專利名稱：：脂肪組織衍生的基質(zhì)細(xì)胞在脊柱融合術(shù)中的應(yīng)用的制作方法脂肪組織衍生的基質(zhì)細(xì)胞在脊柱融合術(shù)中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
：一般存在兩種類型的骨病1)非代謝性骨病，諸如骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髄瘤、骨發(fā)育不良和脊柱側(cè)凸；和2)代謝性骨病，諸如骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、軟骨病、纖維性骨炎、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和佩吉特骨病。代謝性骨病骨質(zhì)疏松癥為全身性疾病，其特征在于主要臨床癥狀包括脊柱后凸和腰背側(cè)骨、中央稚骨、股骨頸、橈骨下端、肋骨、肱骨上端等的骨折。在骨組織中，骨形成和因骨吸收導(dǎo)致的破壞不斷發(fā)生。在骨形成與因骨吸收導(dǎo)致的破壞之間的平衡惡化時(shí)，發(fā)生骨的定量減少。在傳統(tǒng)上，骨吸收阻抑物，諸如雌激素、降鈣素和二膦酸鹽主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。就骨/脊柱疾病而言，超過(guò)75%的美國(guó)人群在其生命過(guò)程中一度患有背痛。主要的醫(yī)學(xué)疾病可以導(dǎo)致背痛。這些疾病包括脊柱側(cè)凸、推管狹窄、關(guān)節(jié)盤(pán)變性疾病、傳染過(guò)程、腫瘤和創(chuàng)傷。骨干骨中大段缺損的修復(fù)是當(dāng)前矯形外科醫(yī)師面臨的重大問(wèn)題。盡管這類骨丟失可以作為急性損傷的結(jié)果發(fā)生，但是這些大的缺陷通常繼先天畸形、良性和惡性腫瘤、骨感染和骨折不愈合之后出現(xiàn)。新鮮的自體骨移植材料的應(yīng)用已經(jīng)被視為治療的歷史性標(biāo)準(zhǔn)，但伴隨顯著發(fā)病率，包括感染、畸形、疼痛和功能喪失(Kahn等，1995，Clin.0rthop，Rel.Res.313:69-75)。因移植物采集的復(fù)雜化，結(jié)合其有限的供給已經(jīng)啟示了需要研發(fā)用于修復(fù)臨床顯著性骨缺陷的可選擇的策略。解決這一問(wèn)題的主要手段已經(jīng)集中在研發(fā)有效性的骨植入物材料。已經(jīng)從這些研究嘗試中產(chǎn)生了三大類骨植入物，并且可以將這些種類分類為骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性或直接成骨性的。異體移植骨可能是已知最佳類型的骨傳導(dǎo)性植入物。盡管廣泛應(yīng)用了許多年，但是疾病4傳播、宿主排斥和缺乏骨誘導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)損害了其理想性(Leads,1988，JAMA260:2M7-2488)。合成的骨傳導(dǎo)性植入物包括鈦纖維金屬和鞋磷灰石和/或磷酸三鈣構(gòu)成的陶瓷。這些材料有利的多孔性促進(jìn)了骨向內(nèi)生長(zhǎng)，但是其缺乏骨誘導(dǎo)性潛能限制了它們的應(yīng)用。還研究了各種骨誘導(dǎo)性化合物，包括脫礦質(zhì)骨基質(zhì)，已知它包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。自BMP最初發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其他人已經(jīng)在修復(fù)大的骨缺損的正位部位中表征，克隆，表達(dá)和植入了純化或重組BMP(Gerhart等，1993，Clin.Orthop.Rel.Res.293:317-326;Stevenson等，1994，J.BoneJointSurg.76:1676-1687;Wozney等，1988Science242:1528-1534)。這種手段的成功依賴于存在能夠?qū)MP提供的誘導(dǎo)信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)的間充質(zhì)細(xì)胞(Lane等，1994，InFirstInternationalConferenceonBoneMorphogenicProteins)。正是這些間充質(zhì)先祖進(jìn)行成骨分化且最終導(dǎo)致在手術(shù)部位合成新的骨。骨誘導(dǎo)性手段的一種可替代的選擇為植入直接成骨性的活細(xì)胞。由于已經(jīng)證實(shí)骨髓包含具有成骨潛能的細(xì)胞群，所以一些人已經(jīng)設(shè)計(jì)了基于在需要骨骼修復(fù)的部位植入新鮮的自體或同源骨髓的實(shí)驗(yàn)療法(Grundel等，1991，Clin.Orthop.Rel.Res.266:244-258;Werntz等，1996，J.Orthop.Res,14:85-93;Wolff等，1994，J.Orthop.Res.12:439-446)。盡管在原則上是正確的，但是獲得足夠的具有必要數(shù)量的骨先祖細(xì)胞的骨髄的可實(shí)施性是有限的。再生性藥物的新出現(xiàn)的領(lǐng)域探索將生物材料，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞合并成修復(fù)受損組織和器官的新治療劑。隨著這種特制品的開(kāi)發(fā)，對(duì)用于組織改造應(yīng)用的可靠，安全和有效的人成體干細(xì)胞來(lái)源存在需求。為了制定規(guī)章的目的，這些細(xì)胞必須根據(jù)可定量的純度衡量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。為了在臨床水平上的實(shí)施目的，這些細(xì)胞應(yīng)該是在護(hù)理要求時(shí)即刻可得到的"現(xiàn)貨供應(yīng)"產(chǎn)品。從商品的觀點(diǎn)來(lái)看，與自體成體干細(xì)胞相反，將同種異體成體干細(xì)胞用于移植的能力可以對(duì)產(chǎn)品的研發(fā)具有顯著的積極影響。在這些情況下，可以將來(lái)源于一個(gè)供體的單批細(xì)胞植入多個(gè)哺乳動(dòng)物，從而可降低質(zhì)量控制和質(zhì)量保證的成本。研究已經(jīng)證實(shí)多重組織部位中存在成體干細(xì)胞。來(lái)源于骨髄的細(xì)胞，稱作間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)已經(jīng)得到廣泛表征(Castro-Malaspina等，1980，Blood56:289-30125;Piersma等，1985，Exp.Hematol13:237-243;Simmons等，1991，Blood78:55-62;Beresford等，1992，J.細(xì)胞.Sci.102:341—351;Liesveld等，1989Blood73:1794-1800;Liesveld等，Exp.Hematol19:63-70;Bennett等，1991，J.細(xì)胞.Sci.99:131-139)。近期的研究已經(jīng)證實(shí)可以植入同種異體骨髓衍生的MSC(Bartholomew等，2002，Exp.Hematol.30:42-8)并且用于修復(fù)犬模型中的臨界大小的矯形外科缺陷(Arinzeh等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:1927-35)。然而，MSC表示每10，000—100，000個(gè)有核的骨髄細(xì)胞中有約1個(gè)或每ml骨髄抽吸物中有約200個(gè)細(xì)胞(Bruder等，2000，PrinciplesofTissueEngineering,2ndEdition,AcademicPress)。為了獲得足以用于組織改造應(yīng)用的MSC數(shù)量，必須通過(guò)體外多次傳代擴(kuò)充骨髄衍生的MSC。與骨髓對(duì)比，脂肪組織易于進(jìn)行手術(shù)采集并且在普通成年美國(guó)人中富含。近來(lái)，已經(jīng)證實(shí)脂肪組織可以用作干細(xì)胞源(稱作脂肪衍生的成體干細(xì)胞或ADAS細(xì)胞)。這些細(xì)胞能夠沿著多重i普系途經(jīng)分化。作為對(duì)特殊化學(xué)品，激素和/或細(xì)胞因子的反應(yīng)，人和嚙齒動(dòng)物ADAS細(xì)胞表達(dá)與脂肪，骨，軟骨，肌肉和神經(jīng)元細(xì)胞一致的生化和組織學(xué)特征。在近期的研究中，鼠ADAS細(xì)胞加速修復(fù)臨界大小的顱蓋缺陷(Cowan等，2004，Nat.Biotechnol.22:560-7)。骨移植術(shù)通常用于治療骨病。實(shí)際上，每年進(jìn)行超過(guò)140萬(wàn)例骨移植術(shù)。骨移植術(shù)的成功或失敗取決于許多因素，包括移植物部位的生命力，移植物處理和植入組織的免疫相容性。鑒于骨病的普遍性，對(duì)用于治療、診斷和研究應(yīng)用的新骨源存在需求。本發(fā)明可滿足這一需求。發(fā)明概述本發(fā)明包括促進(jìn)哺乳動(dòng)物脊柱融合術(shù)后融合的方法，包括對(duì)哺乳6動(dòng)物脊柱給予分離的脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，其中ADAS細(xì)胞在體內(nèi)分化成表達(dá)至少一種骨細(xì)胞特征的細(xì)胞。本發(fā)明還包括對(duì)哺乳動(dòng)物實(shí)施一種或多種脊柱融合術(shù)的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物脊柱給予ADAS細(xì)胞以有利于單或多個(gè)水平的脊柱融合術(shù)。優(yōu)選在將ADAS給予到哺乳動(dòng)物脊柱中后，ADAS細(xì)胞在體內(nèi)分化成表達(dá)至少一種骨細(xì)胞特征的細(xì)胞。在一個(gè)方面中，在將ADAS細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物前在體外培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間，而不被誘導(dǎo)分化。在另一個(gè)方面中，就哺乳動(dòng)物而言，ADAS細(xì)胞為同種異體的。在另一個(gè)方面中，ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)推體間脊柱融合術(shù)的骨形成。在另一個(gè)方面中，ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)橫突間脊柱融合術(shù)的骨形成。在一個(gè)方面中，ADAS細(xì)胞進(jìn)一步包含生物相容性基質(zhì)。優(yōu)選地，生物相容性基質(zhì)選自藻酸鈣、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素A、硫酸皮膚素和骨基質(zhì)明膠。在另一個(gè)方面中，ADAS細(xì)胞為遺傳修飾的。在另一個(gè)方面中，將ADAS細(xì)胞給予入哺乳動(dòng)物脊柱中一個(gè)或多個(gè)推體間空間。在另一個(gè)方面中，脊柱融合術(shù)在脊柱區(qū)段中進(jìn)行，所述的脊柱區(qū)段選自頸段、胸段、腰段、腰骶和骶髂(SI)關(guān)節(jié)。在另一個(gè)方面中，通過(guò)選自后部途徑、后外側(cè)途徑、前部途徑、前外側(cè)途徑和外側(cè)途徑的途徑將ADAS細(xì)胞給予入一個(gè)或多個(gè)推體間空間。在另一個(gè)方面中，所述的哺乳動(dòng)物是人。附圖簡(jiǎn)述為了解釋本發(fā)明的目的，圖中描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方案。然而，本發(fā)明并不限于圖中所示實(shí)施方案的精確安排和手段。圖l為描繪脊柱融合術(shù)的圖像。圖IA描繪了腰推脊柱中的推間隙。圖1B和1C分別表明機(jī)械裝置和骨移植物的導(dǎo)入以便穩(wěn)定空間。圖ID為描繪脊柱的圖像。圖2為ADAS細(xì)胞沿著多重譜系途經(jīng)分化潛能的圖像。作為對(duì)特殊的化學(xué)品和生長(zhǎng)因子混合物的反應(yīng)，人ADAS細(xì)胞可以在體外分化成軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元-和神經(jīng)膠質(zhì)-樣細(xì)胞。圖3為描繪人ADAS細(xì)胞的骨發(fā)生的圖像。圖4為脂肪形成和成骨分化過(guò)程中ADAS細(xì)胞中醛磷酸酶表達(dá)的圖。圖5為表明ADAS細(xì)胞在體內(nèi)形成骨的圖像。詳細(xì)描述本發(fā)明包括用于治療骨病的方法和組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物脊柱融合術(shù)后的骨融合。定義本文所用的下列術(shù)語(yǔ)各自具有與它在這部分中相關(guān)處舍義。本文所用的冠詞"一種"意指該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象中的一種或一種以上(即指至少一種)。作為實(shí)例，"一種成分"意指一種成分或一種以上成分。術(shù)語(yǔ)"約"為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，且改變至其使用的一定程度。術(shù)語(yǔ)"脂肪組織衍生的細(xì)胞"意指來(lái)源于脂肪組織的細(xì)胞。分離自脂肪組織的起始細(xì)胞群為同種異體細(xì)胞群，包括，但不限于間質(zhì)血管部分(SVF)細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)"脂肪衍生的基質(zhì)細(xì)胞"，"脂肪組織衍生的基質(zhì)細(xì)胞，，，"脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞"或"脂肪組織衍生的干細(xì)胞(ASC)"可以互換使用并且意指來(lái)源于來(lái)源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞，所述的脂肪組織可以用作各種不同細(xì)胞類型的干細(xì)胞-樣前體，所述的細(xì)胞類型，諸如，但不限于脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉8和神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系。"脂肪"意指任何脂肪組織。脂肪組織可以為棕色或白脂肪組織。優(yōu)選脂肪組織為皮下白脂肪組織。這類細(xì)胞可以包含初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)限增殖細(xì)胞系。脂肪組織可以來(lái)自具有脂肪組織的任何生物體。優(yōu)選脂肪組織為哺乳動(dòng)物的，最優(yōu)選脂肪組織為人的。人脂肪組織的便利來(lái)源為來(lái)源于脂肪抽吸手術(shù)的脂肪組織。然而，脂肪組織來(lái)源或脂肪組織的分離方法對(duì)本發(fā)明而言并不關(guān)鍵。"同種異體"意指來(lái)源于相同種類的不同動(dòng)物的移植物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"自體"意指來(lái)源于隨后再導(dǎo)入個(gè)體的相同個(gè)體的任何材料。"異種"意指來(lái)源于不同種類的哺乳動(dòng)物的移植物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"生物相容性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)"的含義是指可以有利于形成有助于組織發(fā)育的三維結(jié)構(gòu)的底物。因此，例如，可以在這類生物相容性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)或接種生物相容性細(xì)胞，所述的生物相容性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)諸如包括胞外基質(zhì)材料，合成聚合物，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子等?？梢詫⒕W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)模制成有利于組織類型發(fā)育的所需形狀。此外，至少在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的早期階段，給培養(yǎng)基和/或底物補(bǔ)充有利于適當(dāng)組織類型和結(jié)構(gòu)發(fā)育的因子(例如生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，胞外基質(zhì)材料等)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"骨病(或損傷或疾病)"意指骨的病癥或疾病，包括，但不限于骨的急性，慢性，代謝性和非代謝性疾患。