專利名稱：珍珠蚌銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種珍珠蛘褶紋冠蛘銅鋅超氧化物歧化酶基因工程菌的構(gòu)建及酶產(chǎn) 物生產(chǎn)和純化工藝，屬于生物酶制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家終于揭開了影響人類健康長壽之迷，自由基是 導(dǎo)致人類各種疾病的原兇。同時也發(fā)現(xiàn)了清除體內(nèi)自由基的酶一超氧化物歧化酶SOD。SOD 是國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的能清除體內(nèi)自由基的活性酶。超氧化物歧化酶(SOD)具有專一清除生物體內(nèi)的超氧離子，平衡機(jī)體的氧自由 基，保護(hù)人體細(xì)胞免受環(huán)境因素破壞，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明SOD酶抗衰老、抗輻射、抗疲勞、消 炎，抑制腫瘤和癌細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力，能有效降低血脂、膽固醇和血壓，起到增強(qiáng)肝腎的 功能，預(yù)防前列腺炎，調(diào)節(jié)女性生理周期，推遲更年期。SOD酶對糖尿病也有明顯的恢復(fù)作 用。目前SOD酶已作為一種保健醫(yī)藥產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品等行業(yè)，具有非常 廣闊的市場。但目前商品化的SOD酶由于熱穩(wěn)定性差，非常容易失活，極大的影響其功能的正 常發(fā)揮，市場需求受到極大制約。目前市場流通的S0D，大多是從動物血液中提取的，用于人 類難以消除各種病毒及外源污染，并且歐盟已于1999年頒布法令，禁止從動物血液中提取 的SOD用于人類。目前日本、加拿大等國家也開始采用基因重組等新的生物工程技術(shù)來合 成SOD。因此利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性，高耐熱性的SOD酶是當(dāng)前SOD酶開發(fā)最重 要的途徑。中國專利(CN1263158 “重組超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、產(chǎn)物制備方 法”公開了一種重組超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌產(chǎn)物制備方法。其基因來自絲狀 蘭藻_魚腥藻的總DNA，克隆到pET32載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)，得工程菌。將工 程菌高密度培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)后，基因得到大量表達(dá)。產(chǎn)物經(jīng)DEAE-S印hadexA-50柱層析， 純化產(chǎn)物為一種重組超氧化物歧化酶。上述發(fā)明獲得的是來自于魚腥藻的含有199個氨基酸殘基的成熟蛋白的SOD酶， 而且在表達(dá)過程中沒有加入一定濃度的CuSO4和ZnCl2,因此酶的比活不是太高，而且表達(dá) 產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，因此要獲得有活性的酶產(chǎn)物需要一個比較繁瑣的復(fù)性過程。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用分子克隆和基因重組技術(shù)，開發(fā)一 種來自于褶紋冠蛘的SOD酶產(chǎn)品通過分子克隆技術(shù)獲得褶紋冠蛘銅鋅超氧化物歧化酶 (Cp-CuZnSOD)基因，經(jīng)過與國際基因數(shù)據(jù)庫(GeneBank)比對，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的SOD酶氨 基酸序列與全球已知SOD酶基因同源性相比，是一個全新的SOD酶基因，編碼155個氨基酸 的成熟蛋白。利用該基因構(gòu)建了一種基因工程菌，該工程菌產(chǎn)生的SOD酶活性高，性質(zhì)穩(wěn) 定，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的技術(shù)方案是挑選健康的褶紋冠蛘，從蛘組織細(xì)胞或血細(xì)胞中提取總RNA。按照 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 的方法合成 cDNA。以 第一鏈 cDNA 為模板，用一對表達(dá)引物 SODFb 5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3'，SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3‘進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 用膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶Kpn I 和EcoR I雙酶切后用T4 DNA連接酶將Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌DH5a，用含卡那霉素的LB瓊脂平板篩選陽性克隆，將測序驗(yàn)證后的陽性重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組表達(dá)菌。重組表達(dá)菌接種于LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至 對數(shù)生長期，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。同時在培養(yǎng)基中同時加入一定 濃度的Cu2+和Zn2+離子，轉(zhuǎn)移至20°C _25°C下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時，離心收集菌體。將收集的 菌體超聲波裂解后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先 用含50mmOl/L-250mmOl/L咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白，然后將洗脫液置于透析袋，PBS透 析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。專利CN1263158與本發(fā)明的差異對比表
