分鐘。在第五周不給CCl4，第六周重新開始，接觸5分鐘。5分鐘的接觸時間維持到11周。從開始接觸CCl4前1周到實驗結(jié)束時，在引用水中加入400mg/l苯巴比妥(Luminal，Bayer，Leverkusen，Germany)。在開始處理之前，留出一周不施用CCl4。在處理過程中，按照記錄(圖2)給動物施用一周劑量的CCl4。動物的分布在開始誘導肝硬化之前，將動物分成4組。
健康對照(Co)沒有接受纖維化處理的動物。
處理的健康對照(Co＋P144)沒有接受纖維化處理，但在最后3周施用肽P144的動物(與大鼠Tto2組的處理時間一致)。
硬化對照1(Ci1)每周吸入CCl4兩次，接受硬化誘導處理的動物。到第五周時將這些動物分成2組硬化對照1(Ci1)11周以后，繼續(xù)接受纖維化誘導處理，而沒有接受肽P144的動物。在整個誘導過程中，在不施用CCl4的其它天給它們施用鹽水血清(第5到11周)。
處理的硬化1(Tto1)在誘導纖維化過程的第5到11周中，在不施用CCl4的其它天，施用來自III型受體序列的肽P144的動物。
硬化對照2(Ci2)連續(xù)接受纖維化誘導處理而不接受肽P144或鹽水血清的動物。到第11周將這組動物分成另兩組。
硬化對照2(Ci2)不接受任何類型處理的硬化動物，作為對照。這些動物接受3周鹽水血清的注射(第13到15周)。
處理的硬化2(Tto2)用來自III型受體(P144)序列的肽處理3周(第13至15周)的硬化動物。動物的處理·Tto1組這些動物在纖維化過程中接受處理。在第5周開始用肽的處理(在接觸CCl4之前的5分鐘)，持續(xù)到硬化誘導過程的第11周末?！to2組這些動物在纖維化誘導過程(11周)完成后接受處理。在最后一次吸入后的一周開始處理，持續(xù)21天。
在開始處理之前和處理之后，從所有接受肽處理的動物體內(nèi)取血。在腹部以500μl生理鹽水中70μg/只動物的劑量皮下注射施用肽。處死動物并解剖出肝臟當完成用肽處理動物后，對于大鼠模型和小鼠模型，用毛細管從動物的后-眶血管叢取血后，斷頭處死動物。
然后立即解剖肝臟并收集樣品。切碎樣品并置于甲醛中作為固定液，用于以后的組織學檢查。其它碎片置于浸在液氮中的冷凍管中，然后-80℃儲藏。肝臟的病理解剖學評價將之前固定在甲醛中至少24小時的肝臟碎片進行組織學檢查，之后將它們置于乙醇中(70％)。
脫水后，將它們嵌入石蠟塊。用Leitz旋轉(zhuǎn)式顯微鏡用薄片切片機和鋼刀從得到的石蠟塊連續(xù)制備3μm厚的切片。染色之前將切片置于二甲苯(AnalaR、BDH、Poole，UK)中15分鐘脫石蠟，將它們在60℃的烘箱中加熱15分鐘后，使它們連續(xù)通過濃度降低的乙醇100％、96％、80％和70％最后是水，使它們脫水。使用下列染料蘇木素-曙紅Masson’s三色(trichromic)(Locquin M.和Langeron，(1985)in Manual deMicroscopia Ed.Labor S.A.Barcelona)對于膠原蛋白應用一種特定染料(綠光)。天狼紅膠原蛋白的特異性染料。肝纖維化的確定圖像分析對于得到樣品的圖像分析，應用一種連接有攝象機(Sony DXP-950P，Sony Co.，Tokyo，Japan)的光學顯微鏡(Olympus BH-2，Tokyo，Japan)，利用該裝置各切片的每個視野均被拍攝下來。對于每個切片隨機拍攝六個視野。利用計算機程序(Visilog 4.1.5，Noesis，Orsay，F(xiàn)rance)分析拍攝的各種圖像，該程序能夠計算纖維化面積和切片的總面積。從這些數(shù)據(jù)計算各視野的纖維化指數(shù)(纖維化面積/總面積)。為了能夠應用該程序，有必要應用偏振光濾光片(Olympus U-POT，Tokyo，Japan)和綠光濾光片(Olympus IF550，Tokyo，Japan)改變圖像的物象，其使樣品分析過程的自動化成為可能。石蠟-處理組織的14μm切片中的膠原檢測按照前面描述的3μm切片的同樣方式制備用于該方法的14μm切片。將這些切片置于二甲苯12小時，使它們脫石蠟。去除石蠟后，將它們通過不同濃度的乙醇96％、80％、50％，使樣品脫水，最后在蒸餾水中完成該過程。
脫水后，使它們在160mg Fast Green FCF(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)的160ml飽和苦味酸(Merck，Darmstadt，Germany)溶液中黑暗下保持15分鐘進行預染色處理。將樣品浸入水中漂洗，直到它們不再使漂洗水顯色。去除紫色染料后，使樣品在160mg Direct Red 80(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)和64mg Fast Green的160ml飽和苦味酸溶液中黑暗下保持30分鐘染色樣品。再次漂洗它們，直到去除紫色染料，然后用小抹刀刮樣品，以從薄片上分離樣品。以這種方式分離下來的切片分別置于含3ml NaOH 0.1N(Quimon，Montplet&Esteban S.A.，Barcelona，Spain)和甲醇(1∶1)的試管中。從各試管取等量液體，在分光光度計(Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer，Perkin-Elmer，Norwalk USA)上，在波長540nm和630nm處讀數(shù)，以NaOH0.1N和甲醇液的等量液作為空白(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)Histochem，Cytochem.33737-743；Gaudio E.等(1993)國際實驗病理學雜志(Int.J.Exp.Path.)74463-469)。
按照Gaudio E.等((1993)國際實驗病理學雜志74463-469)的工作，施用下列公式計算膠原蛋白和總蛋白的量 結(jié)果的統(tǒng)計學分析對體內(nèi)實驗得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。通過Shapiro-Wilks實驗驗證量變的常態(tài)。
由于沒有將數(shù)據(jù)調(diào)整到正常分布，進行了非-參數(shù)統(tǒng)計分析。利用Kruskal-Wallis H方法，然后通過Mann-Whitney U.比較，實現(xiàn)組間比較。數(shù)據(jù)用直方圖表示，并表示了數(shù)據(jù)的中值(每個框內(nèi)的粗線)，以及四分位內(nèi)數(shù)的間距(框的高度)，而各框的“胡須”表示一個給定四分位數(shù)的間距的最高和最低觀察值。
用Fisher’s精確度檢驗研究變量之間的相關(guān)性。應用邏輯回歸研究這些變量相關(guān)性的獨立性。
P值等于或低于0.05被認為具有顯著性。
用Windows V 6.1.3.的程序SPSS完成所有統(tǒng)計分析。TGFβ1的體外抑制活性抑制MV-1-Lu細胞系細胞生長的實驗TGFβ1是一種能夠抑制MV-1-Lu細胞系體外生長的細胞因子(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)83764-770；Brennan FM等(1990)臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)81278-285)，因此用該細胞系實驗肽對TGFβ1的阻斷作用。我們應用培養(yǎng)基、細胞和腺苷的不同組合，研究不同濃度的TGFβ1對培養(yǎng)中的MV-1-Lu細胞整合[甲基-3H]胸苷的影響，用于確定實驗的最合適條件。這些條件在圖3中顯示。
