亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一株異戊酰螺旋霉素i組分高含量、高產(chǎn)量基因工程菌的制作方法

文檔序號:584961閱讀:261來源:國知局
專利名稱:一株異戊酰螺旋霉素i組分高含量、高產(chǎn)量基因工程菌的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及利用調(diào)節(jié)基因技術構建獲得抗生素單一組分高含量、高產(chǎn)量菌株。
背景技術
必特螺旋霉素(原名生技霉素)[專利號ZL97104440. 6]是利用基因工程技術研 制的螺旋霉素衍生物。必特螺旋霉素對革蘭氏陽性菌有較強的活性,尤其對肺炎鏈球菌、肺 炎支原體、衣原體活性強,對紅霉素和內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌、流感桿菌、軍團菌、產(chǎn)氣 莢膜梭菌有抗菌活性;與同類藥沒有完全交叉耐藥性。它有較高的親脂性,口服吸收快,組 織滲透性強,分布廣,體內(nèi)維持時間長,有較好的抗生素后效應。目前已完成基因工程必特 螺旋霉素的三期臨床試驗研究,結果顯示良好的療效和安全性,目前正在申報國家一類新 藥證書。臨床研究已經(jīng)證明,必特螺旋霉素是一個服用安全有效的抗生素,其療效不亞于 目前公認最好的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿奇霉素。然而,其本身是多組分藥物,盡管按照目前 建立的片劑生產(chǎn)工藝,可以得到產(chǎn)品組分比例可控、質(zhì)量穩(wěn)定的必特螺旋霉素,然而其對提 取、純化工藝的控制要求比較高,質(zhì)量檢測過程也比較繁鎖。同時為了提高其在臨床的治 療效率,有必要研制其注射劑,眾所周注射劑藥效迅速,適用于對危重病人或不宜口服的病 人。注射劑在質(zhì)量控制方面要求更高。通常對于經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的多組分抗生素,按照化學藥 品的質(zhì)控方式很難控制其質(zhì)量,而且工藝條件的細小變化均有可能導致物質(zhì)基礎的變化, 而這些質(zhì)量上的變化較難通過終產(chǎn)品的質(zhì)量標準加以控制,從而可能會引發(fā)不可預測的不 良反應。這就是至今尚無發(fā)酵產(chǎn)生的多組分注射劑問世的原因。必特螺旋霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生多組分是源于螺旋霉素的多組分。螺旋霉素是一個大環(huán) 內(nèi)酯類抗生素,其主核是一個由16元環(huán)組成的內(nèi)酯環(huán),與普拉特內(nèi)酯同質(zhì),含有三個糖分 子福洛糖胺、碳霉糖胺和碳霉糖,而必特螺旋霉素主組分是螺旋霉素碳霉糖4’位羥基被異 戊?;セ难苌?。由于螺旋霉素產(chǎn)生菌中存在3-0?;D移酶基因,因而使螺旋霉素 內(nèi)酯環(huán)3位羥基可以進行乙?;纬陕菪顾豂I組分和丙?;纬陕菪顾豂II組分, 內(nèi)酯環(huán)3位為羥基時為螺旋霉素I組分,所以必特螺旋霉素至少也含有異戊酰螺旋霉素I、 II、III三個組分。必特螺旋霉素主組分的化學結構如下福洛糖胺普拉特內(nèi)酯碳霉糖胺碳霉糖必特螺旋霉素結構
3
其中異戊酰螺旋·請IIIR =COCH2CH3R,= COCH2CH(CH3)2
異戊酰螺旋·請IIR =COCH3R,= COCH2CH(CH3)i
異戊酰螺旋·I素ιR =HR,= COCH2CH(CH3)已有研究表明,螺旋霉素的三種組分之間及異戊酰螺旋霉素的三種組分之間,其 抗菌活性無顯著差異。為了減少菌種產(chǎn)生多種組分,本實驗室利用基因重組技術,在必特 螺旋霉素產(chǎn)生菌WSJ-I中,通過阻斷3-0酰基轉移酶基因,構建了只產(chǎn)生異戊酰螺旋霉 素 I 組分的菌種 WSJ-2 [Chunyan Ma et al. CurrentMicrobiology, 2010, DOI 10. 1007/ S00284-010-9664-8]。但是,該菌種發(fā)酵單位很低,不利于進行規(guī)?;a(chǎn)。本發(fā)明擬利用 調(diào)節(jié)基因acyB2,改造必特螺旋霉素產(chǎn)生菌,以提高異戊酰螺旋霉素I組分的含量及產(chǎn)量。已知來源于耐熱鏈霉菌的異戊酰基轉移酶基因ist與調(diào)節(jié)基因acyB2連鎖,調(diào)節(jié) 基因的存在可以激活ist基因的表達,含有完整ist和acyB2調(diào)節(jié)基因的變鉛青鏈霉菌可 以將67-79%泰洛菌素轉化為4”異戊酰泰洛菌素,而僅含有單個ist或ist與不完整的 acyB2基因的變鉛青鏈霉菌對泰洛菌素的轉化率僅為0-2.4% [Arisawa A et al =Biosci Biotechnol Biochem 1993,57(12) :2020_2025]。