本發(fā)明涉及生物工程領域，具體涉及一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法。
背景技術：
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一個全球性的公共健康問題，其患病人數(shù)已從1980年的1億左右增長到今天的近5億，而中國的DM發(fā)病率還要明顯高于世界的平均水平。各種原因引起的胰島β細胞受損胰島素合成分泌減少，或胰島素的信號通路障礙，導致了葡萄糖的儲存和利用減少，血糖水平持續(xù)升高并出現(xiàn)尿糖，這是DM發(fā)生的主要原因。包括葡萄糖和果糖在內(nèi)的一系列還原糖在代謝過程中會產(chǎn)生大量高活性的二羰基化合物，如丙酮醛(methylglyoxal,MGO)。這些化合物常與生物大分子(如蛋白質、核酸等)結合，形成糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)，損害組織器官的功能狀態(tài)。這種效應也是體內(nèi)“高血糖記憶”的主要原因，即血糖含量雖已經(jīng)控制在正常水平，但是DM引起的損傷可在一段相當長的時間存在。目前，在DM的建模方面，主要采用以下方法：①用高糖和/或高脂飼養(yǎng)動物模擬人的2型DM發(fā)病過程，②將瘦素基因進行純合突變獲得ob/ob的2型DM小鼠，③篩選自發(fā)性瘦素受體突變的小鼠可得到db/db的2型DM小鼠，④用化學藥物(如鏈脲佐菌素，四氧嘧啶等)選擇性地損害實驗動物的胰島β細胞從而造成1型DM模型，⑤用高糖、MGO或AGEs處理細胞可以制備DM的細胞模型。對于建模方法⑤，使用AGEs要比高糖和MGO更能模擬DM的真實過程，研究結果也更具說服力。對于AGEs，傳統(tǒng)方式采用葡萄糖或果糖和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)反應制備，然而，這種方法周期較長，制備率較低，往往導致實驗結果不穩(wěn)定。
AGEs是建立2型DM體外細胞模型和整體動物實驗模型的關鍵試劑，然而，市面上提供AGEs的商業(yè)化試劑公司較少。另外，個別提供AGEs的試劑公司對其要價極高，如BioVision公司提供的AGEs(No.2221-10)每10mg售價295美元。如此高的價格在某種程度上限制了它的廣泛應用。
技術實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供AGEs的一種簡易制備方法，該方法用相對較便宜的動物血清蛋白和丙酮醛作為原料，生產(chǎn)出含量高，質量穩(wěn)定的AGEs，顯著的降低了AGEs的價格。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為50-70g/L，獲得動物血清蛋白溶液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；丙酮醛-動物血清蛋白反應液中丙酮醛的濃度為0.6-10mM；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣并攪拌混勻一次，反應時間為3-7天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行純化，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
優(yōu)選地，步驟3)所述對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行純化具體為采用透析袋對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析，去除游離的丙酮醛。
優(yōu)選地，還包括步驟4)，具體為對透析后的糖基化終末產(chǎn)物溶液進行含量測定。
優(yōu)選地，步驟4)所述含量測定的方法為對比糖基化終末產(chǎn)物溶液與動物血清蛋白溶液的顏色差異；若與動物血清蛋白溶液相比，糖基化終末產(chǎn)物溶液顏色變?yōu)樽厣珓t表明生成了糖基化終末產(chǎn)物，顏色越深則表明糖基化終末產(chǎn)物含量越高。
優(yōu)選地，步驟4)所述含量測定的方法為：對糖基化終末產(chǎn)物溶液與動物血清蛋白溶液的顏色分別進行灰度分析，利用假設檢驗獲得P值，當P值小于0.05表明已生成糖基化終末產(chǎn)物。
優(yōu)選地，步驟4)所述含量測定的方法為：采用熒光酶標儀對糖基化終末產(chǎn)物溶液進行含量檢測，檢測所用激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長465nm。
優(yōu)選地，步驟1)所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液。
優(yōu)選地，步驟1)所述的動物血清蛋白為牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白中的一種。
優(yōu)選地，一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為50-70g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為10mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物；
4)采用熒光酶標儀對糖基化終末產(chǎn)物溶液進行含量檢測，檢測所用激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長465nm。
相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
1.本發(fā)明采用相對較便宜的動物血清蛋白和丙酮醛作為原料，生產(chǎn)出含量高，質量穩(wěn)定的AGEs，顯著的降低了AGEs的價格。
2.本發(fā)明通過采用動物血清蛋白和丙酮醛作為原料，制備AGEs，該方法操作簡單，不需采用大型昂貴精密儀器，容易實現(xiàn)，具有易于操作、應用范圍廣的優(yōu)點。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的定性定量檢測圖。