該術(shù)語(yǔ)包括因組織一般發(fā)生疾病，創(chuàng)傷或襲竭導(dǎo)致的疾患。骨病的實(shí)例包括，但不限于骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨發(fā)育不良、脊柱側(cè)凸、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、軟骨病、纖維性骨炎、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和佩吉特骨病。本文所用的"分化培養(yǎng)基"意指包含添加劑或缺乏添加劑的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，使得在培養(yǎng)基中孵育時(shí)未完全分化的干細(xì)胞，脂肪衍生的成體基質(zhì)細(xì)胞或其它這類先祖細(xì)胞發(fā)育成具有分化細(xì)胞的某些或全部特征的細(xì)胞。本文所用的"可擴(kuò)充性"意指細(xì)胞增殖，例如在數(shù)量上或就發(fā)生群體倍增的細(xì)胞群而言擴(kuò)充的能力。"移植物"意指用于移植的細(xì)胞，組織，器官，乃至任何其它生物相容性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所謂"生長(zhǎng)因子，，意指下列特定因子，包括，但不限于生長(zhǎng)激素、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、骨保護(hù)素配體、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白，其濃度在皮克/ml-毫克/ml的水平。本文所用的術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)培養(yǎng)基"意指促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基一般包含動(dòng)物血清。在某些情況中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以不含動(dòng)物血清。"分離的細(xì)胞"意指從其它成分和/或天然伴隨組織或哺乳動(dòng)物中分離的細(xì)胞的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多能"或"多能性"的含義是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞分化成一種以上類型的細(xì)胞的能力。本文所用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)"的含義是指生物狀態(tài)的任何改變，即增加，減少等0本文所用的術(shù)語(yǔ)"非免疫原性"的含義是指ADAS細(xì)胞不會(huì)誘導(dǎo)MLR中T細(xì)胞增殖的發(fā)現(xiàn)。然而，非免疫原性不應(yīng)限于MLR中的T細(xì)胞增殖，而是還應(yīng)適用于不誘導(dǎo)體內(nèi)T細(xì)胞增殖的ADAS細(xì)胞。本文所用的"增殖"意指類似形式，尤其是細(xì)胞的繁殖或增殖。即，增殖包括大量細(xì)胞的產(chǎn)生并且其中可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)，測(cè)定摻入細(xì)胞的力-胸苷等來(lái)測(cè)量。"細(xì)胞周期的進(jìn)展或通過(guò)細(xì)胞周期的進(jìn)展"用于指細(xì)胞準(zhǔn)備和/或進(jìn)入有絲分裂和/或減數(shù)分裂的過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞周期的進(jìn)展包括通過(guò)Gl期，S期，G2期和M-期的進(jìn)展。術(shù)語(yǔ)"前體細(xì)胞"，"先祖細(xì)胞"和"干細(xì)胞，，在本領(lǐng)域和本文中10可以互換使用，并且意指多能或鐠系-未定型的先祖細(xì)胞，它潛在地能夠進(jìn)行無(wú)限數(shù)量的有絲分裂以便更新其自身或產(chǎn)生分化成所需細(xì)胞類型的子代細(xì)胞。不同于多能干細(xì)胞，一般將謙系-定型的先祖細(xì)胞視為不能產(chǎn)生在表型上彼此不同的大量細(xì)胞類型。而先祖細(xì)胞產(chǎn)生一種或可能產(chǎn)生兩種鐠系-定型的細(xì)胞類型。本文所用的術(shù)語(yǔ)"基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基"意指用于培養(yǎng)ADAS細(xì)胞的培養(yǎng)基?；|(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例為包含DMEM/F12Ham's，10%胎牛血清，100U青霉素/100lug鏈霉素/0.25pg兩性霉素B的培養(yǎng)基。一般而言，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基包含基質(zhì)培養(yǎng)基，血清和抗生素/抗霉菌劑。然而，可以不含抗生素/抗霉菌劑的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)ADAS細(xì)胞并且補(bǔ)充至少一種生長(zhǎng)因子。優(yōu)選生長(zhǎng)因子為人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)。優(yōu)選的hEGF濃度約為1-50ng/ml，更優(yōu)選該濃度約為5ng/ml。優(yōu)選的基質(zhì)培養(yǎng)基為DMEM/F12(1:1)。優(yōu)選的血清為胎牛血清(FBS)，但可以使用其它血清，包括馬血清或人血清。優(yōu)選向上述培養(yǎng)基中加入達(dá)20%FBS以支持基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，可以使用確定的培養(yǎng)基，如果必要，確定FBS中用于基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和激素并且以適當(dāng)濃度提供在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到可以向培養(yǎng)基中加入額外的成分。這類成分包括，但不限于抗生素，抗霉菌劑，清蛋白，生長(zhǎng)因子，氨基酸和其它本領(lǐng)域中公知用于細(xì)胞培養(yǎng)的成分?？梢约尤氲脚囵B(yǎng)基中的抗生素包括，但不限于青霉素和鏈霉素。青霉素在培養(yǎng)基中的濃度約為10-約200個(gè)單位/ml。鏈霉素在培養(yǎng)基中的濃度約為10-約200Mg/ml。然而，本發(fā)明決不應(yīng)限于用于培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的任何一種培養(yǎng)基。而是可以使用能夠支持組織培養(yǎng)物中基質(zhì)細(xì)胞的任何培養(yǎng)基?？梢耘c生物學(xué)相容性載體或培養(yǎng)基互換使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體(或培養(yǎng)基)"意指適用于接觸人和動(dòng)物組織，但無(wú)過(guò)度毒性，刺激，過(guò)敏反應(yīng)或與合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比相應(yīng)的其它并發(fā)癥范圍內(nèi)的試劑，細(xì)胞，化合物，材料，組合物和/或劑型。作為本文所用的術(shù)語(yǔ)"合適的推體間空間"意指盤(pán)居留在健康脊ii柱中，但因脊推上磨損和撕裂導(dǎo)致至少部分缺乏盤(pán)物質(zhì)的相鄰?fù)乒侵臻g。本文所用的"治療有效量"為足以對(duì)給予所述細(xì)胞的受試者提供有益作用的ADAS細(xì)胞的量。"治療"意指對(duì)骨病改善的作用或延遲，阻止或逆轉(zhuǎn)其發(fā)展或延緩或預(yù)防其發(fā)作。本文所用的"內(nèi)源性"意指來(lái)自從生物體，細(xì)胞或系統(tǒng)內(nèi)部或在其中產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"外源性"意指來(lái)自生物體，細(xì)胞或系統(tǒng)外部或在其外部產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"編碼"意指多核苷酸中核苷酸特異性序列的內(nèi)在屬性，所述的多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA,以便用作合成生物過(guò)程中的其它聚合物和大分子的模板，所述的聚合物和大分子具有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定的氨基酸序列和由此產(chǎn)生的生物特性。因此，基因編碼蛋白質(zhì)，條件是相當(dāng)于該基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。編碼鏈，即與mRM序列相同并且通常在序列表中提供的核苷酸序列和用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈可以稱作編碼該基因或cDM的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。除非另作陳述，否則"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括彼此為簡(jiǎn)并形式并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RM的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。"分離的核酸"意指從位于其天然存在狀態(tài)側(cè)翼的序列中分離的核酸區(qū)段或片段，即從一般與該片段相鄰的序列中取出的DNA片段，即與其天然存在的基因組中的片段相鄰的序列。該術(shù)語(yǔ)還適合于基本上從其它成分中純化的核酸，所述的其它成分天然伴隨核酸，即RNA或DNA或蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞中天然伴隨核酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括例如摻入載體，摻入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《净蛟思?xì)胞或真核細(xì)胞基因a.制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組或cDM片段)的重組DNA。還包括為編碼額外多肽序列的雜合基因部分的重組DNA。在本發(fā)明的上下文中，使用用于通常存在的核酸的下列縮寫(xiě)。"A"意指腺苷，"C"意指胞嘧啶，"G"意指鳥(niǎo)苷，"T"意指胸腺嘧啶，且"U"意指尿苷。本文所用的術(shù)語(yǔ)"在轉(zhuǎn)錄控制下"或"可操作地連接"意指在與多核苷酸相關(guān)的正確位置和方向上的啟動(dòng)子以控制RNA聚合酶引發(fā)和多核苷酸表達(dá)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列"意指表達(dá)可操作地與啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列連接的基因產(chǎn)物所需的核酸序列。在某些情況中，該序列可以為核心啟動(dòng)子序列，而在其它情況中，該序列還可以包括增強(qiáng)子序列和表達(dá)基因產(chǎn)物所需的其它調(diào)節(jié)元件。例如，啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列可以為以組織特異性方式表達(dá)基因產(chǎn)物的序列。"組成型"啟動(dòng)子為一種核苷酸序列，在與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí)，它在細(xì)胞的大部分或所有生理?xiàng)l件下導(dǎo)致基因產(chǎn)物在細(xì)胞中產(chǎn)生的。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子為一種核苷酸序列，在與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí)，它基本上僅在誘導(dǎo)物相當(dāng)于存在于細(xì)胞中的啟動(dòng)子時(shí)導(dǎo)致基因產(chǎn)物在細(xì)胞中產(chǎn)生。"組織特異性"啟動(dòng)子為一種核苷酸序列，在與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí)，它基本上導(dǎo)致基因產(chǎn)物在細(xì)胞中出產(chǎn)生，唯一的條件在于該細(xì)胞為相當(dāng)于啟動(dòng)子的組織類型的細(xì)胞。"載體"為包含分離的核酸并且可以用于將分離的核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組合物。大量載體為本領(lǐng)域中公知的，包括，但不限于線性多核苷酸，與離子型或兩性化合物結(jié)合的多核苷酸，質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語(yǔ)"栽體"包括自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用以包括非質(zhì)粒和非病毒化合物，它們有利于核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞，諸如，例如聚賴氨酸化合物，脂質(zhì)體等。病毒載體的實(shí)例包括，但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體等。"表達(dá)載體"意指包含重組多核苷酸的載體，該多核苷酸包含可操作地與所表達(dá)的核苷酸序列連接的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包含足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其它元件可以由宿主細(xì)胞或在體外表達(dá)系統(tǒng)中提供。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域中公知的所有那些，諸如摻入重組多核苷酸的粘粒，質(zhì)粒(即，棵的或包含在脂質(zhì)體中的)和病毒。描述本發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞可以分化成各種不同細(xì)胞類型，包括，但不限于脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉和神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞謙系。特別地，本發(fā)明涉及ADAS細(xì)胞可以沿體內(nèi)成骨語(yǔ)系分化的觀察結(jié)果?；诒景l(fā)明披露的內(nèi)容，ADAS細(xì)胞可以成功地用于實(shí)驗(yàn)/治療目的的細(xì)胞和/或基因療法。例如，細(xì)胞可以用于治療骨病。優(yōu)選細(xì)胞用于強(qiáng)化脊柱融合術(shù)后的骨融合。脊柱融合術(shù)為用于治療患有關(guān)節(jié)盤(pán)變性疾病，推管狹窄，脊柱側(cè)凸，脊柱骨折，腫瘤等的哺乳動(dòng)物背痛的常用矯形外科和神經(jīng)外科手術(shù)操作。ADAS的分離和培養(yǎng)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法分離用于本發(fā)明方法的ADAS細(xì)胞。例如，這類方法描述在美國(guó)專利US6,153,432中，將該文獻(xiàn)完整地引入本文。在一種優(yōu)選的方法中，從哺乳動(dòng)物受試者，優(yōu)選人體受試者中分離ADAS細(xì)胞。在人中，一般從抽脂材料中分離ADAS細(xì)胞。如果將本發(fā)明的細(xì)胞植入人體受試者，那么優(yōu)選從相同受試者中分離ADAS細(xì)胞，以便提供自體移植物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所給予的ADAS細(xì)胞就接受者而言可以為同種異體的。從與接受者相同種類中的不同個(gè)體的供體中分離同種異體ADAS細(xì)胞。在分離后，術(shù)語(yǔ)本文披露的方法培養(yǎng)細(xì)胞以便產(chǎn)生同種異體產(chǎn)物。本發(fā)明還包括就接受者而言為異種的ADAS細(xì)胞。14由于無(wú)論如何并不限制本發(fā)明，所以可以術(shù)語(yǔ)本文披露的方法從脂肪組織中分離基質(zhì)細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過(guò)抽脂術(shù)從皮下儲(chǔ)庫(kù)中取出人體脂肪組織。然后將脂肪組織從抽脂杯中轉(zhuǎn)入500ml無(wú)菌燒杯并且使其沉降約IO分鐘。