本發(fā)明屬于多肽合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過片段法合成艾塞那肽的方法。

背景技術(shù)：

艾塞那肽是一種含有39個(gè)氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為：H₂N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂，是GLP-1的類似物，能夠刺激胰島β細(xì)胞再生，促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通過減少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖濃度，從而改善血糖控制。

艾塞那肽的制備方法目前主要采用傳統(tǒng)經(jīng)典的固相多肽合成法，此法合成效率低、純化成本高。

因此，開發(fā)一種高效率低成本合成艾塞那肽的方法成為本領(lǐng)域急需解決的技術(shù)問題。

張騰在《精細(xì)化工》，2014年10月公開艾塞那肽的合成，該合成方法將艾塞那肽分成六個(gè)片段進(jìn)行固相合成法，該方法中使用了傳統(tǒng)的多肽合成碳端酰胺化，所用氨基酸都為全保護(hù)氨基酸，價(jià)格較貴，并在片段合成時(shí)使用了價(jià)格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的方案，成本較高。本方案盡可能降低成本較高的全保護(hù)氨基酸的使用，提高價(jià)格低廉的游離氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種合成艾塞那肽的方法，其提高了合成效率，減少了雜質(zhì)累積，降低了純化難度，為有效解決艾塞那肽合成規(guī)?；档图兓y度，提高產(chǎn)品純度。

具體來說，本發(fā)明公開了一種固液聯(lián)合法合成艾塞那肽的方法，以N-C延伸策略，將艾塞那肽的39個(gè)氨基酸分成13個(gè)小片段，先用液相法分別合成12個(gè)N端Fmoc保護(hù)小片段肽，用固相法合成第13個(gè)肽樹脂片段，然后用固相法將12個(gè)小片段依次連接到第13個(gè)肽樹脂片段上，得到艾塞那肽樹脂，然后進(jìn)行切割，得到艾塞那肽粗品，粗品經(jīng)純化后得到艾塞那肽產(chǎn)品。

更具體來說，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過如下的13個(gè)片段的保護(hù)片段進(jìn)行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法通過如下的13個(gè)片段進(jìn)行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法包括如下步驟：

(1)通過液相合成片段1-12，通過固相合成片段13；以及

(2)組裝連接得到產(chǎn)品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是將片段的羧基端通過N-羥基丁二酰亞胺活化后連接氨基酸而延長氨基酸鏈。

其中，所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH、有機(jī)溶劑和N-羥基丁二酰亞胺混合至溶解，之后加入溶解在有機(jī)溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)，固液分離得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機(jī)溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉混合水溶液加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機(jī)溶液中進(jìn)行反應(yīng)，之后對反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，調(diào)節(jié)pH值至2～3，萃取分離得到有機(jī)相，經(jīng)濃縮得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

所述片段2-12的合成方法如下：選擇相應(yīng)的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

中所述步驟(1)所述有機(jī)溶劑為1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃；優(yōu)選所述Fmoc-His(Trt)-OH與有機(jī)溶劑是按質(zhì)量-體積比為1g：(5～10)mL混合。

其中步驟(1)所述在有機(jī)溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺是二環(huán)己基碳二亞胺與有機(jī)溶劑按質(zhì)量-體積比為1g：(2～3)mL的混合溶液.

其中步驟(1)Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)；步驟(1)和步驟(2)所述反應(yīng)條件為室溫反應(yīng)2～3小時(shí)。

其中步驟(2)所述萃取步驟的萃取劑是乙酸乙酯；優(yōu)選萃取的步驟是用乙酸有機(jī)乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、過濾得到有機(jī)相；甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1；

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步驟:

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶脹后脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；以及

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步驟(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步驟(2)的方法依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

步驟(1)所述溶脹是用N,N-二甲基甲酰胺溶脹；優(yōu)選所述各個(gè)步驟脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；更優(yōu)選所述反應(yīng)的條件是在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～2小時(shí)

其中所述組裝連接得到產(chǎn)品包括如下步驟：

(1)將片段13脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)按照步驟(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)將步驟(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc兩次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)按照步驟(3)的方法在步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脫Fmoc兩次得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中切割，經(jīng)分離得到艾塞那肽粗品，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產(chǎn)品。

其中步驟(4)所述切割液是質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液；所述連接的12個(gè)片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1。

所述1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺各個(gè)物質(zhì)與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

一種所述制備方法制備得到艾塞那肽，其純度大于98％。

再具體來說，本發(fā)明提供一種固液聯(lián)合法合成艾塞那肽的方法，其由下述步驟組成：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