確定MV-1-Lu細胞的最佳濃度(5000細胞/孔)和能夠產(chǎn)生約90％細胞抑制的最低TGFβ1濃度(200pg/ml，圖18)之后，對濃度為200μg/ml的合成肽的抑制作用進行實驗。合成肽對TGFβ1活性的體外抑制用MV-1-Lu細胞系實驗作為TGFβ1活性的潛在抑制劑的合成肽，該合成肽是按照“待合成肽的選擇(來源于結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)和TGFβ1本身的肽)”部分描述的方法選擇出來的。將肽溶解于緩沖的RPMI培養(yǎng)基，無胎牛血清，應用下列程序?qū)儆谑荏w序列的肽，或互補于TGFβ1親水性峰的肽，在存在該細胞因子的情況下，保溫30分鐘，然后與細胞培養(yǎng)物混合。將來源于TGFβ1序列的肽在加入TGFβ1之前加到細胞培養(yǎng)物中，因為它們與細胞表面受體相互作用。在100μl用于加入細胞的同樣培養(yǎng)基中進行上述保溫。根據(jù)活性肽抑制TGFβ1的能力不同，使細胞生長程度較大或較小。利用來源于TGFβ1的肽抑制TGFβ1首先，合成來源于TGFβ1的重疊肽。合成這些肽(表2)，期望它們中的某些能夠結(jié)合細胞受體，因此防止天然TGFβ1與這些受體的結(jié)合。表2.來源于TGFβ1的肽。顯示了肽的數(shù)目，在完全序列中的位置，以及其氨基酸序列。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一個丙氨酸，其未在表中顯示。肽 序列Pl(280-293)AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsnP2(284-297)AsnTyrCysSerSerThrGluLysAsnCysCysValArgP3(288-301)SerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGlnLeuTyrIleP4(294-307)CysCysValArgGlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuP5(296-311)GlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpP6(302-315)AspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProP7(306-319)AspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisP8(308-321)GlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnP9(312-325)IleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyP10(316-329)LysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrPll(319-333)HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuP12(322-335)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP13(326-339)ProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysP14(330-343)IleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuP15(335-349)ThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP16(336-349)GlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP17(340-353)ValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaP18(343-358)LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP19(344-358)TyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP20(348-360)AsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnP21(350-363)GlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluP22(354-367)AlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleP23(358-371)ValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleValTyrTyrValP24(364-377)ProLeuProIleValTyrTyrValGlyArgLysProLysValP25(368-381)ValTyrTyrValGlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerP26(372-385)GlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerAsnMetIleValP27(378-391)GluGlnLeuSerAsnMetIleValArgSerCysLysCysSer
圖4顯示了表6中的肽對TGFβ1活性的抑制作用。因為TGFβ1抑制MV-1-Lu細胞的生長，肽對這些細胞因子的抑制作用導致重新實現(xiàn)MV-1-Lu細胞的生長。
從圖4中可以看到，來源于TGFβ1序列的肽P12是一種對TGFβ1活性表現(xiàn)較高抑制作用。為了更詳細研究肽P12的抑制作用，進行下列關(guān)于肽濃度對細胞因子抑制作用影響的研究，其在下面描述。肽P12對TGFβ1的抑制作用的劑量-反應實驗研究了肽P12的濃度對TGFβ1活性的抑制作用的影響。由于該肽不容易溶解于實驗培養(yǎng)基，用肽的名義濃度(那將是如果肽完全溶解得到的濃度)制備儲備液或懸浮液，然后從中取等分液，過濾，或甚至直接用于抑制實驗。
圖5考察了過濾前和過濾后，名義濃度的肽的抑制作用?？梢钥吹剑^濾或不過濾，肽P12實際上具有相同的活性。
得到肽P12的結(jié)果后，決定在N-末端和C-末端雙向延長肽，研究對其活性的影響。另外，對其序列進行改變，以改善其溶解性，并研究其序列中兩個半胱氨酸對TGFβ1抑制活性的重要性。表3中描述了合成的肽。表3.來源于對肽P12進行修飾的肽肽 序列P12(322-335)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP28(322-344)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnLysValLeuAlaLeuTyrP29(313-335)HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP30 PheSerLeuGiyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP31 PheCysLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP32 PheSerLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP33 PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP34 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP35 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP36 GlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP37 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerP38 AspGlyProCysProTyrIleTrpSerAsp圖6顯示了表3中的肽對TGFβ1的抑制作用的結(jié)果。
從圖6中可以看到，肽P29是有活性的。該肽包括以前實驗的肽P12，并在N-末端方向具有9個額外氨基酸(圖4)。按照Quian SW等((1992)國家科學院科學進展896290-6294)和Brmester JK等((1993)國家科學院科學進展908628-8632)的方法，應用鑒定有上述細胞因子活性必須的TGFβ1區(qū)(成熟TGFβ1序列中的氨基酸40到82)的嵌合重組蛋白質(zhì)進行研究。推測肽P29(成熟TGFβ1序列中的氨基酸34到56)，其比肽P12(氨基酸43到56)延長了一個較長的區(qū)域，可能需要一種更類似環(huán)狀TGFβ1結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。由于這個原因，用肽P29基于親合性標記實驗結(jié)合細胞受體。肽P29對TGFβ1與其受體結(jié)合的抑制實驗(親合性標記)將來源于TGFβ1序列的肽P29用于親合性標記實驗，用于驗證其抑制TGFβ1與其細胞受體結(jié)合的能力(材料和方法)。