通過(guò)抽吸除去沉淀的血液。將約125ml體積(或更少)的組織轉(zhuǎn)入ml連續(xù)離心管且然后給該管充Krebs-Ringer緩沖液。使組織和緩沖液沉降約3分鐘或直到獲得澄清分離物，且然后通過(guò)抽吸除去緩沖液。用Krebs-Ringer緩沖液將組織再洗滌4一5分鐘或直到組織變成橙-黃色并且直到緩沖液變成淡褐色為止。可以使用膠原酶處理分離脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，從組織中除去緩沖液并且以1ml膠原酶溶液/ml組織的比例用約2mg膠原酶/mlKrebs緩沖(Worthington，ME)溶液替代。將管在37C下的水浴中通過(guò)間歇振搖孵育約30-35分鐘。通過(guò)在室溫下以500xg離心5分鐘從脂肪組織的其它成分中分離基質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)抽吸除去油和脂肪細(xì)胞層?？梢酝ㄟ^(guò)劇烈渦旋將剩余的部分重新懸浮于約100ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中，分入50ml試管并且以500xg離心5分鐘。通過(guò)抽吸除去緩沖液，遺留下基質(zhì)細(xì)胞。然后將基質(zhì)細(xì)胞重新懸浮于基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中并且以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度鋪板且在37C下和5%002中孵育過(guò)夜。一旦粘附在培養(yǎng)皿或燒瓶上，就可以即刻使用培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞或?qū)⑵渚S持在培養(yǎng)物中一段時(shí)間或大量傳代，此后按照本文披露的方法使用細(xì)胞。然而，本發(fā)明決不應(yīng)限于分離基質(zhì)細(xì)胞的任何一種方法。而分離ADAS細(xì)胞的任何方法均應(yīng)包括在本發(fā)明中。能夠支持細(xì)胞培養(yǎng)物中成纖維細(xì)胞的任何培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)ADAS。支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基制品包括，但不限于極限必需培養(yǎng)基Eagle，ADC-I，LPM(不含牛血清清蛋白)，F(xiàn)l0(PIAM)，F(xiàn)12(HAM)，DCCM1，DCCM2，RPMI1640，BGJ培養(yǎng)基(使用和不使用Fitton-Jackson改變)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(BME-添加了Earle鹽基質(zhì))，Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM-不含血清)，Yamane，IMEM-20，Glasgow改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(GMEM)，LeibovitzL-15培養(yǎng)基，McCoy's5A培養(yǎng)基，培養(yǎng)基M199(M199E-含有Earle鹽基質(zhì))，培養(yǎng)基M199(M199H-含有Hank鹽基質(zhì))，極限必需培養(yǎng)基Eagle(MEM-E-含有Earle鹽基質(zhì))，極限必需培養(yǎng)基Eagle(MEM-H-含有Hank鹽基質(zhì))和極限必需培養(yǎng)基Eagle(含有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。用于培養(yǎng)ADAS的優(yōu)選培養(yǎng)基為DMEM，更優(yōu)選DMEM/F12(1:1)。用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)基的額外的非限制性實(shí)例可以包含濃度至少為1%-約30%，優(yōu)選至少約5%-15%,最優(yōu)選約10%的?；蚱渌N類的胎血清。小雞或其它重量胎胚胎提取物可以以約1%-30%,優(yōu)選至少約5°/。-15%,最優(yōu)選約10%的濃度存在。在分離后，在培養(yǎng)儀器中的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育ADAS細(xì)胞一段時(shí)間或直到細(xì)胞達(dá)到匯合，此后使細(xì)胞通過(guò)另一培養(yǎng)儀器。培養(yǎng)儀器可以屬于常用于體外培養(yǎng)細(xì)胞任何培養(yǎng)儀器。優(yōu)選匯合水平高于70%，此后使細(xì)胞通過(guò)另一培養(yǎng)儀器。更優(yōu)選匯合水平高于90%。時(shí)間期限可以為適合于體外培養(yǎng)細(xì)胞的任何時(shí)間。可以在培養(yǎng)ADAS細(xì)胞的任何時(shí)間時(shí)替換基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選每隔3-4天替換一次基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。然后從培養(yǎng)儀器中收集ADAS細(xì)胞，此時(shí)可以即刻使用ADAS細(xì)胞或?qū)⑵淅洳乇４嬉员銉?chǔ)存為以后應(yīng)用?？梢酝ㄟ^(guò)胰蛋白酶消化，EDTA處理或用于從培養(yǎng)儀器中收集細(xì)胞的任何其它操作步驟收集ADAS細(xì)胞。各種術(shù)語(yǔ)用于描述培養(yǎng)物中的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)物一般意指取自活生物體并且在受控條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞。初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物為直接取自生物體和首次傳代培養(yǎng)前的細(xì)胞，組織或器官的培養(yǎng)物。細(xì)胞在它們置于有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂的條件下的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)在培養(yǎng)物中擴(kuò)充，由此產(chǎn)生大量細(xì)胞群。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)充時(shí)，細(xì)胞增殖率一般根據(jù)細(xì)胞數(shù)量倍增所需的時(shí)間量，否則稱作倍增時(shí)間確定。每個(gè)周期的傳代培養(yǎng)稱作傳代。當(dāng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們稱作已經(jīng)傳代。特異性細(xì)胞群或細(xì)胞系有時(shí)稱作或特征在于它已經(jīng)傳代的次數(shù)。例如，已經(jīng)傳代10次的培養(yǎng)的細(xì)胞群可以稱作P10培養(yǎng)物。將初級(jí)培養(yǎng)物，在從組織中分離細(xì)胞后的首次培養(yǎng)物命名為PO。在首次傳16代培養(yǎng)后，將細(xì)胞描述為繼代培養(yǎng)物(P1或第l代)。在第二次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三級(jí)培養(yǎng)物(P2或第2代)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在傳代期限過(guò)程中可以存在許多群體倍增數(shù)；因此，培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)大于傳代數(shù)。傳代之間期限過(guò)程中細(xì)胞的擴(kuò)充(即群體倍增數(shù))取決于許多因素，包括，但不限于接種密度，底物，培養(yǎng)基和傳代之間的時(shí)間。遺傳修飾本發(fā)明的細(xì)胞還可以用于表達(dá)治療目的或追蹤接受者細(xì)胞同化和/或其分化方法中的異種蛋白或分子。因此，本發(fā)明包括用于將外源性DM導(dǎo)入ADAS細(xì)胞的表達(dá)載體和方法，同時(shí)在ADAS細(xì)胞中外源性DNA得以表達(dá)。用于在細(xì)胞中導(dǎo)入和表達(dá)DNA的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且包括，例如在Sambrook等(2001，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)和Ausubel等(1997，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork)中所述的那些。分離的核酸可以編碼用于追蹤ADAS細(xì)胞被導(dǎo)入接受者的遷移，同化和存活的分子。用于追蹤細(xì)胞的蛋白質(zhì)包括，但不限于綠色熒光蛋白(GFP)，其它熒光蛋白中的任何種(例如增強(qiáng)的綠色，青色，黃色，藍(lán)色和紅色熒光蛋白；Clontech，PaloAlto，CA)或其它標(biāo)記蛋白(例如LacZ，F(xiàn)LAG-標(biāo)記，Myc，HiS6等)。追蹤本發(fā)明ADAS細(xì)胞的遷移，同化和/或分化并不限于栽體或病毒表達(dá)的可檢測(cè)分子的應(yīng)用。還可以使用一系列有利于哺乳動(dòng)物體內(nèi)植入的ADAS細(xì)胞定位的探針評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移，同化和/或分化。可以使用本文額外處對(duì)細(xì)胞-特異性標(biāo)記詳細(xì)描述的抗體或核酸進(jìn)一步追蹤ADAS細(xì)胞移植物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"遺傳修飾"意指外源性DNA的有意導(dǎo)入對(duì)ADAS細(xì)胞基因型的穩(wěn)定或暫時(shí)改變。DM可以為合成的或天然衍生的并且可以包含基因，基因部分或其它有用的DNA序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)"遺傳修飾"并不意味著包括天然存在的改變，諸如通過(guò)天然病毒活性，天然遺傳重組等發(fā)生的改變。可以使用病毒載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒，修飾的皰滲病毒，皰滲病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，慢病毒等)或通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)染(脂轉(zhuǎn)染、磷酸4丐轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔等)將外源性DNA導(dǎo)入ADAS細(xì)胞。當(dāng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的目的在于產(chǎn)生生物活性物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)一般為用于治療指定病癥的物質(zhì)。例如，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便它們分泌與骨形成相關(guān)的某些生長(zhǎng)因子產(chǎn)物。可以用導(dǎo)入細(xì)胞的外源性遺傳物質(zhì)對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便產(chǎn)生諸如營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等這類對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞有益的分子。此外，通過(guò)對(duì)細(xì)胞遺傳修飾以產(chǎn)生這類分子，該細(xì)胞可以在植入有此需要的哺乳動(dòng)物時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物提供附加的治療作用。例如，遺傳修飾的細(xì)胞可以分泌對(duì)哺乳動(dòng)物中相鄰細(xì)胞有益的分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)因子產(chǎn)物"意指對(duì)細(xì)胞具有生長(zhǎng)，增殖，分化或營(yíng)養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，肽，促分裂原或其它分子。例如，用于治療骨病的生長(zhǎng)因子產(chǎn)物包括，但不限于FGF,TGF-P，胰島素樣生長(zhǎng)因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白。按照本發(fā)明，將包含編碼異源蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體導(dǎo)入ADAS細(xì)胞。即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳改變以便導(dǎo)入其表達(dá)在哺乳動(dòng)物中具有治療作用的基因。按照本發(fā)明的某些方面，可以對(duì)來(lái)自所治療的哺乳動(dòng)物或另一種哺乳動(dòng)物的ADAS細(xì)胞進(jìn)行遺傳改變以取代缺陷基因和/或?qū)肫浔磉_(dá)對(duì)所治療的哺乳動(dòng)物具有治療作用的基因。就將基因構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞的所有情況而言，同種異體基因可操作地與在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)該基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列連接。這類調(diào)節(jié)序列一般包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)。優(yōu)選將基因構(gòu)建體作為表達(dá)載體提供，它包括可操作地與必需調(diào)節(jié)序列連接的異種蛋白的編碼序列，使得當(dāng)將該載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞時(shí)，所述的編碼序列由該細(xì)胞表達(dá)。所述的編碼序列可操作地與在細(xì)胞中表達(dá)該序列所必需的調(diào)節(jié)元件連接。編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以為cDNA，基因組DNA，，合成的DNA或其雜種或RM分子，諸如mRNA?；驑?gòu)建體包括編碼可操作地與調(diào)節(jié)元件連接的有益蛋白的核苷酸序列并且仍然可以作為起作用的胞質(zhì)分子，起作用的附加型分子存在于細(xì)胞中，或可以整合入細(xì)胞的染色體DNA?？梢詫⑼庠葱赃z傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，其中它仍然作為質(zhì)粒形式的單獨(dú)遺傳物質(zhì)保留?；蛘?，可以將可整合入染色體的線性MA導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可以加入促進(jìn)DM整合入染色體的試劑。用于促進(jìn)整合的DNA序列的也可以包括在DNA分子中?；蛘撸梢詫NA導(dǎo)入細(xì)胞。用于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子，起始密碼子，終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)。優(yōu)選這些元件在本發(fā)明的細(xì)胞中為可操作的。此外，優(yōu)選這些元件可操作地與編碼蛋白質(zhì)的核苦酸序列連接，使得核苷酸序列可以在細(xì)胞中得到表達(dá)且由此可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。一般將起而，優(yōu)選這些元件在細(xì)胞中起作用。類似地，所用的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)必需在本發(fā)明的細(xì)胞中起作用。用于實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子的實(shí)例包括，但不限于在許多細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子，諸如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子。