專利名稱：：用于使化合物靶向多種選定器官或組織的分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及體內(nèi)靶向領(lǐng)域，并提供了歸巢于、結(jié)合于多種器官或組織并被多種器官或組織吸收的分子。
背景技術(shù)：
：大多數(shù)治療性化合物通過循環(huán)遞送至靶器官或組織。然而，在大多數(shù)情況下，藥物或其它治療不僅靶向患病器官或組織，而且會被體內(nèi)的其它器官和組織吸收。這由于例如遍及患者身體的普遍毒性效應而導致不期望的副作用。因此，選擇性靶向特定器官或組織是理想的。另外，將治療化合物與靶向分子偶聯(lián)能夠改善被靶向的組織或細胞對化合物的攝取性質(zhì)，這產(chǎn)生更有效的分子。因此，與靶向分子偶聯(lián)獲得相比于母體化合物更有效且毒性更低的化合物，參見Curnisetal.,2000,NatureBiotechnol.18，1185-1190。這能夠應用于多種化合物，例如肽、蛋白質(zhì)、細胞抑制劑、抗菌素和抗病毒劑。在諸如杜興氏肌營養(yǎng)不良(DMD)、肌強直性營養(yǎng)不良(MD)或脊髓性肌萎縮(SMA)的肌肉疾病的情況下，肌特異性肽能夠與例如反義寡核苷酸(AON)和小干擾RNA(siRNA)結(jié)合。AON和siRNA通過阻斷不期望基因的轉(zhuǎn)錄而具有用作治療特定疾病的新型藥品的高效能。在DMD治療領(lǐng)域中，反義誘導的外顯子跳讀(antisense-inducedexonskipping)作為用于校正抗肌萎縮蛋白(dystrophin)轉(zhuǎn)錄子的翻譯讀碼框的新穎且有前景的工具而備受關(guān)注。其目的是以如下方式操作剪接跳讀被靶向的外顯子(通過將AON與前體mRNA結(jié)合)并產(chǎn)生較短但為框內(nèi)的轉(zhuǎn)錄子。這允許校正翻譯讀碼框，并誘導合成貝克肌營養(yǎng)不良(Becker'smusculardystrophy，BMD)樣抗肌萎縮蛋白，所述蛋白可以顯著緩解疾病進展。已有若干報道顯示出在體外培養(yǎng)的患者來源的肌細胞中(vanDeutekometal.，2001,Hum.Mol.Genet.10，1547-1554)和在體內(nèi)通過肌內(nèi)注射的轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠肌組織中(Bremmer-Boutetal.，2004，Mol.Ther.10，232-240)，外顯子跳讀策略用于恢復抗肌萎縮蛋白生成的治療潛力。然而，要克服的最大障礙是這些AON的體內(nèi)攝取差，特別是在如肌強直性營養(yǎng)不良(MD)和脊髓性肌萎縮(SMA)的各類肌病中。這些肌萎縮癥的有效治療需要靶向包括臂和腿的骨骼肌的基本上所有的骨骼肌和參與呼吸的肌肉以及心肌。至今沒有研究出能夠同時將(反義)寡核苷酸(更不用說完整基因)特異性遞送至全身基本上所有肌組織/細胞的機理，。迄今為止已經(jīng)公開的用于將基因或其它化合物體內(nèi)遞送至肌肉的方法包括采用或不采用電轉(zhuǎn)移注射裸DNA、使用微泡(Luetal.2003,GeneTher.10，396-405)和使用泊洛沙姆(羥基聚(氧-乙烯)聚(氧丙烯))的全身遞送。最近在mdx小鼠中顯示出全身遞送嗎啉代AON導致抗肌萎縮蛋白在若干肌肉中表達增加(Alteretal.，2006，NatureMed.12，1-3)。然而，即使在重復給予后，抗肌萎縮蛋白表達在膈中幾乎檢測不到，并且在心肌中檢測不出。此外，在這些mdx小鼠中AON相當容易被吸收進入肌肉中，因為肌膜受損，但例如年輕杜興氏患者的肌肉的情況并非如此。而且，在如SMA和MD的其它肌肉疾病中，AON的遞送是復雜的，因為在該情況下肌細胞壁未受損。理論上，全身肌肉治療使用具有細胞特異性靶向能力的化合物的全身遞送(例如靜脈內(nèi)或皮下)。某些分子已經(jīng)被描述為具有肌細胞靶向的潛力。最先報道的是具有增強的體內(nèi)骨骼和心肌結(jié)合的肽序列，其通過篩選隨機噬菌體展示文庫被鑒定(SamoylovaandSmith,1999,MuscleNerve22，460-466)。然而，沒有表明該肽是否能夠用于使偶聯(lián)的化合物體內(nèi)靶向肌細胞。還已經(jīng)描述了在噬菌體隨機肽文庫的體內(nèi)篩選后從人骨骼肌中回收的多個7-聚肽序列(Arapetal.，2002，NatureMedicine8，121-127)。未提供與心肌細胞結(jié)合的信息。該文同樣沒有表明，這些肽是否能夠用于使偶聯(lián)的化合物體內(nèi)靶向肌細胞。已經(jīng)描述的另一分子是體內(nèi)選擇性轉(zhuǎn)運至骨骼肌的單克隆抗體(mAb)的Fv部分(Weisbartetal.,2003,Mol.Immunol.39，783-789)。將鼠源性mAb的單鏈Fv片段注射入小鼠尾靜脈，4小時后，在20%的骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)片段，所述片段主要位于細胞核中。mAb顯示出與骨骼肌細胞裂解物中的蛋白肌球蛋白IIb結(jié)合，但其未與心肌細胞裂解物中的任何蛋白結(jié)合。因此，該抗體可以用于靶向骨骼肌而不是靶向心肌。