專利名稱：：在受治療組織中展現(xiàn)高停留時(shí)間的氧化的抗生物素蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可在活體內(nèi)與組織交互作用的經(jīng)化學(xué)氧化的抗生物素蛋白，其是透過可逆的共價(jià)化學(xué)鍵以延遲其擴(kuò)散的方式作用。這類氧化的抗生物素蛋白是在外科手術(shù)步驟或經(jīng)由注射投與至需要治療的選定的器官或組織。借由10mM過碘酸鈉進(jìn)行的抗生物素蛋白的氧化作用最近有報(bào)道(US20020137125)。后者中，作者將氧化的抗生物素蛋白與磷酸五甘露糖_肼偶合，以取得高度磷酸化的亞胺衍生物，然后可將其給予患者，以修改溶酶體酶，如此可加強(qiáng)溶酶體病的酶替代療法的效力。值得注意的是，亞胺形成作用并未在活體內(nèi)發(fā)生。也需注意，該申請(qǐng)案中并未報(bào)道這類經(jīng)改質(zhì)的抗生物素蛋白的活性。尤其是，本發(fā)明是關(guān)于經(jīng)由將糖蛋白的糖部分氧化來取得氧化的抗生物素蛋白，與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比較，其顯示出在組織中有更高的持久性，同時(shí)也將在使用先前報(bào)道的經(jīng)改質(zhì)的抗生物素蛋白時(shí)所面臨的副作用減至最低。氧化的抗生物素蛋白的組織結(jié)合作用為高度同質(zhì)性且不像在IART中般依賴帶正電的抗生物素蛋白在腫瘤及發(fā)炎組織中定位的能力。因此，氧化的抗生物素蛋白的作用并不局限于與腫瘤細(xì)胞的特殊交互作用，如此，可將圍繞在經(jīng)手術(shù)移除的腫瘤周圍的組織(已知其含有以野生型抗生物素蛋白靶向時(shí)不易接近的多余的腫瘤細(xì)胞)抗生物素蛋白化。本發(fā)明的第一種優(yōu)選實(shí)施方式是關(guān)于借由吡喃糖苷糖的氧化開環(huán)來化學(xué)改質(zhì)的野生型抗生物素蛋白，如此可產(chǎn)生可與存在于所關(guān)注的組織中的氨基殘基交互作用的醛部分。由于存在質(zhì)子化NH3+形式，CHO基團(tuán)在酸性pH(低于6.0)下對(duì)蛋白質(zhì)NH2大體上為惰性。然而，在pH^7下，CH0基團(tuán)與蛋白質(zhì)NH2殘基反應(yīng)以形成希夫氏堿。圖表l中呈現(xiàn)野生型抗生物素蛋白的代表性甘露糖殘基的化學(xué)氧化作用以及接下去新形成的CHO基團(tuán)與氨基團(tuán)(R-N^，其中R為組織蛋白質(zhì)殘基)的反應(yīng)的實(shí)例。圖表1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>此糖氧化作用是根據(jù)為人熟知的基于天然抗生物素蛋白與過碘酸鈉的反應(yīng)的方法來獲得(Zaborsky，0.R.，etal.，Biochem.Bioph.Res.Comm.，1974，61，1，210;Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)。然而，已知抗生物素蛋白的氧化作用會(huì)對(duì)某些蛋白質(zhì)氨基-酸性殘基造成損害(即，涉及生物素結(jié)合部位的色胺酸的氧化)，使得對(duì)生物素及/或生物素衍生物的親和力較低(US20040191832;Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)抗生物素蛋白在氧化步驟前結(jié)合至低親和性配體4-羥基偶氮苯-2'-甲酸(HABA)時(shí)可提供前者防止色胺酸殘基氧化的構(gòu)型，此點(diǎn)可由這類衍生物的UV光譜揭露出。UV光譜中，282nm及291nm處的獨(dú)特曲折減低是與色胺酸氧化程度嚴(yán)格相關(guān)；同時(shí)，250-260nm區(qū)中吸收的增加為形成經(jīng)取代的羥吲哚的特征。與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)的吸收光譜相比較，氧化的抗生物素蛋白(OXavidin)及HABA-飽和的氧化的抗生物素蛋白(0XavidinHABA)的吸收光譜指出在氧化期間使用HABA來保護(hù)生物素結(jié)合部位可大為降低色胺酸的損害率(圖1)。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式為氧化的抗生物素蛋白，其UV光譜中在282nm及291nm處的吸收與所觀察到的WTavidin的吸收相比較并未呈現(xiàn)色胺酸殘基氧化的彎曲特征。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式為氧化的抗生物素蛋白，其UV光譜中該250nm至260nm處的吸收與所觀察到的WTavidin的吸收相比較并未出現(xiàn)任何增加。本發(fā)明的又一優(yōu)選實(shí)施方式是在配體HABA(由于氧化表現(xiàn)出色氨酸殘基)的存在下氧化抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白衍生物的方法。與HABA的保護(hù)作用完全一致，0XaVidinmBA顯示出與WTavidin非常類似的構(gòu)造及熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。熱穩(wěn)定性及構(gòu)形改變是在氧化前及氧化后，有或無4當(dāng)量的生物素的情況下借由圓二色譜測(cè)定。經(jīng)由追蹤在25-95°C的溫度范圍內(nèi)，225nm處的二色性信號(hào)減少來記錄熔解曲線。借0rigin7.0軟件，Boltzman配合模型來計(jì)算S型曲線的拐點(diǎn)和斜率(P)，其代表通過變性條件的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。對(duì)各特定化合物而言，熱穩(wěn)定性相當(dāng)于在25_95°C的溫度范圍內(nèi)，該配合對(duì)應(yīng)曲線中的拐點(diǎn)的溫度。