專利 CNl263158本發(fā)明
基因來源魚腥藻褶紋冠蛘
表達(dá)質(zhì)粒pET32pET30
重組菌的篩選氨芐青霉素LB培養(yǎng)基卡那霉素LB培養(yǎng)基
誘導(dǎo)劑IPTGIPTG
誘導(dǎo)溫度37 0C20-25 0C
P1,2+誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基中未添加Cu2+離子和Zn2+培養(yǎng)基中添加一定濃度的UU
離子離子和Zn2+離子
產(chǎn)物狀態(tài)包涵體，需復(fù)性產(chǎn)物才具有活可溶蛋白，無需復(fù)性
性
產(chǎn)物純化方式DEAE-SephadexA-50 柱層析鎳離子親和柱層析
產(chǎn)物大小編碼199個氨基酸的成熟蛋白編碼155個氨基酸的成熟蛋白
產(chǎn)物活性一般較高
SOD酶技術(shù)指標(biāo)j■組SOD酶的比活5368U，純化產(chǎn)物在pH5. 0 10. 0、溫度10
60°C范圍內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，并司耐受2 8mol 的尿素和1 % 6%的十二烷基硫酸鈉(SDS)。
本發(fā)明的有益效果是制備工藝流程簡便，易于組織生產(chǎn)，SOD產(chǎn)量高、活性高、成 本低，產(chǎn)品適用于醫(yī)療及水產(chǎn)領(lǐng)域。


附圖為珍珠蛘銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法工藝流程方框圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1挑選健康的褶紋冠蛘，從蛘閉殼肌血竇中抽取血液IOmL ；4°C、3600rpm離心5min ；棄上清，獲得細(xì)胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol試劑提取血細(xì)胞中 的總RNA，取上面獲得的細(xì)胞沉淀，加入ImL的Trizol，反復(fù)吹打使Trizol充分裂解血細(xì) 胞。室溫靜置lOmin，于4°C、12000Xg離心IOmin ；取上清，加入0. 2mL氯仿，劇烈搖動15s， 室溫靜置3min,4°C、12000 X g離心15min ；取上清，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入0. 5mL的 異丙醇，室溫靜置lOmin，于4°C、10000Xg離心lOmin。沉淀用75%乙醇洗滌后，-35°C保 存在 100% 乙醇中，備用。按照 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 的 方法合成cDNA。取總RNA 5 μ g，加入CDS引物和Smart II引物各1 μ L，70°C保溫3min 后，冰上速冷2min ；然后在終體積為20 μ L的反應(yīng)體系中，加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液 (250mmol/LTris-HCl,pH8. 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgC12)4 μ L、DTT(20mmol/L)2 μ L、 dNTP(10mmol/L) IyL 和逆轉(zhuǎn)錄酶 Primerscript II transcriptase 1 μ L，42°C保溫 Ih 合 成第一鏈cDNA，合成反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中完成。以第一鏈cDNA為模板，用表達(dá)引物SODFb 5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3' ， SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的 PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙酶切后用T4 DNA連接 酶將Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布于含卡那霉 素50 μ g/ml的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；PCR鑒定陽性克隆后接種陽性克隆抽提重組質(zhì) 粒，用Kpn I和EcoR I雙酶切并瓊脂糖電泳作初步鑒定，然后交測序公司測定序列以驗(yàn)證 重組質(zhì)粒pET30-CpS0D。將pET30-CpS0D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，PCR方法鑒定陽性菌落， 獲得重組表達(dá)菌。