專利名稱：：異戊酰螺旋霉素i的分離制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗生素的分離及其在抗感染性疾病中的應(yīng)用，特別涉及異戊酰螺旋霉素單組分化合物。
背景技術(shù)：
：可利霉素是利用基因工程技術(shù)研制的新型螺旋霉素衍生物，原命名為必特霉素，曾用名為生技霉素[專利號ZL97104440.6]。根據(jù)〃中國藥品通用名稱命名原則〃，經(jīng)國家藥典委員會技術(shù)審核及研究確定，必特霉素的中文通用名稱更改為可利霉素，英文名稱為Calimycin。可利霉素為基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是以4〃-異戊酰螺旋霉素為主成分，包括4〃_異戊酰螺旋霉素1、11、111，其次還含有約6種4〃-位羥基酰基化的螺旋霉素，故其化學(xué)名統(tǒng)稱為4〃酰化螺旋霉素。可利霉素主成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(1)所示(1)其中R=H，COCH3、COCH2CH3;R'=COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2可利霉素為16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其作用機(jī)制是通過與細(xì)菌核糖體結(jié)合而抑制其蛋白質(zhì)合成。體外試驗結(jié)果表明，可利霉素對革蘭陽性菌、尤其對某些耐藥菌(如耐13-內(nèi)酰胺金葡菌、耐紅霉素金葡菌等)有效，與同類藥無明顯的交叉耐藥性。同時它對支原體、衣原體有很好的抗菌活性，對部分革蘭陰性菌也有抗菌活性，且對弓形體、軍團(tuán)菌等有良好抗菌活性和組織滲透性，還有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。其體內(nèi)抗菌活性明顯優(yōu)于體外[ZL200310122420.9]。臨床研究表明，每日服用可利霉素片劑0.2-0.4g5-7天，可適用于治療化膿性鏈球菌引起的急性細(xì)菌性咽炎、急性化膿性扁桃體炎；敏感細(xì)菌引起的細(xì)菌性鼻竇炎、急性支氣管炎；肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎支原體所致的輕癥肺炎；支原體、衣原體引起的非淋球菌性尿道炎；敏感細(xì)菌引起的皮膚軟組織感染、牙周炎、中耳炎等感染性疾病。其總有效率為87.76%，可利霉素的不良反應(yīng)率低。臨床研究證明，可利霉素是一個口服安全有效的抗生素。然而，由于可利霉素本身是多組分藥物，經(jīng)過發(fā)酵得到的產(chǎn)品，在發(fā)酵過程產(chǎn)生的多種雜質(zhì)，給組分定量測定帶來一定困難。目前建立的高效液相色譜峰高計算法，能將可利霉素樣品中幾對難分離的物質(zhì)如異戊酰螺旋霉素II與(異)丁酰螺旋霉素III、(異)丁酰螺旋霉素II與丙酰螺旋霉素ni、丙酰螺旋霉素in與其前面的小組分、丙酰螺旋霉素ii與乙酰螺旋霉素in的分離，度達(dá)到中國藥典規(guī)定的1.5以上；而乙酰螺旋霉素III與其前面的小組分的分離度為1.2。目前建立的可利霉素片劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，系采用高效液相分析峰高計算法，測定可利霉素9個?；菪顾亟M分，其中異戊酰螺旋霉素(I+II+III)總含量應(yīng)不低于65%;?；菪顾乜偤繎?yīng)不低于80%。盡管按照目前的片劑生產(chǎn)工藝，可以得到產(chǎn)品組分比例可控、質(zhì)量穩(wěn)定的可利霉素，然而，為了改進(jìn)提取純化工藝、簡化質(zhì)量檢測過程、提高臨床治療效果，有必要研制異戊酰螺旋霉素主要單一組分的注射制劑。尤其對于臨床危重病人或不宜口服用藥的病人，注射給藥見效迅速，更易接受。對于發(fā)酵產(chǎn)生的多組分抗生素，按照化學(xué)藥品質(zhì)控方法很難控制其質(zhì)量，而且任何細(xì)小的變化，均有可能導(dǎo)致物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，增加終產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的難度，引發(fā)不可預(yù)測的用藥不良反應(yīng)。所以通過發(fā)酵產(chǎn)生的多組分抗生素注射劑迄今尚不多見。藥代動力學(xué)研究結(jié)果表明，可利霉素中具活性的有效組分主要為異戊酰螺旋霉素I、II、III?？衫顾剡M(jìn)入體內(nèi)后很快代謝為螺旋霉素，以母體藥物異戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代謝物螺旋霉素I、II、III的AUC。