由于應用的125I-TGFβ1的不同批次的活性不同，該實驗中應用的肽的濃度按照各情況下使用的125I-TGFβ1批次的濃度調(diào)整。這些實驗的結(jié)果在圖7和8中顯示。
進行進一步的實驗，以尋找阻斷125I-TGFβ1與細胞受體結(jié)合所需的最小濃度。來源于大鼠III型受體序列的肽對TGFβ1的抑制為了尋找抑制TGFβ1活性的新肽，合成了來源于大鼠III型受體的肽。在預測與TGFβ1序列的氨基酸序列模塊互補的序列區(qū)域基礎(chǔ)上選擇一些肽。期望這些肽將能夠結(jié)合游離TGFβ1，遮蔽它并防止它與細胞受體結(jié)合。
通過重疊10個氨基酸并覆蓋部分III型受體的胞外區(qū)(氨基酸45到410)合成另外一些肽。曾報道可溶性III型受體存在對應的受體胞外區(qū)，將該區(qū)從膜上切下來，作為循環(huán)系統(tǒng)中TGFβ1的遮蔽劑(Lopez CasillasF.等(1991)細胞67785-795)。后來的研究描述了兩種結(jié)合TGFβ1的可能區(qū)域，一種定位在受體的N-末端(Lopez-Casillas等(1994)細胞生物學雜志124557-568)，另一種定位在C-末端側(cè)最靠近膜的區(qū)域(Fukushima D.等(1993)生物化學雜志26822710-22715；Pepin MC等(1995)FEBS Lett.377368-372)。由于上述原因，合成了這些受體的胞外區(qū)，猜測這些肽可能能夠遮蔽循環(huán)中的TGFβ1。
表4顯示了合成的肽。表4.來源于大鼠III型受體的肽。P39到P65是預測互補于TGFβ1的肽，P66到P138是覆蓋受體胞外區(qū)的重疊肽。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加一個丙氨酸，其在表中沒有顯示。肽序列P39(91-102)AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProP40(104-115)ValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpP41(109-120)SerProGlnProLauValTrpHisLeuLysThrGluP42(110-121)ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgP43(333-344)TrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP44(428-439)ProIleValProSerValGlnLeuLeuProAspHisP45(555-566)GlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAlaP46(363-574)LeuSerArgAlaGlyValValValPheAsnCysSerP47(603-614)LeuPheLeuValProSerProGlyValPheSerValP48(605-616)LeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGluP49(707-718)GluLeuThrLeuCysSerArgLysLysGlySerLeuP50(712-723)SerArgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCysP51(717-728)SerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAspP52(722-733)ArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeuP53(727-738)AspAspAlaCysThrSerLeuAspAlaThrMetIleP54(731-742)ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP55(732-743)SerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetGlnP56(737-748)MetIleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPheP57(742-752)MetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAlaP58(747-758)ThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnValP59(761-775)LysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProIleProProP60(766-780)SerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnIleP61(771-785)SerProIleProProProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspP62(776-790)ProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetP63(781-795)PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaP64(786-800)ThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaAlaPheValIleGlyP65(797-809)LeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrIleTyrSerHisP66(45-55)LeuMetGluSerPheThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyP67(50-64)ThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProP68(55-69)CysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluValHisValP69(60-74)ThrThrGlyLeuProArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerP70(65-79)ArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProP7l(70-84)LeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgP72(75-89)ThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisP73(80-94)GlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaP74(85-99)GluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisP75(90-104)LeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProIleValP76(95-109)SerValHisThrHisHisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerP77(100-114)HisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValP78(105-119)PheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrP79(110-124)ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaP80(115-129)TrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuP81(120-134)ArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlyP82(125-139)GlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlySerValValGlnP83(130-144)PheLeuValSerGluGlySerValValGlnPheProSerGlyAsnP84(135-149)GlySerValValGlnPheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaP85(140-154)PheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgP86(145-159)PheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluP87(150-164)GluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValP88(155-169)AsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysP89(160-174)AsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValP90(163-179)ArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluP91(170-184)GluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgP92(175-189)ThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysP93(190-194)LeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnP94(185-159)AsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnValPheProProThrP95(190-201)ValGlyGluAspGlnValPheProProThrCysAsnIleGlyLysP96(195-209)ValPheProProThrCysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuP97(200-214)CysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluP98(205-219)AsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysP99(210-224)AsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCysP100(215-229)TyrLeuGlnProLysAlaA1aGluGlyCysValLeuProSerGlnP101(220-234)AlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGlnProHisGluLysGluP102(225-239)ValLeuProSerGlnProHisGluLysGluValHisIleIleGluP103(230-244)ProHisGluLysGluValHisIleIleGluLeuIleThrProSerP104(235-249)ValHisIleIleGluLeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerP105(240-254)LeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspP110(265-279)AspProGluValValLysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysP11l(270-284)LysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpP112(275-289)IleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpValIleLysSerPheP113(210-294)LysSerValAsnTrpValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnP114(285-299)ValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnLeuLysValI1eAlaP115(250-304)AspValLysGlyAsnLeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyP106(245-259)SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIleP107(250-264)AlaPheGlnValAspIleIleValAspIleArgProAlaGlnGluP108(255-269)IleIleValAspIleArgProAlaGlnGluAspProGluValValP109(260-274)ArgProAlaGlnGluAspProGluValValLysAsnIeuValLeuPl16(295-309)LeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerP117(300-314)ProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrP118(305-319)PheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrMetThrLysLeuValP119(310-324)GluArgSerMetThrMetThrLysLeuValArgAspAspIleProP120(315-329)MetThrLysLeuValArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnP121(320-334)ArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaP122(325-339)SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrP123(330-344)LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP124(335-349)LeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerTyrThrMetAlaProP125(340-354)ArgProValThrSerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheP126(345-359)TyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGluP127(350-364)ValAlaAsnArgPheHisLeuArgLauGluAsnAsnGluGluMetP128(355-369)HisLeuArgLeuG1uAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValP129(360-374)AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThrIleProProP130(365-379)ArgAspGluGluValHisThrIleProProGluLeuArgIleLeuP131(370-384)HisThrIleProProGluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisP132(375-389)GluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisProProAlaLeuAspP133(380-394)LeuAspProAspHisProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProP134(385-399)ProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProGlyGluGlySerProP135(390-404)AsnProLeuPheProGlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProP136(395-409)G1yGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspP137(400-414)AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGlyP138(405-419)PheProPheProAspIleProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