在溶酶體貯積癥的情況下，酶替代療法中的問題是肌細胞對治療性重組酶的體內(nèi)攝取差。例如在龐貝氏病(糖原貯積病II型)中，由于骨骼肌對rhGAA的攝取差，因此臨床研究中需要的重組人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)的劑量非常高(ffinkeletal.,2004,Ann.Neurol.55，495-502)。鑒于以上所述，進一步改善遞送系統(tǒng)是實現(xiàn)諸如aon的藥劑的體內(nèi)特異性攝取明顯所需的。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供化合物，優(yōu)選肽或模擬肽(ρ印tidomimetic)，其歸巢于感興趣的器官或組織或細胞型，特別是包括心臟在內(nèi)的肌細胞。通過將診斷部分或具有生物活性的部分與這樣的歸巢化合物(homingcompound)偶聯(lián)，使所述部分靶向特定器官或組織或細胞。在廣泛研究后，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出大量與肌細胞選擇性結(jié)合并被肌細胞攝取的肽，所述肌細胞包括心臟。因此本發(fā)明通過將例如治療性重組酶或(反義)寡核苷酸與肌肉特異性肽結(jié)合滿足了改善所述酶或寡核苷酸體內(nèi)攝取的需要。分子有利地用于治療肌病的反義治療方法、其中肌肉潛在地用作蛋白生成儲庫的疾病的基因治療、以及將多種診斷或藥物遞送至心臟和肌細胞。因此，本發(fā)明涉及包含選自以下序列或由選自以下序列組成的肽或模擬肽LGAQSNF(SEQidn0:100)QLFTSAS(SEQIDno:3)lyqdysl(seqidno85)spnsigtstfthprstihgstsaprplyaaqtstpyqdsaktavtinepvtaatlstypaallelspsaptvpqlttqnappslydidnrrqtllpshtsfqphrgntpsraltqmsisrltlpmpgtappvhhspskipfphypmsashlepsamttkidatlthpphmatfhyllatptpaqpnkfkmpallrslppehplAHPQLATYAGPYQHHWEMWSYQAPRLffSHTPNSTHSNQLVEGfspstpnasspvhrsphsasldqlplipslaaylhwsqmhflsipllnhnqqfyilfesrtaQPLSNASKPAYGSTANYSVSIYSHTAATQHPPffRVmpavphssallpsfthpptthsnsirpnasvqqrgfppsftamqqgprpqktalpltygtkisslkllnqTSSTMNRYKHTPTTGSffYQVPYYFPPFYAYKPVGRASTLKffATffTFRIPSYMIQLSIQSPHFFSVSPffGITHLPffQTAHSMGTGFMSPLffTIVNTAPLSTFTKSPIPTLPSSAFVSRQPSSLPLRKTYSTLGYVTYKTASEPLQLKMWSLQASHTLffVPSRQGMHRGTSESMSIKLPffKPLGQSPHTAPTPAHPNYSLLGSTPTALPPSYVNSATHSLPLTPLPNQLPLHATQTPLKQhaiyprhamisaihnltrlhthvianag以上序列的序列標識符為SEQIDNO:1-SEQIDN0:100。本發(fā)明還涉及肽或模擬肽與部分的偶聯(lián)物，所述部分選自與肽或模擬肽連接的生物活性部分和診斷部分，所述肽或模擬肽包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成LGAQSNF(SEQIDNO:100)QLFTSAS(SEQIDNO3)lyqdysl(seqidno85)SPNSIGTSTFTHPRSTIHGSTSAPRPLYaaqtstpyqdsaktavtinepvtaatlstypaallelspsaptvpqlttqnappslydidnrrqtllpshtsfqphrgntpsraltqmsisrltlpmpgtappvhhspskipfphypmsashlepsamttkidatlthpphmatfhyllatptpaqpnkfkmpallrslppehplAHPQLATYAGPYQHHWEMWSYQAPRLffSHTPNSTHsnqlvegfspstpnasspvhrsphsasldqlplipslaaylhwsqmhflsipllnhnqqfyilfesrltaQPLSNASKPAYGSTANYSVSIYSHTAATQHPPffRVmpavphssallpsfthpptthsnsirpnasvqqrgfppsftamqqgprpqktalpltygtkisslkllnqTSSTMNRYKHTPTTGSffYQVPYYFPPFYAYKPVGRASTLKffATffTFRIPSYMIQLSIQSPHFFSVSPffGITHLPffQTAHSMGTGFMSPLffTIVNTAPLSTFTKSPIPTLPSSAFVSRQPSSLPLRKTYSTLGYVTYKTASEPLQLKMWSLQASHTLffVPSRQGMHRGTSESMSIKLPffKPLGQSPHTAPTPAHPNYSLLGSTPTALPPSYVNSATHSLPLTPLPNQLPLHATQTPLKQhaiyprhamisaihnltrlhthvianag上述的偶聯(lián)物用作藥物是本發(fā)明的一方面。