專利名稱：一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體地，本發(fā)明涉及一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統及方法。
背景技術：
漆酶(苯二醇氧氧化還原酶，EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，和植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物的血漿銅藍蛋白同屬藍色多銅氧化酶家族。漆酶能催化O2通過4個電子還原成水，并且伴隨著一些酚類底物的氧化。漆酶主要用于有機合成、環(huán)境污染物的降解和染料脫色、生物檢測和電化學分析、造紙工業(yè)中的紙漿漂白和廢水處理、纖維原料的降解等。正是由于漆酶的廣闊的應用前景，近幾十年來，漆酶成為生物學、化學和環(huán)境科學的研究熱點。漆酶首先在高等植物漆樹中發(fā)現，而后人們通過大量的研究發(fā)現漆酶在自然界中分布于多種植物、真菌、少數細菌和昆蟲中。真菌漆酶是漆酶的主要來源，其中栓菌在世界各地分布廣泛而且在自然界中表現出優(yōu)異木材降解能力。作為此類真菌的代表性菌株-變色栓菌(Trametes versicolor)是最早報道的能夠產生大量漆酶的真菌之一，而且該真菌漆酶已經被一些國際知名酶制劑公司(如Sigma)商品化，但是目前的價格太高，達不到大規(guī)模應用的要求。造成漆酶生產和應用成本高的原因之一就在于其發(fā)酵表達水平低，因此， 提高漆酶的產率，降低生產成本成為漆酶生產研究的主要目的。目前采用的策略包括漆酶高產菌株的篩選、漆酶的發(fā)酵工藝及其合成調控、漆酶基因的克隆和異源表達等等，其中固定化菌絲體發(fā)酵技術不僅可以提高漆酶發(fā)酵水平還可以提高漆酶生產強度，是降低漆酶生產成本有效策略之一。這些策略雖然能夠在一定程度上提高漆酶發(fā)酵水平，但其獲得的漆酶發(fā)酵液的漆酶蛋白表達水平仍然較低，屬于稀溶液體系。正是由于漆酶發(fā)酵液中目的產物濃度低的特點，導致漆酶分離純化操作復雜，進一步增加了其生產成本。漆酶的純化一般采用的方法為先經過超濾或硫酸銨分級沉淀，再進行柱層析，如DEAE-S印hadexA-50柱層析、DEAE纖維素柱層析、PhenylSepharoseTM疏水柱層析、Sephaex柱層析等，最后用SDS-PAGE鑒定其純度。上述方法中漆酶的發(fā)酵與分離純化操作是分開進行的，雖然能分離出高純度的漆酶，但步驟十分繁瑣，處理時間長，而且處理量小，而且在漆酶的發(fā)酵過程中菌體會分泌蛋白酶進行蛋白的分解，影響漆酶的得率， 因此及時將發(fā)酵液中漆酶從反應體系中有選擇性的分離出來是提高漆酶發(fā)酵水平的有效方法之一。另外，由于漆酶的蛋白質結構中的組氨酸殘基含量高，因而使用親和色譜進行漆酶的蛋白純化效果可能更佳，目前親和色譜所用的配基主要有螯合金屬離子、染料配基和 Con-A配基，在實際應用時，親和色譜可以單獨使用或與其他分離方法協同使用。

發(fā)明內容
本發(fā)明為了解決目前漆酶發(fā)酵與分離純化操作分開進行，程序繁瑣，發(fā)酵與分離存在漆酶表達水平低、分離純化操作復雜的問題，從而本發(fā)明的目的是提供一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統。本發(fā)明的另一目的是提供一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的方法。根據本發(fā)明提供的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其包括鼓泡床反應器1，磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的裝置3和蠕動泵2，其中，鼓泡床反應器1頂部和底部分別通過蠕動泵 2與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的進料口 3-2和出料口 3-8相連通；所述鼓泡床反應器1與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的體積比為20-40 1 ；固定化產漆酶菌株置于所述鼓泡床反應器1內；所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的裝置3內裝有表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒，其中，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3，包括一反應器3-4，所述的反應器 3-4有一罐體3-5，罐體3-5頂部有一進料口 3-2，底部有一放料口 3_17及其物料閥3_18 ； 該罐體3-5內中心軸線位置安裝一攪拌槳3-3，攪拌槳3-3上部穿過反應器3-4頂部與驅動攪拌槳3-3的攪拌電機3-1相連；還包括一柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15 ；所述的柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15包括有一頂部封閉的圓柱形的套筒3-16， 該套筒3-16底部固設于與罐體3-5側壁的中下部并與反應器3-4相連通，其內嵌套有一圓柱形活塞3-9，其外套設有一環(huán)形磁鐵3-6 ；所述的套筒3-16筒體的上部設有一出料口 3-8，該出料口 3-8上還設有一液體閥門3-7 ；所述的活塞3-9通過固定軸套3-11與曲柄連桿機構3-13的曲柄連桿3_12相連， 該曲柄連桿3-12穿設于套筒3-16的頂部，并在曲柄連桿機構3-13的作用下帶動活塞3_9