由于確定了OXavidin的熔解溫度(Tm)及S型曲線的斜率(p)與WTavidin相比較較低(分別為74.3t:對(duì)79.(TC及8.9對(duì)14.7)，數(shù)據(jù)(表1)指出氧化作用將降低熱穩(wěn)定性。令人驚訝地，當(dāng)氧化作用是在經(jīng)HABA保護(hù)的抗生物素蛋白上進(jìn)行時(shí)幾乎可以忽略該不穩(wěn)定化作用(由0XavidinHABA及抗生物素蛋白的Tm及p值確認(rèn)，分別為78.rC對(duì)79.(TC及11.2對(duì)14.7)。表1Tm(。C)P*抗生物素蛋白79.0±0.114.7±0.3抗生物素蛋白+4當(dāng)量生物素>95n.a.OXavidin74.3±0.18.9±0.10Xavidin+4當(dāng)量生物素86.3±0.220.7±1.1OXavidin,78.1±0.311.2±0.40Xavidin咖A+4當(dāng)量生物素>95n.a.AS型曲線的斜率；n.a.=不適用雖然在加熱時(shí)未加入生物素時(shí)熱變性對(duì)OXavidinHABA及OXavidin二者均為不可逆，但當(dāng)在生物素的存在下加熱/冷卻時(shí)僅OXaVidinmBA可回復(fù)其二極構(gòu)造，類似于WTavidin(其數(shù)據(jù)未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)可確認(rèn)HABA飽和作用為抗生物素蛋白進(jìn)行化學(xué)氧化時(shí)用來保存其構(gòu)形的一種非常有效的方式，并且解釋了因此保留的生物素結(jié)合能力。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式為呈現(xiàn)高于或等于78t:的熱穩(wěn)定性的氧化的抗生物素蛋白。本發(fā)明的一種更佳實(shí)施方式為呈現(xiàn)高于或等于78t:的熱穩(wěn)定性且S型曲線的斜率大于10的氧化的抗生物素蛋白。先前的發(fā)現(xiàn)也借由氧化的抗生物素蛋白(0XaVidinHABA)對(duì)生物素化的加合物ST2210的結(jié)合力(如表2中所示，其類似于WTavidin)得到證實(shí)。表27<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>n=獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)目；SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差；NT=未測(cè)試@借由HABA分析與游離生物素相比較時(shí)，以生物素D0TA(ST2210)取得的實(shí)驗(yàn)值97.4±0.5是被假定為100%來作為改質(zhì)的抗生物素蛋白的參考值；*p<0.05對(duì)lOmM;#p<0.01對(duì)lOmM(單向Anova，再接續(xù)Student-Newman-Keuls);**p<0.001對(duì)相同物但無廳A(雙向A麗a，再接續(xù)Bonferroni)根據(jù)最優(yōu)化的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白(OXavidin皿)與無HABA保護(hù)作用時(shí)所制得的氧化的抗生物素蛋白相比較，其在結(jié)合ST2210方面顯示出改良的性質(zhì)，但在受治療的組織(經(jīng)肌肉內(nèi)注射后的小鼠肌肉肢體)中仍維持高持久性。確實(shí)，若在氧化作用前加入HABA，則當(dāng)以lOmMNaI04將抗生物素蛋白氧化后，其在結(jié)合ST2210方面的能力增加(86.3X，相對(duì)于無HABA存在時(shí)，對(duì)應(yīng)的氧化的抗生物素蛋白僅為50.9%)。當(dāng)氧化作用是在較高濃度(20mM)的過碘酸鈉的存在下發(fā)生時(shí)可取得類似的結(jié)果(81.4%對(duì)49.1%)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式為一種氧化的抗生物素蛋白，相關(guān)于WTavidin與ST2210結(jié)合的程度為97.4%，其呈現(xiàn)出與ST2210的結(jié)合程度是高于或等于75%。再者，不管這類氧化作用是否是在HABA的存在下發(fā)生，在小鼠后肢中的氧化的抗生物素蛋白的組織持久性較WTavidin高出很多。此行為與抗生物素蛋白的糖基化側(cè)鏈內(nèi)存有CHO基團(tuán)絕對(duì)相關(guān)。在本發(fā)明的一更佳實(shí)施方式中，以10和20mMNaI04氧化后可產(chǎn)生每一抗生物素蛋白約帶有8至15個(gè)CHO殘基(此是借Purpald氏方法估計(jì))。再于本發(fā)明的一更佳實(shí)施方式中，"經(jīng)HABA保護(hù)"的氧化的抗生物素蛋白衍生物(0XavidinmBA)在注射后24小時(shí)及一周時(shí)仍維持高ST2210結(jié)合能力并展現(xiàn)出組織持久性，這與CHO基團(tuán)數(shù)目相關(guān)。借由等溫滴定量熱法(ITC)測(cè)得的這類抗生物素蛋白/生物素交互作用的物化特性揭露出ST2210能夠以可相比擬的方式與WTavidin和OXavidinHABA結(jié)合，此可由結(jié)合常數(shù)(KA)及熱函變化(AH)證實(shí)(分別為3.45對(duì)2.50X106M—1及-1.48對(duì)-1.71X104千卡摩爾—0。相反地，ST2210/0Xavidin交互作用顯示出較低的KA(6.45X105M—0及較高的AH(-0.79X104千卡摩爾—0。根據(jù)ST2210結(jié)合氧化的抗生物素蛋白的數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)，該測(cè)得的交互作用的化學(xué)計(jì)量為每分子WTaVidin、OXavidinHABA及OXavidin分別結(jié)合3.0、1.7及1.2個(gè)分子的ST2210。