①合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫?cái)嚢?，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應(yīng)2～3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

②合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟①得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18～20小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

①合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

將Fmoc-Glu(otBu)-OH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫?cái)嚢?，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應(yīng)2～3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

②合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟①得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-Glu(otBu)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18～20小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH；

③合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

將Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫?cái)嚢?，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應(yīng)2～3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

④合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

將蘇氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟③得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，蘇氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18～20小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

(3)合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Phe--Thr-S er-COOH；

(4)合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-S er-COOH；

(5)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步驟(1)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟(1)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH；

(6)合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-Gl u-COOH；

(7)合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH；

(8)合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pb f)-Leu-Phe-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH；

(9)合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH；

(10)合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH；

(11)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH；

(12)合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH；

(13)合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

①合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～2小時(shí)，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

②合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～2小時(shí)，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；

③合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟②的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBH A Resin；

(14)合成艾塞那肽

①組裝連接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin

將步驟(13)得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Re sin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、步驟(12)得到的Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～2小時(shí)，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr o-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

②組裝連接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟①的組裝連接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、F moc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(p bf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-L ys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Am ide MBHA Resin；

③組裝連接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為0.5～1:1～2:1的混合液、Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～3小時(shí)，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin；

④組裝連接艾塞那肽

按照步驟③的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Gl u(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Met-Glu-Glu-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫?cái)嚢?～3小時(shí)，過濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽；

上述12個(gè)片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

本發(fā)明有益效果如下：

1.本發(fā)明提高了合成效率，減少了雜質(zhì)累積，降低了純化難度，為有效解決艾塞那肽合成規(guī)?；?，降低純化難度，提高產(chǎn)品純度，提供了一種新方法。

2.本發(fā)明盡可能降低成本較高的全保護(hù)氨基酸原料的使用，提高價(jià)格低廉的游離氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

3.本發(fā)明最大限度的減少了價(jià)格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink A mide-MBHA Resin等氨基樹脂的使用，降低了合成成本。

4.本發(fā)明片段合成時(shí)，采用液相法合成，縮合時(shí)采用固相法進(jìn)行片段對接，兼顧了液相規(guī)?；⒊杀镜偷葍?yōu)點(diǎn)及固相法步驟簡單、效率高的優(yōu)點(diǎn)，大幅的降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1合成的艾塞那肽的質(zhì)譜圖。

圖2是實(shí)施例1合成的艾塞那肽的液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

下面對說明書中的簡寫進(jìn)行說明：

Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其名稱是4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺樹脂

Fmoc：芴甲氧羰基

pbf、tbu、Otbu、Trt、Boc都是保護(hù)基，名稱分別是2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；⑹宥』?、叔丁氧基、三苯甲基、叔丁氧羰基。

本發(fā)明所述“全保護(hù)片段”是指對氨基酸中影響合成的基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)后得到具有保護(hù)基的片段。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過如下的13個(gè)片段的保護(hù)片段進(jìn)行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

在一種具體實(shí)施方式中，所述方法通過如下的13個(gè)片段進(jìn)行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

這是發(fā)明人對該序列分析并結(jié)合各個(gè)氨基酸的性質(zhì)，同時(shí)考慮到合成的成本，在各個(gè)因素之間進(jìn)行選擇和實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，及對39個(gè)氨基酸的位置進(jìn)行拆分為如上所述的13個(gè)片段。上述選擇是發(fā)明人創(chuàng)造性勞動的結(jié)果，其控制了不利因素，有效降低成本。

上述序列中各個(gè)氨基酸選擇的保護(hù)基可以是任意保護(hù)基，只要能夠達(dá)到所希望的可以保護(hù)的技術(shù)效果即可，但發(fā)明人經(jīng)過優(yōu)選上述取代基效果最好。選擇所述氮端和碳端是兼顧氨基酸作為碳端和氮端的反應(yīng)活性以利于片段的組裝反應(yīng)，同時(shí)兼顧斷點(diǎn)的選擇以平衡全保護(hù)片段的長度、溶解性、數(shù)量，這樣可以有效減少合成步驟、提高效率、降低成本，減少組裝完成后的處理步驟。

在一種具體實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)通過液相合成片段1-12，通過固相合成片段13；以及

(2)組裝連接得到產(chǎn)品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是將片段的羧基端通過N-羥基丁二酰亞胺活化后連接氨基酸而延長氨基酸鏈。

