一種用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑。該試劑由檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種，或多種的試劑組成。檢測腦梗死患者靜脈血中的脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體的含量，從而早期判斷患者是否可能發(fā)生微出血，為早期干預(yù)提供了依據(jù)。
【專利說明】—種用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]腦微出血是腦內(nèi)微小血管病變所致的以微小量出血為主要特點(diǎn)的腦實(shí)質(zhì)亞臨床損害。在梯度回波T2加權(quán)成像上，微出血表現(xiàn)為一個或多個斑點(diǎn)狀信號缺失灶，直徑2-5mm，周圍無水腫。組織病理學(xué)證實(shí)，信號缺失主要是因纖維透明樣變性的微動脈血液微量外滲，導(dǎo)致含鐵血紅素的沉積所致。研究表明腦微出血與年齡、心血管危險因素、腦白質(zhì)變性、腦卒中、腦淀粉樣血管病變、認(rèn)知功能障礙、卒中后情感障礙有一定關(guān)系，腦微出血與缺血性卒中、腦出血和溶栓或抗栓治療后癥狀性腦出血關(guān)系密切。
[0003]早期的前瞻性研究提示腦微出血有可能增加急性腦梗死溶栓后出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險。而最近一些研究則顯示腦微出血與溶栓后出血轉(zhuǎn)化并不存在相關(guān)性。Kim等對急性腦梗死患者在發(fā)病3小時內(nèi)行靜脈tPA溶栓或發(fā)病6小時內(nèi)行動脈尿激酶溶栓治療，研究顯示腦微出血的數(shù)目并不是超急性期腦梗死溶栓后出血轉(zhuǎn)化的獨(dú)立危險因素。但該試驗(yàn)中腦微出血數(shù)目大于10的患者僅為5例，可能對結(jié)果有影響。Fiehler等對570例發(fā)病6小時內(nèi)給予靜脈溶栓治療的患者的研究顯示，86例患者在溶栓前基線期發(fā)現(xiàn)有腦微出血，其中6例患者的腦微出血數(shù)目大于5個。該86例患者中有5例(5.8%)發(fā)生出血轉(zhuǎn)化，無腦微出血的患者中有13例(2.7%)出現(xiàn)出血轉(zhuǎn)化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該研究指出，與既往文獻(xiàn)報道的溶栓治療的獲益率(?10%)相比，即使腦微出血的患者發(fā)生出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險輕微升高，也不可能超過溶栓帶來的益處；同時由于具有多個腦微出血的患者人數(shù)較少，腦微出血的數(shù)目與出血轉(zhuǎn)化的關(guān)系尚有待進(jìn)一步證實(shí)。該研究是目前最大的多中心合作的回顧性研究，但該研究在腦微出血評估、統(tǒng)計學(xué)方法的選擇及統(tǒng)計效力、對不同部位的腦微出血的潛在作用的評價等方面仍存在不足，其結(jié)論尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。對于腦卒中后的抗栓治療，目前的研究顯示腦微出血可能與抗栓治療后的出血轉(zhuǎn)化有關(guān)，但其風(fēng)險-獲益比值目前尚不明確。在此基礎(chǔ)上，微出血的存在可以對缺血性卒中患者選擇使用祛聚、抗凝及溶栓藥物提供指導(dǎo)。
[0004]脂聯(lián)素(adiponectin)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽。大量存在于血液循環(huán)中。脂聯(lián)素又被稱作ACrp30、apMl、AdipOQ、GBP28。脂聯(lián)素能夠影響脂肪和糖類的代謝、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎，在腦血管病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的神經(jīng)和血管保護(hù)作用。
[0005]E-選擇素(E-selectin)是選擇素家族的一員，是一類Ca2+依賴的細(xì)胞粘著分子，能與特異糖基識別并結(jié)合。主要參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識別與粘著。E-選擇素存在于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，又稱內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1。微出血的發(fā)生可能與血管內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致血腦屏障(BBB)的通透性增高有關(guān)，一旦內(nèi)皮損傷就會導(dǎo)致BBB通透性增力口，血液成分外滲，出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，E-選擇素隨著激活的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加而表達(dá)量增高。
[0006]S100B是SlOO蛋白家族的一員，為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性的蛋白，主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是那些包裹血管內(nèi)皮細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時，SlOOB從損傷細(xì)胞釋放至血管外間隙，通過BBB進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中的S100B蛋白水平增高。