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明的氧化的抗生物素蛋白大體上維持野生型抗生物素蛋白的生物素結(jié)合能力，但取得以可逆方式與組織蛋白質(zhì)交互作用的性質(zhì)，如此可產(chǎn)生用于近距離放射治療中(如用于IAIO^中)的理想的候選作用劑。于本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，氧化的抗生物素蛋白是在手術(shù)間階段投與以產(chǎn)生用于接下去的抗癌劑的"人工受體"。本發(fā)明的一更佳實(shí)施方式是提供作為第一種近距離放射治療劑的以化學(xué)方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治療的組織中具有高持久性)與對(duì)所述第一種氧化的抗生物素蛋白具親和性的第二種作用劑。本發(fā)明的一甚至更佳的實(shí)施方式是提供作為第一種近距離放射治療劑的以化學(xué)方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治療的組織中具有高持久性)與對(duì)所述第一種氧化的抗生物素蛋白具親和性的第二種抗癌劑。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式為一種藥學(xué)組合物，其含有該經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白作為第一種成分及生物素化的治療劑作為第二種活性成分。于本發(fā)明的一優(yōu)選體現(xiàn)中，上述藥學(xué)組合物的第二種活性成分為生物素化的抗癌劑。抗癌劑意指可對(duì)抗腫瘤的試劑。抗癌劑的非詳盡列表中包含化療藥物、經(jīng)放射標(biāo)示的化合物、效應(yīng)細(xì)胞、毒素、細(xì)胞因子及抗癌細(xì)胞。于本發(fā)明的另一優(yōu)選體現(xiàn)中，該療法采用放射治療的形式。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式包含用于乳房、肌肉、肝臟、胰臟、膀胱、腦、肺、前列腺、卵巢、眼及其他器官的近距離放射治療的試劑盒的制備方法。于該試劑盒的優(yōu)選體現(xiàn)中，所述二種成分是在二個(gè)分開的容器中。于一更佳的實(shí)施方式中，該經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白的容器中包含適量的產(chǎn)物，此產(chǎn)物是在可相容的酸性溶液中配制或與合適的賦形劑一起凍干以形成凍干塊。于一特佳的實(shí)施方式中，上述容器將為特定的針筒形式，此針筒形式可適合連續(xù)投與數(shù)個(gè)精準(zhǔn)體積至由于重要器官浸潤(rùn)而無法借手術(shù)移除的生病組織的切除邊緣或殘余部分。較合宜地，該容器也可為適合以噴霧形式給予經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白的形式。優(yōu)選地，該已含有個(gè)別成分的劑量的不同容器是制成攜帶用于該投與模式的規(guī)格的單一包裝。更佳地，所述各種容器為針筒的形式。于另一特佳實(shí)施方式中，該用于近距離放射治療中(如用于IART⑧中)的試劑盒適合用于依序局部投與第一種成分及接下去的系統(tǒng)性或局部投與第二種成分。本發(fā)明組合物的第二種成分可借任何數(shù)目的途徑投與，包括，但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、室內(nèi)、皮內(nèi)或透皮施用、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)、直腸裝置或在生病組織上局部投與。有些臨床病例的近距離放射治療是借由直接將放射同位素直接投至腫瘤塊體(即，JulowJ.，etal.，Prog.Neurol.Surg.，2007，20，303中所描述的不宜手術(shù)的腦腫瘤)或腫瘤影響器官(即，SaitoS，etal.，Int.J.Clin.Oncol.，2007,12,395中所描述的前列腺)中來進(jìn)行。在這類病例中，理想的近距離放射治療設(shè)備為在受治療部位中顯示出均勻分布及穩(wěn)定性的設(shè)備。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)組織抗生物素蛋白化可在不同組織中出現(xiàn)，如在肌肉、乳腺(顯示于此處的實(shí)施例中)及腦組織中。于另一特佳實(shí)施方式中，該復(fù)合的氧化的抗生物素蛋白_生物素化的治療劑可經(jīng)由將二種成分混合來取得，再接著投給患者。本發(fā)明的組合物構(gòu)成用于可手術(shù)或不可手術(shù)或不可完全移除的實(shí)體腫瘤的治療的藥物，這些腫瘤是諸如，但不只限于乳癌、胰臟癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面頸癌、膀胱癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、眼癌及其他器官的癌(如以本申請(qǐng)人的名義申請(qǐng)的專利申請(qǐng)案W02004/093916中所描述者)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，該借由本發(fā)明的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白可定義為經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白，該經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白中至少一甘露糖殘基已被下列式(I)的殘基取代式I本發(fā)明的另一目的為先前描述的藥學(xué)組合物加上賦形劑及/或藥學(xué)上可接受的稀釋劑。