所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH、有機(jī)溶劑和N-羥基丁二酰亞胺混合至溶解，之后加入溶解在有機(jī)溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)，固液分離得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機(jī)溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉混合水溶液加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機(jī)溶液中進(jìn)行反應(yīng)，之后對反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，調(diào)節(jié)pH值至2～3，萃取分離得到有機(jī)相，經(jīng)濃縮得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

該方法在合成片段結(jié)構(gòu)時(shí)，使用了N-羥基丁二酰亞胺進(jìn)行羧基的活化，可有效防止氨基酸縮合過程中旋光性改變，而使用二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行縮合，反應(yīng)生成二環(huán)己基脲，該物質(zhì)在一般有機(jī)溶劑中的溶解度都比較小，僅需經(jīng)過簡單的過濾就可除去，另，F(xiàn)moc-His(Trt)-COOSu合成反應(yīng)后，過量的二環(huán)己基碳二亞胺在水中即反應(yīng)生成二環(huán)己基脲，不會影響與甘氨酸的縮合反應(yīng)。

所述片段2-12的合成方法如下：選擇相應(yīng)的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

其中，所述步驟(1)所述有機(jī)溶劑為1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃；優(yōu)選所述Fmoc-His(Trt)-OH與有機(jī)溶劑是按質(zhì)量-體積比為1g：(5～10)mL混合。

其中，步驟(1)所述在有機(jī)溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺是二環(huán)己基碳二亞胺與有機(jī)溶劑按質(zhì)量-體積比為1g：(2～3)mL的混合溶液。

其中，步驟(1)Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)；步驟(1)和步驟(2)所述反應(yīng)條件為室溫反應(yīng)2～3小時(shí)。

其中，步驟(2)所述萃取步驟的萃取劑是乙酸乙酯；優(yōu)選萃取的步驟是用乙酸有機(jī)乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、過濾得到有機(jī)相；甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1。

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶脹后脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA R esin；該步驟中使用的原料是Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其是由MB HA Resin連接Fmoc保護(hù)修飾的Rink Amide Linker構(gòu)成。本發(fā)明使用的是取代度為0.34mmol/g，但其他取代度的也可以達(dá)到相同或類似的技術(shù)效果，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明使用的取代度0.34mmol/g是從合成片段的產(chǎn)率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MB HA Resin；

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步驟(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步驟(2)的方法依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

步驟(1)所述溶脹是用N,N-二甲基甲酰胺溶脹；優(yōu)選所述各個(gè)步驟脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；更優(yōu)選所述反應(yīng)的條件是在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?～2小時(shí)

其中所述組裝連接得到產(chǎn)品包括如下步驟：

(1)將片段13脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin；

(2)按照步驟(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)將步驟(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin脫Fmoc兩次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進(jìn)行反應(yīng)得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ri nk Amide MBHA Resin；

(4)按照步驟(3)的方法在步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(t Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脫Fmoc兩次得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中切割，經(jīng)分離得到艾塞那肽粗品，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產(chǎn)品。

其中步驟(4)所述切割液是質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液；所述連接的12個(gè)片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1。

所述1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺各個(gè)物質(zhì)與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

該步驟中各個(gè)物質(zhì)的投料量均是以Fmoc-Rink Amide MBHA Resin作為參比，通過這種控制有助于對投料量的有效控制，保證原料的完全反應(yīng)，從而達(dá)成保持產(chǎn)品品質(zhì)，同時(shí)控制成本的目的。該比例保證了合成的成本最低化，同時(shí)純度和工藝達(dá)到要求。在制備過程中各個(gè)物質(zhì)之間的比例可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，獲得的產(chǎn)品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個(gè)物質(zhì)之間的比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明還提供了所述制備方法制備得到艾塞那肽，其純度大于98％

實(shí)施例

下面對實(shí)施例中使用的各個(gè)物質(zhì)的來源進(jìn)行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領(lǐng)域常規(guī)使用儀器和原料，只要其能滿足實(shí)驗(yàn)需要即可。

本發(fā)明的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的取代度為0.34mmol/g，2-c hlorotrityl chloride resin的取代度為1.74mmol/g，均由天津南開和成科技有限公司生產(chǎn)。

固相多肽合成反應(yīng)器為通用的多肽合成反應(yīng)器，可以購自成都斯諾進(jìn)出口貿(mào)易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L2000。