實驗了表4中的肽在MV-1-Lu細胞系抑制模型中阻斷TGFβ1的能力。因為TGFβ1能夠抑制該細胞系的生長，肽對TGFβ1的抑制能夠使細胞重新開始生長。這些實驗在圖9到12中顯示。
如圖9到12所示，存在多種能夠較高或較低程度地抑制Mv-1-IU細胞系生長的肽，但僅肽P54能夠幾乎完全地抑制TGFβ1的活性。為了對該肽進行更完全的研究，對不同濃度的肽抗固定濃度為200pg/ml的TGFβ1，進行了實驗。肽P54對TGFβ1抑制的劑量-應答實驗研究了肽P54的濃度對TGFβ1活性抑制作用的影響。由于該肽溶解性較低，制備名義濃度的肽儲備液，如同對肽P12進行的同樣操作，從中取等分液，過濾，或者甚至直接用于抑制實驗。
圖13考察了過濾前和過濾后，名義濃度的肽的抑制作用?？梢钥吹皆陔腜54的濾液中沒有可檢測到的抑制活性。
驗證了肽P54以應用劑量依賴方式抑制TGFβ1活性的能力后，我們接著以P54序列為基礎(chǔ)合成了新肽，目的在于試圖改善溶解性并由此提高在較低劑量中的活性。還合成了兩種來源于人III型受體的肽。一種肽(P144)等價于肽P54。另一種肽(P145)類似于大鼠III型受體的肽P106，該肽也證明具有活性。這些新肽在表5中顯示。表5.來源于對肽P54進行修飾的肽(肽P139-P143)，以及來源于人III型受體的肽(肽P144和P145)。肽 序列 來源P54(731-742)ThrSerLuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet大鼠III型受體P139 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpAspAspAspP140 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP141 AspAlaThrMetIleTrpAspP142 ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMetP143 ThrSerLeuAspAlaThrThrMetMetP144(729-742)TnrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMet人III型受體GlnAsnP145(241-254)SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThr人III型受體IleAsp表5中的肽的活性實驗在圖14中顯示。肽P144對TGFβ1抑制作用的劑量-應答實驗用來源于人III型受體序列的肽P144進行劑量-應答實驗，目的在于實驗其活性是否依賴于濃度(圖15)?？梢钥吹?，肽的活性隨著實驗中應用的肽濃度的降低而降低。肽P144對TGFβ1與其受體結(jié)合的抑制實驗(親合性標記)在親合標記實驗中使用來源于人III型受體序列的肽P144，用于驗證其抑制TGFβ1與TGFβ1的細胞受體結(jié)合的能力(材料和方法)。
由于使用的不同批次的125I-TGFβ1的活性不同，該實驗中使用的肽的濃度按照每種情況下使用的125I-TGFβ1批次的濃度調(diào)整。這些實驗的結(jié)果在圖15中顯示。
當驗證了肽P144抑制TGFβ1與其細胞受體結(jié)合后，進行新的實驗以確定肽P144的濃度。觀察到當肽的濃度為125I-TGFβ1的分子濃度的2×105倍時，該肽喪失了其活性。來源于能夠結(jié)合TGFβ1的其它蛋白質(zhì)并預測互補于TGFβ1的肽的抑制作用在該部分中合成了表6中的肽，它們來源于能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)。表6.來源于各種能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)(II型受體P146，胎球蛋白P147至P149，endoglin P150至P154和α2-巨球蛋白P155至P179)的肽。顯示了肽的數(shù)目，其在完整序列中的位置，其氨基酸序列以及其來源。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一個丙氨酸，其未在表中顯示。肽 序列 來源P146(84-102)CysValAlaValTrpArgLysAsnAspGluAsnIleThr II型受體LeuGluThrValCysP147(114-322)CysAspPheGlnLeuLeuLysLeuAspGlyLysPheSer FetuinValValTyrAlaLysCysP149(114-122)CysAspPheHisIleLeuLysGlnAspGlyGlnPheArg FetuinValCysHisAlaGlnCysP149(114-132)CysAspIleHisValLeuLysGlnAspGlyPheSerVal FetuinLeuPheThrLysCysAspP150(247-261)GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSer EndoglinTrpLeuP151(289-393)ValAsnLeuProAspThrArgGlnGlyLeuLeuGluGlu EndoglinAlaArgP152(445-459)LeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSer EndoglinProHisP153(482-495)ProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAspSerCys EndoglinGlnLeuP154(479-493)MetSerProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAsp EndoglinSerCysP155(22-24)LeuLeuLeuLeuValLeuLeuProThrAspAlaSerα-2-巨球蛋白P156(20-31)ProThrAspAlaSerValSerGlyLysProGlnTyrα-2-巨球蛋白P157(44-53)ThrGluLysGlyCysValLeuLeuSerTyrLeuAsnα-2-巨球蛋白P158(166-177)TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGlnα-2-巨球蛋白P158(166-177)TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGlnα-2-巨球蛋白P159(193-283)PheProLeuSerSerGluProPheGlnGlySerTyrα-2-巨球蛋白P160(247-258)AsnValserValCy5GlyLeuTyrThrTyrGlyLysα-2-巨球蛋白P161(244-259)ValSerValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysProα-2-巨球蛋白P162(250-261)ValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysProValProα-2-巨球蛋白P163(267-278)SerIleCysArgLysTyrSerAspAlaSerAspCysα-2-巨球蛋白P164(469-480)ProCysGlyHisThrGlnThrValGlnAlaHisTyrα-2-巨球蛋白P165(554-565)AspSerAlaLysTyrAspValGluAsnCysLeuAlaα-2-巨球蛋白P167(730-801)GlnProPhePheValGluLeuThrMetProTyrSerα-2-巨球蛋白P168(827-838)GlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAlaValProα-2-巨球蛋白P169(835-816)SerValGlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAlaα-2-巨球蛋白P170(876-887)AlaLeuGluSerGlnGluLeuCysGlyThrGluValα-2-巨球蛋白P171(1081-1012)LysSerLysIleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyr α-2-巨球蛋白P172(1085-1016)IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeuα-2-巨球蛋白P173(1062-1073)LysArgLysGluValLeuLysSerLeuAsnGluGluα-2-巨球蛋白P174(1193-1204)ValGlyHisPheTyrGluProGlnAlaProSerAlaα-2-巨球蛋白P175(2209-1220)ThrSerTyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAlaα-2-巨球蛋白Pl76(1211-1222)TyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrAlaGlnProAlaα-2-巨球蛋白P177(1256-1167)ValAlaLeuHisAlaLeuSerLysTyrGlyAlaAlaα-2-巨球蛋白P178(1232-1243)TyrG1yArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaα-2-巨球蛋白Pl79(1234-1245)ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaPheValα-2-巨球蛋白圖17和18顯示了來源于表10的肽的抑制活性。
如圖17和18所示，僅肽P150顯示了高于50％的活性。然而，對于肽P146和P149，Demetriou M等((1996)生物化學雜志27112755-12761)報道具有活性，但在該實驗使用的條件下沒有發(fā)現(xiàn)活性。合成肽對TGFβ1與其細胞受體結(jié)合的抑制作用的流動細胞記數(shù)測定通過流動細胞記數(shù)測定來源于前面合成過程的肽，包括從TGFβ1序列和從III型受體序列合成的肽，測定它們抑制TGFβ1與其細胞受體結(jié)合的能力。在這些實驗中，將細胞與肽保溫，然后加入TGFβ1-生物素，其將用抗生物素蛋白-FITC檢測到(材料和方法)。然后測定抗生物素蛋白-FITC發(fā)散的熒光它將與結(jié)合到細胞上的TGFβ1的量成正比，而與肽的活性成反比。最相關(guān)肽得到結(jié)果在圖19和表7中顯示。表7.通過抑制MV-1-Lu細胞生長1的生物分析測定(肽濃度200μg/ml)和應用流動細胞記數(shù)2測定抑制TGFβ1與其細胞受體結(jié)合(肽濃度420μg/ml)，比較了一些肽的TGFβ1的抑制活性。肽生物檢測 細胞記數(shù)序列(％抑制率)1(％抑制率)2P29 77.6 92.34 HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP11 40 86HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuP12 96 77PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP18 18.2 6.5 LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP54 97 82.3 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP140 -1.7 69.8 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP142 70 72ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMetP106 40 91SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIleP145 21 74.35 SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThrIleAspP144 88 80ThrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMetGlnAsnP150 64 73GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSerTrpP152 45 68.4LeuLeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSerProHisTGFβ1活性的體內(nèi)抑制已經(jīng)證明在抑制MV-1-Lu細胞系生長的生物檢測中具有活性的、來源于人III型受體的序列的肽P144，應用于體內(nèi)實驗，用于研究其在大鼠模型中對CCl4誘導的實驗硬化的抑制作用。Wistar大鼠的硬化實驗模型在該模型中，通過吸入四氯化碳11周，每周兩次，誘導肝硬化(LopezNovas JM等(1976) Patologia IX223-240；Camps J.等(1987)胃腸病學93498-505)，如材料和方法中描述的那樣。
按照兩種方案施用肽P1441.方案1在硬化誘導過程中(11周)，通過腹膜內(nèi)途徑每隔一天施用肽一次。圖20和21。2.方案2當出現(xiàn)硬化時，即從開始誘導硬化的第12周開始，通過腹膜內(nèi)途徑每隔一天施用肽一次，連續(xù)3周。圖22和23。
通過兩種方法測定兩種方案中產(chǎn)生的膠原蛋白。
圖36和38顯示了產(chǎn)生的總膠原，通過染色的肝切片(每只動物兩個切片)，用East Green和Direct Red測定顏色的洗脫，在分光光度計上讀數(shù)(材料和方法)(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)組織化學和細胞化學(Histochem.Cytochem.)33737-743；Gaudio E.等(1993)國際實驗病理學雜志(Int.J.Exp.Path)74463-469)。
圖21和23顯示了產(chǎn)生的膠原，通過對天狼紅染色的肝切片用光學顯微鏡進行的圖像分析測定(材料和方法)。
如圖20所示，當研究膠原蛋白與總蛋白的比率時，在用肽P144處理的大鼠組(Tto1)和硬化大鼠的對照組(Ci1)之間，觀察到顯著差異(P＜0.05)。在圖37中，當研究纖維化面積時，肽P144處理大鼠組(Tto1)和硬化大鼠的對照組(Ci1)之間的差異也是顯著的(P＜0.001)。
如圖22和23所示，它們顯示了出現(xiàn)硬化后處理大鼠的結(jié)果，當用兩種測定纖維化方法中的任何一種，肽P144處理的大鼠組(Tto2)和硬化大鼠的對照組(Ci2)之間的差異都是不顯著的。
用線性回歸比較了這兩種測定膠原的方法，目的在于驗證各制備過程中選擇的研究視野的隨機性，由此證明圖像分析的有效性，圖24和25。
如圖24和25所示，兩種方法之間存在相關(guān)性，兩種情況下，均R＞0.85，它們是高度顯著的(F≤0.001)。這證明用于研究的圖像的精確性完全隨機實現(xiàn)，因此證明圖像分析得到的數(shù)據(jù)的有效性。
圖26和27顯示了從天狼紅染色的肝切片(從硬化誘導過程中處理大鼠(Ci1和Tto1)的肝得到)的光學顯微鏡得到的圖像，10X放大倍數(shù)。
圖26中的圖像由沒有經(jīng)過任何類型的濾光片得到。
圖27顯示了應用特殊軟件為研究而修飾后的圖像。這些修飾包括應用兩種濾光片，一個是偏振光的，另一個是綠光的，目的為了改善圖像的質(zhì)量，有助于它們的自動檢查。
圖26和27表明，在從硬化大鼠(Ci1)得到的圖像和從肽P144處理大鼠(Tto1)得到的圖像之間存在差異。
方案1和2之間有效性的差異可能由于CCl4誘導出現(xiàn)硬化后(方案2)比CCl4誘導硬化過程中(方案1)可能產(chǎn)生較少的TGFβ1，甚至可能在正常水平所致，因此在方案2中比在方案1中用肽P144處理產(chǎn)生的效果將不顯著。
當我們比較硬化誘導過程結(jié)束時的未處理大鼠組(Ci1)和誘導結(jié)束后第4周未處理的硬化大鼠組(Ci2)時，我們發(fā)現(xiàn)兩組之間存在顯著差異(P＝0.016)(圖28)，這表明當硬化物質(zhì)除去后，硬化的部分衰退，多位作者公開了這一觀察結(jié)果(Szende-B等(1992)體外(In Vivo)6355-361；Columbano A(1996)癌發(fā)生(Carcinogenesis)17395-400)。