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于將診斷部分或生物活性部分靶向感興趣的器官或組織或細胞型的肽或模擬肽，所述細胞型特別是包括心臟在內(nèi)的肌細胞。本發(fā)明范圍內(nèi)的肽包含至少7個氨基酸。所述肽可以完全由天然存在的L-氨基酸構(gòu)建，或者可以包含一種或多種對主鏈和/或側(cè)鏈的修飾?？梢酝ㄟ^摻入氨基酸模擬物來引入這些修飾，所述氨基酸模擬物顯示出與天然氨基酸的類似性。上述包含一種或多種氨基酸模擬物的肽序列被稱為模擬肽。在本發(fā)明范圍內(nèi)，氨基酸模擬物包括但不限于β2-和β3-氨基酸、β2，2-β2，3和β3，3-二取代氨基酸、α，α-二取代氨基酸、氨基酸的抑制素(statine)衍生物、D-氨基酸、α-羥基酸、α-氨基腈、N-烷基氨基酸等。此外，肽的C-末端可以是羧酸或羧胺，或由摻入一種上述氨基酸模擬物生成的其它物質(zhì)。此外，上述肽可以包含一個或多個天然肽鍵由下述基團取代的取代，所述基團包括但不限于磺酰胺、逆酰胺(retroamide)、含氨氧基的鍵、酯、烷基酮、α，α-二氟酮、α-氟酮、類肽(ρ印toid)鍵(N-烷基化甘氨酰酰胺鍵)。此外，上述肽可以包含氨基酸側(cè)鏈(是指相應天然氨基酸的側(cè)鏈)的取代，例如4-氟苯丙氨酸、4-羥賴氨酸、3-氨基脯氨酸、2-硝基酪氨酸、N-烷基組氨酸或者在β-側(cè)鏈碳原子處具有與天然手性相反的手性的支鏈氨基酸或支鏈氨基酸模擬物(例如別蘇氨酸、別異亮氨酸及其衍生物)。在一個其它實施方案中，以上提及的肽序列可以包含氨基酸的相似結(jié)構(gòu)類似物或氨基酸模擬物，例如取代賴氨酸的鳥氨酸、取代苯丙氨酸的高苯丙氨酸或苯基甘氨酸、取代甘氨酸的β“丙氨酸、取代谷氨酸的焦谷氨酸、取代亮氨酸的正亮氨酸或者甲硫氨酸和/或半胱氨酸的硫氧化形式。本專利包括上述肽的線性或環(huán)狀形式，以及它們的逆向、反向和/或逆反類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知更多的類似變型，但是本文并未提及這些，這并不限制本發(fā)明的范圍。在一實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽長度至多為30個氨基酸，或者長度至少為25個氨基酸或20個氨基酸或19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7個氨基酸。生物活性部分是發(fā)揮(直接或間接)生物學功能優(yōu)選治療功能的化合物，因此優(yōu)選治療活性化合物。治療活性化合物能夠是本領(lǐng)域已知的任何化合物，并優(yōu)選為通過調(diào)節(jié)細胞間過程而具有治療作用的化合物。具有(直接)調(diào)節(jié)作用或(直接)生物學功能的治療活性化合物能夠為例如任何蛋白、酶抑制劑、寡核苷酸、siRNA、基因、或藥物。能夠使用任何生物活性化合物或治療活性化合物，只要它能夠與本發(fā)明的肽或模擬肽連接或能夠使其適于與本發(fā)明的肽或模擬肽連接。生物活性化合物或治療活性化合物因此成為本發(fā)明化合物中的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定合適的生物活性或治療活性化合物。在一個實施方案中，生物活性化合物或治療活性化合物是包含核酸或其類似物或者由核酸或其類似物組成的化合物。這樣的化合物可以被認為通過特別是在蛋白生成水平調(diào)節(jié)細胞內(nèi)遺傳機構(gòu)來發(fā)揮(間接)生物學功能，優(yōu)選治療功能。核酸可以是DNA、RNA或其類似物，諸如包含例如2’-0-甲基_、2’-0-甲氧基乙基-(MOE)和2’-0-烯丙基核苷酸的2’-0-烷基或2’-0-烯基(烯丙基)或2’-0-炔基核苷酸的化合物，鎖核酸(LNA)Ji核酸(PNA)，乙烯橋聯(lián)核酸(ENA)，硫代磷酸修飾的核苷酸例如2’-0-甲氧基乙基硫代磷酸RNA核苷酸或2’-0-甲基硫代磷酸RNA核苷酸，基于嗎啉代的核苷酸及其組合等。核酸可以是基因、多核苷酸或寡核苷酸、小干擾RNA等等。在一個實施方案中，診斷部分與本發(fā)明的肽或模擬肽連接。診斷部分可以用于體內(nèi)或體外診斷目的。常用的成像標記、放射標記或熒光標記例如Cy3、Cy5、Cy5.5等，或者綠色熒光蛋白(GFP)或其它可能經(jīng)由重組表達的診斷蛋白可以用作診斷部分。為了制備本發(fā)明的偶聯(lián)物，通過將化合物與氨基酸或肽偶聯(lián)的已知方法，將生物活性部分或診斷部分與本發(fā)明的肽或模擬肽進行偶聯(lián)。常規(guī)方法是將部分與肽或模擬肽中的自由氨基或自由羥基或自由羧酸基團或自由硫醇基連接。通常的結(jié)合方法包括硫醇/馬來酰亞胺偶聯(lián)、酰胺或酯鍵形成，或混合二硫化物形成。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知能夠用于產(chǎn)生所需偶聯(lián)的標準化學方法。生物活性部分或診斷部分可以與肽或模擬肽直接偶聯(lián)或經(jīng)由間隔子或連接子分子偶聯(lián)。