用含重組質(zhì)粒pET30-CpS0D菌體接種至少量LB (含卡那霉素50 μ g/mL, LBK)培養(yǎng)基中37°C、220r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)產(chǎn)物作為菌種，次日按1 1000比例轉(zhuǎn)接至 大量LBK，于37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度 為1.0mmol/L。并且在培養(yǎng)基中同時加入0. 5mmol/L的Cu2+離子和0. Immo 1/L的Zn2+離子， 在20°C下繼續(xù)培養(yǎng)8小時，12，OOOg離心5min，收集菌體。將收集的菌體用PBS(20mmol/L 磷酸鹽，0. 5mol/L氯化鈉，pH 7. 4)緩沖液重懸，超聲裂菌(功率300W，破5s停15s，超聲 2min，冰浴)后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先用 含 50mmol/L 咪唑的洗脫 Buffer(50mM 咪唑，50mmol/L Tris-HCl, IOOmmo 1/L NaCl，8mol/ L Urea，pH8. 0)洗脫雜蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脫Buffer (250mM咪唑，50mmol/LT ris-HCl, 100mmol/LNaCl,8mol/L Urea, pH8. 0)洗脫目的蛋白。將洗脫液置于透析袋，PBS 透析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。實(shí)施例2挑選健康的褶紋冠蛘，從蛘閉殼肌血竇中抽取血液IOmL ；4°C、3600rpm離心5min ； 棄上清，獲得細(xì)胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol試劑提取血細(xì)胞中 的總RNA，取上面獲得的細(xì)胞沉淀，加入ImL的Trizol，反復(fù)吹打使Trizol充分裂解血細(xì) 胞。室溫靜置lOmin，于4°C、12000Xg離心IOmin ；取上清，加入0. 2mL氯仿，劇烈搖動15s， 室溫靜置3min,4°C、12000 X g離心15min ；取上清，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入0. 5mL的 異丙醇，室溫靜置lOmin，于4°C、10000Xg離心lOmin。沉淀用75%乙醇洗滌后，-35°C保 存在 100% 乙醇中，備用。按照 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 的 方法合成cDNA。取總RNA 5 μ g，加入CDS引物和Smart II引物各1 μ L，70°C保溫3min 后，冰上速冷2min ；然后在終體積為20 μ L的反應(yīng)體系中，加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl，ρΗ8· 3 ；375mmol/LKCl ；30mmol/L MgC12)4 μ L、DTT(20mmol/L) 2 μ L、 dNTP(10mmol/L) IyL 和逆轉(zhuǎn)錄酶 Primerscript II transcriptase 1 μ L，42°C保溫 Ih 合 成第一鏈cDNA，合成反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中完成。以第一鏈cDNA為模板，用表達(dá)引物SODFb 5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3' ， SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的 PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙酶切后用T4DNA連接 酶將Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a (+)中并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布于含卡那霉 素50 μ g/ml的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；PCR鑒定陽性克隆后接種陽性克隆抽提重組質(zhì) 粒，用Kpn I和EcoR I雙酶切并瓊脂糖電泳作初步鑒定，然后交測序公司測定序列以驗(yàn)證 重組質(zhì)粒pET30-CpS0D。將pET30-CpS0D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，PCR方法鑒定陽性菌落， 獲得重組表達(dá)菌。用含重組質(zhì)粒pET30-CpS0D菌體接種至少量LB (含卡那霉素50 μ g/mL, LBK)培養(yǎng)基中37°C、220r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)產(chǎn)物作為菌種，次日按1 1000比例轉(zhuǎn)接至 大量LBK，于37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度 為0. 5mmol/L0并且在培養(yǎng)基中同時加入0. 6mmol/L的Cu2+離子和0. 15mmol/L的Zn2+離 子，在25°C下繼續(xù)培養(yǎng)8小時，12，OOOg離心5min，收集菌體。將收集的菌體用PBS (20mmol/ L磷酸鹽，0. 5mol/L氯化鈉，pH 7.4)緩沖液重懸，超聲裂菌(功率300W，破5s停15s，超 聲2min，冰浴)后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先 用含 50mmol/L 咪唑的洗脫 Buffer (50mM 咪唑，50mmol/L Tris-HCl，1 OOmmo 1/L NaCl，8mol/ L Urea, pH8. 