用于實(shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子的其它實(shí)例包括，但不限于組織-特異性啟動(dòng)子，即在某些組織中，而不在其它組織起作用的啟動(dòng)子；還有一般在使用或不使用特異性或一般增強(qiáng)子序列在細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，使用使用或不使用增強(qiáng)子序列在細(xì)胞中以組成型方式表達(dá)基因的啟動(dòng)子。如果合適或需要，在這類實(shí)施方案中提供增強(qiáng)子序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員易于利用的眾所周知的技術(shù)轉(zhuǎn)染本發(fā)明的細(xì)胞。可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將外源性基因?qū)爰?xì)胞，其中細(xì)胞表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)砩酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染，DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，化學(xué)品介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或重組病毒載體轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，重組腺病毒栽體用于將具有所需序列的DNA導(dǎo)入細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒用于將具有所需序列的DNA導(dǎo)入細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)CaP04，DEAE葡聚糖或脂質(zhì)載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)用于將所需的DNA摻入分裂的細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)抗生素抗性選擇技術(shù)可以用于鑒定和選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)顯微注射將DM直接導(dǎo)入細(xì)胞。類似地，眾所周知的電穿孔或粒子轟擊技術(shù)可以用于將異種外源DM導(dǎo)入細(xì)胞。通常將第二種基因共轉(zhuǎn)染或與治療基因連接。第二種基因通常為可選擇抗生素抗性基因。可以的細(xì)胞:在大部分';;兄中:如果;種基因不連接且共轉(zhuǎn)染，那么在"生素處理下存活的細(xì)胞中存在兩種基因并且表達(dá)它們。應(yīng)理解本文所述的方法可以按照許多方式進(jìn)行并且可以進(jìn)行各種修改及其變型，這些修改和變型為本領(lǐng)域眾所周知的。還可以理解不方式來(lái)限定本發(fā)明，而提供它們使為了更完整地理解本發(fā)明的方法ADAS細(xì)胞的治療作用除ADAS細(xì)胞可以沿不同的細(xì)胞鐠系分化外，本發(fā)明還涉及ADAS細(xì)胞在誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖方面缺乏免疫原性特征。這種特征為顯示存在接受者免疫細(xì)胞免疫排斥的可能性降低。此外，已經(jīng)證實(shí)ADAS細(xì)胞不會(huì)刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的異體移植PBMC。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，必需或需要在啟動(dòng)使用ADAS細(xì)胞的細(xì)胞/基因療法前對(duì)哺乳動(dòng)物實(shí)施免疫抑制。因此，本發(fā)明中包括使用異體移植乃至異種ADAS細(xì)胞移植。ADAS細(xì)胞在治療骨疾病，病癥或疾患中的應(yīng)用提供了額外的優(yōu)點(diǎn)，即可以在無(wú)需免疫抑制劑的情況下將ADAS細(xì)胞導(dǎo)入接受者。認(rèn)為成功移植細(xì)胞需要在不誘導(dǎo)接受者產(chǎn)生移植物排斥免疫應(yīng)答的情況下供體細(xì)胞的持久移植物植入。一般而言，為了預(yù)防移植物排斥反應(yīng)，使用非特異性免疫抑制劑，諸如環(huán)孢菌素、曱氨蝶呤、類固醇和FK506。以每日為基礎(chǔ)給予這些活性劑，并且如果終止給藥，那么通常發(fā)生移植物排斥。然而，在使用非特異性免疫抑制劑中不需要的后果在于它20們通過(guò)抑制免疫應(yīng)答的所有方面起作用(全面免疫抑制)，由此接受者對(duì)感染和其它疾病的易感性顯著增加。本發(fā)明提供了治療骨疾病，病癥或疾患的方法，通過(guò)將未分化或分化的ADAS細(xì)胞導(dǎo)入接受者來(lái)進(jìn)行，而不需要免疫抑制。因此，植入ADAS細(xì)胞的接受者發(fā)生感染和其它疾病，包括與免疫抑制療法相關(guān)的癌癥相關(guān)疾患的易感性降低。本發(fā)明包括將異體移植或異種ADAS細(xì)胞，否則就是遺傳上不同于接受者的ADAS細(xì)胞給予入接受者以便對(duì)該接受者提供有益性。本發(fā)明提供了使用ADAS細(xì)胞治療骨疾病，病癥或疾患的方法，在將細(xì)胞給予接受者時(shí)不需要使用免疫抑制刑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從任何哺乳動(dòng)物種類的脂肪組織中分離本發(fā)明中使用的ADAS細(xì)胞，包括，但不限于人，小鼠，大鼠，猿，長(zhǎng)臂猿，牛。優(yōu)選ADAS細(xì)胞分離自人，小鼠或大鼠。更優(yōu)選ADAS細(xì)胞分離自人。在體外培養(yǎng)期后，將ADAS細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物。按照誘導(dǎo)ADAS細(xì)胞在體外分化的方式培養(yǎng)ADAS細(xì)胞。然而，優(yōu)選將ADAS細(xì)胞以未分化狀態(tài)植入接受者，并且植入的ADAS細(xì)胞分化以便在體內(nèi)表達(dá)至少一種骨細(xì)胞特征?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)，諸如即美國(guó)專利US5,082，670和US5，618,531(各自引入本文作為參考)中所述的那些方法將本發(fā)明的ADAS細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物，或植入體內(nèi)的任何其它合適的部位?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知或即將研發(fā)的技術(shù)植入本發(fā)明的細(xì)胞。本發(fā)明包括將細(xì)胞植入，移植，輸注，否則就是導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人的方法。對(duì)哺乳動(dòng)物給予的ADAS細(xì)胞數(shù)量與例如脂肪組織處理后的細(xì)胞產(chǎn)率相關(guān)?？梢员Ａ艏?xì)胞總數(shù)的部分以便隨后使用或冷藏。此外，遞送的劑量取決于將細(xì)胞遞送至哺乳動(dòng)物的途徑。ADAS細(xì)胞的劑量在寬限內(nèi)改變并且可以在每種具體的情況至針對(duì)個(gè)體需要進(jìn)行調(diào)整。所用細(xì)胞的數(shù)量取決于接受者的體重和病情，給藥次數(shù)和/或頻率和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的變量。該數(shù)量可以根據(jù)實(shí)現(xiàn)所需治療效果的的數(shù)量級(jí)調(diào)整?？梢詫⒓s105-約1013個(gè)ADAS細(xì)胞/100kg體重給予個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，給予約1.5x106-約1.5x1012個(gè)細(xì)胞/100kg體重。在某些實(shí)施方案中，給予約1x109-約5x1()U個(gè)細(xì)胞/100kg體重。在其它實(shí)施方案中，給予約4x109-約2x10"個(gè)細(xì)胞/100kg體重。在其它實(shí)施方案中，給予約5x108細(xì)胞-約1x10"個(gè)細(xì)/100kg體重。可以將ADAS細(xì)胞以約0.01-約5X106個(gè)細(xì)胞/1111的濃度懸浮于合適的稀釋劑中。注射溶液用合適的賦形劑為那些與ADAS細(xì)胞和接受者在生物性和生理學(xué)上相容的物質(zhì)，諸如緩沖鹽水溶液或其它合適的賦形劑?？梢园凑辗线m當(dāng)無(wú)菌性和穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)方法配制，生產(chǎn)并且儲(chǔ)存給藥用組合物。還可以按照公知的包嚢技術(shù)，包括微囊化將細(xì)胞包囊(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利US4,352,883;US4，353,888;和US5，084，350，將它們引入本文作為參考)或粗微嚢化(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利US5，284，761;US5，158，881;US4，976，859;和US4，968，733;和國(guó)際開(kāi)號(hào)WO92/19195;WO95/05452，將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)并且用于遞送生物活性分子。就粗微嚢化而言，可以改變裝置中的細(xì)胞數(shù)量；優(yōu)選每一裝置包含103-109個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選約105-107個(gè)細(xì)胞?？梢詫追N微嚢化裝置植入哺乳動(dòng)物。粗微囊化和植入細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且描述在例如美國(guó)專利US6,498,018中。本發(fā)明細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物的給藥方式可以根據(jù)幾個(gè)因素的不同而改變，包括所治療疾病的類型，哺乳動(dòng)物的年齡，細(xì)胞是否分化，細(xì)胞其中是否具有導(dǎo)入的同種異體DNA等?？梢酝ㄟ^(guò)直接注射或通過(guò)本領(lǐng)域中用于對(duì)患有特定骨疾病或病癥的哺乳動(dòng)物給予化合物的任何其它方式導(dǎo)入細(xì)胞?？梢詫DAS細(xì)胞以各種方式給予入宿主。給藥方式包括，但不限于血管內(nèi)、大腦內(nèi)、非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜外、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)(intrastemal)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、心內(nèi)或肌內(nèi)。優(yōu)選將細(xì)胞用于脊柱融合術(shù)操作。組合物本發(fā)明還提供了用于植入哺乳動(dòng)物的基質(zhì)，其中該基質(zhì)包含本發(fā)明的ADAS細(xì)胞。該基質(zhì)還可以包括，但不限于ADAS細(xì)胞，ADAS細(xì)胞裂解物，ADAS細(xì)胞條件培養(yǎng)基和由ADAS細(xì)胞產(chǎn)生的胞外基質(zhì)。該基質(zhì)還可以包含一種或多種生物活性因子或用其處理，包括，但不限于抗細(xì)胞凋亡劑(即紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子I和胰島素樣生長(zhǎng)因子II、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胱天蛋白酶抑制劑)；抗炎劑(即p38MAPK抑制劑、TGF-P抑制劑、他汀類藥物、IL-6和IL-I抑制劑和非類固醇消炎藥)；免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑；mTOR抑制劑；抗增殖劑；皮質(zhì)類固醇(即潑尼松龍、氫化可的松)；抗血栓形成劑；和抗氧化劑。生物活性因子的存在可以促使ADAS細(xì)胞增殖和/或分化。本發(fā)明在某些方面中進(jìn)一步提供了使需要的哺乳動(dòng)物骨組織再生的方法，通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物給予包含DAS細(xì)胞，基質(zhì)，ADAS細(xì)胞裂解物，本發(fā)明的ADAS-產(chǎn)物(即ADAS細(xì)胞分泌的分子)或其任何組合的組合物來(lái)進(jìn)行。照此，本發(fā)明包括藥物組合物，其中該組合物可以用于治療骨病。例如，所述的骨病包括，但不限于骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髄瘤、骨發(fā)育不良，脊柱側(cè)凸，骨質(zhì)疏松癥，骨軟化，軟骨病，纖維性骨炎，腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和佩吉特骨病。優(yōu)選本發(fā)明提供了用于促進(jìn)脊柱融合術(shù)后骨融合的組合物和方法。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，制備直接對(duì)部位給藥的包含本發(fā)明細(xì)胞的制劑，其中需要在給藥部位上產(chǎn)生新骨。例如，可以將本發(fā)明的細(xì)胞懸浮于注射用水凝膠溶液中?；蛘?，可以使包含細(xì)胞的水凝膠溶液硬化，例如在塑模中硬化，以便形成具有分散于其中的細(xì)胞的基質(zhì)，此后將其植入，或一旦基質(zhì)已經(jīng)硬化，就可以培養(yǎng)細(xì)胞，以便在植入前使細(xì)胞以有絲分裂方式擴(kuò)充。水凝膠為有機(jī)聚合物(天然或合成的)，它通過(guò)共價(jià)鍵，離子鍵或氫鍵交聯(lián)成截留水分子的三維開(kāi)放晶格23結(jié)構(gòu)以便形成凝膠?？梢杂糜谛纬伤z的材料的實(shí)例包括多糖類，諸如藻酸及其鹽，肽類，聚膦腈類(polyphosphazines)和聚丙烯酸酯類，它們通過(guò)離子方式交聯(lián)；或嵌段共聚物，諸如分別根據(jù)溫度或pH交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。在某些實(shí)施方案中，這些聚合物至少部分可溶于帶有電荷的側(cè)基的水溶液，諸如水，緩沖鹽溶液或水醇溶液或其一價(jià)離子鹽。帶有可以于陽(yáng)離子反應(yīng)的酸性側(cè)基的聚合物的實(shí)例為聚(磷腈)，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸酯)，丙烯酸與曱基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，諸如磺酸化聚苯乙烯。還可以使用具有通過(guò)丙烯酸或甲基丙烯酸與乙烯基醚單體或聚合物反應(yīng)形成的酸性側(cè)基的共聚物。酸性基團(tuán)的實(shí)例為羧酸基團(tuán)，磺酸基團(tuán)，鹵化(優(yōu)選氟化)醇基，酚0H基團(tuán)和酸性0H基團(tuán)。帶有可以與陰離子反應(yīng)的堿性側(cè)基的聚合物的實(shí)例為聚(乙烯基胺)，聚(乙烯基吡啶)，聚(乙烯基咪唑)和一些亞氨基取代的聚磷腈類。這些聚合物的銨或季銨鹽還可以由主鏈氮或側(cè)鏈亞氨基形成。堿性側(cè)基的實(shí)例為氨基和亞氨基。其它聚合物的實(shí)例為，但不限于聚-a-羥基酯類，聚二噁烷酮，富馬酸丙烯酯，聚乙二醇，聚原酸酯類，聚酐類和聚氨基甲酸酯類，聚-L-乳酸，聚-乙醇酸和聚-乳酸-共-乙醇酸。使用支架的ADAS細(xì)胞移植將本發(fā)明的細(xì)胞接種在三維支架上或接種入三維支架并且植入體內(nèi)，其中接種的細(xì)胞在框架內(nèi)增殖并且在體內(nèi)形成與哺乳動(dòng)物細(xì)胞協(xié)同的置換組織。在本發(fā)明的某些方面中，支架包含ADAS細(xì)胞的胞外基質(zhì)，細(xì)胞裂解物(例如可溶性細(xì)胞級(jí)分)或其組合。在某些實(shí)施方案中，支架包含由本發(fā)明細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)蛋白?；蛘?，胞外基質(zhì)為選自藻酸鈣、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素A、硫酸皮膚素和骨基質(zhì)明膠的外源性材料。在某些方面中，基質(zhì)包含天然或合成的聚合物。本發(fā)明包括生物相容性支架，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，自我-裝配結(jié)構(gòu)等，無(wú)論是否為生物可降解的，是液體還是固體。這類支架為基于細(xì)胞的療法，手術(shù)修補(bǔ)，組織改造和傷口愈合領(lǐng)域中公知的。