往復運動，所述二氧化硅介孔納米顆粒具有三維蠕蟲狀介孔孔道，顆粒的粒徑為100 400nm,比表面積為400 850m2/g，其中，所述三維蠕蟲狀介孔孔道的孔徑范圍為2 30nm， 孔體積范圍為0. 823 2. 996m7g。作為上述系統的一種優(yōu)選，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的套筒3-16與反應器3-4的罐體3-5的內夾角的角度范圍是45° 70°。作為上述系統的又一種優(yōu)選，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的活塞3-9 與套筒3-16的內壁呈滑道配合間隙。作為上述系統的另一種優(yōu)選，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的曲柄連桿 3-12與套筒3-16的連接處設有密封圈3-10。作為上述系統的一種改進，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的曲柄連桿機構3-13由直流電機驅動。所述的直流電動機為可調速電機，其轉速為10 20轉/分鐘。 作為一種優(yōu)選，所述的直流電動機還與一時間繼電器3-14相連接，由時間繼電器3-14控制直流電動機作周期間歇性轉動。反應器流出液體中夾帶的磁性介質顆粒流經環(huán)形永磁鐵包裹的套筒區(qū)域時被吸引向套筒壁靠近并發(fā)生凝并，形成磁性介質顆粒層，圓柱形活塞在時間繼電器的控制下由直流電動機驅動作周期間歇性往復運動，從而不斷的將在套筒中被分離的磁性介質顆粒推回反應器中進行回收或循環(huán)使用，實現磁性介質顆粒的原位連續(xù)分
1 O作為上述系統的另一種改進，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的環(huán)形磁鐵 3-6為環(huán)形永磁鐵或電磁線圈。作為一種優(yōu)選，所述的環(huán)形永磁鐵3-6的磁場強度為2000 4000奧斯特，套設在套筒3-16的中間部位，該環(huán)形磁鐵3-6的兩極分布在兩個環(huán)面，且其內環(huán)面是S極。作為上述系統的再一種改進，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5、 攪拌槳3-3、套筒3-16、圓柱形活塞3-9的材質均為不銹鋼、玻璃或塑料。本發(fā)明的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統中的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的具體實現過程如下在柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15的套筒3-16外部的環(huán)形磁鐵3_6的磁場存在的條件下，反應器3-4中的反應液體流經套筒3-16，最后，由套筒3-16上部的出料口 3_8流出。被液體攜帶的磁性介質顆粒與液體的流動方向一致，其流經套筒3-16時受到環(huán)形磁鐵 3-6的磁場吸引力的作用，其吸引力能夠克服流動液體對磁性顆粒的曳力并將流出液體中夾帶的磁性介質顆粒吸附住，被吸引的磁性介質顆粒向柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15的套筒3-16壁靠近發(fā)生凝并，形成一個較為緊密的顆粒層，隨著時間的延長，顆粒層由薄變厚，一段時間后，形成一定厚度的磁性介質顆粒層。此吸附時間的長短，可根據實際生產的需要由時間繼電器3-14設定。而后時間繼電器3-14控制的直流電動機被接通電源并轉動，直流電動機驅動曲柄連桿系統，并經固定軸套3-11將轉動轉變?yōu)閬砘赝鶑瓦\動，直流電機在時間繼電器3-14 設定的轉動周期內轉動一周，流出液體中夾帶的磁性介質顆粒此過程中反應液體仍沿套筒 3-16壁與活塞之間的空隙流動，并流向出料口 3-8。此后，流經套筒3-16的反應液體中的磁性介質顆粒繼續(xù)被磁場吸引并在套筒3-16內壁重新形成新的一定厚度的顆粒層。圓柱形活塞3-9在時間繼電器3-14的控制下作周期間歇性往復運動，從而不斷的將在套筒3-16中被分離的磁性介質顆粒推回反應器3-4中進行回收或循環(huán)使用，實現磁性介質顆粒的原位連續(xù)分離。根據本發(fā)明的系統，所述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒通過包括以下步驟的方法制備1)在室溫、攪拌的條件下，反應體系中依次加入聚醚胺、一元醇、！^e3O4納米顆粒、 水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4納米顆粒 0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)將步驟1)得到的混合溶液在攪拌、通入氮氣保護、水浴加熱和加裝回流裝置的條件下進行水解反應，所得沉淀經磁分離、洗滌、并在有氮氣保護的條件下干燥；3)將步驟幻得到的產物在400 600°C的氮氣氣氛下煅燒除去聚醚胺模板，得到具有三維蠕蟲狀介孔孔道的超順磁性二氧化硅納米顆粒。