—t總和計算，其口服絕對生物利用度平均為91.6%。文獻(xiàn)報道，螺旋霉素人體口服絕對生物利用度為30-40%[FrydmanAMetalJAntimicrobChemother.1988，22(supplB):93-103]。說明異戊酰螺旋霉素的結(jié)構(gòu)明顯改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。單次服藥可利霉素消除較慢，T力e在23-27小時之間。本發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)，可利霉素的主要組分異戊酰螺旋霉素I具有更加優(yōu)良的抗感染活性，為此，本發(fā)明提供異戊酰螺旋霉素I在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，提供一種異戊酰螺旋霉素I化合物及其藥物組合物，以及其在抗感染治療中的應(yīng)用。本發(fā)明將異戊酰螺旋霉素I化合物制備成一種生產(chǎn)工藝簡化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)易控，藥物效果優(yōu)良的單組分抗生素。本發(fā)明的異戊酰螺旋霉素I化合物，具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R=H;R'=C0CH2CH(CH3)2本發(fā)明提供了異戊酰螺旋霉素I的結(jié)構(gòu)確定；本發(fā)明還提供了異戊酰螺旋霉素I的制備方法，主要包括以下步驟按照專利[ZL97104440.6]制備可利霉素，然后進(jìn)行樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等步驟。本發(fā)明提還提供了異戊酰螺旋霉素I抗細(xì)菌、抗支原體及衣原體活性測定。本發(fā)明還提供以本發(fā)明的異戊酰螺旋霉素I作為藥物活性物質(zhì)制備的藥物組合物，異戊酰螺旋霉素I在藥物組合物中所占重量百分比可以是0.01-99.99%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴齊U、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是注射劑型，如水針，粉針，輸液等劑型。本發(fā)明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的藥物組合物，在制備成藥劑時可選擇性地加入適合的藥學(xué)上可接受的載體，所述藥學(xué)上可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定劑型和用法用量。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是，為制藥企業(yè)提供了生產(chǎn)工藝簡化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)易控的異戊酰螺旋霉素I單一組分制品；為臨床危重人或不宜口服給藥的病人提供了見效迅速，易于接受的用藥劑型的可能性。圖1異戊酰螺旋霉素I的HPLC圖譜圖2異戊酰螺旋霉素I的高分辨質(zhì)譜圖圖3異戊酰螺旋霉素I的核磁共振氫譜圖圖4異戊酰螺旋霉素I的核磁共振13C譜圖圖5化合物及對照藥對7株紅霉素耐藥肺炎鏈球菌的累積抑菌百分率其中_#_系列1可禾lj毒素系列2異戊酰螺旋霉素I"系列3紅霉素>^系列4阿奇霉素_^_系歹1」5克拉毒素圖6化合物及對照藥對6株紅霉素耐藥化膿性鏈球菌的累積抑菌百分率其中_^_系列1可利霉素系列2異戊酰螺旋霉素I_*_系列3紅霉素_^_系列4阿奇霉素_^_系列5克拉毒素實施方案以下所列實施例只是為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明?！磳嵤├?〉、異戊酰螺旋霉素I的分離制備可利霉素原料按照"一種利用基因工程技術(shù)制造生技霉素的方法"專利(專利號ZL97104440.6)制備得到。采用制備型高效液相色譜對可利霉素樣品進(jìn)行分離，獲得異戊酰螺旋霉素I化合物純品。具體包括樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等步驟。1)、粗分離首先從可利霉素樣品中對異戊酰螺旋霉素I組分進(jìn)行粗分離，采用硅膠柱層析方法，以乙酸乙酯和甲醇作為洗脫劑，分別采用三倍柱體積乙酸乙酯甲醇(3:i)和三至五倍柱體積乙酸乙酯甲醇(i:i)進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯甲醇(i:i)部分，將收集液濃縮至干，獲得異戊酰螺旋霉素i、n、iii組分，用于進(jìn)一步純化分離。