優(yōu)選用細(xì)胞，胞外基質(zhì)，條件培養(yǎng)基，細(xì)胞裂解物或其組合預(yù)處理(例如接種(seeded)，接種(inoculated),接觸)支架。在本發(fā)明的某些方面中，細(xì)胞附著于支架上?？梢詫⒔臃N的支架按照本領(lǐng)域中公知的任何方式導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，包括，但不限于植入，注射，手術(shù)結(jié)合，使用其它組織植入，注射等?？梢詫⒈景l(fā)明的支架制成體內(nèi)組織或器官形狀和/或大小。例如，但絕不限于，可以設(shè)計(jì)支架，使得支架結(jié)構(gòu)支持接種的細(xì)胞，而不會(huì)隨后降解；從接種時(shí)開(kāi)始支持細(xì)胞，直到由宿主組織改造組織移植物；并且使接種的細(xì)胞附著，增殖并且發(fā)育成具有支持其自身的足夠機(jī)械完整性的組織結(jié)構(gòu)?？梢詫⒈景l(fā)明的支架與任何一種或多種本文另外處所述刺激組織形成，否則就是促進(jìn)或改善本發(fā)明實(shí)施的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞，藥物或其它成分聯(lián)用?？梢詫?duì)接種在支架上的ADAS細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造以表達(dá)生長(zhǎng)因子或藥物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)胞接種在支架上，在所述的支架中，材料展示出多孔性和模擬真骨特征的生物力學(xué)強(qiáng)度的特定物理特性，由此促進(jìn)最終結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和代謝物和細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物的進(jìn)出。即該材料應(yīng)提供結(jié)構(gòu)支持并且可以形成宿主血管化和細(xì)胞遷移可能發(fā)生的支架。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，首先將ADAS細(xì)胞與栽體物質(zhì)混合，此后施用于支架上。合適的載體包括，但不限于藻酸鈣、瓊脂糖、I、II、IV型或其它膠原蛋白同種型、纖維蛋白、聚-乳酸/聚-乙醇酸、透明質(zhì)酸鹽衍生物、明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、淀粉、多糖類、糖類、蛋白聚糖類、合成聚合物、磷酸鈣和陶瓷制品(即羥磷灰石、磷酸三釣)。可以修飾三維構(gòu)架的外表面以便改善細(xì)胞附著或生長(zhǎng)和組織分化，諸如通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行血漿涂敷或添加一種或多種蛋白質(zhì)(例如膠原蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白類、糖胺聚糖類(例如硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸酯、軟骨素-6-疏酸酯、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素)、細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料，諸如，但不限于明膠、藻酸鹽、瓊脂和瓊脂糖來(lái)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，重要的是在培養(yǎng)物中重新建立見(jiàn)于體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境，使得本發(fā)明的細(xì)胞在植入體內(nèi)前生長(zhǎng)至一定程度。此外，可以在接種細(xì)胞前，過(guò)程中或之后將生長(zhǎng)因子，成骨誘導(dǎo)劑和血管生成因子加入到培養(yǎng)基中，以便在植入哺乳動(dòng)物后由ADAS細(xì)胞引起分化和組織形成。AMS細(xì)胞的治療應(yīng)用本發(fā)明包括將ADAS細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物，包括人以便治療疾病的方法，其中導(dǎo)入ADAS細(xì)胞提供治療緩解?？梢詫⒈景l(fā)明的細(xì)胞單獨(dú)或作為與其它細(xì)胞和/或本文另處所述的生物活性因子的混合物給予?？梢耘c本發(fā)明ADAS細(xì)胞聯(lián)合給予的細(xì)胞包括，但不限于其它多能或多能性細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨襯細(xì)胞、干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞?？梢栽诮o予哺乳動(dòng)物前即刻或不久將不同類型的細(xì)胞與ADAS細(xì)胞混合，或在給予哺乳動(dòng)物前將它們彼此共同培養(yǎng)一段時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解可以將ADAS細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物，由此在接受來(lái)自周圍環(huán)境的信號(hào)和暗示時(shí)，細(xì)胞在體內(nèi)分化成由相鄰細(xì)胞環(huán)境指定的成熟細(xì)胞。優(yōu)選ADAS細(xì)胞分化成展示出骨細(xì)胞的至少一種特征的細(xì)胞?；蛘?，ADAS細(xì)胞可與自在體外分化成所需細(xì)胞類型并且可以對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物給予分化的細(xì)胞。本發(fā)明還包括將移植ADAS細(xì)胞與其它治療操作聯(lián)用以便治療骨病。優(yōu)選所述的細(xì)胞用于促進(jìn)脊柱融合術(shù)后的骨融合?？梢詫DAS細(xì)胞與其它，即遺傳修飾的和非遺傳修飾的對(duì)哺乳動(dòng)物發(fā)揮有益作用細(xì)胞共同植入。因此，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，一旦以本文提供的教導(dǎo)武裝起來(lái)，就可以將本文披露的方法與其它治療操作聯(lián)用?？梢詫DAS細(xì)胞與其它有益藥物或生物分子(生長(zhǎng)因子，營(yíng)養(yǎng)因26子)聯(lián)用。當(dāng)將ADAS細(xì)胞與其它活性劑一起給予時(shí)，可以將它們?cè)趩我凰幬锝M合物中或在單獨(dú)的藥物組合物中與其它活性劑同時(shí)或依次(在給予其它活性劑之前或之后)給予?？梢怨餐o予的生物活性因子包括，但不限于抗細(xì)胞凋亡劑(即紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子I和胰島素樣生長(zhǎng)因子II、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胱天蛋白酶抑制劑);抗炎劑(即p38MAPK抑制劑、TGF-p抑制劑、他汀類藥物、IL-6和IL-I抑制劑和非類固醇消炎藥)；免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑；mT0R抑制劑；抗增殖劑；皮質(zhì)類固醇(即潑尼松龍、氫化可的松)；抗血栓形成劑；和抗氧化劑。本發(fā)明包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予作為未分化細(xì)胞，即作為在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ADAS細(xì)胞?；蛘撸梢栽诮佑|在刺激分化成所需表型，例如成骨表型的條件的培養(yǎng)物中后給予ADAS細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)手術(shù)方式植入，注射，遞送(例如借助于導(dǎo)管或注射器)本發(fā)明的細(xì)胞，否則就是直接或間接對(duì)有修復(fù)或增大需要的部位給予本發(fā)明的細(xì)胞?？梢越柚诨|(zhì)細(xì)胞(例如三維支架)給予所述的細(xì)胞?？梢詫⑦@些細(xì)胞與常用藥學(xué)上可接受的載體一起給予。本發(fā)明細(xì)胞或其成分的給藥途徑(例如胞外基質(zhì)，細(xì)胞裂解物，條件培養(yǎng)基)包括肌內(nèi)、眼部、非腸道(包括靜脈內(nèi))、皮下、口服和鼻部給藥。非腸道給藥的具體途經(jīng)包括，但不限于肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、心室內(nèi)、腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、脊柱內(nèi)和/或脊柱周圍給藥途徑。優(yōu)選將這些細(xì)胞用于脊柱融合術(shù)操作。可以將本發(fā)明的細(xì)胞單獨(dú)或與用于修復(fù)骨創(chuàng)傷和缺陷的組合物的混合導(dǎo)入。這類組合物包括，但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)、羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)、明膠、聚-L-賴氨酸和膠原蛋白。例如，可以將本發(fā)明的細(xì)胞與脫鈣骨基質(zhì)(DBM)或其它基質(zhì)合并成復(fù)合成骨性(以其自身正確的方式形成骨)以及骨誘導(dǎo)性的。為了促進(jìn)植入細(xì)胞的分化、存活或活性，可以加入本文另外處所述的額外生物活性因子。例如，生物活性因子可以包括，但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和具有骨傳27導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)性能力的其它生長(zhǎng)因子。為了促進(jìn)移植骨組織的血管化和存活，可以單獨(dú)或與內(nèi)皮細(xì)胞或其前體組合加入血管生成因子，諸如VEGF、PDGF或bFGF?；蛘撸梢詫?duì)移植的ADAS細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以便表達(dá)這類生長(zhǎng)因子，抗氧化劑，抗炎劑或血管生成因子。藥物組合物本發(fā)明范圍內(nèi)還包括ADAS細(xì)胞-產(chǎn)物，包括，但不限于ADAS細(xì)胞自身分泌的胞外基質(zhì)，ADAS細(xì)胞細(xì)胞裂解物(例如可溶性細(xì)胞級(jí)分)和ADAS細(xì)胞條件培養(yǎng)基。照此，就給予包含ADAS細(xì)胞的組合物而言，本發(fā)明包括包含下列成分中的至少一種的藥物組合物ADAS細(xì)胞，由此產(chǎn)生的胞外基質(zhì)，其細(xì)胞裂解物，或ADAS條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選將該藥物組合物用于治療如本文定義的骨病。本發(fā)明的藥物組合物可以包含在藥學(xué)上可接受的載體中的同源或同種異體ADAS細(xì)胞群，本文基質(zhì)或其細(xì)胞裂解物或其條件培養(yǎng)基。用于本發(fā)明細(xì)胞的藥學(xué)上可接受的載體包括合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)栽體物質(zhì)，它們不會(huì)與本發(fā)明的細(xì)胞或其組成或成分產(chǎn)生有害反應(yīng)。就它們是生物相容性的來(lái)說(shuō)，合適的藥學(xué)上可接受的載體包括水，鹽溶液(諸如林格液)，醇類，油，明膠和碳水化合物，諸如乳糖、直鏈淀粉或淀粉、脂肪酸酯類、羥甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮，可以給這類制品滅菌，且如果需要，與助劑，諸如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑和著色劑混合。適用于本發(fā)明的藥物載體為本領(lǐng)域公知的并且，例如描述在PharmaceuticalSciences(17.sup.thEd"MackPub.Co.，Easton，Pa.)和WO96/05309中，將這些文獻(xiàn)各自引入本文作為參考。作為另一個(gè)實(shí)例，可以將本發(fā)明的細(xì)胞單獨(dú)，在藥學(xué)上可接受的載體中給予或接種在本文另外處所述的基質(zhì)上或其中，可以將這些細(xì)胞用于修復(fù)或替代受損或破壞的骨組織，用于增大存在的骨組織，用于導(dǎo)入新的或改變的組織或用于修飾人造假體。當(dāng)以半固體或固體裝置給予細(xì)胞時(shí)，手術(shù)植入體內(nèi)精確位置一般為合適的給藥方式。就以液體或流體藥物組合物的形式給予細(xì)胞而言，可以對(duì)多個(gè)全身位置給予細(xì)胞(即廣泛擴(kuò)散地受侵害區(qū)域)，從其中它們遷移至特定的位置(即通過(guò)對(duì)化學(xué)信號(hào)做出反應(yīng))。其它實(shí)施方案包括通過(guò)給予包含ADAS細(xì)胞成分(例如細(xì)胞裂解物或其成分)或產(chǎn)物(例如胞外基質(zhì)，天然或通過(guò)遺傳修飾產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)和其它生物因子，來(lái)自ADAS培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基)的藥物組合物進(jìn)行的治療方法。此外，這些方法可以進(jìn)一步包含給予如本文另外處所述的其它活性劑。還可以將ADAS細(xì)胞與促進(jìn)，控制，否則就是指導(dǎo)指定治療作用的添加劑一起施用。類似地，可以通過(guò)支持和/或指導(dǎo)植入細(xì)胞的命運(yùn)將細(xì)胞與有利于體內(nèi)組織改造的生物相容性基質(zhì)一起施用。在將ADAS細(xì)胞給予入哺乳動(dòng)物前，可以使用質(zhì)粒，病毒或可變載體策略，用所關(guān)注的核酸穩(wěn)定或在那是轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在進(jìn)行遺傳操作后給予細(xì)胞，使得它們表達(dá)指定促進(jìn)由細(xì)胞提供的治療反應(yīng)的基因產(chǎn)物。本發(fā)明的ADAS細(xì)胞可以用于治療需要修復(fù)或替代因一般發(fā)生組織疾病或創(chuàng)傷或衰竭產(chǎn)生的骨組織的哺乳動(dòng)物。治療可能需要使用本發(fā)明的細(xì)胞以便產(chǎn)生新的骨組織。例如，可以將未分化或成骨分化-誘導(dǎo)的細(xì)胞用于治療骨病，包括代謝和非代謝性骨病。骨病的實(shí)例包括，但不限于骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髄瘤、骨發(fā)育不良、脊柱側(cè)凸、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、軟骨病、纖維性骨炎、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良和佩吉特骨病。脊柱融合術(shù)正如本文所述，背痛仍然是主要的公共健康問(wèn)題，尤其是在老年人中。持續(xù)性和嚴(yán)重性的背痛通常導(dǎo)致虛弱和殘疾。這種疼痛與脊柱推間盤(pán)異常緊密相關(guān)。基于本發(fā)明披露的內(nèi)容，可以通過(guò)在盤(pán)內(nèi)修補(bǔ)受損組織治療變性的盤(pán)。本發(fā)明的ADAS細(xì)胞可以用于刺激骨發(fā)育且由此在變性的不同階段修補(bǔ)推間盤(pán)。然而，通常有必要除去至少部分受損和/或機(jī)能障礙性背部成分。例如，當(dāng)盤(pán)變斷裂時(shí)，可以實(shí)施堆間盤(pán)切除手術(shù)操作以便除去斷裂的盤(pán)并且彼此融合除去的盤(pán)之間的兩根推骨。脊柱融合術(shù)是一個(gè)過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程構(gòu)成脊柱的推骨中的兩根或多根與愈合成單一密質(zhì)骨的骨移植物和內(nèi)部裝置(諸如桿體)彼此融合。脊柱融合術(shù)可以消除推骨之間的反常運(yùn)動(dòng)，且由此減輕對(duì)神經(jīng)末梢的壓力。此外，脊柱融合術(shù)可以用于治療，例如因創(chuàng)傷導(dǎo)致的脊推骨損傷；推骨之間緩沖盤(pán)的突出和變性(有時(shí)稱作打滑的盤(pán)或堆間盤(pán)脫出)；異常彎曲(諸如脊柱側(cè)凸或脊柱后凸)；和因感染或胂瘤導(dǎo)致的弱或不穩(wěn)定脊柱。本發(fā)明包括用于改善脊柱融合術(shù)操作的成功率的組合物和方法。由于已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的ADAS細(xì)胞在體內(nèi)形成骨，所以ADAS細(xì)胞可以用于取代常用于脊柱融合術(shù)的骨移植物的位置。