生物活性或診斷部分并不必需與本發(fā)明的肽或模擬肽共價連接。它還可以通過靜電相互作用結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的肽或模擬肽以及連接部分的分子，所述連接部分不是肽，用于將所述分子與生物活性部分或診斷部分連接。連接部分例如可以是與生物活性多-或寡核苷酸配合的(聚)陽離子基團。這樣的(聚)陽離子基團可以是精胺或聚乙烯亞胺、聚乙二醇、聚-L-賴氨酸等等。如在一個實施方案中提及的，本發(fā)明的肽或模擬肽與生物活性部分連接。例如肽或模擬肽能夠與生物活性或治療性肽連接，并且在一個實施方案中，肽或模擬肽甚至能夠是肽或模擬肽基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的一部分。例如，治療性肽的氨基_或羧基_末端能夠用包含上述肽或由上述肽組成的序列延伸。應當理解，用本發(fā)明的肽或模擬肽延伸的肽包含在本發(fā)明的偶聯(lián)物中。制備這樣的肽能夠通過標準的氨基酸或肽偶聯(lián)步驟實現(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽與核定位信號(NLS)結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物與NLS結(jié)合。在本發(fā)明范圍內(nèi)，NLS的作用為引導本發(fā)明的偶聯(lián)物例如生物活性部分或診斷部分進入細胞核，大概是通過它被胞質(zhì)的核轉(zhuǎn)運受體識別發(fā)揮作用的。NLS可以是本發(fā)明的肽或模擬肽的一部分，例如NLS的氨基或羧基末端能夠用包含上述肽或由上述肽組成的序列延伸。NLS還可以在不同于本發(fā)明的肽或模擬肽的位置與生物活性部分或診斷部分偶聯(lián)。NLS序列在本領(lǐng)域是已知的。通常NLS信號由帶正電荷的賴氨酸和/或精氨酸的(幾個)短序列組成或包含帶正電荷的賴氨酸和/或精氨酸的(幾個)短序列，例如NLS由(K)KKR(K),(K)KRS(K),(K)(S)RK(R)(K)組成或包含(K)KKR(K),(K)KRS(K)、(K)(S)RK(R)(K)。已知的NLS是PKKKRKV、GKKRSKV、KSRKRKL。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽與選自SEQIDNO101-115的NLS結(jié)合。在一個實施方案中，通過肽或模擬肽與生物活性蛋白的重組表達來制備本發(fā)明的偶聯(lián)物，在所述偶聯(lián)物中，生物活性部分是蛋白或多肽且肽或模擬肽包含在所述蛋白或多肽骨架中。優(yōu)選制備DNA構(gòu)建體使得本發(fā)明的肽或模擬肽在生物活性肽的末端表達，優(yōu)選在生物活性肽的C-末端表達。通過重組DNA方法制備這樣的DNA構(gòu)建體并在適當宿主中表達是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實踐。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物是本發(fā)明的肽與治療活性蛋白(例如抗體)或診斷(例如熒光)蛋白或兩者的融合蛋白，任選地還包含NLS，所述本發(fā)明的肽為例如SEQIDN0:l-100的肽。這樣的融合蛋白能夠通過適當DNA構(gòu)建體的表達來制備。因此，本發(fā)明提供了用于將生物活性部分例如寡核苷酸、基因、蛋白、藥物等靶向多種正常器官或組織特別是肌細胞和心臟的肽或模擬肽。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的偶聯(lián)物制備用于將生物活性部分或診斷部分靶向肌細胞的藥物的用途。在一個實施方案中，所述藥物用于治療與肌細胞相關(guān)的病癥，包括心臟病癥。與肌細胞相關(guān)的病癥包括肌病、肌營養(yǎng)不良和肌萎縮癥。在一個實施方案中，所述藥物用于治療與肌肉生長抑制素(myostatin)相關(guān)的病癥。肌肉生長抑制素還與II型糖尿病和肥胖相關(guān)。因此，在一個實施方案中，所述藥物用于治療Π型糖尿病和/或肥胖。在另一實施方案中，所述藥物用于治療包括心臟病癥在內(nèi)的肌細胞相關(guān)病癥，所述病癥選自杜興氏肌營養(yǎng)不良、貝克肌營養(yǎng)不良、艾-德肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifussmusculardystrophy)、肢帶型肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良、強直性肌營養(yǎng)不良、眼咽型肌營養(yǎng)不良、先天性肌營養(yǎng)不良、遠端型肌營養(yǎng)不良、肌萎縮側(cè)索硬化、嬰兒型脊髓性肌萎縮、(少年型、中間期和成年型)脊髓性肌萎縮、脊髓延髓肌萎縮、皮肌炎、多肌炎、包涵體肌炎、重癥肌無力、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征(Lambert-Eatonmyasthenicsyndrome)、先天性肌無力綜合征、甲狀腺機能亢進性肌病、甲狀腺機能減退性肌病、夏-馬-圖三氏肌萎縮(Charcot-Marie-Toothdisease)、弗里德賴希型共濟失調(diào)、德-索氏病(Dejerine-Sottasdisease)、先天性肌強直(湯姆森氏病和貝克氏病)、先天性肌強直、中央軸空病、桿狀體肌病、肌管肌病(中央核肌病)、周期性癱瘓(低鉀性和高鉀性)；線粒體肌病和由肉堿和以下酶缺陷導致的肌肉疾病磷酸化酶、酸性麥芽糖酶(龐貝氏病)、果糖磷酸激酶、脫支酶(也被稱為淀粉-1，6-葡糖苷酶)；也被稱為福布斯病的糖原貯積病、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、乳酸脫氫酶和肌腺苷酸脫氨酶。