2)、高效純化采用制備型高效液相色譜對粗分離樣品進(jìn)行純化，以0DS作為色譜填料，用乙腈和醋酸氨緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，通過紫外檢測，記錄分離的紫外譜圖，并對異戊酰螺旋霉素I目標(biāo)峰進(jìn)行收集。具體色譜條件如下儀器工業(yè)級制備色譜。主要部件包括二元梯度泵，紫外檢測器和色譜工作站；色譜柱:0DS制備色譜柱(70i.d.X380mm，10y);流動相乙腈(A)25%，lOOmMNH4Ac水溶液75%(B)。流速:260mL/min;進(jìn)樣量:10mL;進(jìn)樣濃度0.5g/mL;檢測波長231nm;收集方式紫外觸發(fā)收集；按照異戊酰螺旋霉素I的保留時間(RT44.759)，收集樣品。異戊酰螺旋霉素I高壓液相色譜圖見(圖1)。3)、樣品后處理收集的異戊酰螺旋霉素I樣品，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，然后用1倍量乙酸乙酯萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去萃取液中乙酸乙酯，得膏狀樣品。用石油醚重溶所得樣品，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，獲得異戊酰螺旋霉素I白色粉末狀固體?！磳嵤├?>異戊酰螺旋霉素I的鑒定通過高分辨質(zhì)譜(BrukerAPEXII，HR-SI-MS)確證所分離化合物的分子量為926。異戊酰螺旋霉素I高分辨質(zhì)譜圖見(圖2)，經(jīng)核磁共振^和13C譜[BrukerAM500，溶劑CDC13，內(nèi)標(biāo)TMS(四甲基硅烷)]等分析確證，所分離的化合物的結(jié)構(gòu)為異戊酰螺旋霉素I。異戊酰螺旋霉素I核磁共振^和"C譜見(圖3，4)，核磁共振^和"C譜數(shù)據(jù)見(表1，2)。表1異戊酰螺旋霉素I的核磁共振^譜數(shù)據(jù)(500MHz，CDC13)ProtonS卯m(M，JHz)力」HCOSY2ax2.67(dd，J=11.0，14.7)2eq，32eq2.25(m)2ax，333.79(brd，J=11.0)2eq，2ax，443.06(brd，J=8.8)5，354.10(brd，J=8.8)462.14(m)7eq，17b7ax1.49(m)7eq，87eq0.96(m)7ax，681.93(m)7ax，1994.04(dd，J=9.7，4.0)10105.67(dd，J=9.5，15.1)9，11116.23(dd，J=15.1，10.5)10，12126.OO(dd，J=11.0，15.0)11，137<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>〈實施例3>異戊酰螺旋霉素I的抗菌活性測定A抗細(xì)菌活性1)化合物樣品化合物1可利霉素批號0812512，效價92.8%，沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司提供；化合物2異戊酰螺旋霉素I:批號0811214，效價93.7%，沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司提供；紅霉素批號0706392，效價91.6%，中國藥品生物制品檢定所；阿奇霉素批號0421-9603，效價99.3%，中國藥品生物制品檢定所；克拉霉素批號0482-9901，效價90.4%，中國藥品生物制品檢定所。2)試驗菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎鏈球菌ATCC49619;臨床分離革蘭陽性菌；紅霉素耐藥肺炎鏈球菌Str印tococcuspneumoniae(7株)；紅霉素耐藥化膿性鏈球菌Str印tococcuspyogenes(6株)。每株細(xì)菌在試驗前均經(jīng)過平板轉(zhuǎn)活分純，以新鮮菌體用于試驗。每次實驗均用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為敏感實驗質(zhì)控菌；用不含抗菌藥物的平皿做為試驗菌株生長對照。3)培養(yǎng)基與孵育條件M-H(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基(g/L):酸水解酪素17.5、牛肉浸骨粉2、淀粉1.5、瓊脂12。肺炎鏈球菌在血培養(yǎng)基(M-H培養(yǎng)基中加入5X脫纖維羊血制成)上，35t:5%。02環(huán)境((A培養(yǎng)箱)中孵育20-24h?；撔枣溓蚓谘囵B(yǎng)基(M-H培養(yǎng)基中加入5X脫纖維羊血制成)上，35t:孵育20-24h。4)最低抑菌濃度(MIC)測定采用標(biāo)準(zhǔn)平皿二倍稀釋法。被試菌懸液用多點接種儀接種，每點接種量為104CFU。測定各抗菌藥物對各種致病菌的最低抑菌濃度。