特別地，ADAS細(xì)突間空間內(nèi))的骨形成(推體內(nèi))。本發(fā)明的ADAS細(xì)胞在治療脊柱病癥中具有許多應(yīng)用，包括促進(jìn)推間盤(pán)修復(fù)中富含蛋白聚糖的基質(zhì)產(chǎn)生，產(chǎn)生用于橫突間脊柱融合術(shù)中推體間的骨和產(chǎn)生用于長(zhǎng)骨骨折愈合的骨。本發(fā)明基于ADAS細(xì)胞可以用于促進(jìn)脊柱融合術(shù)中的骨融合的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)推間盤(pán)斷裂時(shí)，可以實(shí)施推間盤(pán)切除手術(shù)操作以便除去斷裂的推間盤(pán)并且彼此融合除去的推間盤(pán)之間的兩根推骨。有關(guān)用于融合推骨的典型實(shí)施方法的詳細(xì)描述披露在美國(guó)專利US6,033,438和US5,015,247中，將這些文獻(xiàn)的內(nèi)容完整地引入本文作為參考。通常用區(qū)段融合治療關(guān)節(jié)盤(pán)變性，由此融合推體間空間的前和后脊柱成分。重要的是認(rèn)為在考慮融合技術(shù)時(shí)機(jī)械應(yīng)力壓迫在前或2后成分上。前運(yùn)動(dòng)區(qū)段成分(推體和關(guān)節(jié)盤(pán))在脊柱內(nèi)的指定水平上具有約80%的壓迫力。推體和關(guān)節(jié)盤(pán)的后1/3代表脊柱軸向壓迫的中心點(diǎn)。這些機(jī)械力對(duì)評(píng)價(jià)何種類型的融合對(duì)指定病理學(xué)情況具有最佳臨床效果而言是關(guān)鍵性的。本發(fā)明提供了脊柱融合術(shù)，其中ADAS細(xì)胞用作骨替代物的來(lái)源。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括對(duì)哺乳動(dòng)物實(shí)施一種或多種脊柱融合術(shù)的方法，包括通過(guò)經(jīng)注射器，導(dǎo)管或套管將有效量的ADAS細(xì)胞給予入哺乳動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)合適的堆體間空間，以便有利于單或多個(gè)水平的脊柱融合術(shù)。將ADAS細(xì)胞置于在生理?xiàng)l件下，即體內(nèi)細(xì)胞分化和形成骨的時(shí)間內(nèi)。ADAS細(xì)胞的操作促進(jìn)了脊柱融合術(shù)中的骨融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于對(duì)哺乳動(dòng)物實(shí)施一種或多種脊柱融合術(shù)的方法，包括通過(guò)與相鄰?fù)乒墙雍显谥辽僖粋€(gè)合適的推體間空間的后部分中放置選自桿體和推弓根螺釘或板和推弓根螺釘?shù)慕饘僦踩胛?；將有效量的ADAS細(xì)胞注入推體間空間的前部；并且使ADAS細(xì)胞分化成展示出骨細(xì)胞的至少一種特征的細(xì)胞且由此在體內(nèi)形成骨。本發(fā)明包括通過(guò)對(duì)推體間空間使用前部途徑，后部途徑或后外側(cè)途徑實(shí)施脊柱融合術(shù)的方法。后外側(cè)途徑(單側(cè)或雙側(cè))降低了前部途徑中的手術(shù)發(fā)病率，但在馬尾周圍操作和脫離堆管中的神經(jīng)根時(shí)要謹(jǐn)慎。堆體間空間的后部入口和可視化比前部途徑的更受限，但許多脊柱外科醫(yī)師經(jīng)歷過(guò)如何處理這些情況的訓(xùn)練。如本文另外處所述，ADAS細(xì)胞還可以包含一定量適合于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的一種或多種活性的生物活性劑，諸如生長(zhǎng)因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白或其藥物載體。ADAS細(xì)胞可以提供治療或結(jié)構(gòu)有益性的一種機(jī)制在于通過(guò)將其自身或其子代摻入新生成的，現(xiàn)存的或修復(fù)的組織或組織成分。例如，ADAS細(xì)胞和/或其子代可以摻入新生成的骨其它結(jié)構(gòu)或功能組織，且由此產(chǎn)生或促進(jìn)治療或結(jié)構(gòu)改善。ADAS細(xì)胞可以提供治療或結(jié)構(gòu)有益性的另一種機(jī)制在于通過(guò)表達(dá)和/或分泌促進(jìn)指定組織或組織成分的結(jié)構(gòu)或功能生成，保留，恢復(fù)和/或再生的分子，例如生長(zhǎng)因子。ADAS細(xì)胞還可以用于與其它細(xì)胞或裝置組合，諸如遞送因子，藥31物，化學(xué)品或其它活性劑的合成或生物支架，材料或裝置，所述的因子，藥物，化學(xué)品或其它活性劑如本文進(jìn)一步所述的改變或強(qiáng)化細(xì)胞的相關(guān)特征。按照在此披露的本發(fā)明，可以在從哺乳動(dòng)物中采集脂肪組織后迅速將ADAS細(xì)胞遞送到哺乳動(dòng)物中。例如，可以在處理脂肪組織并且獲得ADAS細(xì)胞的組合物后即刻給予細(xì)胞。最終，遞送的時(shí)間選擇取決于哺乳動(dòng)物可利用性和加工脂肪組織所需的處理時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于遞送的定時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，只要如本文所述的對(duì)重新輸注給哺乳動(dòng)物的細(xì)胞進(jìn)行額外的修飾，純化，刺激或其它操作。給予哺乳動(dòng)物的細(xì)胞數(shù)量可以與例如脂肪組織處理后的細(xì)胞產(chǎn)率相關(guān)?？梢员３旨?xì)胞總數(shù)以便隨后使用或冷藏。下列實(shí)施例進(jìn)一步解釋了本發(fā)明的方面。然而，決不用來(lái)限定如本文所述的本發(fā)明的教導(dǎo)或披露內(nèi)容。實(shí)施例現(xiàn)在參照下列實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例的目的僅在于解釋，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例，而是包括作為本文提供教導(dǎo)的結(jié)果顯而易見(jiàn)的所有變化形式。進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以便確定ADAS細(xì)胞對(duì)脊柱融合術(shù)結(jié)果的作用。例如，同源和同種異體ADAS細(xì)胞對(duì)脊柱融合術(shù)的影響。本文的結(jié)果表明ADAS細(xì)胞為成骨性的并且促使脊柱融合術(shù)的改善?；诒景l(fā)明披露的內(nèi)容，ADAS細(xì)胞可以用于治療哺乳動(dòng)物，包括，但不限于創(chuàng)傷受害者，缺乏適當(dāng)數(shù)量的成骨細(xì)胞的骨質(zhì)疏松哺乳動(dòng)物和具有非愈合性骨折的哺乳動(dòng)物。實(shí)施例l:脊柱融合術(shù)中自體移植骨的替代物超過(guò)75%的美國(guó)人口患有背痛。在某些情況中，潛在的醫(yī)學(xué)疾病可能促成背痛。它們包括脊柱側(cè)凸、椎管狹窄、關(guān)節(jié)盤(pán)變性疾病、傳染過(guò)程、腫瘤和創(chuàng)傷。就1%的人群而言，背痛由此是嚴(yán)重性的，迫使他們發(fā)生終生殘疾；另有1%的人口因背痛而在有限時(shí)間期限內(nèi)成為殘疾。使用保守療法治療具有背痛的大部分哺乳動(dòng)物；然而，當(dāng)諸如臥床休息和藥物療法這類方式失敗時(shí)，臨床醫(yī)師通常建議實(shí)施脊柱融合術(shù)。這種手術(shù)的目的在于在兩根或多根相鄰?fù)乒侵g形成異位骨，使它們彼此"融合"成堅(jiān)固結(jié)構(gòu)。推骨關(guān)節(jié)的固定化減輕了離開(kāi)脊髄的神經(jīng)根上的壓力和產(chǎn)生的疼痛感。外科醫(yī)師對(duì)腰推使用后外側(cè)途徑(posterlateralapproach)，從而導(dǎo)入了在兩推體之間具有機(jī)械支持的骨移植物或骨誘導(dǎo)性材料以便形成異位骨(圖1)。由于不希望受到任何特定理論約束，所以認(rèn)為用于脊柱融合術(shù)的"理想"移植物材料可以提供下列特性機(jī)械支持性(材料在恢復(fù)期過(guò)程中穩(wěn)定脊柱/手術(shù)部位)；骨傳導(dǎo)性(材料有利于向內(nèi)成長(zhǎng)和其上相鄰骨的整合)；骨誘導(dǎo)性(材料補(bǔ)充和刺激從并非天然可以進(jìn)行的細(xì)胞形成骨不使其生長(zhǎng))；和成骨性(材料包含自身能夠形成新骨的細(xì)胞)。目前，用于脊柱融合術(shù)修復(fù)的"金標(biāo)準(zhǔn)"為自體骨，其通常采集自個(gè)體的髂嵴。外科醫(yī)師將哺乳動(dòng)物自身的骨植入需要的部位。然而，這遠(yuǎn)非完美的解決方案。在30%的哺乳動(dòng)物中，供體部位在手術(shù)后發(fā)生感染，青腫，破碎或疼痛。實(shí)際上，當(dāng)哺乳動(dòng)物需要自體移植骨進(jìn)行多種脊柱融合術(shù)時(shí)，髂嵴可能無(wú)法提供足夠的材料。哺乳動(dòng)物的基本健康狀況進(jìn)一步影響脊柱融合術(shù)的結(jié)果。具有因糖尿病，吸煙或年齡導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥或血管功能不全的哺乳動(dòng)物展示出減少的新骨形成和脊柱融合部位上的骨不連接(Whang等，2003，SpineJ.3:155-65)。因此，對(duì)脊柱融合術(shù)中的自體移植骨的替代物存在需求。盡管存在可利用的可替代材料，但是它們均面臨常用的局限；尚無(wú)一種展示出成骨能力?？梢詫?duì)來(lái)自尸體的異體移植骨滅菌，儲(chǔ)存并且根據(jù)需要用于手術(shù)室?？梢允惯@些材料預(yù)成形以便具體應(yīng)用，或?qū)⑵浞鬯椋顾鼈冏鳛楹齽┦┯糜谑中g(shù)部位；然而，異體移植物可以產(chǎn)生炎癥，引起免疫應(yīng)答并且已經(jīng)在有限數(shù)量的病例中成為感染源(Whang等，2003,SpineJ.3:155-65)。因?yàn)閷愺w移植骨滅菌，所以它不再包含形成有活力的天然骨的細(xì)胞(成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞)并且缺33乏成骨性。在臨床試驗(yàn)中，異體移植骨次于多級(jí)脊柱融合術(shù)中的自體移植骨(Whang等，2003，SpineJ.3:155-65)。陶資材料，諸如羥磷灰石和磷酸三鈣(HA/TCP)為骨傳導(dǎo)性的并且促進(jìn)新骨形成。然而，它們?nèi)狈Τ晒切院凸钦T導(dǎo)性，從而限制了其應(yīng)用。盡管骨誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子，諸如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)為商購(gòu)的(來(lái)自Sofamor/Medtronics的InfuseTM)，但是它們需要存在脊柱融合部位內(nèi)存在成骨細(xì)胞以便促進(jìn)新骨形成(Whang等，2003，SpineJ.3:155-65)。成骨細(xì)胞的發(fā)育具有改善這些可替代脊柱融合術(shù)材料中任何種的結(jié)果的潛能。大量動(dòng)物種類用作臨床前期脊柱融合術(shù)試驗(yàn)中的模型。它們包括大鼠，兔，狗，綿羊，山羊和非人的靈長(zhǎng)類(Khan等，2004，Biomaterials25:1475-85;Liebschner等，2004，Biomaterials25:1697-714;Sandhu等，2001，Eur.SpineJ.10:S122-31)，其中大鼠(Boden等，1998，Spine23:2486-92;Cui等，2001，Spine26:2305-10;Wang等，2003,J.BoneJointSurg.Am.85-A:905-1l)和兔(Khan等，2004，Biomaterials25:1475-85;Kruyt等，2004，Biomaterials25:1463-73)因動(dòng)物大小和成本的原因而已經(jīng)用于"概念驗(yàn)證"研究。在每一種類中，外科醫(yī)師可以對(duì)腰稚使用與用于治療其它哺乳動(dòng)物類似的后外側(cè)途徑。兔更常用于脊柱融合術(shù)可行性研究(Khan等,2004，Biomaterials25:1475-85)，部分原因在于動(dòng)物的大小和脊柱融合術(shù)在兔中的比例與在人中觀察到的結(jié)果類似的經(jīng)證實(shí)的觀察結(jié)果。然而，兔與大鼠模型相比存在模型缺陷。不同于大鼠，其中可利用充分表征的近交品系，實(shí)驗(yàn)室兔未展示出同源性或同基因型單體型。因此，不可能按照常規(guī)方式將細(xì)胞從一只兔移植到另一只兔中，而沒(méi)有排斥風(fēng)險(xiǎn)。大鼠后外側(cè)脊柱融合術(shù)模型已經(jīng)用于成功地證實(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白7在膠原蛋白支架中存在時(shí)的骨誘導(dǎo)性作用(Salamon等，2003，J.SpinalDisord.Tech.16:90-5)。幾組使用了成功評(píng)價(jià)骨髄基質(zhì)細(xì)胞對(duì)脊柱融合的成骨作用的大鼠模型(Boden等，1998，脊柱23:2486-92;Cui等，2001，Spine26:2305-10;Wang等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:905-11)。與單獨(dú)的支架34相比，骨髓基質(zhì)細(xì)胞植入后4-9周內(nèi)，他們實(shí)現(xiàn)了脊柱融合的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的改善。每一研究使用n-4-8只動(dòng)物的組。設(shè)計(jì)下列實(shí)驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)脊柱融合術(shù)操作中ADAS細(xì)胞的作用。ADAS細(xì)胞的分離從雄性Fischer大鼠中采集皮下脂肪組織(8-10周齡，n=25，產(chǎn)生約3克組織/大鼠)。按照公布的方法制備ADAS細(xì)胞(Aust等，2004，Cytotherapy6:7-14;Halvorsen等，2001，Metabolism50:術(shù)-413;Sen等，2001，JournalofcellularBiochemistry81:312-319)。簡(jiǎn)言之，切碎脂肪組織，洗滌并且懸浮于等體積的包含1%牛血清清蛋白和0.1%膠原酶I型(WorthingtonBiochemical,LakewoodNJ)的磷酸緩沖鹽水中。在37X:下通過(guò)攪拌(5Grpm)進(jìn)行60分鐘消化后，在室溫下以1200rpm將混懸液離心5分鐘并且使基質(zhì)血管級(jí)分細(xì)胞沉淀。以0.1克組織消化物/ci^的密度在"基質(zhì)培養(yǎng)基"(補(bǔ)充了10%胎牛血清(Hyclone，LoganUT)和1%抗生素/抗霉菌劑的DMEM/F-12Ham's培養(yǎng)基中鋪板。將細(xì)胞在加濕5%0)2孵育箱中孵育3-6天，直到它們達(dá)到75%的匯合率。產(chǎn)生約為25-30X1(T個(gè)細(xì)胞/cm2。此時(shí)，通過(guò)用胰蛋白酶/EDTA消化收集ADAS細(xì)胞并且以5X1(T個(gè)細(xì)胞/cm2的平板密度傳代。使細(xì)胞擴(kuò)充達(dá)2代以便獲得>6千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞(表1)。如(Halvorsen等，2001，TissueEng.7:729-41;Hicok等，2004，TissueEngineering10:371-380)中所述使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法在1-3周誘導(dǎo)期內(nèi)對(duì)細(xì)胞在體外評(píng)價(jià)成骨和脂肪形成能力?？梢詫⒓?xì)胞冷藏在液氮中，此后使用。為了從組織學(xué)上跟蹤細(xì)胞，在使用攜帶表達(dá)P-半乳糖苷酶的LacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄載體在初始傳代的過(guò)程中標(biāo)記細(xì)胞以便提供可追蹤標(biāo)記。逆轉(zhuǎn)錄載體的穩(wěn)定整合降低了標(biāo)記在植入過(guò)程中丟失的風(fēng)險(xiǎn)。這種方法常用于追蹤植入的細(xì)胞。35表1:估計(jì)的ADAS細(xì)胞產(chǎn)率和擴(kuò)充<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)施例2:體外ADAS細(xì)胞的骨生成已經(jīng)證實(shí)在有抗壞血酸，p-磷酸甘油，地塞米+>和1,25二羥維生素D3存在下培養(yǎng)時(shí)，人ADAS細(xì)胞展示出成骨表型(Halvorsen等，2001，TissueEng.7:729-41)。