在一個實施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物還能夠用作非病毒基因遞送或非病毒基因治療的工具。作為偶聯(lián)物，本發(fā)明的肽或模擬肽能夠使基因靶向細胞，特別是肌細胞。在一個實施方案中，基因構(gòu)建體允許在酶替代治療中生成酶或者基因構(gòu)建體允許生成治療性蛋白，例如諸如因子VIII、因子IX、因子VII、膽紅素UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、所有溶酶體貯積癥蛋白如α-葡糖苷酶或特別是Aldurazyme、Cerezyme、Fabrazyme或Myozyme。本發(fā)明的一個實施方案是將病毒或病毒顆粒靶向細胞。在本發(fā)明的偶聯(lián)物中，病毒或病毒顆粒是生物活性部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽與病毒生物活性部分如下連接在病毒基因組中包括肽或模擬肽的DNA/RNA序列使得肽或模擬肽在病毒或病毒顆粒的外表面處表達。產(chǎn)生這樣的表達的重組方法學是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，所述肽或模擬肽使病毒或病毒顆粒靶向特定細胞/組織。這對于靶向接種、基因治療、基因替代或病毒夕卜顯子跳讀構(gòu)建體(AAVvectorsexpressingantisensesequencesfusedtoeitherUlorU7smallnuclearRNA(表達與Ul或U7小核RNA融合的反義序列的AAV載體)；Dentietal.,2006,Hum.GeneTher.17，565-574)特別有用。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT、VTYKTAS、EPLQLKM、WSLQASH、TLWVPSR、QGMHRGT、LYQDYSL、SESMSIK、LPffKPLG,QSPHTAP、TPAHPNY、SLLGSTP、TALPPSY,VNSATHS,LPLTPLP,NQLPLHA,GNTPSRA,TQTPLKQ,AMISAIH、NLTRLHT,HVIANAG,HAIYPRH禾口LGAQSNF。在另一實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽選自SPNSIGT、STFTHPR、QLFTSAS、STIHGST,SAPRPLY,AAQTSTP,YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPffKPLG,TPAHPNY、TALPPSY,LPLTPLP,HAIYPRH和GNTPSRA。在另一實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT、EPLQLKM、TLWVPSR、LYQDYSL、LPffKPLG,TPAHPNY、TALPPSY、LPLTPLP、HAIYPRH和GNTPSRA。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽選自yqdsakt和gntpsra。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或模擬肽選自qlftsas、lyqdysl和lgaqsnf。本發(fā)明還包括dna和其互補dna序列，以及dna序列的rna轉(zhuǎn)錄子及其互補rna序列，所述dna由編碼本發(fā)明的肽的序列組成或包含編碼本發(fā)明的肽的序列，所述dna序列由編碼本發(fā)明的肽的序列組成或包含編碼本發(fā)明的肽的序列。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的偶聯(lián)物和藥物可接受的載體。實施例實施例1針對成肌細胞和肌管的肽的體外詵擇已經(jīng)篩選了包含20億表達隨機7-mer肽的噬菌體的預制噬菌體肽文庫(NewEnglandBiolabsInc.)以鑒定肌肉特異性肽。簡短地說，將噬菌體展示肽的文庫用鋪于培養(yǎng)瓶中的細胞進行孵育。在洗掉未結(jié)合的噬菌體后，洗脫特異性結(jié)合或內(nèi)在化的噬菌體并進行擴增。包括分別針對人或小鼠肌管和成纖維細胞的正負選擇輪次在內(nèi)的一系列不同體外生物淘選(bioparming)步驟后，富集結(jié)合序列庫，所述結(jié)合序列通過DNA測序來表征。因此，鑒定出與靶細胞結(jié)合并被靶細胞內(nèi)在化的肌肉特異性肽。