兩種方案之間上述有效性的差異也可能由于方案自身，因為方案2的動物僅隔天處理一次，處理3周，而方案1的動物處理了較長時間(7周，同樣隔天處理一次)。
得到的結(jié)果證明，來源于不同蛋白質(zhì)的合成肽在體外和體內(nèi)均可能抑制TGFβ1。將來可能更多關(guān)注于試圖增加這些肽的生物活性。這可以通過將這些序列的各氨基酸由另外19個系統(tǒng)取代而實現(xiàn)。一旦發(fā)現(xiàn)具有較高活性的肽，將必須制備模擬型(mimotope)(McConnell-SJ(1994)基因(gene)151115-118；Steward-MW(1995)病毒學雜志(J.Virol.)697668-7673)，其目的在于增加生物體中抑制物質(zhì)的平均壽命。
圖2.CCl4誘導硬化過程的示意圖。黑箭頭顯示施用給大鼠的CCl4兩周劑量，黑色虛線箭頭表示一周劑量?；疑^表示施用肽P144。A健康對照；B健康對照+P144，B1肽70μg/天；C硬化；C1生理鹽水；C2為肽70μg/天；DCCl4+苯巴比妥誘導硬化；D1加鹽水；D2加肽70μg/天。
圖3.TGFβ1對MV-1-Lu細胞生長的影響。細胞以5000個細胞/孔的密度在指示的TGFβ1濃度(pg/ml)下培養(yǎng)，橫坐標TGFβ1濃度(pg/ml)；縱坐標c.p.m.。
圖4.來自TGFβ1的肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的濃度實驗。對TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時MV-1-Lu細胞的生長。
圖5.在存在各種名義濃度的肽P12時，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，過濾(◆)和未過濾(●)。
圖6.來自TGFβ1的肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的濃度實驗。對TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時MV-1-Lu細胞的生長。
圖7.TGFβ1受體的親和標記實驗的放射能照相。C1道細胞與濃度為0.16μM相應于0.3μCi活性的125I-TGFβ1(陽性對照)共同培養(yǎng)的效果。C2道細胞與濃度10倍于125I-TGFβ1的非-放射性TGFβ1(陰性對照)預培養(yǎng)的效果。C3道與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高106倍濃度的肽P29預培養(yǎng)的效果?？梢钥吹?，肽P29和非-放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1與I、II和II型細胞受體的結(jié)合。
圖8.TGFβ1受體的親合標記實驗的放射能照相。C1到C6道MV-1-Lu細胞與不同濃度的肽P29(分別為125I-TGFβ1分子濃度的106、8×105、6×105、4×105、2×105、和105倍)預培養(yǎng)，之后加入125I-TGFβ1的效果。道C7MV-1-Lu細胞與未標記的TGFβ1(125I-TGFβ1分子濃度的102)預培養(yǎng)，之后加入125I-TGFβ1的效果(陰性對照)。C8道MV-1-Lu細胞與濃度為0.42μM125I-TGFβ1，相應于0.4μCi活性共培養(yǎng)，而沒有之前的預培養(yǎng)的效果(陽性對照)。
圖9.預測與TGFβ1區(qū)域互補的受體肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖10.來源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖11.來源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖12.來源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖13.在存在不同名義濃度的肽P54時，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，過濾(◆)和未過濾(●)。
圖14.來源于對肽P54修飾的受體肽(P139-P143)和來源于人III型受體的肽(P144和P145)對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖15.在存在不同名義濃度的肽P144而未過濾時，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率。
圖16.TGFβ1受體的親合標記實驗的放射能照相。C1道與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高106倍的肽P144進行預培養(yǎng)。C2和C3道細胞與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高10倍濃度的非放射性TGFβ1預培養(yǎng)的效果(陰性對照)。C4和C5道細胞與濃度為0.1μM，相應于0.2μCi活性的125I-TGFβ1共培養(yǎng)的效果(陽性對照)?？梢钥吹诫腜144和非放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1與細胞受體的結(jié)合。
圖17.來源于人II型受體的肽(P146)、來源于胎球蛋白的肽(P147-149)和來源于endoglin的肽(P150-P154)對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖18.來源于α2-巨球蛋白的肽對TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實驗。TGFβ1的100％抑制對應無TGFβ1時獲得的MV-1-Lu細胞生長。
圖19.各種合成肽對TGFβ1與MV-1-Lu細胞結(jié)合的百分抑制率。對于各肽，通過測定標記細胞(發(fā)散熒光)和未標記細胞(未發(fā)散熒光)的百分率研究抑制。
圖20.在用CCl4誘導實驗性硬化過程中，施用肽P144對膠原合成的影響。縱坐標顯示了膠原蛋白與總蛋白的比率。橫坐標顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto1＝接受CCl4誘導硬化并在該過程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4誘導硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖21.在CCl4誘導實驗性硬化過程中，施用肽P144對膠原合成的影響?？v坐標顯示了天狼紅染色的組織切片中纖維化面積與總面積的比率。橫坐標顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto1＝接受CCI4誘導硬化并在該過程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4誘導硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖22.用CCl4誘導硬化后，施用肽P144對膠原合成的影響。縱坐標顯示了膠原蛋白與總蛋白的比率。橫坐標顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4誘導硬化并在該過程結(jié)束時，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4誘導硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖23.用CCl4誘導硬化后，施用肽P144對膠原合成的影響?？v坐標顯示了組織切片中纖維化面積與總面積的比率。橫坐標顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4誘導硬化并在該過程結(jié)束時，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4誘導硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖24.通過應用的兩種方法得到的膠原蛋白量和纖維化面積的數(shù)據(jù)的比較。橫坐標表示通過圖像分析得到的纖維化面積與總面積的比值?？v坐標表示通過Direct Red和Fast Green染色的肝臟切片的分光光度計分析得到的膠原量(μg)與總蛋白(mg)的比值。顯示了R2(F≤0.001)。