具體地，本發(fā)明的制備具有三維蠕蟲狀介孔孔道的的超順磁性二氧化硅納米顆粒是通過α，ω-二氨基表面活性劑聚醚胺為模板調控制備，可包括以下步驟1)采用現有的文獻報道的方法(Peng Ζ. G.，Hidajat K.，Uddin M. S.，J. Colloid Interface Sci.，2004，271，277)制備!^e3O4納米顆粒，經超聲使其分散于去離子水中，形成穩(wěn)定的懸浮液，濃度為1 5% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏備用；2)在室溫(25°C )、攪拌的條件下反應體系中依次加入聚醚胺、一元醇、Fe3O4納米顆粒、水、正硅酸乙酯(TEOS)，其中，基于1重量份的聚醚胺，加入一元醇2 6重量份；優(yōu)選地，在200 400轉/分的轉速下，充分攪拌10 20分鐘，然后加入!^e3O4納米顆粒0. 01 0. 03重量份；在400 600轉/分的轉速下，充分攪拌20 40分鐘后加入水10 15重量份；在600 800轉/分的轉速下充分攪拌10 30分鐘后，將轉速調整至1500 2000 轉/分，加入正硅酸乙酯(TEOS) 0. 5 1. 2重量份；在1500 2000轉/分轉速下充分攪拌 5 20分鐘；3)將步驟2~)得到的混合溶液在攪拌、通入氮氣保護、水浴加熱和加裝回流裝置的條件下進行水解反應，攪拌速度100 300轉/分，反應溫度25 90°C，反應時間20 28 小時，所得沉淀經磁分離后，先后用去離子水和乙醇分別洗滌3 5次，并在有氮氣保護的條件下在烘箱中烘干；4)將步驟3)得到的產物在高溫400 600°C的氮氣氣氛下煅燒4 6小時除去聚醚胺模板，升溫速率2 5°C /分，得到具有三維蠕蟲狀介孔孔道的超順磁性二氧化硅納米顆粒。所述的α，ω- 二氨基表面活性劑選自H2NCH(CH3) CH2 [OCH2CH (CH3) ]ηΝΗ2，即聚醚胺，可選用的分子量(MW)為MW = 400，MW= 2000或MW = 4000，即聚醚胺D-400，D-2000 和 D-4000。所述的一元醇選自甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或者兩者的混合物。根據本發(fā)明所述的系統，所述鼓泡床反應器1內所固定的產漆酶菌株為變色栓菌。根據本發(fā)明的漆酶發(fā)酵與分離耦合的方法，其包括以下步驟1)將固定化產漆酶菌株按10-20% ν/ν的裝載量置入鼓泡床反應器1中進行發(fā)酵，其中，培養(yǎng)基裝液量為65-75% ν/ν，鼓泡床反應器中的總裝載量控制在85% ；2)發(fā)酵48_60h后，通過蠕動泵2將鼓泡床反應器1中的發(fā)酵液導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中進行選擇性分離，其中，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置的罐體3-5中裝有表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒，其濃度為10-20g/L， 吸附發(fā)酵液中的漆酶，所述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒具有三維蠕蟲狀介孔孔道，顆粒的粒徑為100 400nm，比表面積為400 850m2/g，其中，所述三維蠕蟲狀介孔孔道的孔徑范圍為2 30nm,孔體積范圍為0. 823 2. 996m3/g ；3)分離了漆酶的發(fā)酵液從磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的出料口 3-8在蠕動泵2的作用下返回鼓泡床反應器1中繼續(xù)發(fā)酵；4)發(fā)酵結束后，洗脫表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒吸附的漆酶，其中，步驟2)和步驟3)中蠕動泵2的流速為每分鐘鼓泡床反應器體積的 1/100-200，且兩個蠕動泵中料液的流速保持一致。具體地，本發(fā)明提供的基于固定化產漆酶菌株和超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體的漆酶發(fā)酵與分離耦合的工藝是利用固定化產漆酶菌株的菌絲體在鼓泡床反應器中進行漆酶的發(fā)酵，待進入漆酶合成階段后，采用對漆酶具有高度選擇性的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體在磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置中對發(fā)酵液中的漆酶進行直接捕獲分離，不僅能夠提高漆酶的發(fā)酵水平和生產效率，而且能夠極大的簡化漆酶生產中發(fā)酵與分離的過程。具體地，本發(fā)明的方法包括以下步驟