所發(fā)現(xiàn)的特異性肽序列如表1所示。表1針對人和小鼠肌管的體外選擇后發(fā)現(xiàn)的肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1不止發(fā)現(xiàn)一次的序列將小鼠和人肌管上的選擇后頻繁出現(xiàn)的兩種肽SPNSIGT和QLFTSAS與熒光標記(FAM)合成，并測試人和小鼠分化肌細胞(肌管)對肽的攝取。肌管由匯合的人KM109成肌細胞培養(yǎng)物通過去血清7天-14天而獲得。然后將培養(yǎng)物用FAM-標記的肽孵育并在不預先固定的情況下用倒置熒光顯微鏡拍照。觀察到這些肽被顯著攝入培養(yǎng)的肌管中。將肽QLFTSAS與熒光標記(FAM)合成，然后與21-mer2’0_甲基硫代磷酸反義寡核苷酸(AON)偶聯(lián)。肌管由匯合的人KM109成肌細胞培養(yǎng)物通過去血清7天-14天而獲得。然后將培養(yǎng)物用FAM-標記的偶聯(lián)物孵育并在不預先固定的情況下用倒置熒光顯微鏡拍照。照片顯示出偶聯(lián)物被培養(yǎng)的人分化肌細胞(肌管)攝取。實施例2;mdx小鼠中的肽詵擇為了在mdx小鼠中進行淘選實驗，通過尾靜脈注射入文庫。10分鐘-20分鐘后，處死小鼠并灌注，其后分離心臟和不同的肌肉群。從組織勻漿中回收結(jié)合和/或內(nèi)在化的噬菌體，擴增，并再施用至mdx小鼠。選擇富集的序列并進一步表征。所發(fā)現(xiàn)的特異性肽序列如表2所示。表2針對骨骼肌和心臟的在mdx小鼠中4輪體內(nèi)篩選后發(fā)現(xiàn)的肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1不止發(fā)現(xiàn)一次的序列2在體外篩選后也發(fā)現(xiàn)的序列(見表1)如實施例1所述，將在4輪體內(nèi)選擇后發(fā)現(xiàn)的三種肽與熒光標記(FAM)合成，并在細胞培養(yǎng)物中測試肽被人肌管的攝取。照片顯示出所有三種肽均被培養(yǎng)的人肌管攝取。實施例3肌內(nèi)灃射后肌纖維的體內(nèi)染代將顯示被攝入培養(yǎng)的人成肌細胞和肌管中的肽與熒光標簽(FAM)合成，并注射入4周齡mdx小鼠的腓腸肌(腓腸肌肉)中。分析FAM-標記的肽QLFTSAS(注射5nmol)、LYQDYSL(注射2.5nmol)和LGAQSNF(注射2.5nmol)。三天后處死小鼠并將肌肉快速冷凍。切開橫截面，用丙酮固定并封固用于以熒光顯微鏡分析。切開橫截面并用熒光顯微鏡(CCD照相機)拍照。照片顯示出肽QLFTSAS、LYQDYSL和LGAQSNF被攝入大面積肌纖維中并在3天后仍然可見。清楚地顯示出全部纖維染色均勻，并有時觀察到更強烈的膜染色。還測試了健康小鼠的肌肉對FAM-標記的肽QLFTSAS和LGAQSNF的攝取。將各肽5nmol注入腓腸肌中。3天后處死小鼠并評估染色量。用倒置熒光顯微鏡對樣品拍照。雖然這些小鼠的肌細胞沒有像mdx小鼠的肌細胞一樣的受損的膜，但是仍然觀察到肽QLFTSAS和LGAQSNF被大面積攝入被注射小鼠的肌纖維中，如照片上所示。實施例4通過肽-AON偶聯(lián)物的體內(nèi)外顯子跳讀將肽QLFTSAS和LGAQSNF與20_mer2，0-甲基硫代磷酸反義寡核苷酸(AON)M23偶聯(lián)。該AON已經(jīng)顯示出能夠在細胞培養(yǎng)物和在mdx小鼠模型中誘導外顯子23的跳讀(Luetal.,2003,NatureMed.9，1009-1014)。將偶聯(lián)物注入mdx小鼠的腓腸肌中。小鼠接受了2.9nmol偶聯(lián)物的兩次注射，間隔為24_h，并在10天后被處死。然后，進行肌肉中的肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA的RT-PCR分析。在表3中，顯示了與肽QLFTSAS和LGAQSNF偶聯(lián)的AONM23在肌肉中的跳讀百分比。兩種偶聯(lián)物均能夠在與單獨的寡核苷酸相同范圍內(nèi)誘導mdx小鼠肌肉中的外顯子23跳讀。表3肌內(nèi)注射后在mdx小鼠中通過肽-AON偶聯(lián)物的外顯子跳讀<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在健康小鼠中對肽-AON偶聯(lián)物進行同樣的實驗。這些小鼠的肌肉沒有如mdx小鼠的肌肉那樣的受損的膜。如表4所示，在這些健康小鼠中兩種偶聯(lián)物也能夠誘導小鼠中外顯子23的跳讀。表4肌內(nèi)注射后在健康小鼠中通過肽-AON偶聯(lián)物的外顯子跳讀<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例5肽-AON偶聯(lián)物的體內(nèi)攝取將單獨的AONM23和與肽QLFTSAS和LGAQSNF偶聯(lián)的AO匪23靜脈內(nèi)注射入mdx小鼠中。小鼠接受50mg/kg單獨的AON或偶聯(lián)物的3次注射，間隔為48-h，并且在10天后處死。然后，用AONM23特異性雜交-連接ELISA測量AONM23在四頭肌和在心肌中的水平。在表5中，四頭肌和心肌中AONM23-肽偶聯(lián)物的攝取顯示為單獨的AONM23的攝取的百分比(將單獨的AONM23的攝取設(shè)為100%)。