將 ist 和 acyB2 基因轉入泰洛菌素產(chǎn)生 菌(Str印tomyces fradiae),其轉化子經(jīng)發(fā)酵可以產(chǎn)生4”異戊酰泰洛菌素[Arisawa A. et al J Antibiotics 1996,49 (4) :349_354]。acyB2調(diào)節(jié)基因與螺旋霉素產(chǎn)生菌(Str印tomyces ambofaciens)中的轉錄調(diào)控 蛋白 Srm28c 同源[Fatma Karray et al Microbiology 2007,153,4111-4122],其一致性 (identity)為69%,與泰洛菌素產(chǎn)生菌(Str印tomyces fradiae)中的調(diào)控蛋白tylR的 一致性為41%,tylR為泰洛菌素產(chǎn)生菌生物合成正調(diào)控蛋白,它調(diào)控泰洛菌素中一個聚 酮合酶模塊(tylGI)的表達,同時還對泰洛菌素糖基的合成和聚酮環(huán)的氧化起調(diào)控作用。 tylR基因在產(chǎn)生菌的高表達,可以提高泰洛菌素的產(chǎn)量[GeorgeS. etal Mol. Microbiology 2004,54(5) 1326-1334]。本實驗室曾利用基因工程技術將ist基因進行串連,使ist基因在螺旋霉素產(chǎn)生 菌中增加其拷貝數(shù),通過增強其基因劑量提高產(chǎn)生菌異戊?;芰?;同時也利用強啟動 活性的啟動子如紅霉素抗性基因ermE啟動子序列,替換原ist基因啟動子序列,以增強 ist基因的表達,使基因工程菌產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素主組分含量提高了 62% [專利申請?zhí)?200910148767. 8]。本發(fā)明的目的,旨在利用調(diào)節(jié)基因acyB2激活ist基因表達的特點,將ist與調(diào)節(jié) 基因acyB2在螺旋霉素產(chǎn)生菌中共表達,以獲得必特螺旋霉素單組分異戊酰螺旋霉素I的 高含量及高產(chǎn)量菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了異戊酰螺旋霉素I組分高含量、高產(chǎn)量菌株。本發(fā)明還提供了異戊酰螺旋霉素I組分高含量、高產(chǎn)量菌株的構建與制備,具體 包括以下步驟1、構建含ist_acyB2雙基因重組質(zhì)粒pSET52_ia ;2、將重組質(zhì)粒pSET52_ia轉入異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌,轉化子發(fā)酵經(jīng)培養(yǎng),微生
4物法檢測產(chǎn)生菌發(fā)酵效價,并以HPLC定量分析異戊酰螺旋霉素I的含量;3、以含ist單基因異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌作為對照,比較acyB2基因引入其中 后發(fā)酵效價及產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I組分的比例,證明acyB2調(diào)節(jié)基因的引入能明顯提高 菌種產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I組分的含量及產(chǎn)量。發(fā)明效果本發(fā)明的積極效果在于證明acyB2調(diào)節(jié)基因引入異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌,可以 提高產(chǎn)生菌發(fā)酵單位414%,提高異戊酰螺旋霉素組分I含量170. 2%,不僅有利于簡化單 組份抗生素工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制與檢測標準,為注射劑型的制備創(chuàng)造了條件,而且可為 進一步提高臨床治療效果增添一種手段。


圖1 ist_acyB2基因重組質(zhì)粒pSET52_ia的構建圖2含ist-acyB2基因重組質(zhì)粒pSET52_ia菌種WSJ-IA發(fā)酵產(chǎn)生異戊酰螺旋霉 素I組分HPLC分析其中A WSJ-2為含單ist基因菌種對照;B WSJ-IA為含ist和調(diào)節(jié)基因acyB2的 基因工程菌實施方案以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本 發(fā)明?!秾嵤├?》構建含ist_acyB2雙基因重組質(zhì)粒pSET52_ia從本實驗室原先構建的重組質(zhì)粒pSW4中[尚廣東等,生物工程學1999,15(2) 171],用SmaI-BamHI酶切,獲得含ist完整基因和部分acyB2基因1820bp片段,以 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供的耐熱鏈霉菌(Str印tomyces thermotolarences CGMCC4. 