1)將保藏號為CICC 14001的變色栓菌CTrametes versicolor)采用現有文獻 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol,2007,23,367)制備以海藻酸鈣凝膠為載體的固定化變色栓菌；2)將上述固定化變色栓菌按10-20% (ν/ν)的裝載量置入鼓泡床反應器1中，培養(yǎng)基裝液量65-75% (ν/ν)，鼓泡床反應器中的總裝載量控制在85%，培養(yǎng)溫度25°C，通氣量 0. 1-0. 2vvm, pH 值控制在 4. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L) =KH2PO4O. 2，CaCl2 · 2H20 0. 1， MgSO4 · 7H20 0. 05，NH4H2PO4O. 5，FeSO4 · 7H20 0. 035，glucose 2，NH4Cl 0. 267, CuSO4 · 5H20 0. 02 ；3)采用上述提供的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒的制備方法合成孔徑為 18. 3nm的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體，采用已有文獻報道的方法(Mohapatra S， Pal D, Ghosh SK,Pramanik P. J. Nanosci. Nanotechnol，2007，7，3193)對其進行表面修飾， 使其表面螯合有銅離子后即獲得磁性介孔親和吸附載體；4)將上述螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后，裝入上述的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5中，載體濃度為10-20g/L ；5)當發(fā)酵48_60h后通過蠕動泵2將鼓泡床反應器1中的發(fā)酵液導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中進行漆酶的選擇性分離，分離得到的漆酶吸附在上述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體上，從磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的出料口 3-8流出的液體經蠕動泵2返回至鼓泡塔反應器1內繼續(xù)進行發(fā)酵，該耦合過程一直持續(xù)到漆酶發(fā)酵結束的72h，通過以上連續(xù)的操作實現漆酶發(fā)酵與分離過程的耦合；6)漆酶發(fā)酵分離耦合結束后，將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的發(fā)酵液排出，不再返回鼓泡床反應器1中，在鼓泡床反應器1中加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行漆酶發(fā)酵；7)將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體吸附的漆酶用PH8. O的咪唑緩沖液洗脫，其后，載體經0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液進行再生處理，然后經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后繼續(xù)參加漆酶發(fā)酵與分離耦合反應，漆酶洗脫液經透析、噴霧干燥后可獲得高純度的漆酶產品。綜上所述，本發(fā)明提供的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統與方法具有以下優(yōu)點1)采用固定化產漆酶菌株，將漆酶發(fā)酵與吸附分離相耦合的策略，在漆酶發(fā)酵過程中實現漆酶的直接捕獲分離，可提高漆酶的發(fā)酵水平；2)固定化產漆酶菌株和超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體均可重復使用，進一步提高了漆酶的生產強度，降低了漆酶發(fā)酵成本；3)漆酶發(fā)酵與分離耦合的策略，改變了傳統漆酶生產的模式，操作簡單，便于放大，且適合于高純度漆酶的生產。


圖1為實現漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統示意圖；圖2為本發(fā)明的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置的結構示意圖。附圖標識1、鼓泡床反應器 2、蠕動泵3、磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置
3-1、攪拌電機3-2、進料口3-3、攪拌槳
3-4、反應器3-5、罐體3-6、環(huán)形永磁鐵
3-7、液體閥門3-8、出料口3-9、圓柱形活塞
3-10、密封圈3-11、固定軸套3-12、曲柄連桿
3-13、曲柄連桿機構3-14、時間繼電器3-15、柱塞式原位連續(xù)分離系統
3-16、套筒3-17、放料口3-18、物料閥