顯示出四頭肌中偶聯(lián)物的攝取高于單獨的M23AON的兩倍，且心肌中偶聯(lián)物的攝取高于單獨的M23AON的三倍。表5在全身遞送后四頭肌和心肌中肽-AON偶聯(lián)物的攝取，相對于裸AON的攝取(設(shè)為100%)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例6全身遞送后的體內(nèi)靶向?qū)㈦腖GAQSNF與熒光標記Cy5合成。在全身(靜脈內(nèi)或皮下)注射至小鼠后該標記能夠通過熒光成像系統(tǒng)(NightOWLjertholdTechnologies)被以高靈敏度檢測。這能夠在注射化合物后監(jiān)測存活小鼠不同器官的分布。將該肽71nmol皮下注射至mdx小鼠的背部，并在48小時后用成像系統(tǒng)獲取圖片。圖1顯示在mdx小鼠中皮下注射48小時后Cy5_標記的肽LGAQSNF的分布。使小鼠仰臥，首先將后爪和腹部區(qū)域剃毛，因為皮膚上的毛發(fā)消弱信號檢測。在后爪和前爪和在尾部能夠檢測到清楚的信號。腹部剃毛區(qū)域中的信號很可能來自腹肌。該結(jié)果顯示背部注射的肽被小鼠腹肌以及后足、爪和尾部的肌肉攝取。實施例7蛋白靶向肌細胞為了檢測肽LGAQSNF和QLFTSAS將蛋白轉(zhuǎn)運至肌細胞的能力，制備DNA構(gòu)建體，其中肽序列與蛋白序列融合。制備以下構(gòu)建體并使用細菌表達載體表達LGAQSNF-NLS-3F5-GFPLGAQSNF-3F5-GFPQLFTSAS-NLS-3F5-GFPQLFTSAS-3F5-GFPNLS核定位序列KKRKVHH3F5駱駝來源的抗體GFP:綠色熒光蛋白永生化小鼠(immortomouse)IM2成肌細胞用純化的LGAQSNF-NLS-3F5-GFP蛋白孵育過夜。第二天，進行熒光成像以評估細胞中蛋白構(gòu)建體的攝取。圖片顯示出蛋白被攝入細胞的細胞質(zhì)。這表明靶向肽能夠?qū)⒋蟮鞍邹D(zhuǎn)運至肌細胞中。權(quán)利要求與選自生物活性部分和診斷部分的部分連接的肽或模擬肽的偶聯(lián)物，所述肽或模擬肽包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成LGAQSNF(SEQIDNO100)QLFTSAS(SEQIDNO3)LYQDYSL(SEQIDNO85)SPNSIGTSTFTHPRSTIHGSTSAPRPLYAAQTSTPYQDSAKTAVTINEPVTAATLSTYPAALLELSPSAPTVPQLTTQNAPPSLYDIDNRRQTLLPSHTSFQPHRGNTPSRALTQMSISRLTLPMPGTAPPVHHSPSKIPFPHYPMSASHLEPSAMTTKIDATLTHPPHMATFHYLLATPTPAQPNKFKMPALLRSLPPEHPLAHPQLATYAGPYQHHWEMWSYQAPRLWSHTPNSTHSNQLVEGFSPSTPNASSPVHRSPHSASLDQLPLIPSLAAYLHWSQMHFLSIPLLNHNQQFYILFESRLTAQPLSNASKPAYGSTANYSVSIYSHTAATQHPPWRVMPAVPHSSALLPSFTHPPTTHSNSIRPNASVQQRGFPPSFTAMQQGPRPQKTALPLTYGTKISSLKLLNQTSSTMNRYKHTPTTGSWYQVPYYFPPFYAYKPVGRASTLKWATWTFRIPSYMIQLSIQSPHFFSVSPWGITHLPWQTAHSMGTGFMSPLWTIVNTAPLSTFTKSPIPTLPSSAFVSRQPSSLPLRKTYSTLGYVTYKTASEPLQLKMWSLQASHTLWVPSRQGMHRGTSESMSIKLPWKPLGQSPHTAPTPAHPNYSLLGSTPTALPPSYVNSATHSLPLTPLPNQLPLHATQTPLKQHAIYPRHAMISAIHNLTRLHTHVIANAG。2.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述的本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT，VTYKTAS,EPLQLKM,WSLQASH,TLWVPSR,QGMHRGT,LYQDYSL,SESMSIK,LPffKPLG,QSPHTAP,TPAHPNY,SLLGSTP,TALPPSY,VNSATHS,LPLTPLP,NQLPLHA,GNTPSRA,TQTPLKQ,AMISAIH,NLTRLHT,HVIANAG,HAIYPRH和LGAQSNF。3.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述的本發(fā)明的肽或模擬肽選自SPNSIGT，STFTHPR,QLFTSAS,STIHGST,SAPRPLY,AAQTSTP,YQDSAKT,EPLQLKM,TLWVPSR,LYQDYSL,LPffKPLG,TPAHPNY,TALPPSY,LPLTPLP,HAIYPRH和GNTPSRA。4.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述的本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT，EPLQLKM,TLWVPSR,LYQDYSL,LPffKPLG,TPAHPNY,TALPPSY,LPLTPLP,HAIYPRH和GNTPSRA。