[0007]可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體(sRAGE)是晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的可溶性成分。RAGE是晚期糖基化終產(chǎn)物的信號傳導(dǎo)受體，是細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族中的一種多配體受體，在許多細(xì)胞中表達(dá)。其無糖化的內(nèi)源性配體包括促炎分子S100B、HMGB-U淀粉樣蛋白多肽和b2整合蛋白巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體-1等。sRAGE與RAGE有部分相似的結(jié)構(gòu)，可與其配體結(jié)合，競爭性抑制RAGE的活性。因此，能保護(hù)細(xì)胞免受RAGE-配體軸所介導(dǎo)的損害性反應(yīng)。此外，sRAGE還可作為循環(huán)中AGEs和其他RAGE配體的清道夫受體。
[0008]如何預(yù)測腦梗死患者是否發(fā)生微出血，目前尚無確定方法，僅有一些臨床評分量表，但是準(zhǔn)確性與特異性均不高，且尚未在我國人群中驗(yàn)證其效度。目前尚無可供預(yù)測微出血發(fā)生的生化檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑。
[0010]本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0011]一種用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑，由檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種，或多種的試劑組成，優(yōu)選由檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種，或多種的ELISA試劑組成。
[0012]檢測脂聯(lián)素的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人脂聯(lián)素特異性抗體、人脂聯(lián)素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物等。
[0013]檢測E-選擇素的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人E-選擇素特異性抗體、人E-選擇素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物等。
[0014]檢測S100B蛋白的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人S100B特異性抗體、人S100B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物等。
[0015]檢測sRAGE的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人sRAGE特異性抗體、人sRAGE蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物等。
[0016]上述ELISA試劑可自制，也可購買商品化的相應(yīng)抗體和ELISA試劑盒。
[0017]脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種或多種在制備預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑中的應(yīng)用。
[0018]預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的生物分子組合，由脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意兩種、或兩種以上組成。
[0019]有益效果:
[0020]腦梗死患者靜脈血中的脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體的含量與腦微出血的發(fā)生具有顯著的相關(guān)性，本發(fā)明提供的檢測試劑對腦微出血有很好的預(yù)測價值，為早期干預(yù)腦微出血提供了依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】[0021]實(shí)施例
[0022]I資料與方法
[0023]1.1研究對象
[0024]研究對象為2012年I月至2012年8月期間在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院住院的首發(fā)缺血性卒中患者，以及同期因頭痛、頭暈健康體檢志愿者做為對照組，均完成MRI (3.0T)磁敏感序列(SWI)掃描。神經(jīng)功能缺損程度由兩位不知影像學(xué)檢查結(jié)果的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分。入組標(biāo)準(zhǔn)如下=(I)NIHSS評分<8分；(2)在發(fā)病I周內(nèi)入院；(3)無MRI檢查禁忌癥(例如體內(nèi)存在磁性金屬物質(zhì))。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:(O腎臟或肝臟疾??；(2)有急性或慢性炎癥性疾病，如肺炎、腦膜炎等，最近使用任何消炎藥；(3)惡性腫瘤或腦部手術(shù)。收集所有受試者的基線資料，如性別、年齡、吸煙史、飲酒史、既往史以及用藥史。
[0025]1.2MRI檢查方法