具體實施例方式實施例1、1、采用現有文獻 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)將保藏號為 CICC 14001 的變色栓菌 (Trametes versicolor)制備成以海藻酸鈣凝膠為載體的固定化變色栓菌；2、將固定化變色栓菌按20% (ν/ν)的裝載量置入鼓泡床反應器1中，培養(yǎng)基裝液量65% (ν/ν)，培養(yǎng)溫度25°C，通氣量0.2VVm，pH值控制在4.0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L) KH2PO4O. 2，CaCl2 · 2Η20 0. 1，MgSO4 · 7H20 0. 05，NH4H2PO4O. 5，FeSO4 · 7H20 0. 035，glucose 2，NH4Cl 0. 267，CuSO4 · 5H20 0. 02 ；3、制備孔徑為18. 3nm的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體，制備方法如下1)采用現有的文獻報道的方法(Peng Ζ. G.，Hidajat K.，Uddin M. S.，J. Colloid Interface Sci.，2004，271，277)制備!^e3O4納米顆粒，經超聲使其分散于去離子水中，形成穩(wěn)定的懸浮液，濃度為1 5% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏備用；2)在室溫(25°C )、攪拌的條件下反應體系中依次加入聚醚胺、一元醇、Fe3O4納米顆粒、水、正硅酸乙酯(TEOS)，其中，基于1重量份的聚醚胺，加入一元醇2 6重量份；優(yōu)選地，在200 400轉/分的轉速下，充分攪拌10 20分鐘，然后加入!^e3O4納米顆粒0. 01 0. 03重量份；在400 600轉/分的轉速下，充分攪拌20 40分鐘后加入水10 15重量份；在600 800轉/分的轉速下充分攪拌10 30分鐘后，將轉速調整至1500 2000 轉/分，加入正硅酸乙酯(TEOS) 0. 5 1. 2重量份；在1500 2000轉/分轉速下充分攪拌 5 20分鐘；3)將步驟2~)得到的混合溶液在攪拌、通入氮氣保護、水浴加熱和加裝回流裝置的條件下進行水解反應，攪拌速度100 300轉/分，反應溫度25 90°C，反應時間20 28 小時，所得沉淀經磁分離后，先后用去離子水和乙醇分別洗滌3 5次，并在有氮氣保護的條件下在烘箱中烘干；4)將步驟3)得到的產物在高溫400 600°C的氮氣氣氛下煅燒4 6小時除去聚醚胺模板，升溫速率2 5°C /分，得到具有三維蠕蟲狀介孔孔道的超順磁性二氧化硅納米顆粒。5)制備得到的超順磁性二氧化硅納米顆粒對其表面進行修飾，使其表面螯合有銅離子；4、將螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后，裝入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5中，載體濃度為20g/L;鼓泡床反應器1與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的體積比為40 1 ；5、當發(fā)酵4 后通過蠕動泵2將鼓泡床反應器1中的發(fā)酵液從進料口 3-2導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中進行漆酶的選擇性分離，磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15的套筒3-16與反應器3-4的罐體3_5的內夾角α 的角度是70°，直流電動機轉速為20轉/分鐘，環(huán)形永磁鐵6磁場強度3000奧斯特，時間繼電器3-14設為停3分鐘開3秒，即活塞的運行周期是每停留3分鐘運行一個往復運動， 分離條件溫度25°C。分離出的漆酶吸附在超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體上，分離后的發(fā)酵液利用蠕動泵2經磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反應器1內繼續(xù)進行發(fā)酵，蠕動泵2的流速保持一致且控制在每分鐘鼓泡床反應器體積的1/200，該漆酶發(fā)酵與分離耦合的過程一直持續(xù)到漆酶發(fā)酵結束的72h ；6、漆酶發(fā)酵分離耦合結束后，將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的發(fā)酵液排出，不再返回鼓泡床反應器1中，在鼓泡床反應器1中加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行漆酶發(fā)酵；7、將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體吸附的漆酶用PH8. 0的咪唑緩沖液洗脫，其后，載體經0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液進行再生處理，然后經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后繼續(xù)參加漆酶發(fā)酵與分離耦合反應，漆酶洗脫液經透析、噴霧干燥后可獲得高純度的漆酶產品，最終獲得的漆酶總活力較同等條件下發(fā)酵與分離分步操作提高40 %，該耦合體系重復運行10次，獲得漆酶總活力保持穩(wěn)定。