在這些條件下，ADAS細(xì)胞使其胞外基質(zhì)如使用用于磷酸鈣沉積的茜素紅或vonKossa染色陽(yáng)性證實(shí)的礦化(圖3)。觀察到在IO-天期限內(nèi)的人ADAS細(xì)胞骨發(fā)生伴隨堿性磷酸酶活性增加。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，成骨細(xì)胞(礦化)展示出高于在對(duì)照條件下維持細(xì)胞3倍水平的堿性磷酸酶(圖4)。同樣，在成骨條件下骨鈣素分泌水平存在時(shí)間依賴性增加。ADAS細(xì)胞表達(dá)大量與成骨細(xì)胞表型一致的基因標(biāo)記，包括骨鈣素，骨橋蛋白，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2和4和BMP受體IA，IB和II。還證實(shí)ADAS細(xì)胞具有沿著多重鐠系途經(jīng)分化的潛能。作為對(duì)化學(xué)品和生長(zhǎng)因子的特定混合物的反應(yīng)，ADAS細(xì)胞可以在體外分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元-和神經(jīng)膠質(zhì)-樣細(xì)胞(圖2)。實(shí)施例3:ADAS細(xì)胞在體內(nèi)為成骨性的為了延長(zhǎng)體外發(fā)現(xiàn)，將人ADAS細(xì)胞植入免疫缺陷SCID小鼠，使ADAS細(xì)胞加栽在3cn^立方體的羥磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)支架上并且經(jīng)皮下植入。在6-周期限后，采集植入物，固定，脫鈣并且用蘇木精/伊紅或用人核抗原特異性抗體染色(圖5)。基于H&E染色，觀察到在有人ADAS細(xì)胞存在下形成與羥磷灰石/磷酸三鈣支架相鄰的新骨。基于使用人抗原特異性抗體的免疫熒光分析鑒定骨內(nèi)的人細(xì)胞。在有單獨(dú)的支架(無(wú)細(xì)胞)存在下，新骨不會(huì)形成并且未檢測(cè)到人細(xì)胞。這些研究表明ADAS細(xì)胞能夠在體內(nèi)骨發(fā)生。實(shí)施例4:可以通過(guò)異體移植方式植入ADAS細(xì)胞下列實(shí)驗(yàn)用于提供有關(guān)ADAS細(xì)胞在脊柱融合模型中的異體移植的概念驗(yàn)證。已經(jīng)證實(shí)ADAS細(xì)胞難以引起來(lái)自混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中異體移植淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在不希望受到任何特定理論的約束的情況下，據(jù)認(rèn)為ADAS細(xì)胞釋放抑制對(duì)同種異體抗原的淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的因子。存在ADAS細(xì)胞延長(zhǎng)了狒狒模型中皮膚移植物的存活且由此表明可以通過(guò)異體移植方式將成體干細(xì)胞植入以便組織改造應(yīng)用。使用犬模型，可以生成狗股骨干中臨界大小的部分缺損，可以使用單獨(dú)的羥磷灰石/磷酸三釣支架或其與自體或異體ADAS細(xì)胞的組合修復(fù)這些缺損；異體移植細(xì)胞就HLA-I和HLA-2抗原而言發(fā)生錯(cuò)配(表2)。移植物接受者未接受任何免疫抑制療法。16周后處死動(dòng)物并且可以將在有ADAS細(xì)胞存在下觀察到的骨修復(fù)程度與單獨(dú)的支架移植物(無(wú)ADAS細(xì)胞)比較。由于不希望受到任何特定理論的約束，所以認(rèn)為在使用自體與異體ADAS細(xì)胞獲得的修復(fù)之間未觀察到顯著性差異，也不存在對(duì)同種異體細(xì)胞的任何免疫應(yīng)答的證據(jù)。這些實(shí)驗(yàn)用于證實(shí)組織改造的構(gòu)建體中異體植入成體干細(xì)胞是切實(shí)可行的并且在某些情況中無(wú)需免疫抑制療法。表2:犬區(qū)段缺損中骨和陶瓷制品的組織形態(tài)測(cè)定分析**<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>**陶瓷制品百分比為陶瓷制品占植入物總面積的百分比，且骨百分比為骨占多孔空間的百分比。將數(shù)值定為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。與不含細(xì)胞的植入物相比，差異為顯著性的(p<0.05)(Arinzeh等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:1927-35)。實(shí)施例5:同源ADAS細(xì)胞對(duì)脊柱融合的作用下列實(shí)驗(yàn)用于解決ADAS細(xì)胞體內(nèi)為成骨性的且與合適的生物材料栽體組合可以改善和加速動(dòng)物模型中的脊柱融合的推定。表3概括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。使用同源ADAS細(xì)胞(來(lái)自相同品系大鼠的細(xì)胞)進(jìn)行最初研究，以便模擬在人自體細(xì)胞移植物中存在的條件。通過(guò)除去與免疫應(yīng)答和排斥相關(guān)的問(wèn)題，這些實(shí)驗(yàn)集中在ADAS細(xì)胞在脊柱融合中的成骨能力。實(shí)驗(yàn)大鼠作為脊柱融合模型的這些實(shí)驗(yàn)以本領(lǐng)域中公知的方法為模式(Boden等，1995，Spine20:412-20;Wang等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:905-11;Cui等，2001，Spine26:2305-10;Sandhu等，2001，Eur.SpineJ.10Suppl.2:S122-31;Wang等，2003:SpineJ.3:155-65)。手術(shù)操作和安樂(lè)死如Cui所述對(duì)96只雌性Fischer大鼠實(shí)施單級(jí)橫突間脊柱關(guān)節(jié)固定術(shù)(L4-L5)(Cui等，2001，Spine26:2305-10)。用氯胺酮(80mg/kg)和賽拉溱(7mg/kg)麻醉動(dòng)物，剃刮，懸垂并且使用聚維酮碘和70%乙醇對(duì)其皮膚進(jìn)行消毒。從L3-L5做中線后縱切口。沿棘突和與小面的側(cè)面連接的層使骨膜隆起。使用骨鉗除去小面并且用鹽水溶液沖洗傷口。將動(dòng)物隨機(jī)分成n=32的組。A組不接受治療。B組接受單獨(dú)的羥磷灰石/磷酸三鈣(40mg)植入融合床。C組接受羥磷灰石/磷酸三鈣"0mg)與2X106個(gè)來(lái)源于Fischer大鼠的皮下脂肪組織的ADAS細(xì)胞(同源細(xì)胞)的組合植入融合床。在放置植入物后，封閉深筋膜和皮膚切口。在手術(shù)操作后監(jiān)測(cè)為術(shù)后鎮(zhèn)痛接受鹽酸丁丙諾啡(O.1mg/kg)的動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)性和功能恢復(fù)達(dá)24小時(shí)。在手術(shù)操作后6和12周通過(guò)C02窒息處死來(lái)自每個(gè)組的16只動(dòng)物的組。此時(shí)，釆集血清樣本和腰堆用于分析。38放射照像隨訪在手術(shù)后和手術(shù)后6周間隔時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腰骶部脊柱的后前位的側(cè)位射線照相。放射照像分析用于檢測(cè)手術(shù)部位上腰推中的異位骨形成和骨痂形成。對(duì)處死后剖離的樣本進(jìn)行顯微計(jì)算機(jī)化斷層攝(顯微-CT)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法測(cè)定新骨形成的結(jié)構(gòu)和體積(Mankani等，2004，Radiology230:369-76)。脊柱融合術(shù)的手部觸診在處死動(dòng)物時(shí)，從動(dòng)物中剖離L3-L5腰推。觸摸樣本的L3-4和L4-5上的延長(zhǎng)部分和彎曲部分。對(duì)有或沒(méi)有任何運(yùn)動(dòng)存在下的樣本分級(jí)。在任何方向上存在運(yùn)動(dòng)的那些樣本接受"0"的評(píng)分，而認(rèn)為那些在任何方向上沒(méi)有運(yùn)動(dòng)的樣本與"1"的評(píng)分"融合"(Cui等，2001，脊柱26:2305-10;Grauer等，2004，脊柱J.4:281-6)。脊柱融合的生物力學(xué)測(cè)試在測(cè)試前，清除所有的肌肉并且分開(kāi)L4-5上的推間盤(pán)，使得僅融合體連接兩根椎骨。將鐵k-絲(3.2mm)針?lè)湃攵ㄏ蛴谕企w的前后軸。以0.5cm/分鐘的移位速率與通過(guò)k-絲施加的負(fù)荷進(jìn)行單軸拉伸測(cè)試。用伸長(zhǎng)計(jì)測(cè)定移位并且借助測(cè)力傳感器測(cè)定負(fù)荷。根據(jù)計(jì)算機(jī)生成的負(fù)荷移位圖測(cè)定斷裂的峰值負(fù)荷。將剛度測(cè)定為負(fù)荷移位曲線上兩點(diǎn)之間的線的斜率(在50%和75%負(fù)荷下斷裂)。按照類似方式測(cè)試L3-4上的相鄰區(qū)段。組織學(xué)分析將腰堆樣本(對(duì)每組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)而言n-8)固定在福爾馬林中48小時(shí)，在4t:下磷酸緩沖鹽水中0.25M的乙二胺四乙酸中脫鈣2周并且在37t:下的X-gal溶液(lmg/ml)中孵育16小時(shí)。將樣本進(jìn)行石蠟包埋，做橫切片(5nm)并且用蘇木精和伊紅染色。使用Medivue(Nikon)軟件分析來(lái)自每一樣本的IO個(gè)切片，以便對(duì)異位骨占據(jù)的每39一植入物的平均百分比定量(士標(biāo)準(zhǔn)偏差)。由于不希望受到任何特定理論約束，所以認(rèn)為主要實(shí)現(xiàn)下列結(jié)果，ADAS細(xì)胞就可成功用于脊柱融合術(shù)1)觀察到在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)A組(無(wú)治療)中有最少的融合證據(jù)(90。/。的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為0，無(wú)異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有10個(gè)切片中小于5%的手術(shù)部位面積被骨基質(zhì)占據(jù))；2)在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)在B和C組中檢測(cè)動(dòng)物組織學(xué)分析中的HA/TCP支架；3)在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)B組(單獨(dú)的HA/TCP)中有最少的融合證據(jù)(90%的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為0，無(wú)異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有10個(gè)切片中小于5%的手術(shù)部位面積被骨基質(zhì)占據(jù))；4)基于組織學(xué)分析時(shí)的p-半乳糖苷酶活性或免疫檢測(cè)的手術(shù)后檢測(cè)C組中植入的ADAS細(xì)胞6周；和5)在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)，優(yōu)于單獨(dú)的支架(B組)或空白損害(A組)對(duì)照組的在有ADAS細(xì)胞(C組)存在下的脊柱融合術(shù)(90°/的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為"1"，在手術(shù)部位上有異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有10個(gè)切片中大于30%的HA/TCP植入物面積被骨基質(zhì)占據(jù))。將本實(shí)施例中所列的實(shí)驗(yàn)用于解決ADAS細(xì)胞在加速和改善大鼠模型中腰推融合中的應(yīng)用。表3:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概括<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例6:異體移植ADAS細(xì)胞對(duì)脊柱融合的作用下列實(shí)驗(yàn)用于解決可以使用生物材料支架以異體移植的方式植入ADAS細(xì)胞以便獲得優(yōu)于單獨(dú)的生物材料支架的脊柱融合的推定。表4中概括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。已經(jīng)證實(shí)能夠植入骨髄衍生的MSC以便在沒(méi)有明顯免疫排斥的情況下修復(fù)骨缺陷(Arinzeh等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:1927-35)。本文披露的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了異體移植ADAS細(xì)胞在腰推融合模型中的應(yīng)用。選擇Fischer和ACI近交品系用于下列基于文獻(xiàn)中的在先研究的實(shí)驗(yàn)(Akahane等，1999，J.BoneMinerRes.14:561-8;Yoshikawa等，2000，J.BoneMinerRes.15:1147-57)。除非指定免疫抑制療法，否則這些動(dòng)物展示出組織相容性抗原錯(cuò)配和排斥成骨組織移植物(Akahane等，1999，J.BoneMinerRes.14:56H;Yoshikawa等，2000，J.BoneMinerRes.15:1147-57)。將來(lái)自ACI大鼠的分離的異體移植ADAS細(xì)胞用于植入Fischer大鼠腰推脊柱融合體。本文的實(shí)驗(yàn)可以和與同源自體ADAS細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行，由此能夠進(jìn)行對(duì)比分析?？梢曰趩蜗蚧旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)和對(duì)獲自各組的血清樣品的流式細(xì)胞檢測(cè)分析評(píng)價(jià)存在或不存在對(duì)異體移植ADAS細(xì)胞的免疫應(yīng)答。表4:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概括組A無(wú)RxB僅支架C支架+同源細(xì)胞橫突間脊柱L4-L5關(guān)節(jié)融合術(shù)N=96只Fischer大鼠植入物N=32N=32N=32HA-TCP支架—++ACIADAS細(xì)胞(2x10"-—+在6周時(shí)實(shí)施安樂(lè)死N=16N=16N-16在12周時(shí)實(shí)施安樂(lè)死N=16N=16N=16體內(nèi)分析顯微CT分析，X-射線分析，手工測(cè)定脊柱融合(盲式分析，2個(gè)獨(dú)立的觀察者)體外分析脫鉤時(shí)的組織學(xué)(H&E)，生物力學(xué)測(cè)試，單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，血清樣品的流式細(xì)胞檢測(cè)分析(包括C組)41如本文另外處所述從雄性ACI大鼠(8-10周齡，n=25，產(chǎn)生約3克組織/大鼠)中釆集皮下脂肪組織。使用各代獲得的細(xì)胞數(shù)量遵循表l中概括的估計(jì)值。使來(lái)自ACI大鼠的ADAS細(xì)胞進(jìn)行與用于Fischer大鼠ADAS細(xì)胞相同的體外分析。如本文另外處所述進(jìn)行手術(shù)和隨后操作(即放射照像隨訪，脊柱融合術(shù)中的手部觸診)。HA/TCP植入物可以在100)il體積中包含約2X106個(gè)細(xì)胞。為了進(jìn)行組織學(xué)分析，將腰推樣本固定在福爾馬林中48小時(shí)，在4r下磷酸緩沖鹽水中0.25M的乙二胺四乙酸中脫鈣2周并且在37。C下的X-gal溶液(lmg/ml)中孵育16小時(shí)。將樣本進(jìn)行石蠟包埋，做橫切片(5jim)并且用蘇木精和伊紅染色。使用Medivue(Nikon)軟件分析來(lái)自每一樣本的10個(gè)切片，以便對(duì)異位骨占據(jù)的每一植入物的平均百分比定量(土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在有或沒(méi)有浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞存在下評(píng)價(jià)切片。由于不希望受到任何特定理論的約束，所以可以將針對(duì)全造血系抗體(抗-CD45)的抗體用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以便鑒定植入物內(nèi)或周圍任何免疫細(xì)胞。