其中圖1包括A部分、B部分、C部分。
具體實施方式
下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：
實施例1：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為0.6mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
實施例2：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為1.2mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
實施例3：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為2.5mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
實施例4：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為5mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
實施例5：
一種糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)向所獲得的動物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的濃度為10mM，獲得丙酮醛-動物血清蛋白反應液；
3)將丙酮醛-動物血清蛋白反應液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使丙酮醛-動物血清蛋白反應液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對丙酮醛-動物血清蛋白反應液進行透析除去游離的丙酮醛，獲得糖基化終末產(chǎn)物。
對照組實施例
糖基化終末產(chǎn)物的簡易制備方法的對照組，包括如下步驟：
1)配制磷酸鹽緩沖液，將動物血清蛋白加入到所配制的磷酸鹽緩沖液中至濃度為60g/L，獲得動物血清蛋白溶液；所述動物血清蛋白為牛血清白蛋白；所述配制磷酸鹽緩沖液具體為：分別稱取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，調節(jié)pH至7.4，過濾除菌獲得磷酸鹽緩沖液；
2)與實施例1-5的區(qū)別在于本步驟不向動物血清蛋白溶液中添加丙酮醛；
3)將動物血清蛋白溶液裝入容器中，放置在37℃環(huán)境中，每12h打開容器使動物血清蛋白溶液接觸空氣，并攪拌混勻一次，反應時間為3天；反應后，對動物血清蛋白反應液進行透析，獲得對照組溶液。
檢測AGEs實施例
對實施例1-5所獲得的AGEs溶液和對照組實施例所獲得的對照組溶液分別采用如下方法進行AGEs檢測：
方法一：對比糖基化終末產(chǎn)物溶液(實施例1-5)與動物血清蛋白溶液(對照組)的顏色差異；若與動物血清蛋白溶液相比，糖基化終末產(chǎn)物溶液顏色變?yōu)樽厣珓t表明生成了糖基化終末產(chǎn)物，顏色越深則表明糖基化終末產(chǎn)物含量越高。結果如圖1的A部分所示，具體為從左往右的EP管代表對照組、實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、實施例5。
方法二：對糖基化終末產(chǎn)物溶液(實施例1-5)與動物血清蛋白溶液(對照組)分別進行灰度分析，利用假設檢驗檢測每個實施例是否與對照組有顯著差異，獲得P值，當P值小于0.05表明已生成糖基化終末產(chǎn)物。結果如圖1的B部分所示，具體為從左往右的每根柱子代表對照組、實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、實施例5。
方法三：采用熒光酶標儀對糖基化終末產(chǎn)物溶液的平均熒光強度(MFI)進行檢測，檢測所用激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長465nm。結果如圖1的C部分所示，具體為從左往右的每根柱子代表對照組、實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、實施例5、MGO溶液。
在圖1的B部分和圖1的C部分中，*表明*為P<0.05vs對照組,**為P<0.01vs對照組。在本發(fā)明圖1的A部分顯示，隨著MGO在溶液中的濃度不斷增加，棕色的顏色不斷加深。進一步的灰度分析半定量結果顯示(圖1的B部分)，2.5mM,5mM,10mM MGO組與單獨BSA組比較差異具有統(tǒng)計學意義,P值分別小于0.05,0.01,0.01，具有劑量依賴關系。進一步應用更為靈敏的熒光法(激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長465nm)進行檢測AGEs的平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)，結果如圖1的C部分顯示，在0.6mM～10mM的濃度范圍內(nèi)，MGO也可使反應液的MFI明顯增加(P均<0.01)。另外，10mM MGO本身并未產(chǎn)生明顯的熒光，提示反應體系中熒光信號的增加是因為生成了AGEs的緣故。值得注意的是，5mM MGO基本達到最大的MFI，提示BSA結合MGO可能趨向于達到飽和。以上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明采用用BSA和MGO共同孵育的方法能夠制備出AGEs；提供了一種成本低廉、操作簡單的AGEs制備方法。
對于本領域的技術人員來說，可根據(jù)以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變或修正，而所有的這些改變或修正都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內(nèi)。