實施例2、1、采用現有文獻 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)將保藏號為 CICC 14001 的變色栓菌 (Trametes versicolor)制備成以海藻酸鈣凝膠為載體的固定化變色栓菌；2、將固定化變色栓菌按15% (ν/ν)的裝載量置入鼓泡床反應器1中，培養(yǎng)基裝液量70% (ν/ν)，培養(yǎng)溫度25°C，通氣量0. 15vvm，pH值控制在4.0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同實施例1 ；3、制備孔徑為18. 3nm的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體，制備的具體方法同實施例1 ；4、將螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后，裝入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5中，載體濃度為 15g/L;鼓泡床反應器1與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的體積比為30 1 ；5、當發(fā)酵54h后通過蠕動泵2將鼓泡床反應器1中的發(fā)酵液通過進料口 3_2導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中進行漆酶的選擇性分離，磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15的套筒3-16與反應器3-4的罐體3_5的內夾角α 的角度是60°，直流電動機轉速為10轉/分鐘，環(huán)形永磁鐵6磁場強度觀00奧斯特，時間繼電器3-14設為停5分鐘開6秒，即活塞的運行周期是每停留5分鐘運行一個往復運動， 反應溫度25°C，分離出的漆酶被吸附在超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體上，分離后的發(fā)酵液利用蠕動泵2從磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反應器1內繼續(xù)進行發(fā)酵，蠕動泵的流速保持一致且控制在每分鐘鼓泡床反應器體積的 1/150，該漆酶發(fā)酵與分離耦合的過程一直持續(xù)到漆酶發(fā)酵結束的72h ；
6、漆酶發(fā)酵分離耦合結束后，將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的發(fā)酵液排出，不再返回鼓泡床反應器1中，在鼓泡床反應器1中加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行漆酶發(fā)酵；7、將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的載體吸附的漆酶用pH8. 0的咪唑緩沖液洗脫，其后，載體經0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液進行再生處理，然后經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后繼續(xù)參加漆酶發(fā)酵與分離耦合反應，漆酶洗脫液經透析、噴霧干燥后可獲得高純度的漆酶產品，最終獲得的漆酶總活力較同等條件下發(fā)酵與分離分步操作提高50%，該耦合體系重復運行10次，獲得漆酶總活力保持穩(wěn)定實施例3、1、采用現有文獻 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)將保藏號為 CICC 14001 的變色栓菌 (Trametes versicolor)制備成以海藻酸鈣凝膠為載體的固定化變色栓菌；2、將固定化變色栓菌按10% (ν/ν)的裝載量置入鼓泡床反應器中，培養(yǎng)基裝液量 75% (ν/ν)，培養(yǎng)溫度25°C，通氣量0. lvvm，pH值控制在4. 0 ；3、制備孔徑為18. 3nm的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體，制備的具體方法同實施例1 ；4、將銅離子螯合的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后，裝入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5中，載體濃度為IOg/ L ；鼓泡床反應器與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置的體積比為20 1 ；5、當發(fā)酵4 后通過蠕動泵2將鼓泡床反應器1中的發(fā)酵液通過進料口 3-2導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的罐體3-5中進行漆酶的選擇性分離，磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的柱塞式原位連續(xù)分離系統3-15的套筒3-16與反應器3-4的罐體3_5 的內夾角α的角度是45°，直流電動機轉速為15轉/分鐘，環(huán)形永磁鐵6磁場強度3500 奧斯特，時間繼電器3-14設為停4分鐘開4秒，即活塞的運行周期是每停留4分運行一個往復運動，反應溫度25 °C，分離出的漆酶吸附在超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒載體上，分離后的發(fā)酵液利用蠕動泵2經磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反應器1內繼續(xù)進行發(fā)酵，蠕動泵2的流速保持一致且控制在每分鐘鼓泡床反應器體積的1/100，該漆酶發(fā)酵與分離耦合的過程一直持續(xù)到漆酶發(fā)酵結束的72h ；6、漆酶發(fā)酵分離耦合結束后，將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的發(fā)酵液排出，不再返回鼓泡床反應器1中，在鼓泡床反應器1中加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行漆酶發(fā)酵；7、將磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置3中的載體吸附的漆酶用pH8. 0的咪唑緩沖液洗脫，其后，載體經0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液進行再生處理，然后經乙醇和無菌水先后分別洗滌3次以上后繼續(xù)參加漆酶發(fā)酵與分離耦合反應，漆酶洗脫液經透析、噴霧干燥后可獲得高純度的漆酶產品，最終獲得的漆酶總活力較同等條件下發(fā)酵與分離分步操作提高45%，該耦合體系重復運行10次，獲得漆酶總活力保持穩(wěn)定。
權利要求
1.一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其特征在于，所述系統包括鼓泡床反應器(1)，一磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的裝置(3)和蠕動泵O)，其中，鼓泡床反應器(1)頂部和底部分別通過蠕動泵O)與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)的進料口(3- 和出料口 (3-8)相連通；所述鼓泡床反應器(1)與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)的體積比為20-40 1 ；固定化產漆酶菌株置于所述鼓泡床反應器(1)內；所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的裝置(3)內裝有表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒，其中，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)，包括一反應器(3-4)，所述的反應器 (3-4)有一罐體(3-5)，罐體(3-5)頂部有一進料口(3-2)，底部有一放料口 (3-17)及其物料閥(3-18)；該罐體(3-5)內中心軸線位置安裝一攪拌槳(3-3)，攪拌槳(3-3)上部穿過反應器(3-4)頂部與驅動攪拌槳(3-3)的攪拌電機(3-1)相連；還包括一柱塞式原位連續(xù)分離系統(3-15)；所述的柱塞式原位連續(xù)分離系統(3-15)包括有一頂部封閉的圓柱形的套筒(3-16)， 該套筒(3-16)底部固設于與罐體(3-5)側壁的中下部并與反應器(3-4)相連通，其內嵌套有一圓柱形活塞(3-9)，其外套設有一環(huán)形磁鐵(3-6)；所述的套筒(3-16)筒體的上部設有一出料口(3-8)，該出料口(3-8)上還設有一液體閥門(3-7)；所述的活塞(3-9)通過固定軸套(3-11)與曲柄連桿機構(3-13)的曲柄連桿(3-12) 相連，該曲柄連桿(3-12)穿設于套筒(3-16)的頂部，并在曲柄連桿機構(3-13)的作用下帶動活塞(3-9)往復運動，所述二氧化硅介孔納米顆粒具有三維蠕蟲狀介孔孔道，顆粒的粒徑為100 400nm，比表面積為400 850m2/g，其中，所述三維蠕蟲狀介孔孔道的孔徑范圍為2 30nm，孔體積范圍為 0. 823 2. 996m3/go
2.根據權利要求1所述的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其特征在于，所述的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)的套筒(3-16)與反應器(3-4)的罐體(3-5)的內夾角的角度范圍是45° 70°。
3.根據權利要求1所述的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其特征在于，所述的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)的活塞(3-9)與套筒(3-16)的內壁呈滑道配合間隙。
4.根據權利要求1所述的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其特征在于，所述的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)的曲柄連桿(3-12)與套筒(3-16)的連接處設有密封圈 (3-10)。