1501)總DNA為模板,根據(jù)NCBI公布的acyB2序列,設計引物 pi 5' -CGCTCAGGGACGCAAGACC-3‘禾ΠΡ2 :5’ -CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC-3, (EcoRI),通過 PCR 反應獲得 acyB2部分基因1013bp片段,將PCR產(chǎn)物用BamHI-Ec0RI酶切,獲得934bp片段,將上述 SmaI-BamHI (1820bp)、BamHI-EcoRI (934bp)片段連入 pBluesript II KS (+)載體(Merck 公司)的SmaI-EcoRI酶切位點,獲得含ist和完整acyB2基因重組質(zhì)粒pBKS_ia。通過 XbaI-EcoRI酶切位點連入大腸桿菌/鏈霉菌接合轉移質(zhì)粒pSET152 (來自基因酷共享資源 www. genecool. com),獲得ist_acyB2雙基因重組質(zhì)粒pSET52_ia。構建流程見圖1。《實施例2》重組質(zhì)粒pSET52_ia轉化異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌WSJ-2為本實驗室構建,發(fā)表在[Chunyan Ma et al. Current Microbiology 2010,DOI 10. 1007/s00284-010-9664_8]。菌種在斜面培養(yǎng)基 [黃豆餅粉 2.0%,葡萄糖 1.0%,淀粉 3.0%,CaCO3 0. 5%, NaCl 0.4%,瓊脂 2.0%]上 28 °C 培養(yǎng) 7-10 天,按照文獻[D. A. Hopwood 等 Genetic manipulation ofStreptomyces, A Laboratory Manual, Norwich John Innes Foundation UK,1985]描述的方法制備原 生質(zhì)體,具體來說是將菌種挖塊接種至含蔗糖R2YE培養(yǎng)基[蔗糖10. 3 %,葡萄糖1.0%, 酵母提取液0. 4 %,胰蛋白胨0. 2 %,蛋白胨0. 4%,酪蛋白氨基酸0.4%,K2SO4 0. 025 %,
5CaCl2 0. 216%, KH2PO4 0. 005%, MgCl2 · 6H201. 012%,在 IOOml 培養(yǎng)基中加入 NaOH(lmol/ L)0.5ml,Tris-HCl (0. 25mol/LpH7. 2) 10ml,微量元素溶液[ZnCl2 0.04 %,F(xiàn)eCl3 · 6H20 0. 02%, CuCl2 0. 001%, MnCl · 4H20 0. 001%, Na2B4O7 · 10H20 0. 001%, (MM)6MO7O2 · 4H20 0. 0012% ]0· 2ml,28°C培養(yǎng)2-4天,以10%接種量轉種上述培養(yǎng)基,并加入0. 5%甘氨酸, 培養(yǎng)20小時,離心收集菌絲,用10. 3 %蔗糖溶液洗滌2-3次,在含溶菌酶2mg/ml的P溶 液[Tris-HCl (pH8.0)lmol/L 0. 31ml,CaCl2 · 2H20 0. 368 %, MgCl2 ‘ 6Η20 0.204%,蔗糖 10. 3%,葡萄糖0. 1%,微量元素溶液0. 2ml]中37°C溶菌15-60分鐘,經(jīng)棉花過濾獲得原生 質(zhì)體。將重組質(zhì)粒pSET52-ia在PEG介導下轉入原生質(zhì)體,并涂布于R2YE固體培養(yǎng)基,28°C 培養(yǎng)24小時后,用含阿泊拉霉素溶液覆蓋培養(yǎng)物,使阿泊拉霉素在培養(yǎng)基中的終濃度為50 微克/毫升,繼續(xù)培養(yǎng)7-10天挑取轉化子。獲得含重組質(zhì)粒pSET52-ia異戊酰螺旋霉素I 產(chǎn)生菌,參椐的生物材料為WSJ-IA,于2010年6月25日送交中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心保藏,地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,保藏編號CGMCC 3942, 分類命名為螺方寵霉素鏈霉菌Streptomyces spiramyceticus。《實施例3》WSJ-IA菌種發(fā)酵效價檢測WSJ-IA菌種在上述斜面培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7_10天,挖塊接種接種于種子培養(yǎng)基黃 豆餅粉 1. 5%,淀粉 3. 0%,NaCl 0. 4%,CaCO3 0. 5%,魚蛋白胨 0. 3%,KH2PO4 0.05%。28°C 培養(yǎng)48小時,轉入發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖0.5%,淀粉6.0%,酵母粉0. 5 %,魚粉2. 0 %, NH4NO3 0. 6%, NaCl 1. 0%, CaCO3 0. 5%, KH2PO4O. 05%, MgSO4 0.1% 28°C發(fā)酵培養(yǎng) 96 小 時。