0)洗脫雜蛋白，后用含200mmol/L咪唑的洗脫Buffer (250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl, 100mmol/LNaCl,8mol/L Urea，pH8. 0)洗脫目的蛋白。將洗脫液置于透析袋，PBS 透析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。實(shí)施例3挑選健康的褶紋冠蛘，從蛘閉殼肌血竇中抽取血液IOmL ；4°C、3600rpm離心5min ； 棄上清，獲得細(xì)胞沉淀用于RNA提取。采用Invitrogen公司的Trizol試劑提取血細(xì)胞中 的總RNA，取上面獲得的細(xì)胞沉淀，加入ImL的Trizol，反復(fù)吹打使Trizol充分裂解血細(xì) 胞。室溫靜置lOmin，于4°C、12000Xg離心IOmin ；取上清，加入0. 2mL氯仿，劇烈搖動15s， 室溫靜置3min,4°C、12000 X g離心15min ；取上清，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入0. 5mL的 異丙醇，室溫靜置lOmin，于4°C、10000Xg離心lOmin。沉淀用75%乙醇洗滌后，-35°C保 存在 100% 乙醇中，備用。按照 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 的 方法合成cDNA。取總RNA 5 μ g，加入CDS引物和Smart II引物各1 μ L，70°C保溫3min 后，冰上速冷2min ；然后在終體積為20 μ L的反應(yīng)體系中，加入5Χ第一鏈反應(yīng)緩沖液 (250mmol/LTris-HCl,pH8. 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgC12)4 μ L、DTT(20mmol/L)2 μ L、 dNTP(10mmol/L) IyL 和逆轉(zhuǎn)錄酶 Primerscript II transcriptase 1 μ L，42°C保溫 Ih 合 成第一鏈cDNA，合成反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中完成。以第一鏈cDNA為模板，用表達(dá)引物SODFb 5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G-3' ， SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAATTT TGA AAT TCC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的 PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙酶切后用T4 DNA連接 酶將Cp-icCuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布于含卡那 霉素50 μ g/ml的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；PCR鑒定陽性克隆后接種陽性克隆抽提重組質(zhì)粒，用Kpn I和EcoR I雙酶切并瓊脂糖電泳作初步鑒定，然后交測序公司測定序列以驗(yàn) 證重組質(zhì)粒pET30-CpS0D。將pET30-CpS0D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，PCR方法鑒定陽性菌 落，獲得重組表達(dá)菌。用含重組質(zhì)粒pET30-CpS0D菌體接種至少量LB (含卡那霉素50 μ g/ mL，LBK)培養(yǎng)基中37°C、220r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)產(chǎn)物作為菌種，次日按1 1000比例轉(zhuǎn)接 至大量LBK，于37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃 度為1. Ommol/Lο并且在培養(yǎng)基中同時加入0. 8mmol/L的Cu2+離子和0. 2mmol/L的Zn2+離 子，在20°C下繼續(xù)培養(yǎng)4小時，12，OOOg離心5min，收集菌體。將收集的菌體用PBS (20mmol/ L磷酸鹽，0. 5mol/L氯化鈉，pH 7.4)緩沖液重懸，超聲裂菌(功率300W，破5s停15s，超 聲2min，冰浴)后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先 用含 50mmol/L 咪唑的洗脫 Buffer (50mM 咪唑，50mmol/L Tris-HCl，1 OOmmo 1/L NaCl，8mol/ L Urea, pH8. 0)洗脫雜蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脫Buffer (250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl, 100mmol/LNaCl,8mol/L Urea，pH8. 0)洗脫目的蛋白。將洗脫液置于透析袋，PBS 透析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。實(shí)施例4取健康褶紋冠蛘蛘肝胰腺0. Ig,加液氮碾磨，將碾磨碎的組織轉(zhuǎn)移至1. 5ml EP管 中，加入Trizol試劑使細(xì)胞充分裂解，靜置5min,4°C、12000 X g離心IOmin ；取上清，加入 0. 25mL氯仿，劇烈搖動15s，室溫靜置2min，4°C、12000 X g離心IOmin ；取上清，轉(zhuǎn)移到干凈 的EP管中，加入0. 