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式為用于制備藥學(xué)組合物的方法，該方法的特征為將該經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白與合適的賦形劑、穩(wěn)定劑及/或藥學(xué)上可接受的稀釋劑混合。賦形劑為加入藥物中以提供體積的惰性物質(zhì)。該藥學(xué)組合物也可含有為投與治療劑的藥學(xué)上可接受的載體。這類載體包括抗體及其他多肽、基因和其他治療劑(諸如脂質(zhì)體)，其先決條件為投與該載體時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不當(dāng)?shù)亩拘浴：线m的載體可為大的、慢慢代謝的巨分子，諸如蛋白質(zhì)、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物及非活性的病毒顆粒。藥學(xué)上可接受的載體的詳盡討論可在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中找到。治療組合物中的藥學(xué)上可接受的載體可另外含有液體，諸如水、生理食鹽水、甘油及乙醇。另外，這類組合物中也可存有輔助性物質(zhì)，諸如濕潤(rùn)或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。這類載體使藥學(xué)組合物可配制成凍干塊、片劑、藥丸、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿體、混懸液等形式以供患者食入。欲治療的個(gè)體可為動(dòng)物；尤其是可用來治療人類個(gè)體。配藥治療可為單劑量用藥或多劑量用藥。該劑量可由該領(lǐng)域的技術(shù)人員決定，以遞送展現(xiàn)有效的治療作用的量至標(biāo)靶組織。—般的劑量范圍可介于10-100毫升的濃度為3-5毫克/毫升的氧化的抗生11物素蛋白溶液。劑量體積是取決于欲治療的標(biāo)靶組織的體積，即，乳房四分之一切除術(shù)(quadrantectomy)的部位周圍的乳房區(qū)域的典型治療中是使用30毫升(PaganelliG.，etal.，TheBreast,2007，16，17)或治療腹膜腔中是使用至多100毫升。氧化的抗生物素蛋白的生化特征包括借由本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的比色Plirpald⑧法(AvigadG.，Anal.Biochem.，1983，134，2，499)，使用丙醛作為標(biāo)準(zhǔn)來估計(jì)CHO基團(tuán)。附圖簡(jiǎn)要說明圖1:其顯示三種不同形式的抗生物素蛋白的UV光譜。圖2:曲線A、B及C分別關(guān)于在體積排阻色譜法(Bios印-SEC-S3000柱(PhenOHieneX,300x7.8毫米，體積14.3毫升))上的WTavidin、0XavidinHABA及OXavidin的洗脫變化形廓，該層析法是利用恒組成溶劑洗脫條件，以lOOmM醋酸鈉緩沖液pH5.5及0.15MNaCl，流速1毫升/分鐘，在室溫下進(jìn)行。后二者是利用NaI04(20mM)，借氧化作用自WTavidin取得。280/260比是關(guān)于抗生物素蛋白在色胺酸殘基的氧化及羥吲哚的形成方面的完整性。圖3:其顯示經(jīng)肌肉內(nèi)給予后，在受治療的小鼠中的氧化的抗生物素蛋白的生物分布。尤其是，圖3a指出注射后1小時(shí)，在受治療的肢體中氧化的抗生物素蛋白的量超過二倍的天然抗生物素蛋白。其差異隨時(shí)間增加天然抗生物素蛋白在24和48小時(shí)后幾乎測(cè)不到，而氧化的抗生物素蛋白分別代表約22%及15%注射劑量/100毫克組織。因此，如圖3b、c及d中分別顯示的血液、腎臟及肝臟的結(jié)果，在受治療的肢體中，與野生型抗生物素蛋白相比較，較高濃度的氧化的抗生物素蛋白是與非標(biāo)靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布較少及野生型抗生物素蛋白的分布較多有關(guān)，尤其是在第1小時(shí)中。圖3e顯示對(duì)側(cè)肢體中氧化的抗生物素蛋白及野生型抗生物素蛋白的分布情形。圖4:其顯示經(jīng)1251-放射性標(biāo)記的WTavidin及0XaVidinHABA在受治療及對(duì)側(cè)肢體中至多14周的組織持久性。參考第1小時(shí)的水平時(shí)，這類圖形指出相對(duì)于WTavidin的組織半衰期為2小時(shí)，0XavidinHABA的組織半衰期為約2周。圖5:其顯示以配制在100mM醋酸鹽緩沖液pH5.5中的45微克(在15微升體積中)經(jīng)1251_標(biāo)記的WTavidin、PEGavidin或OXavidin注射Balb/c小鼠的一邊后肢后24小時(shí)，WTavidin、PEGavidin及0XavidinHABA的組織持久性。在受治療的肢體中的放射活性是借由Y計(jì)數(shù)器測(cè)量(CamberraPackard,SchwadorfAustria)。圖6:其顯示取自注射WTavidin(板面a)或0XavidinmBA(板面b)的Balb/c小鼠肌肉的切片，該切片是先以用于免疫螢光的抗-抗生物素蛋白抗體小鼠抗-抗生物素蛋白腹水(A5680批次064K4826,SigmaAldrich)，再以抗小鼠AlexaFluor488(批次99E2.2，分子探針)染色。板面a顯示微弱的局部點(diǎn)狀，而來自注射OXavidiriH艦的肌肉的切片顯示強(qiáng)而12均勻的分布。二種情況中抗生物素蛋白均定位在間質(zhì)。圖7:其顯示在經(jīng)i.v.，注射mIn-ST2210的Balb/c小鼠后肢中于不同時(shí)點(diǎn)的持久性，該Balb/c小鼠是在48小時(shí)前以WTavidin或0XavidinHABA(板面a)處理。板面b、c及d是分別指經(jīng)i.v.注射mIn-ST2210后肝臟、腎及脾臟中所捕集的mIn-ST2210。