圖25.在方案2結(jié)束時，使用兩種考察樣品的方法得到的膠原量和纖維化面積的數(shù)據(jù)比較。橫坐標表示通過圖像分析得到的纖維化面積與總面積的比值?？v坐標表示通過Direct Red和Fast Green染色的肝臟切片的分光光度計分析得到的膠原量(μg)與總蛋白(mg)的比值。顯示了R2(F≤0.001)。
圖26.通過用光學顯微鏡(10X)對天狼紅染色的大鼠肝臟切片觀察得到24個代表性視野的圖像。CCl4誘導硬化結(jié)束時的硬化大鼠(Ci1)和CCl4誘導硬化過程中用肽P144處理的硬化大鼠(Tto1)。不同視野取自從各動物得到的切片(R＝大鼠，C＝視野)。
圖27.通過用光學顯微鏡(10X)對天狼紅染色的大鼠肝臟切片觀察得到24個代表性視野的圖像。CCl4誘導硬化結(jié)束時的硬化大鼠(Ci1)和CCl4誘導硬化過程中用肽P144處理的硬化大鼠(Tto1)。不同視野取自從各動物得到的切片(R＝大鼠，C＝視野)。使用了偏振光和綠光濾光片，以便顯露出膠原纖維。
圖28.兩組未處理的硬化大鼠之間的比較。Ci1是在CCl4誘導硬化的12周末的硬化大鼠，Ci2是誘導硬化過程結(jié)束后4周的硬化大鼠。P＝0.016。縱坐標纖維化面積/總面積。序列表<110>納瓦拉公司科學與技術(shù)研究所<120>TGFβ1-抑肽<160>10<210>SEQ IN NO1<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來源于TGFβ1，319-333位<400>His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp5 10Ser Leu15<210>SEQ IN NO2<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來源于TGFβ1，322-335位<400>Phe Cys Leu Gly Pro Cys pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp5 10Thr<210>SEQIN NO3<211>12<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>推測與TGFβ1，731-742位互補<400>Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met5 10<210>SEQ IN NO4<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>與大鼠III型受體的胞外區(qū)，245-259位重疊<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val5 l0Asp Ile15<210>SEQ IN NO5<211>9<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>推測與TGFβ1，731-742位互補的修飾P54<400>Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met5<210>SEQ IN NO6<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來源于修飾的人III型受體，729-742位<400>Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln5 10Asn<210>SEQ IN NO7<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來源于修飾的人III型受體，241-254位<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile5 10Asp<210>SEQ IN NO8<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>endoglin的247-261位<400>Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser5 10Trp Leu15<210>SEQ IN NO9<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>endoglin的445-459位<400>Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser5 10Pro His15<210>SEQ IN NO10<211>23<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>TGFβ1的322-335位的修飾P12<400>His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly5 10Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr15 20
權(quán)利要求
1.一種作為體內(nèi)TGFβ1與其受體結(jié)合的拮抗劑的肽，其特征在于，它們具有部分等同于或類似于TGFβ1本身和/或其受體的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
3.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
5.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。
7.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
8.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO7的氨基酸序列。
9.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO8的氨基酸序列。
10.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO9的氨基酸序列。
11.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO10的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1-11之一的活性肽的模擬型(mimotope)，特征在于它們表現(xiàn)類似于權(quán)利要求1-11活性肽的拮抗作用，但比后者在體內(nèi)具有更長的平均壽命。
13.一種應用至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽和/或至少一種它們的模擬型生產(chǎn)應用于肝臟疾病的組合物的方法。
14.一種應用至少一種編碼至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽的DNA生產(chǎn)應用于肝臟疾病的組合物的方法，任選包括至少一種所述活性肽的模擬型。
15.一種應用至少一種編碼至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽的重組表達系統(tǒng)生產(chǎn)應用于肝臟疾病的組合物的方法，任選包括至少一種所述活性肽的模擬型。
16.按照權(quán)利要求15的方法，特征在于所述重組表達系統(tǒng)是一種缺陷型腺病毒。
17.按照權(quán)利要求15的方法，特征在于所述重組表達系統(tǒng)是一種質(zhì)粒。
18.按照權(quán)利要求13-17的方法應用于肝纖維化。
全文摘要
從生物體中的TGFβ1或從其受體得到的拮抗性合成肽,它們能夠即可以以它們自身,也可以以編碼它們的基因序列和表達它們的重組系統(tǒng),用于生產(chǎn)用于治療肝臟疾病,更具體地說是纖維化的組合物。所述組合物能夠任選地包括所述活性肽的模擬型(mimotope)。
文檔編號C07K14/71GK1328569SQ9981361
公開日2001年12月26日 申請日期1999年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月24日
發(fā)明者伊格納西奧·何塞·埃斯克羅·薩恩斯, 胡安·何塞·拉薩爾特·薩加斯蒂韋爾薩, 赫蘇斯·普列托·巴爾圖埃納, 弗朗西斯科·博拉斯·奎斯塔 申請人:納瓦拉公司科學與技術(shù)研究所