結(jié)果在所測定的紅霉素耐藥鏈球菌中，本發(fā)明的單組分異戊酰螺旋霉素I對鏈球菌的抗菌作用比可利霉素更加優(yōu)越，MIC5。和MIC9。分別為0.5和2mg/L，同時，明顯強(qiáng)于對照藥紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素(表3)。對于7株紅霉素高耐藥肺炎鏈球菌(紅霉素MIC64->256mg/L)，阿奇霉素與克拉霉素也同樣表現(xiàn)為高度耐藥，而本發(fā)明化合物異戊酰螺旋霉素I的MIC值在0.25-32mg/L，低于可利霉素2-4倍，低于對照藥8-1024倍(表4，圖5)。對于6株紅霉素低耐藥化膿性鏈球菌(紅霉素MIC=l-8mg/L)，本發(fā)明化合物的MIC5。值在0.5mg/L，低于可利霉素，優(yōu)于對照藥紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素2-32倍。(表3，5，圖6)。表3.化合物及對照藥MIC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4.化合物及對照藥對7株紅霉素耐藥肺炎鏈球菌MIC(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表5.化合物及對照藥對6株紅霉素耐藥化膿性鏈球菌MIC(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>B抗肺炎支原體和肺炎衣原體活性1.化合物化合物1可利霉素批號0812512，效價92.8%，沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司提供化合物2異戊酰螺旋霉素I:批號0811214，效價93.7%，沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司提供紅霉素批號0706392，效價91.6%，中國藥品生物制品檢定所阿奇霉素批號0421-9603，效價99.3%，中國藥品生物制品檢定所2.肺炎支原體菌種肺炎支原體菌種(ATCC-FH)。3.肺炎支原體培養(yǎng)基1.支原體瓊脂培養(yǎng)基支原體瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0xoid公司，CM0401)2.84g，加入超純水80ml，12rC高壓15min滅菌，放置在50°C的水浴中，加入肺炎支原體添加劑(Oxoid，SR0059C)1瓶(20ml)，制備瓊脂培養(yǎng)皿。2.支原體PPLO肉湯培養(yǎng)基支原體PPLO肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BD公司)2.lg，去離子純凈水70ml，12rC、15min高壓滅菌。冷卻至室溫后加入凍干肺炎支原體培養(yǎng)添加物(Oxoid添加物)1瓶(20ml無菌去離子水溶解)、無菌50%葡萄糖溶液2.Oml和0.4%的酚紅0.5ml。4.肺炎支原體培養(yǎng)肺炎支原體FH株接種于含20mlPPLO肉湯培養(yǎng)基，72h收獲用玻璃珠刮下，12000rpm，10min離心沉淀，棄上清液，沉淀用8ml新鮮PPLO肉湯培養(yǎng)基再懸，分裝8管凍存-8(TC冰箱。肺炎支原體FH接種物滴定上述制備肺炎支原體FH接種物培養(yǎng)使用PPLO肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行1:10、1:100和1:1000稀釋后涂布于肺炎支原體瓊脂平皿，37t:5%C02培養(yǎng)7天，在X40倍顯微鏡下計數(shù)。計算肺炎支原體滴度。5.肺炎支原體MIC的測定化合物以16mg/ml溶解于無水乙醇，用支原體PPL0肉湯培養(yǎng)基以IO倍比稀釋。肺炎支原體接種物加入上述系列稀釋的藥物管內(nèi)，肺炎支原體FH最終接種濃度為8.25X105CFU/ml，接種后的培養(yǎng)管(包括對照管)于37。C培養(yǎng)并每天觀察顏色的變化。試驗設(shè)立(1)陽性對照稀釋后的肺炎支原體FH接種物(1.65X106CFU/ml)0.5ml+PPL0肉湯培養(yǎng)基0.5ml;(2)陰性對照PPLO肉湯培養(yǎng)基1ml;(3)無水乙醇?xì)绺蓴_對照稀釋后的肺炎支原體FH接種物(1.65X106CFU/ml)O.5ml，PPLO肉湯培養(yǎng)基O.5ml，最終濃度0.05%無水乙醇。當(dāng)陽性對照管發(fā)生明顯的顏色改變(由紅色變黃色)時，而此時沒有發(fā)生顏色改變管的抗生素濃度為最低抑菌濃即MIC濃度。7.肺炎衣原體菌種肺炎衣原體菌種CWL-029(ATCCVR1310)。8.肺炎衣原體培養(yǎng)(1)細(xì)胞培養(yǎng)液10%胎牛血清(HyClone公司)Dulbecco'sMEM(Sigma公司)培養(yǎng)液。