制備型高效液相色譜儀為創(chuàng)新恒通LC3000，C18分析色譜柱為大連物理化學(xué)研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質(zhì)譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷等其它試劑均為國產(chǎn)AR或CP。

實(shí)施例1

1、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將30.99gFmoc-His(Trt)-OH與300ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢?，加?.33gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)按質(zhì)量-體積比為11.35g：23mL的混合溶液，室溫反應(yīng),3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液滴加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到27.07gFmoc-His(Trt)-Gly-COOH。

反應(yīng)中Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1。

2、合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

(1)合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

將21.28gFmoc-Glu(otBu)-OH與200ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢瑁尤?.33gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質(zhì)量-體積比為11.35g：23mL的混合溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

將4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液滴加到步驟(1)得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到22.20gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH。

反應(yīng)中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1。

(3)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

將19.30gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH與190ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢?，加?.06gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)按質(zhì)量-體積比為9.08g：20mL的混合溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(4)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

將5.24g蘇氨酸和3.70g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20小時(shí)，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到21.01gFmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

反應(yīng)中Fmoc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1

3、合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成21.87gFmoc-Phe-Thr-Ser-COOH。

4、合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成22.51gFmoc-As p-Leu-Ser-COOH。

5、合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步驟1中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟1中(2)的合成方法合成21.48gFmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH。

6、合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成23.68gFmoc-Met-Glu-Glu-COOH。

7、合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成21.92gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH。

8、合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-A rg(pbf)-Leu-Phe-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成34.75gFmoc-Ar g(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH。

9、合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成26.38gFmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH。

10、合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成23.81gFmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH。

11、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Gly-Pro-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成18.29gFmoc-Gly-Pro-Ser-COOH。

12、合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成19.23gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH。

13、合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將30gFmoc-Rink Amide MBHA Resin(取代度0.34mmol/g)用300ml N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應(yīng)20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、7.82gFmoc-Ser(tBu)-OH、2.76g1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?小時(shí)，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應(yīng)20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、6.88gFmoc-Pro-OH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?小時(shí)，得到F moc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟(2)的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接F moc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。Fmoc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護(hù)氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:2:2:2:2。

14、合成艾塞那肽

(1)組裝連接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

將步驟13得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應(yīng)20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入300ml N,N-二甲基甲酰胺、10.43gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?小時(shí)，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

(2)組裝連接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MB HA Resin

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

(3)組裝連接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液400ml脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液400ml、12.15gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢?小時(shí)，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Le u-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)組裝連接艾塞那肽

按照步驟(3)的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-C OOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫?cái)嚢?小時(shí)，過濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽14.13g，收率33.1％；

所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：2:2:2:2:1。

采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果見圖1，由圖可見，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產(chǎn)物為艾塞那肽。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進(jìn)行純度測定，液相色譜圖見圖2，由圖2可見，艾塞那肽的純度大于98％。

實(shí)施例2

本實(shí)施例步驟1中，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

本實(shí)施例步驟2中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟3中，F(xiàn)moc-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Phe-Thr-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟4中，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟5中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟6中，F(xiàn)moc-Met-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Met-Glu-C OOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟7中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、纈氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟8中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Arg(pb f)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、苯丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、異亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟9中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、色氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟10中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、天冬酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-L ys(Boc)-Asn-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟11中，F(xiàn)moc-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、脯氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Gly-Pro-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟12中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Ser(tB u)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟13中，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護(hù)氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:2:3:3:3，該步驟的其它與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟14中，所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：3:3:3:3:1，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。得到14.01g艾塞那肽，收率32.8％。采用實(shí)施例1相同的條件對產(chǎn)品采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進(jìn)行純度測定，純度大于98％。

實(shí)施例3

本實(shí)施例步驟1中，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

本實(shí)施例步驟2中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟3中，F(xiàn)moc-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Phe-Thr-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟4中，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟5中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟6中，F(xiàn)moc-Met-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Met-Glu-C OOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟7中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、纈氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟8中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Arg(pb f)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、苯丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、異亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟9中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、色氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟10中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、天冬酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-L ys(Boc)-Asn-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟11中，F(xiàn)moc-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、脯氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Gly-Pro-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟12中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Ser(tB u)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟13中，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護(hù)氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:3:4:4:4，該步驟的其它與實(shí)施例1相同。

該實(shí)施例步驟14中，所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：4:4:4:4:1，該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。得到13.20g艾塞那肽，收率30.9％。采用實(shí)施例1相同的條件對產(chǎn)品采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進(jìn)行純度測定，純度大于98％。