5m L的異丙醇，室溫靜置lOmin，4°C、10000 X g離心lOmin。沉淀用75%乙 醇洗滌，-20V保存在100%乙醇中備用。取上述總RNA 5 μ g，加入⑶S引物和Smart II引物 各1 μ L，70°C保溫3min后，冰上速冷2min ；然后在終體積為20 μ L的反應(yīng)體系中，加入5X 第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl, pH8. 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgC12)4yL、 DTT (20mmol/L) 2 μ L、dNTP (IOmmo 1/L) 1 μ L 禾口逆轉(zhuǎn)錄醇 Primerscript II transcriptase 1 μ L，42°C保溫Ih合成第一鏈cDNA，合成反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中完成。以第一鏈cDNA為模 板，用表達(dá)引物 SODFb :5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3'，SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3‘進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對 產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收的PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I 雙酶切后用T4 DNA連接酶將Cp-CuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a，涂布于含卡那霉素50μ g/ml的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；PCR鑒定陽性克隆后接 種陽性克隆抽提重組質(zhì)粒，用Kpn I和EcoR I雙酶切并瓊脂糖電泳作初步鑒定，然后交測 序公司測定序列以驗(yàn)證重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，PCR方法鑒定陽性 菌落，獲得重組表達(dá)菌。用含重組質(zhì)粒pET30-CpS0D菌體接種至少量LB (含卡那霉素50yg/ mL，LBK)培養(yǎng)基中37°C、220r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)產(chǎn)物作為菌種，次日按1 1000比例轉(zhuǎn)接 至大量LBK，于37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃 度為0. 5mmol/L。并且在培養(yǎng)基中同時加入0. 6mmol/L的Cu2+離子和0. 2mmol/L的Zn2+離 子，在25°C下繼續(xù)培養(yǎng)4小時，12，OOOg離心5min，收集菌體。將收集的菌體用PBS (20mmol/ L磷酸鹽，0. 5mol/L氯化鈉，pH 7.4)緩沖液重懸，超聲裂菌(功率300W，破5s停15s，超 聲2min，冰浴)后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先 用含 50mmol/L 咪唑的洗脫 Buffer (50mM 咪唑，50mmol/L Tris-HCl，IOOmmo 1/L NaCl，8mol/ L Urea, pH8. 0)洗脫雜蛋白，后用含250mmol/L咪唑的洗脫Buffer (250mM咪唑，50mmol/LTris-HCl, 100mmol/L NaCl,8mol/L Urea，pH8. 0)洗脫目的蛋白。將洗脫液置于透析袋，PBS 透析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。實(shí)施例5取健康褶紋冠蛘蛘肝胰腺0. Ig,加液氮碾磨，將碾磨碎的組織轉(zhuǎn)移至1. 5ml EP管 中，加入Trizol試劑使細(xì)胞充分裂解，靜置5min,4°C、12000 X g離心IOmin ；取上清，加入 0. 25mL氯仿，劇烈搖動15s，室溫靜置2min，4°C、12000 X g離心IOmin ；取上清，轉(zhuǎn)移到干凈 的EP管中，加入0. 5mL的異丙醇，室溫靜置lOmin，4°C、10000 X g離心lOmin。沉淀用75%乙 醇洗滌，-20V保存在100%乙醇中備用。取上述總RNA 5 μ g，加入⑶S引物和Smart II引物 各1 μ L，70°C保溫3min后，冰上速冷2min ；然后在終體積為20 μ L的反應(yīng)體系中，加入5X 第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl, pH8. 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgC12)4yL、 DTT (20mmol/L) 2 μ L、dNTP (lOmmol/L) 1 μ L 禾口逆轉(zhuǎn)錄醇 Primerscript II transcriptase 1 μ L，42°C保溫Ih合成第一鏈cDNA，合成反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中完成。