在每個(gè)樣本10個(gè)切片中測(cè)定浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量并且使用Medivue軟件程序定量。血清免疫應(yīng)答通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)評(píng)價(jià)結(jié)合ACI品系A(chǔ)DAS細(xì)胞的血清抗體。將來(lái)自ACI大鼠的ADAS細(xì)胞從液氮儲(chǔ)存中快速融化并且放入培養(yǎng)物中5天以便促進(jìn)最大活力和表面抗原表達(dá)。通過(guò)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，在染色緩沖液(lxDPBS,5%FBS，0.5%BSA，0.1%疊氮化鈉)中洗滌且重新懸浮于5x1()6個(gè)細(xì)胞/ml中。將90pl細(xì)胞(5xl()5個(gè)細(xì)胞)等分入2ml埃彭道夫管。向每支管中加入IOiil未稀釋的大鼠血清或按照1:10在染色緩沖液中稀釋的血清而得到1:10和1:100的有效血清稀釋液。將所有的管在冰上孵育30分鐘，用洗滌緩沖液(1XDPBS，0.5%BSA和0.1%疊氮化鈉)洗滌且然后重新懸浮于100Ml染色緩沖液中。將山羊抗大鼠(IgG/IgM)FITC二次抗體以1:100的最終稀釋液加入到所有管中。對(duì)照管接受僅含有二次抗體(陰性對(duì)照)或含有陽(yáng)性42對(duì)照Fischer抗-ACI大鼠血清的ACIADAS細(xì)胞，所述的陽(yáng)性對(duì)照Fischer抗-ACI大鼠血清是通過(guò)用ACIADAS細(xì)胞對(duì)Fischer大鼠反復(fù)免疫接種產(chǎn)生的。在黑暗中的冰上將混懸液孵育15分鐘并且如本文另外處所述用洗滌緩沖液洗滌兩次。然后在獲取前將細(xì)胞固定在200ja11%低聚甲醛中并且將其在冰上的固定劑中孵育至少15分鐘。需要20，000個(gè)結(jié)果用于流式細(xì)胞計(jì)量分析?；谄骄鶡晒鈴?qiáng)度增加將結(jié)果表示為使用二次抗體染色的ACI細(xì)胞占單獨(dú)二次抗體陰性對(duì)照的百分比。單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)本測(cè)定法基于下列原理如果在體內(nèi)使T細(xì)胞接觸ACI異型抗原，那么它們以較快的動(dòng)力學(xué)速率對(duì)體外再刺激產(chǎn)生反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)MLR測(cè)定法評(píng)價(jià)接受者大鼠T細(xì)胞對(duì)異體移植ACI品系A(chǔ)DAS細(xì)胞活化。使用收集的腸系膜+宮頸LN細(xì)胞作為反應(yīng)者細(xì)胞對(duì)各大鼠進(jìn)行MLR測(cè)定。評(píng)價(jià)來(lái)自3組的每組8只動(dòng)物無(wú)治療(A組)；僅支架(B組)；支架+異體移植細(xì)胞(D組)(表5),通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)反應(yīng)者細(xì)胞設(shè)定測(cè)定，所述的培養(yǎng)基含有照射的(5000R)同源Fischer脾刺激細(xì)胞或含有照射的異體移植ACI脾刺激細(xì)胞。作為對(duì)培養(yǎng)基或?qū)ν雌⒓?xì)胞的反應(yīng)的T細(xì)胞增殖代表了本底響應(yīng)；一般從對(duì)異體移植細(xì)胞的反應(yīng)中扣除同源反應(yīng)，以便評(píng)價(jià)真實(shí)的增殖.作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，使用照射的異體移植ACI(陽(yáng)性)和同源Fischer(陰性)淋巴細(xì)胞設(shè)定測(cè)定；它們的異體移植與同源HLA1和2抗原的表達(dá)確保了反應(yīng)者Fischer衍生的淋巴細(xì)胞的強(qiáng)勁增殖反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)。使用每次處理一式三份孔的96孔平板進(jìn)行MLR測(cè)定。以4x105個(gè)細(xì)胞/孔將反應(yīng)者細(xì)胞鋪板并且將脾細(xì)胞刺激物以1x105個(gè)細(xì)胞/孔鋪板。所用的培養(yǎng)基為補(bǔ)充了非必需氨基酸，丙酮酸鈉，2-巰基乙醇和抗生素/抗霉菌劑的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基+10%FBS(Hyclone)。制備復(fù)制式培養(yǎng)平板用于在培養(yǎng)的第3和第7天采集。在第2或第6天用3H-胸苷(luCi/孔)脈沖培養(yǎng)物，并且在隨后的約1小時(shí)采集細(xì)胞用于閃爍計(jì)數(shù)。將結(jié)果報(bào)導(dǎo)為每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)，它們反映出培養(yǎng)孔中T細(xì)胞增殖的程度。表5:單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在不希望受到任何特定的理論約束的情況下，據(jù)信同種異體ADAS細(xì)胞成功用于脊柱融合術(shù)，只要獲得下列結(jié)果在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)A組(無(wú)治療)中有最少的融合證據(jù)(90%的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為0，無(wú)異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有10個(gè)切片中小于5°/的手術(shù)部位面積被骨基質(zhì)占據(jù))；在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)在B和D組中檢測(cè)所有動(dòng)物組織學(xué)分析中的HA/TCP支架；在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)B組(單獨(dú)的HA/TCP)中有最少的融合證據(jù)(90°/。的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為0，無(wú)異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有IO個(gè)切片中小于5%的手術(shù)部位面積被骨基質(zhì)占據(jù))；在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)B組(單獨(dú)的HA/TCP)中有最少的融合證據(jù)(90%的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為0，無(wú)異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有IO個(gè)切片中小于5%的手術(shù)部位面積被骨基質(zhì)占據(jù))；基于組織學(xué)分析時(shí)的P-半乳糖苷酶活性或免疫檢測(cè)的手術(shù)后檢測(cè)D組中植入的ADAS細(xì)胞6周；在6和12周時(shí)間點(diǎn)時(shí)，優(yōu)于單獨(dú)的支架(B組)或空白損害(A組)對(duì)照組的在有ADAS細(xì)胞(D組)存在下的脊柱融合術(shù)(90%的動(dòng)物中的人工控制融合評(píng)分為"1"，在手術(shù)部位上有異位骨X線照片影像且基于組織學(xué)和CT分析每個(gè)樣本有10個(gè)切片中大于30%的HA/TCP植入物面積被骨基質(zhì)占據(jù))；C和D組(ADAS細(xì)胞植入物)中的抗-ADAS抗體水平低于A和B組(無(wú)細(xì)胞處理)1.5倍的增加；和在比較A，B和D組時(shí)，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中與單獨(dú)的培養(yǎng)基或同源衍生的脾細(xì)胞相比，不存在由同種異體衍生的脾細(xì)胞刺細(xì)胞增殖增強(qiáng)的證據(jù)。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照展示出至少10，000cpm的增殖反應(yīng)。實(shí)施例7:比較和對(duì)比脊柱融合模型中同源和同種異體ADAS細(xì)胞的相對(duì)有效性本文提供的披露內(nèi)容提供了能夠測(cè)定異體移植(HLA錯(cuò)配)和同源(HLA相容性)ADAS細(xì)胞是否在實(shí)現(xiàn)脊柱融合中展示出等效功能的數(shù)據(jù)。將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概括在表6中。由于不希望受到任何特定的理論約束，所以認(rèn)為基于實(shí)驗(yàn)同種異體MSC在狗中實(shí)現(xiàn)成功修復(fù)臨界大小的骨缺陷的預(yù)先研究認(rèn)為兩種細(xì)胞群為等效的(Arinzeh等，2003，J.BoneJointSurg.Am.85-A:1927-35)。同源和同種異體ADAS細(xì)JI包的比較提供了顯著的醫(yī)學(xué)和商業(yè)內(nèi)含。本文披露的公開(kāi)內(nèi)容提供了ADAS細(xì)胞在組織再生療法中的應(yīng)用，表6:使用同種異體與同源ADAS細(xì)胞的脊柱融合術(shù)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在不希望受到任何特定的理論約束的情況下，據(jù)信同種異體ADAS細(xì)胞與同源ADAS細(xì)胞在成功用于脊柱融合術(shù)方面相差無(wú)幾，只要表6中的所有參數(shù)不表現(xiàn)出在同種異體與同源ADAS細(xì)胞組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p>0.05，優(yōu)選p>0.30)。將本文引述的每一和每篇專利，專利申請(qǐng)和公開(kāi)文獻(xiàn)披露的內(nèi)容完整地引入本文作為參考。盡管已經(jīng)參照具體實(shí)施方案披露了本發(fā)明，但是顯而易見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明確切精神和范圍的情況下設(shè)計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施方案和變化形式。所附的權(quán)利要求旨在包括所有這類實(shí)施方案和等價(jià)變化形式。權(quán)利要求1.促進(jìn)哺乳動(dòng)物脊柱融合術(shù)后骨融合的方法，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物的脊柱給予分離的脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，其中所述的ADAS細(xì)胞在體內(nèi)分化成表達(dá)至少一種骨細(xì)胞特征的細(xì)胞。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中在將所述細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物前將所述的ADAS細(xì)胞在體外培養(yǎng)一段時(shí)間而不被誘導(dǎo)分化。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞就所述的哺乳動(dòng)物而言為同種異體的。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)推體間脊柱融合術(shù)的骨形成。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)橫突間脊柱融合術(shù)的骨形成。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞進(jìn)一步包含生物相容性基質(zhì)。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的生物相容性基質(zhì)選自藻酸4丐、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素A、硫酸皮膚素和骨基質(zhì)明膠。8.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞為遺傳修飾的。9.權(quán)利要求1所迷的方法，其中所迷的ADAS細(xì)胞給予入哺乳動(dòng)物脊柱的一個(gè)或多個(gè)推體間空間。10.權(quán)利要求l所述的方法，其中脊柱融合術(shù)在脊柱區(qū)段中進(jìn)行，所述的脊柱區(qū)段選自頸段、胸段、腰段、腰骶和骶髂(SI)關(guān)節(jié)。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)一種途徑將所述的ADAS細(xì)胞給予入一個(gè)或多個(gè)推體間空間，所述的途徑選自后部途徑、后外側(cè)途徑、前部途徑、前外側(cè)途徑和外側(cè)途徑。12.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。13.對(duì)哺乳動(dòng)物實(shí)施一種或多種脊柱融合術(shù)的方法，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物的脊柱給予分離的脂肪組織衍生的成體基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞，以便有利于單或多個(gè)水平的脊柱融合術(shù)。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞在體內(nèi)分化成表達(dá)至少一種骨細(xì)胞特征的細(xì)胞。15.權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述的ADAS細(xì)胞在體外培養(yǎng)一段時(shí)間，在將所述細(xì)胞給予所述的哺乳動(dòng)物前不會(huì)被誘導(dǎo)分化。16.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞就哺乳動(dòng)物而言為同種異體的。17.權(quán)利要求13所述的方法，其中ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)推體間脊柱融合術(shù)的骨形成。18.權(quán)利要求13所述的方法，其中ADAS細(xì)胞誘導(dǎo)橫突間脊柱融合術(shù)的骨形成。19.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞進(jìn)一步包含生物相容性基質(zhì)。20.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的生物相容性基質(zhì)選自藻酸鉤、瓊脂糖、纖維蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖、透明席酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素A、硫酸皮膚素和骨基質(zhì)明膠。21.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的ADAS細(xì)胞為遺傳修飾的。22.權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述的ADAS細(xì)胞給予入所述哺乳動(dòng)物脊柱的一個(gè)或多個(gè)推體間空間。23.權(quán)利要求13所述的方法，其中脊柱融合術(shù)在脊柱區(qū)段中進(jìn)行，所述的脊柱區(qū)段選自頸段、胸段、腰段、腰骶和SI關(guān)節(jié)。24.權(quán)利要求13所述的方法，其中通過(guò)一種途徑將所述的ADAS細(xì)胞給予入一個(gè)或多個(gè)推體間空間，所述的途徑選自后部途徑、后外側(cè)途徑、前部途徑、前外側(cè)途徑和外側(cè)途徑。25.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。全文摘要本發(fā)明包括用于治療骨病的方法和組合物。本發(fā)明分離的脂肪組織衍生的基質(zhì)細(xì)胞及其相關(guān)產(chǎn)品具有多種應(yīng)用，包括，但不限于研究，診斷和治療應(yīng)用，諸如在脊柱融合術(shù)中。文檔編號(hào)A61F2/44GK101500514SQ200680036606公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2006年7月26日優(yōu)先權(quán)日2005年8月1日發(fā)明者J·M·金布利,M·洛佩斯申請(qǐng)人:路易斯安那州州立大學(xué)及農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)院管理委員會(huì)