板面e顯示組織抗生物素蛋白化48小時(shí)后所捕集的mIn-ST2210。在第二個(gè)案例的情況中(重復(fù)min-ST2210)，所述動(dòng)物空腹接受一個(gè)冷ST2210(coldST2210)劑量，24小時(shí)后再給予第二個(gè)mIn-ST2210劑量。圖8:其顯示注射在一只后肢中1周后，與ST2210復(fù)合的WTavidin或OXavidinH艦的組織停留時(shí)間。圖9:其顯示注射入頭骨左側(cè)后24小時(shí)，OXaVidinHABA的腦組織停留時(shí)間。下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:氧化的抗生物素蛋白的合成方法及生化特征該氧化程序的方法包含下列連續(xù)步驟a)將預(yù)先與一摩爾過量的HABA混合的野生型抗生物素蛋白與氧化劑(諸如在pH值低于6.0的50-100mM醋酸鹽緩沖液中的10-20mM過碘酸鈉)于4。C或室溫下培養(yǎng)1_5小時(shí)；b)阻斷反應(yīng)，并借由色譜法、超濾作用、透析作用或其他本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的純化方法移除氧化劑及HABA，以進(jìn)行純化；及c)在酸性pH下進(jìn)行凍干或制劑。將氧化的抗生物素蛋白在Bios印-SEC-s3000柱(Phenomenex,300x7.8毫米，體積14.3毫升)上，利用恒組成溶劑洗脫條件，以lOOmM醋酸鈉緩沖液pH5.5及0.15MNaCl，流速1毫升/分鐘，在室溫下利用體積排阻色譜法，以進(jìn)一步分析分子尺寸。如圖2所示，氧化的抗生物素蛋白的洗提液顯示出與天然抗生物素蛋白相比較稍有些延遲。實(shí)施例2:氧化的抗生物素蛋白在受治療的小鼠中的生物分布在小鼠模型的剌激性IART⑥中評(píng)估與野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比較，氧化的抗生物素蛋白(Oxavidin)在受治療的組織中的持久性、其在未受治療的器官中的生物分布及其捕捉mIn-ST2210的能力。手術(shù)切開一小鼠后肢以建立IART逸的動(dòng)物模型，令經(jīng)放射性標(biāo)記的抗生物素蛋白浸潤(rùn)手術(shù)邊緣和周圍組織并在投藥后于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量受治療肢體中的放射活性。在小鼠的平行組中令放射活性的抗生物素蛋白浸潤(rùn)未手術(shù)的肢體中。在投藥后的1及24小時(shí)，經(jīng)手術(shù)治療及未經(jīng)手術(shù)治療的動(dòng)物中的放射活性量類似。因此，通過浸潤(rùn)抗生物素蛋白而不手術(shù)來進(jìn)行進(jìn)一步研究。根據(jù)IodoGen方法(伊利諾州(IL)Rockford市，Pierce)，以^I(意大利，PerkinElmer)標(biāo)示W(wǎng)Tavidin。在PD-1013柱(瑞典Uppsala，AmershamBiosciences)上借由色譜法將經(jīng)標(biāo)記的抗生物素蛋白自游離碘分離出并依先前實(shí)施例1中的描述進(jìn)行氧化，無任何預(yù)先的HABA保護(hù)。根據(jù)先前描述的方法(UrbanoN.，etal.，Eur.JNucl.Med.Mol.Imaging,2007,34,68)，以min(意大利，PerkinElmer)標(biāo)示專利申請(qǐng)案WO02/066075中所描述的ST2210(第18頁，l-[2-[6-[5-[(3aS，4S，6aR)-六氫-2-氧代-lH-噻吩并[3，4_d]咪唑-4-基]-l-五氨基]-l-六氨基]-2-氧代乙基]-l，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三醋酸五鹽酸鹽)。將Balb/c皿/皿小鼠(意大利，HarlanUdine)分成8組，每組5只。經(jīng)由肌肉內(nèi)途徑(i.m.)在每只小鼠的一只后肢中給予以1251標(biāo)示的WTavidin或0Xavidin(400微克/小鼠，在40微升的體積中)并在1、24或48小時(shí)后經(jīng)由靜脈內(nèi)途徑(i.v.)給予小鼠16微克的mIn-ST2210。投與mIn-ST2210后的1、24或48小時(shí)處死小鼠并收集受治療及對(duì)側(cè)的肢體、腎臟、肝臟及血液樣本，在Y-計(jì)數(shù)器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)中計(jì)算。如圖3a中所示，注射1小時(shí)后，受治療的肢體中，氧化的抗生物素蛋白的量超過二倍的抗生物素蛋白。其差異隨時(shí)間增加WTavidin在24及48小時(shí)后幾乎測(cè)不到，而0Xavidin分別為約22X及15X的注射劑量/100毫克組織。因此，如圖3b、c及d中的血液、腎臟及肝臟的結(jié)果所示，在受治療的肢體中，與野生型抗生物素蛋白相比較，較高濃度的氧化的抗生物素蛋白是與非標(biāo)靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布較少及野生性抗生物素蛋白的分布較多有關(guān)，尤其是在第1小時(shí)中。圖3e顯示對(duì)側(cè)肢體中OXavidin及WTavidin的分布情形。如專利申請(qǐng)案WO2004/093916中所描述，由于IART⑧預(yù)先局部投與WTavidin(手術(shù)間注射)，4-72小時(shí)后再經(jīng)由靜脈內(nèi)途徑注射抗癌劑，顯然地，使用經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白(如本發(fā)明的實(shí)施例中)可提供很好的助益。