發(fā)酵液離心取上清液,用含3% NaCl的pH 7. 8 8. 0磷酸鹽緩沖液進行稀釋。采用芽 孢桿菌[CMCC(B) 63501]為檢定菌,培養(yǎng)基[蛋白胨0. 6%,牛肉浸出粉0. 15%,酵母浸出膏 0. 6%,葡萄糖0. 2%,瓊脂1. 5-2. 0% ],按照中國藥典2010版二部附錄XI A所述標準曲線 方法,以乙酰螺旋霉素為標準品,計算發(fā)酵效價,WSJ-IA菌種發(fā)酵效價為1160微克/毫升, 見表一?!秾嵤├?》WSJ-IA菌種發(fā)酵產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I組分的檢測將上述發(fā)酵液調(diào)pH至8. 5,用等量乙酸乙酯提取,濃縮乙酸乙酯提取液至干,溶于 甲醇。采用Kromasil C18柱(4. 5mmX 150mm,5 μ m);流動相甲醇磷酸二氫鈉溶液(體 積比 53 47);檢測波長231nm;流速l.OmL .mirT1 ;柱溫 25°C;進樣量10-20 μ L。HPLC 檢測以峰高法計算產(chǎn)物中異戊酰螺旋霉素I組分的含量,HPLC分析結果見圖2Β,結果表明, WSJ-IA菌種發(fā)酵產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I總含量為12. 061%?!秾嵤├?》調(diào)節(jié)基因提高菌種發(fā)酵效價和產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素組分I含量檢測WSJ-IA與含ist單基因的WSJ-2菌種對照,按實施例3進行發(fā)酵培養(yǎng),微生物法 測定兩個菌種發(fā)酵效價,乙酸乙酯提取產(chǎn)物并進行HPLC分析,結果見圖2。比較兩者產(chǎn)生 異戊酰螺旋霉素I組分的情況,分別計算兩者產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I與螺旋霉素的比例,結 果顯示,調(diào)節(jié)基因的引入提高WSJ-IA菌種發(fā)酵效價414%,產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I含量提高 170. 2%,相應地降低了螺旋霉素的產(chǎn)生,使異戊酰螺旋霉素I組分與螺旋霉素比例提高了 218% (表一)。本發(fā)明提供了一個含acyB2調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I的菌種,該菌種在一 定發(fā)酵條件下,比原來只含ist基因的菌種產(chǎn)生異戊酰螺旋霉素I組分含量提高了 1. 70 倍,發(fā)酵效價提高了 4. 14倍。
表一 .WSJ-IA與WSJ-2菌種性能比較
權利要求
一株異戊酰螺旋霉素I組分高含量、高產(chǎn)量基因工程菌,其特征是,所述基因工程菌是異戊?;D移酶基因ist與acyB2調(diào)節(jié)基因連鎖基因,在異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌中共表達的克隆菌株。
2.構建制備權利要求1所述基因工程菌的方法,其主要步驟包括A)構建含ist_acyB2雙基因重組質(zhì)粒pSET52_ia;B)將重組質(zhì)粒pSET52-ia轉入異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌,獲得含重組質(zhì)粒pSET52_ia 的異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌,命名為WSJ-IA,菌種保藏編號CGMCCNo3942 ;OffSJ-IA菌種發(fā)酵培養(yǎng)、提?。籇)WSJ-IA菌種發(fā)酵液微生物法效價檢測;E)HPLC定量分析WSJ-IA菌種發(fā)酵產(chǎn)物主組分異戊酰螺旋霉素I的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用調(diào)節(jié)基因技術構建獲得抗生素單一組分高含量、高產(chǎn)量菌株,具體來講,是將含有ist-acyB2雙基因重組質(zhì)粒pSET52-ia轉入異戊酰螺旋霉素I產(chǎn)生菌,獲得異戊酰螺旋霉素I組分高含量、高產(chǎn)量的基因工程菌株,為其工業(yè)化生產(chǎn)和制備注射劑型創(chuàng)造了良好條件。
文檔編號C12R1/465GK101914482SQ20101023759
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者周紅霞, 姜洋, 戴劍漉, 楊生武, 林靈, 武臨專, 王以光, 赫衛(wèi)清, 郝玉有, 馬春燕 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所;沈陽同聯(lián)集團有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1