5.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述的本發(fā)明的肽或模擬肽選自YQDSAKT和GNTPSRA。6.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述的本發(fā)明的肽或模擬肽選自LGAQSNF(SEQIDNO:85)、QLFTSAS(SEQIDNO3)和LYQDYSL(SEQIDNO:85)。7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的偶聯(lián)物，其中所述生物活性部分選自DNA、RNA或其類似物，諸如包含2’-O-烷基特別是2’-O-甲氧基乙基-和2’-O-甲基、或2’-O-烯基(烯丙基)或2’-O-炔基核苷酸的化合物，鎖核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，乙烯橋聯(lián)核酸(ENA)，硫代磷酸修飾的核苷酸，基于嗎啉代的核苷酸及其組合。8.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物是SEQIDN0:l-100的肽與治療活性蛋白和/或診斷蛋白的融合蛋白。9.如權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其還包含核定位信號。10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的偶聯(lián)物用于制備使生物活性部分或診斷部分靶向肌細胞的藥物的用途。11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述藥物用于治療與肌細胞相關(guān)的病癥，包括心臟病癥。12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述藥物用于治療肌病、肌營養(yǎng)不良或肌萎縮癥。13.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述藥物用于治療II型糖尿病或肥胖。14.分子，其包含肽或模擬肽以及用于連接所述分子與生物活性部分或診斷部分的非肽的連接部分，所述肽或模擬肽包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成LGAQSNF(SEQIDNO100)QLFTSAS(SEQIDNO3)LYQDYSL(SEQIDNO85)SPNSIGTSTFTHPRSTIHGSTSAPRPLYaaqtstpyqdsaktavtinepvtaatlstypaallelspsaptvpqlttqnappslydidnrrqtllpshtsfqphrgntpsraltqmsisrltlpmpgtappvhhspskipfphypmsashlepsamttkidatlthpphmatfhyllatptpaqpnkfkmpallrslppehplAHPQLATYAGPYQHHWEMWSYQAPRLffSHTPNSTHsnqlvegfspstpnasspvhrsphsasldqlplipslaaylhwsqmhflsipllnhnqqfyilfesrltaqplsnaskpaygstanysvsiyshtaatQHPPffRVMPAVPHSSALLPSFTHPPTTHSNSIRPNASVQQRGfppsftamqqgprpqktalpltygtkisslkllnqTSSTMNRYKHTPTTGSffYQVPYYFPPFYAYKPVGRASTLKffATffTFRIPSYMIQLSIQSPHFFSVSPffGITHLPffQTAHSMGTGFMSPLffTIVNTAPLSTFTKSPiptlpssafvsrqpsslplrktystlgyvtyktasEPLQLKMWSLQASHTLffVPSRQGMHRGTSESMSIKLPffKPLGQSPHTAPTPAHPNYSLLGSTPtalppsyvnsathslpltplpnqlplhatqtplkqhaiyprhamisaihnltrlhthvianag。全文摘要本發(fā)明提供了包含與部分連接的器官、組織或腫瘤細胞歸巢分子的偶聯(lián)物。所述部分能夠是例如寡核苷酸、小干擾RNA、基因、病毒、蛋白、藥物或可檢測劑。此外，本發(fā)明提供了通過給予患有或疑似患有病變的個體分子或偶聯(lián)物以診斷或治療肌肉或心臟病變的方法，所述分子或偶聯(lián)物歸巢于、結(jié)合于肌細胞或心臟細胞并被肌細胞或心臟細胞攝取。文檔編號A61K47/48GK101815535SQ200880101666公開日2010年8月25日申請日期2008年7月14日優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日發(fā)明者朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬多伊特科姆,杰勒德·約翰尼斯·普拉滕伯格,皮特拉·萬庫伊克-羅梅恩,約翰尼斯·安東尼烏斯·海姆斯凱克申請人:普羅森那技術(shù)公司