實(shí)施例3:野生型及氧化的抗生物素蛋白的長(zhǎng)期組織持久性在Balb/c皿/皿小鼠(意大利Lecco，CharlesRiver)的一只后肢中注射體積為15微升的配制在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩沖液中的45微克以1251標(biāo)示的WTavidin或以125I標(biāo)示的OXavidin并在指出的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，借Y_計(jì)數(shù)器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測(cè)量受治療的肢體及其他非標(biāo)耙器官中的放射活性。監(jiān)測(cè)WTavidin及OXavidinH艦的組織持久性至多14周。當(dāng)指1小時(shí)的水平時(shí)，相對(duì)于WTavidin的組織半衰期為2小時(shí)，OXavidin的組織半衰期為約2周(圖4)。實(shí)施例4:氧化的抗生物素蛋白在乳房組織中的生物分布評(píng)估與WTavidin相比較，0XaVidinHABA在乳房組織中的持久性。將依實(shí)施例1中所描述的一般方法制備的50微克(在15微升體積中)的以125I標(biāo)示的WTavidin或OXavidinnABA投至兔子(意大利Rieti，F(xiàn)rancucciEnzo)乳頭下方的乳房區(qū)域(每一抗生物素蛋白3個(gè)乳房)。注射后24小時(shí)處死動(dòng)物并自注射區(qū)收集約200毫克的組織樣本，依前述那樣在Y-計(jì)數(shù)器中計(jì)算。該數(shù)據(jù)為3個(gè)測(cè)定值的平均值(+/-SD)。表4中的數(shù)據(jù)顯示出24小時(shí)后乳房組織中的WTavidin及0XaVidinmBA分別為8.5%及65.8%ID。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)與先前在小鼠的肌肉組織中所觀察到的WTavidin相比較，兔子乳房組織中的0XaVidinHABA具較高的持久性。14[one]表4:兔子乳房組織中WTavidin及0XaVidinHABA的24小時(shí)持久性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例5:野生型、聚乙二醇化或氧化的抗生物素蛋白的組織持久性其他科學(xué)小組先前曾描述意圖改良抗生物素蛋白在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期的經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白(CalicetiP.，etal.，J.Control.Release,2002，83，97;SalmasoS.，etal.，Int.J.Pharm.，2007，340，20)。在C57B1/6小鼠中(意大利Lecco，CharlesRiver)評(píng)估WTavidin、根據(jù)Caliceti制備的PEGavidin或0XavidinHABA(根據(jù)本發(fā)明的氧化的抗生物素蛋白)的組織持久性。在動(dòng)物的一只后肢中注射(i.m.)體積為15微升的在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩沖液中配制的45微克以125I標(biāo)示的WTavidin、PEG-avidin或OXavidin咖A。注射后24小時(shí)處死小鼠，用Y-計(jì)數(shù)器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測(cè)量受治療的肢體中的放射活性。PEG-結(jié)合作用不會(huì)影響WTavidin的組織持久性，但可確認(rèn)0XaVidinHABA的組織持久性增加(圖5)。實(shí)施例6:WTavidin或0XavidinmBA的組織定位在Balb/c裸鼠(意大利Udine，Harlan)的一只后肢中經(jīng)肌肉內(nèi)注射0XavidinHABA及WTavidin后，在抗生物素蛋白化組織的冷凍切片中評(píng)估與WTavidin相比較，0XaVidinHABA的組織定位。治療后24小時(shí)切開肌肉并自各樣本制備一系列冷凍切片。將各載玻片以蘇木精/洋紅染色以評(píng)估組織形態(tài)或?qū)⑵湎扰c小鼠抗-抗生物素蛋白抗體(意大利，SigmaAldrich，A5680)—起培養(yǎng)，再與抗_小鼠Alexafluor488(意大利米蘭，Invitrogen)一起培養(yǎng)。最后，在載玻片上蓋上蓋玻片并在顯微鏡下觀察。如圖6中所示，自注射WTavidin(板面a)的肌肉取得的切片顯示出微弱的局部點(diǎn)狀，而來自注射0XavidinHABA的肌肉的切片(板面b)顯示強(qiáng)而均勻的分布。在二種情況中抗生物素蛋白均定位在間質(zhì)處。蘇木精/洋紅染色顯示出以WTavidin或0XavidinHABA注射后24小時(shí)肌肉并無組織學(xué)上的異常(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例7:mIn-ST2210的單次及重復(fù)捕集在小鼠模型的剌激性IART中評(píng)估與WTavidin相比較，0XavidinHABA捕集mIn-ST2210的能力。在Balb/c皿/皿小鼠(意大利，HarlanUdine)的一只后肢中注射(i.m.)體積為15微升的配制在pH5.5的lOOmM醋酸鹽緩沖液中的45微克WTavidin或0XavidinHABA。注射后48小時(shí)，經(jīng)由靜脈內(nèi)途徑(i.v.)給予動(dòng)物5微克的mIn-ST2210。在指定的時(shí)間點(diǎn)處死各為只的動(dòng)物組并用Y-計(jì)數(shù)器(奧地利Schwadorf，CamberraPackard)測(cè)量受治療的肢體及其他非標(biāo)耙器官中的放射活性。如圖7a中所示，在i.v.注射2小時(shí)后，以0XaVidinHABA治療的組織所特異捕集的mIn-ST2210較以WTavidin治療者高出很多。這些放射活性的持久性差異在i.v.