[0026]MRI檢查采用Siemens公司3.0T MRI機(jī),行自旋回波常規(guī)序列、三維時間飛躍血管成像以及GER-T2*WI和SWI序列掃描。SWI掃描參數(shù)為:矩陣298x448 ;檢查區(qū)域230mmX 184mm,層厚1.5mm,重復(fù)時間、回波時間分別為28ms和20ms,激勵I(lǐng)次。微出血定義為直徑2-10_的低信號缺失，邊界清楚，周圍無水腫。排除蒼白球鈣化、蛛網(wǎng)膜下腔低信號影和血管流空影等。缺血性卒中患者根據(jù)有無微出血分為兩組。微出血按照部位分為深部、腦葉和幕下。并按照微出血數(shù)量分級:無微出血、輕度(微出血總數(shù)I至5個)、中度(6至15個)和重度(大于15個)。以上影像學(xué)結(jié)果由2名對患者臨床資料不知情的神經(jīng)影像科醫(yī)生分析。
[0027]1.3ELISA法檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B和sRAGE
[0028]入院患者次日晨空腹采集患者肘正中靜脈血2ml，而對照組為門診空腹采血均置于EDTA抗凝管中，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，分離血漿，置于_80°C冰箱存儲備用。脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B和sRAGE檢測方法基本相同，脂聯(lián)素檢測試劑盒購自美國Millipore公司，E-選擇素試劑盒購自eBioscience公司，S100B檢測試劑盒購自BioVendor公司，sRAGE檢測試劑盒購自R&D公司，均按試劑盒說明書流程進(jìn)行操作。以下以S100B為例具體說明。
[0029]①加樣:將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(50pg/ml,100pg/ml, 200pg/ml, 500pg/ml, IOOOpg/ml，2000pg/ml)、稀釋緩沖液(空白對照)、待檢血清樣本以100微升/孔的量加入酶標(biāo)板內(nèi)，設(shè)置2個復(fù)孔。蓋上封板膜，室溫(25°C)孵育2小時。
[0030]②洗板:扣去孔內(nèi)液體，300微升/孔加入洗脫液；停留I分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)3次，最后一次在濾紙上扣干。
[0031]③加檢測抗體:100微升/孔加入稀釋后的生物素偶聯(lián)的一抗。蓋上封板膜，室溫(25°C)孵育1-1.5小時。
[0032]④洗板:扣去孔內(nèi)液體，300微升/孔加入洗脫液；停留I分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)3次，最后一次在濾紙上扣干。
[0033]⑤加酶:100微升/孔加入Str印tavidin-HRP。蓋上封板膜，室溫孵育30分鐘。
[0034]⑥洗板:扣去孔內(nèi)液體，300微升/孔加入洗脫液；停留I分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù)3次，最后一次在濾紙上扣干。[0035]⑦顯色:100微升/孔加入TMB，室溫避光孵育5_30分鐘。根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺(深藍(lán)色)來判定終止反應(yīng)。通常顯色10-20分鐘可以達(dá)到很好的效果。
[0036]⑧終止反應(yīng):迅速100微升/孔加入終止液終止反應(yīng)。
[0037]⑨讀板:終止后10分鐘內(nèi)，以酶標(biāo)儀用檢測波長450nm讀值，得出每孔的OD值。
[0038]2統(tǒng)計學(xué)分析
[0039]應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，非正態(tài)分布計量資料比較用Kruskal-Wallis或Mann - Whitney U檢驗(yàn),計數(shù)資料比較用X2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)。將與微出血嚴(yán)重程度有關(guān)的因素進(jìn)行單因素分析后P < 0.2變量再行等級Logistic回歸分析。此外，在微出血組采用偏相關(guān)分析，并校正可能的混雜因素，如年齡，性別，他汀類藥物的使用等。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0040]3 結(jié)果
[0041]3.1患者的一般人口學(xué)資料
[0042]共有170例患者被納入本研究，平均年齡63.9歲，其中男性109例，占64.1%。81人患者發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)微出血，占47.6%。其中單發(fā)微出血27例，占33.3%，多發(fā)微出血54例，占66.7%。患者病史情況及主要實(shí)驗(yàn)室檢查情況見表I。
[0043]3.2E-選擇素與微出血的相關(guān)性分析
[0044]住院期間發(fā)生微出血的患者入院時的血清E-選擇素明顯高于未發(fā)生微出血的患者的血清E-選擇素數(shù)值。Logistic回歸分析顯示，在校正了血壓、HDL和纖維蛋白原后，E-選擇素仍與微出血正相關(guān)(OR:1.12，95%C1:1.03-1.17)。若以12為截斷點(diǎn)，則診斷敏感性為60%，特異性為74%。
[0045]3.3脂聯(lián)素與微出血的相關(guān)性分析
[0046]住院期間發(fā)生微出血的患者入院時的血清脂聯(lián)素明顯低于未發(fā)生微出血的患者的血清脂聯(lián)素數(shù)值。Logistic回歸分析顯示，在校正了血壓、HDL和纖維蛋白原后，脂聯(lián)素仍與微出血負(fù)相關(guān)(OR:0.54，95%C1:0.36-0.82)。若以300為截斷點(diǎn)，則診斷敏感性為72%，特異性為83%。