以第一鏈cDNA為模 板，用表達(dá)引物 SODFb :5' -AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAGGCT GTT TGC G-3'，SODRb 5' -GGA GAA TTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC-3‘進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對產(chǎn) 物進(jìn)行回收，將回收的PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙 酶切后用T4 DNA連接酶將Cp-icCuZnSOD基因克隆入pET30a(+)中并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a，涂布于含卡那霉素50μ g/ml的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；PCR鑒定陽性克隆后接 種陽性克隆抽提重組質(zhì)粒，用Kpn I和EcoR I雙酶切并瓊脂糖電泳作初步鑒定，然后交測 序公司測定序列以驗(yàn)證重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，PCR方法鑒定陽性 菌落，獲得重組表達(dá)菌。用含重組質(zhì)粒pET30-CpS0D菌體接種至少量LB (含卡那霉素50 μ g/ mL，LBK)培養(yǎng)基中37°C、220r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)產(chǎn)物作為菌種，次日按1 1000比例轉(zhuǎn)接 至大量LBK，于37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃 度為1. Ommol/Lο并且在培養(yǎng)基中同時加入0. 4mmol/L的Cu2+離子和0. lmmol/L的Zn2+離 子，在25°C下繼續(xù)培養(yǎng)6小時，12，OOOg離心5min，收集菌體。將收集的菌體用PBS (20mmol/ L磷酸鹽，0. 5mol/L氯化鈉，pH 7.4)緩沖液重懸，超聲裂菌(功率300W，破5s停15s，超 聲2min，冰浴)后收集上清。將上清流過已經(jīng)平衡好的(His)鎳離子親和層析預(yù)裝柱，先 用含 50mmol/L 咪唑的洗脫 Buffer (50mM 咪唑，50mmol/L Tris-HCl，1 OOmmo 1/L NaCl，8mol/ L Urea, pH8. 0)洗脫雜蛋白，后用含200mmol/L咪唑的洗脫Buffer (250mM咪唑，50mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L NaCl,8mol/L Urea，pH8. 0)洗脫目的蛋白。將洗脫液置于透析袋，PBS 透析除去鹽物質(zhì)及咪唑，用聚乙二醇8000濃縮。得到純化的濃縮重組褶紋冠蛘銅鋅SOD酶。
權(quán)利要求
一種珍珠蚌銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法，包括從生物組織或血細(xì)胞中提取總RNA，克隆銅鋅超氧化物歧化酶基因，將酶基因與原核表達(dá)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過篩選得到工程菌，將工程菌高密度培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)，純化得到銅鋅超氧化物歧化酶，其特征在于(1)從健康的褶紋冠蚌組織或血細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用表達(dá)引物SODFb5′ AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G 3′，SODRb5′ GGA GAATTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC 3′對銅鋅超氧化物歧化酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)選用PET30原核表達(dá)質(zhì)粒與目的基因連接；(3)用卡那霉素LB培養(yǎng)基對重組菌進(jìn)行篩選；(4)在誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)基內(nèi)添加Cu2+離子和Zn2+離子，誘導(dǎo)溫度為20℃ 25℃；(5)通過鎳離子親和柱層析對產(chǎn)物進(jìn)行純化；(6)用聚乙二醇8000對蛋白進(jìn)行濃縮。
全文摘要
一種珍珠蚌銅鋅超氧化物歧化酶的制備方法。是通過提取一種育珠蚌褶紋冠蚌的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)獲得褶紋冠蚌銅鋅超氧化物歧化酶基因的全長cDNA，將cDNA克隆到pET30載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組工程菌。將工程菌在LB培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)，同時在培養(yǎng)基中加一定濃度的Cu2+和Zn2+后，重組基因得到大量表達(dá)。產(chǎn)物經(jīng)親和層析柱，得到純化的重組超氧化物歧化酶。該發(fā)明準(zhǔn)確獲得含有155個氨基酸殘基的成熟蛋白序列，該酶具有抗氧化、抗衰老作用。本方法獲得的菌體產(chǎn)量高，表達(dá)量高，活性高，產(chǎn)物對酸堿、溫度、變性劑均很穩(wěn)定，對乙醇損傷的LO-2肝細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，且易純化，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/08GK101921786SQ20101023791
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者徐歡歡, 文春根, 胡寶慶, 范小勇 申請人:南昌大學(xué)