投與mIn-ST2210后的接續(xù)時(shí)點(diǎn)仍可持續(xù)至多24小時(shí)，由此可確認(rèn)以0XavidinHABA取得的長(zhǎng)期持續(xù)的組織抗生物素蛋白化。以WTavidin及0XaVidinHABA治療時(shí)，mIn_ST2210在非標(biāo)靶器官中的分布類似(圖7b、c、d)。令一組動(dòng)物先接受5微克冷ST2210的第1個(gè)靜脈內(nèi)劑量后24小時(shí)再接受5微克m工n-ST2210的第2個(gè)劑量。前者是在抗生物素蛋白化24小時(shí)后進(jìn)行。經(jīng)i.v.注射經(jīng)放射性標(biāo)示的ST2210后2小時(shí)處死動(dòng)物并依上述Y_計(jì)數(shù)器測(cè)量受治療的肢體中的放射活性。如圖7e中所示，以O(shè)XaVidinHABA治療的肢體中所捕集的第二個(gè)mIn-ST2210劑量的量與以單一劑量所捕集者相當(dāng)。此結(jié)果暗示本研究中所使用的單一ST2210劑量并未使該抗生物素蛋白化組織被浸透飽和，而將給定的所欲劑量分成幾部分是合適的。實(shí)施例8:在NeuT轉(zhuǎn)基因小鼠中的mIn/9°Y_ST2210捕集及療效意大利托林(Turin)大學(xué)GuidoForni教授親切提供攜帶活化的大鼠HER-2/neu致癌基因的Balb/c轉(zhuǎn)基因小鼠(Balb-NeuT小鼠)(DiCarloE.，etal.，Lab.Invest.，1999，79，10，1261)。在動(dòng)物12周大時(shí)(此時(shí)期相當(dāng)于動(dòng)物的所有IO個(gè)乳房中原位發(fā)展出癌癥的期間)為每組四只的動(dòng)物的二邊IV乳房經(jīng)乳頭內(nèi)途徑注射25微升(3.3毫克/毫升)的介質(zhì)、WTavidin或0XaVidinHABA。48小時(shí)后給予(i.v.)動(dòng)物劑量為4.4微克的經(jīng)放射標(biāo)示的ST2210。此劑量相當(dāng)于用于治療目的的800iiCi的9。Y(飾Ci的mIn_ST2210突起是用于計(jì)算劑量)。在投藥后3小時(shí)處死2只動(dòng)物/組并切開乳房IV及III，依上述在Y-計(jì)數(shù)器中計(jì)算。也收集非標(biāo)靶器官進(jìn)行稱重及計(jì)算。數(shù)據(jù)以^D/克組織表示。依前述的乳腺整體分析來評(píng)估此預(yù)先靶向的近距離放射治療對(duì)腫瘤損害的效果(DeGiovanniC.，etal.，CancerResearch,2004，64，4001)。表5中所示的數(shù)據(jù)指出在NeuT小鼠中，經(jīng)OXavidin皿治療的IV乳房中有明顯的經(jīng)放射標(biāo)示的ST2210的特異捕集，但在經(jīng)WTavidin治療及經(jīng)介質(zhì)治療的IV乳房中均無。來自所有動(dòng)物組的乳房III為陰性(血液背景水平)，此暗示抗生物素蛋白化是僅局限于受治療的乳房。全部數(shù)據(jù)與先前關(guān)于WTavidin及OXavidiriH艦的組織持久性方面的差異相一致。在任何案例中，血液及非標(biāo)靶器官(包括腎臟、肝臟及脾臟)中的背景放射活性均低于0.2%ID/克組織，此暗示不需如目前的IAIO^變體般以生物素化白蛋白進(jìn)行追蹤步驟。此以O(shè)Xavidin皿為基礎(chǔ)的近距離放射治療對(duì)NeuT小鼠的乳腺的效果使經(jīng)0XaVidinHABA治療的乳房中的癌癥損害與經(jīng)載劑或WTavidin治療的乳房相比較明顯減少(數(shù)據(jù)未顯示)。表5Neut模型％JMlti/9CIY-ST2210的。/"D/克(土SD)'血液脾臟腎臟肝臟乳房IV乳房III介質(zhì)0.003(0.001)0.007(0.002)0.143(0.OU)0.023(0.001)0,007(0，002)0.005(0.001)WTavidin0.002(0.001)0.008(0.001)0.161(0.035)0-027(0.006)0.028(0.027)0.007(0.002)OXavididhaba0,003(0.001)0.006(0.001)0.101(0,008〉0-019(0.003)1,784(0,512)實(shí)施例9:單步驟近距離放射治療在體外以ST2210將125I-OXavidinHABA飽和后借由超濾作用將125I-OXavidinHABA自未結(jié)合的ST2210中純化出來，再將其經(jīng)由肌肉內(nèi)途徑注射入Balb/c小鼠的一只后肢中。在WTavidin方面也依循相同的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。161周后，將受治療的肢體中該以ST2210飽和的WTavidin或0XavidinH^的量與游離的WTavidin或OXavidiriH^相比較。圖8中的結(jié)果同時(shí)指出在注射后一周仍存有與ST2210復(fù)合的OXavidin咖A或未復(fù)合的OXavidinHABA(l7%ID/100毫克)，WTavidin則幾乎完全消失(<0.5%ID/100毫克)，由此可證明預(yù)先以生物素化試劑飽和的OXaVidinHABA與游離OXavidinHABA有相同的作用方式，其可用于單步驟近距離放射治療。實(shí)施例10:OXavidinmBA與WTavidin相比較的腦部持久性在全身麻醉下，將5微升體積(16微克劑量)依前述制備的^I-WTavidin或OXaVidinmBA注射至Balb/c小鼠的腦部。注射入腦部時(shí)是使用Hamilton注射器通過頭骨左側(cè)，深度達(dá)4-5毫米。圖9中的結(jié)果指出類似于肌肉和乳房，于注射后24小時(shí)，儀在腦部的0XaVidinHABA為約12.65±6.59%ID/100毫克組織。如先前在其他組織中所評(píng)估者，WTavidin的量低于2.08±1.03%ID/100毫克組織。