[0047]3.4S100B與微出血的相關(guān)性分析
[0048]住院期間發(fā)生微出血的患者入院時的血清S100B明顯高于未發(fā)生微出血的患者的S100B數(shù)值。Logistic回歸分析顯示，在校正了血壓、HDL和纖維蛋白原后，S100B仍與微出血正相關(guān)(OR:2.1，95%CI:1.8-4.3)。若以100為截斷點(diǎn)，則診斷敏感性為85%，特異性為 94%ο
[0049]3.5sRAGE與微出血的相關(guān)性分析
[0050]住院期間發(fā)生微出血的患者入院時的血清sRAGE明顯低于未發(fā)生微出血的患者的血清sRAGE數(shù)值。Logistic回歸分析顯示，在校正了血壓、HDL和纖維蛋白原后，sRAGE仍與微出血負(fù)相關(guān)(OR:0.32，95%C1:0.24-0.48)。若以900為截斷點(diǎn)，則診斷敏感性為92%，特異性為88%。
[0051]3.6聯(lián)用2種檢測指標(biāo)與微出血的相關(guān)性分析
[0052]各指標(biāo)截斷點(diǎn)同上。
[0053]若聯(lián)用脂聯(lián)素+E-選擇素，則診斷敏感性為79%，特異性為60%。[0054]若聯(lián)用脂聯(lián)素+S100B，則診斷敏感性為88%，特異性為74%。
[0055]若聯(lián)用脂聯(lián)素+sRAGE,則診斷敏感性為96%，特異性為68%。
[0056]若聯(lián)用E-選擇素+S100B，則診斷敏感性為89%，特異性為54%。
[0057]若聯(lián)用E-選擇素+sRAGE,則診斷敏感性為94%，特異性為62%。
[0058]若聯(lián)用SlOOB+sRAGE，則診斷敏感性為97%，特異性為69%。
[0059]3.7聯(lián)用3種檢測指標(biāo)與微出血的相關(guān)性分析
[0060]各指標(biāo)截斷點(diǎn)同上。
[0061]若聯(lián)用脂聯(lián)素+E-選擇素+S100B，則診斷敏感性為95%，特異性為45%。
[0062]若聯(lián)用脂聯(lián)素+E-選擇素+sRAGE,則診斷敏感性為97%，特異性為51%。
[0063]若聯(lián)用脂聯(lián)素+SlOOB+sRAGE，則診斷敏感性為96%，特異性為63%。
[0064]若聯(lián)用E-選擇素+SlOOB+sRAGE,則診斷敏感性為96%，特異性為79%。
[0065]3.8聯(lián)用4種檢測指標(biāo)與微出血的相關(guān)性分析
[0066]各指標(biāo)截斷點(diǎn)同上。
[0067]若聯(lián)用脂聯(lián)素+E-選擇素+SlOOB+sRAGE,則診斷敏感性為98%，特異性為39%。
[0068]表1.患者基本臨床資料比較
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑，其特征在于由檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、SlOOB蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種，或多種的試劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑，其特征在于由檢測脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種，或多種的ELISA試劑組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑，其特征在于檢測脂聯(lián)素的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人脂聯(lián)素特異性抗體、人脂聯(lián)素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物；檢測E-選擇素的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人E-選擇素特異性抗體、人E-選擇素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物；檢測S100B蛋白的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人S100B特異性抗體、人S100B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù)合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物；檢測sRAGE的ELISA試劑包括生物素偶聯(lián)的人sRAGE特異性抗體、人sRAGE蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉親和素偶聯(lián)的HRP復(fù) 合物、聯(lián)苯胺反應(yīng)底物。
4.脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意一種或多種在制備預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的試劑中的應(yīng)用。
5.預(yù)測急性腦梗死患者發(fā)生微出血的生物分子組合，其特征在于由脂聯(lián)素、E-選擇素、S100B蛋白以及可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體sRAGE中的任意兩種、或兩種以上組成。
【文檔編號】G01N33/68GK103901214SQ201410137088
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】葉瑞東, 朱武生, 劉新峰 申請人:劉新峰