5.根據權利要求1所述的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其特征在于，所述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒通過包括以下步驟的方法制備1)在室溫、攪拌的條件下，反應體系中依次加入聚醚胺、一元醇、狗304納米顆粒、水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4納米顆粒0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)將步驟1)得到的混合溶液在攪拌、通入氮氣保護、水浴加熱和加裝回流裝置的條件下進行水解反應，所得沉淀經磁分離、洗滌、并在有氮氣保護的條件下干燥；3)將步驟幻得到的產物在400 600°C的氮氣氣氛下煅燒除去聚醚胺模板，得到具有三維蠕蟲狀介孔孔道的超順磁性二氧化硅納米顆粒。
6.根據權利要求1所述的磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的系統，其特征在于，所述鼓泡床反應器(1)內的產漆酶菌株為變色栓菌。
7.一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)將固定化產漆酶菌株按10-20%ν/ν的裝載量置入鼓泡床反應器(1)中進行發(fā)酵， 其中，培養(yǎng)基裝液量為65-75% ν/ν，鼓泡床反應器中的總裝載量控制在85% ；2)發(fā)酵48-60h后，通過蠕動泵( 將鼓泡床反應器(1)中的發(fā)酵液導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置(3)中進行選擇性分離，其中，所述磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置的罐體(3-5)中裝有表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒，其濃度為 10-20g/L，吸附發(fā)酵液中的漆酶，所述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒具有三維蠕蟲狀介孔孔道，顆粒的粒徑為100 400nm，比表面積為400 850m2/g，其中，所述三維蠕蟲狀介孔孔道的孔徑范圍為2 30nm，孔體積范圍為0. 823 2. 996m3/g ；3)分離漆酶后的發(fā)酵液從磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置C3)的出料口(3-8)在蠕動泵O)的作用下返回鼓泡床反應器(1)中繼續(xù)發(fā)酵；4)發(fā)酵結束后，洗脫表面螯合有銅離子的超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒吸附的漆酶，其中，步驟2)和步驟3)中蠕動泵(2)的流速為每分鐘鼓泡床反應器體積的 1/100-200，且兩個蠕動泵中料液的流速保持一致。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述超順磁性二氧化硅介孔納米顆粒通過包括以下步驟的方法制備1)在室溫、攪拌的條件下，反應體系中依次加入聚醚胺、一元醇、狗304納米顆粒、水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4納米顆粒0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)將步驟1)得到的混合溶液在攪拌、通入氮氣保護、水浴加熱和加裝回流裝置的條件下進行水解反應，所得沉淀經磁分離、洗滌、并在有氮氣保護的條件下干燥；3)將步驟幻得到的產物在400 600°C的氮氣氣氛下煅燒除去聚醚胺模板，得到具有三維蠕蟲狀介孔孔道的超順磁性二氧化硅納米顆粒。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述鼓泡床反應器(1)內所固定的產漆酶菌株為變色栓菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體地，本發(fā)明涉及一種漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統及方法。根據本發(fā)明提供的漆酶發(fā)酵與分離耦合的系統，其包括鼓泡床反應器、磁性介質顆粒原位連續(xù)分離的裝置和蠕動泵，其中，鼓泡床反應器頂部和底部分別通過蠕動泵與磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置的進料口和出料口相連通；根據本發(fā)明提供的漆酶發(fā)酵與分離耦合的方法，包括將固定化產漆酶菌株置入鼓泡床反應器中進行發(fā)酵，通過蠕動泵將發(fā)酵液導入磁性介質顆粒原位連續(xù)分離裝置中進行選擇性分離，分離后發(fā)酵液在蠕動泵的作用下返回鼓泡床反應器中繼續(xù)發(fā)酵，本發(fā)明提供的系統和方法改變了傳統漆酶生產的模式，提高發(fā)酵和分離的水平，而且操作簡單，便于放大。
文檔編號C12N9/02GK102337201SQ20101023842
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者劉春朝, 王 鋒, 郭晨 申請人:中國科學院過程工程研究所