(2)肺炎衣原體培養(yǎng)液10X胎牛血清Dulbecco'sMEM培養(yǎng)液，含2yg/ml的放線菌酮(Sigma公司)。(3)BGMK(綠猴腎細(xì)胞，DiagnosticHYBRIDS公司)種植在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，37°C，5%C02培養(yǎng)48小時成為單層細(xì)胞。9.肺炎衣原體MIC的測定化合物以16mg/ml溶解于無水乙醇，首先用衣原體培養(yǎng)液以IO倍比稀釋，將濃度為3.3Xl(fcfu(包涵體形成單位)/lml肺炎衣原體接種物1:200稀釋，最終濃度為1.65X105cfu/lml，吸去96孔培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后按0.lml/孔進(jìn)行接種。菌種接種完畢離心96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用Beckman-Coulter公司的J-6MC離心機(jī)，離心力X1500g，離心溫度35°C，離心時間60min。[cms]設(shè)立對照(1)陽性對照BGMK細(xì)胞，稀釋的肺炎衣原體CWL-029菌種。(2)陰性對照BGMK細(xì)胞，肺炎衣原體培養(yǎng)液。(3)藥物對照BGMK細(xì)胞，最高稀釋濃度(8yg/ml)的化合物，最終濃度0.05%無水乙醇。離心完畢后，吸去肺炎衣原體接種物，分別加入系列稀釋的化合物0.lml/孑L。37°C，5%C02培養(yǎng)72min。培養(yǎng)完畢，吸取抗生素藥物溶液，PBS(0.OIM，pH7.4)洗滌2次，100%無水乙醇固定15min。間接免疫熒光染色鑒定肺炎衣原體單克隆抗體，50iil/孔，37t:濕盒內(nèi)溫育30min，然后洗板機(jī)洗板4次，再加入兔抗鼠熒光抗體(Sigma公司)，50y1/孔，同樣方法及條件溫育及洗板。加入封片甘油，100ii1/孔，在01ympusX71倒置熒光顯微鏡下觀察MIC的定義96孔試驗板中肺炎衣原體包涵體生長完全被抑制孔(全孔未發(fā)現(xiàn)熒光染色的包涵體)的最小抗生素稀釋濃度。10.結(jié)果在所測定的抗肺炎支原體活性中的異戊酰螺旋霉素I活性明顯強(qiáng)于可利霉素，并明顯優(yōu)于對照藥。對肺炎衣原體的活性，異戊酰螺旋霉素I與可利霉素相當(dāng)，優(yōu)于紅霉素。表6化合物對肺炎支原體/衣原體活性Pg/ml)菌號化合物l化合物2紅霉素阿奇霉素肺炎支原體0.1250.032>50.25肺炎衣原體0.0640.0640.50.064〈實施例四>異戊酰螺旋霉素I藥物制劑的制備本發(fā)明可以將異戊酰螺旋霉素I單組分作為活性成分，與藥學(xué)上可接收的載體制備成臨床可用的各種劑型。如注射劑分別將異戊酰螺旋霉素I(簡稱原料)100-500mg與溶劑己二酸18-90mg或枸櫞酸26-130mg或馬來酸14_70mg等摩爾混合均勻后溶解于l_5ml水中，可得到淡黃色澄明溶液，pH在4.6-5.6之間。再加入甘露醇30-150mg作為凍干支撐劑，低溫快速冷凍9h后，冷凍干燥，獲得淡黃色疏松塊狀物，使用前用2-10ml無菌水溶解。權(quán)利要求含有異戊酰螺旋霉素I化合物的藥物組合物，所述異戊酰螺旋霉素I化合物具有以下結(jié)構(gòu)其中R＝H，R′＝COCH2CH(CH3)2。FSA00000027650000011.tif2.權(quán)利要求1所述藥物組合物的制備方法，包括將異戊酰螺旋霉素I化合物和藥學(xué)上可接受的載體混合的步驟。3.權(quán)利要求2所述的制備方法，其中異戊酰螺旋霉素I化合物的分離包括樣品粗分離，高效純化，樣品后處理等步驟。4.權(quán)利要求2所述的制備方法，其中分離采用高效液相色譜對可利霉素樣品進(jìn)行分離，獲得異戊酰螺旋霉素I化合物純品的步驟。5.權(quán)利要求1所述藥物組合物及其藥物活性物質(zhì)異戊酰螺旋霉素I化合物在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及抗生素的分離及其在抗感染性疾病中的應(yīng)用，特別涉及異戊酰螺旋霉素I單組分化合物；經(jīng)樣品粗分離、高效純化、樣品后處理等，采用高效液相色譜對可利霉素樣品進(jìn)行分離，獲得異戊酰螺旋霉素I化合物純品；生物學(xué)試驗結(jié)果表明，所說組分I化合物的抗菌活性優(yōu)于可利霉素，明顯優(yōu)于對照組，其為研制臨床有效的異戊酰螺旋霉素I單組分抗生素奠定了基礎(chǔ)。文檔編號A61P31/04GK101785778SQ20101011974公開日2010年7月28日申請日期2010年3月9日優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日發(fā)明者姜洋,張海平,徐霈名,梁鑫淼,郝玉有,金郁申請人:沈陽同聯(lián)集團(tuán)有限公司