此結(jié)果指出0XavidinHABA可用于腦瘤的近距離放射治療中或用來眶準(zhǔn)腦部生物素化的治療劑。權(quán)利要求一種氧化的抗生物素蛋白，其中每一抗生物素蛋白分子至少有一甘露糖殘基被下式所示的殘基所取代FPA00001011318300011.tif2.如權(quán)利要求1的氧化的抗生物素蛋白，其包含約8至15個(gè)醛部分。3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白，其具有等于或高于78t:的熱穩(wěn)定性。4.一種復(fù)合物，其是由如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白及生物素化的治療劑所組成。5.如權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中該生物素化的治療劑為抗癌劑。6.—種如權(quán)利要求4或5的復(fù)合物作為藥物的用途。7.—種如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白的用途，其中該氧化的抗生物素蛋白是在治療的第一個(gè)步驟中投與，接著投與生物素化的治療劑。8.如權(quán)利要求6或7的用途，其是在近距離放射治療中用于治療罹患癌癥的患者。9.如權(quán)利要求8的用途，其中所述癌癥為乳癌、胰臟癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面頸癌、膀胱癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌或眼癌。10.如權(quán)利要求8的用途，其中該抗癌劑是選自放射性同位素、化療劑、細(xì)胞因子、毒素及抗癌細(xì)胞。11.如權(quán)利要求6或7的用途，其中該治療劑的代表為用于治療癌癥、退化性或遺傳性疾病的生物素化的干細(xì)胞或體細(xì)胞。12.如權(quán)利要求4或7的氧化的抗生物素蛋白的用途，其是應(yīng)用于可用來治療自體免疫/退化性/遺傳性疾病的組織再生中，該自體免疫/退化性/遺傳性疾病包括糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默氏癥、脊髓受傷、杜興氏肌肉失養(yǎng)癥(Duche皿emusculardystrophy)、心肌梗死及中風(fēng)。13.如權(quán)利要求10的用途，其中所述放射性同位素是選自Fe-52、Mn-52m、Co_55、Cu-64、Ga-67、Ga_68、Tc-99m、In-lll、1-123、1-125、1-131、P_32、Sc_47、Cu_67、Y_90、Pd-109、Ag-lll、1-131、Pm-149、Re_186、Re_188、At_211、Pb_212、Bi-212及Lu_177。14.一種藥學(xué)組合物，其包含如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白或復(fù)合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。15.—種試劑盒，其包含在一種容器中的如權(quán)利要求14的藥學(xué)組合物及在第二種容器中的生物素化的治療劑，所述藥學(xué)組合物包含如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白。16.如權(quán)利要求15的試劑盒，其是用于二步驟的輔助性手術(shù)間及圍手術(shù)期的局部區(qū)域及/或系統(tǒng)性療法中，其中所述二種容器為注射器形式。17.—種氧化抗生物素蛋白的方法，其中該氧化作用包括下列步驟a)將預(yù)先與摩爾過量的(HABA)混合的野生型抗生物素蛋白與氧化劑(諸如在pH值低于6.0的50-100mM醋酸鹽緩沖液中的10_20mM過碘酸鈉)于4。C或室溫下培養(yǎng)1_5小時(shí)；b)阻斷反應(yīng)，并借由色譜法、超濾作用、透析作用或其他本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的純化方法移除氧化劑及HABA，以進(jìn)行純化；及c)在酸性pH下進(jìn)行凍干或制劑。18.治療患有癌癥的患者的方法，其特征在于用權(quán)利要求13中任一項(xiàng)的氧化的抗生物素蛋白使欲治療的組織或器官抗生物素蛋白化，接著給予生物素化的抗癌劑，或者對(duì)欲治療的組織或器官直接給予權(quán)利要求4的復(fù)合物。全文摘要本發(fā)明描述經(jīng)化學(xué)改質(zhì)的抗生物素蛋白，其與野生型抗生物素蛋白相比較，在受治療的組織中具有較高的持久性。抗生物素蛋白的氧化作用是在低親和性配體HABA的存在下借由與過碘酸鹽一起培養(yǎng)來進(jìn)行，該占據(jù)生物素結(jié)合部位的HABA阻止蛋白質(zhì)在氧化步驟期間變性。過碘酸鹽氧化作用自抗生物素蛋白甘露糖開環(huán)中產(chǎn)生CHO基團(tuán)，一旦注射后便與組織NH2殘基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的席夫氏堿(Schiff′sbase)。該固定的抗生物素蛋白可保持結(jié)合具有治療活性的生物素化作用劑(如經(jīng)放射性標(biāo)記的生物素、干細(xì)胞及體細(xì)胞)的能力，可用于近距離放射治療(brachytherapy)(如術(shù)中抗生物素蛋白化放射性核素療法(IntraoperativeAvidinationRadionuclideTherapy))或退化性或遺傳性疾病中。文檔編號(hào)A61K47/42GK101772353SQ200880101669公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2008年7月16日優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日發(fā)明者C·A·努佐羅,R·德桑提斯申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司