專利名稱：一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)dna調(diào)控元件及其植物表達(dá)載體的制作方法
一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)DNA調(diào)控元件及其植物表達(dá)載
體本發(fā)明涉及香蕉淀粉粒合成酶基因啟動(dòng)子序列的獲得和植物表達(dá)載體的構(gòu)建。 [背景技術(shù)]香蕉(Musa spp.)屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)。是重要的熱帶水果，是利 用轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)重組藥用蛋白和肽，或者是有價(jià)值的化合物的理想植物。外源基因能夠在植物組織中實(shí)現(xiàn)正常乃至高效的表達(dá)，一個(gè)重要的條件是構(gòu)建一 個(gè)能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，而對(duì)一個(gè)高效表達(dá)的載體而言，啟動(dòng)子則是其最 重要元件之一。因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考 慮的問(wèn)題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子 葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的Ubiquitin 啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基 因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的 表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。為了使外 源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá) 啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。果實(shí)特異性啟動(dòng)子作為重要的組織特異性啟動(dòng)子，可以 控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)中特異表達(dá)?？寺『脱芯抗麑?shí)特異性啟動(dòng)子，可為深入 研究果實(shí)品質(zhì)形成機(jī)理、提高果實(shí)品質(zhì)及為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定基礎(chǔ)。但 是，由于受到果實(shí)特異表達(dá)基因數(shù)量的限制，果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆鑒定及應(yīng)用研究 的報(bào)道非常有限，目前相關(guān)研究在番茄上進(jìn)展較大，如番茄E8基因的啟動(dòng)子被證明是果實(shí) 成熟啟動(dòng)子且對(duì)乙烯做出反應(yīng)，Penarrubia(Penarrubia et al. 1992)等用該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移 的指導(dǎo)甜蛋白基因在番茄果實(shí)成熟中表達(dá)，結(jié)果獲得較高的表達(dá)量，且甜蛋白受乙烯誘導(dǎo) 而增加。番茄PG基因(Bird C R et al. 1998)和2A11基因亦被證實(shí)為果實(shí)成熟特異表達(dá)， Chengappa等(Chengappa S et al. 1990)用2A11基因啟動(dòng)子在番茄果實(shí)中特異表達(dá)反義 蔗糖合成酶基因，證實(shí)為果實(shí)特異表達(dá)。毛自朝等(2002)用番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12 驅(qū)動(dòng)ipt基因在番茄中表達(dá)，結(jié)果表明在果實(shí)中專一表達(dá)。另外，Atkinson (Atkinson R G et al. 1995)和Wang(Wang Z Y et al. 2000)分別研究了蘋(píng)果ACC合成酶、PG基因和獼猴 桃PG基因的表達(dá)，它們均為果實(shí)特異表達(dá)，分離三個(gè)基因的啟動(dòng)子，分別與報(bào)告基因GUS構(gòu) 建表達(dá)載體且轉(zhuǎn)化番茄，在轉(zhuǎn)基因番茄中GUS表達(dá)表明呈現(xiàn)果實(shí)成熟特異性。香蕉的啟動(dòng) 子研究也獲得一些進(jìn)展，王新立等(2001)克隆了香蕉ACC合成酶和氧化酶基因的啟動(dòng)子， 通過(guò)⑶S基因的瞬時(shí)表達(dá)研究證實(shí)為果實(shí)特異性，但未見(jiàn)更深入的研究報(bào)道。亦未見(jiàn)有果 實(shí)特異啟動(dòng)子在香蕉轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的報(bào)道。Prabodh Kumar Trivedi等2004年發(fā)現(xiàn)乙烯和 IAA可促進(jìn)香蕉果實(shí)中MaExpl的啟動(dòng)子(888bp)的活性，認(rèn)為這個(gè)啟動(dòng)子可用作香蕉中外 源基因的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)果實(shí)成熟。香蕉淀粉粒合成酶基因(Granule-BoundStarch Synthase gene，MaGBSS)是我們通過(guò)果實(shí)抑制差減文庫(kù)獲得的一個(gè)香蕉成熟相關(guān)基因，器官表達(dá)特異性證明該基因只在果 實(shí)中表達(dá)。通過(guò)基因芯片表達(dá)和Northern blot分析，結(jié)果顯示該基因在果實(shí)中大量表達(dá)且 與果實(shí)成熟過(guò)程密切相關(guān)(香蕉果實(shí)成熟相關(guān)基因克隆及表達(dá)。楊小亮，碩士論文，2004; XuBY,Su W,Liu JHjWang JB and Jin ZQ. Differentially expressed cDNAs at the early stage ofbanana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray. Planta, March, 2007, 226 :529_539)，因此我們認(rèn)為，MaGBSS 基因的啟動(dòng) 子很可能是果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子。為了解決香蕉作為生物反應(yīng)器的需要，同時(shí)亦為在香蕉果實(shí)特異表達(dá)氨基酸合成 基因、抗衰老基因、藥用蛋白質(zhì)基因等有用基因，培育具有較高商業(yè)價(jià)值及保健價(jià)值的香蕉 新品種，本發(fā)明的目的是提供一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)DNA調(diào)控元件及其植物表達(dá)載 體。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種分離的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)DNA調(diào)控元件，具有序 列表中<400>項(xiàng)下的序列。上述DNA調(diào)控元件是包括從香蕉總DNA分離的香蕉MaGBSS基因啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序 其長(zhǎng)度為606bp，通過(guò)Promoter predictions等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子的分析，結(jié)果表明 在93-138和182-227bp存在2處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。利用該啟動(dòng)子序列置換植物表達(dá)載體 PCAMBIA1304啟動(dòng)子構(gòu)建成一個(gè)含有MaGBSS基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP和⑶S基因的新的植物 融合表達(dá)載體P1304PGBSS。通過(guò)基因槍法將載體pl304PGBSS轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)薄片、根系及葉 片中，GFP和⑶S染色顯示該啟動(dòng)子為果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子；啟動(dòng)子啟動(dòng)⑶S基因表達(dá)活性 檢測(cè)顯示，P1304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片活性高于pCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片，而且持續(xù) 的時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明MaGBSS基因啟動(dòng)子在果實(shí)中的啟動(dòng)活性高于35S啟動(dòng)子，證明了 MaGBSS 基因啟動(dòng)子是一個(gè)果實(shí)特異性的高效啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了前述的分 離的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子置換植物表達(dá)載體PCAMBIA1304上的35S啟動(dòng)子構(gòu)建 成一個(gè)含有MaGBSS基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP和GUS基因的新的植物融合表達(dá)載體，命名為 P1304PGBSS。[結(jié)果分析]一、MaGBSS基因啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建1. MaGBSS基因啟動(dòng)子的分離及序列分析香蕉基因組DNA提取采用經(jīng)改良的SDS法小量提取香蕉基因組DNA。根據(jù)我們克 隆的MaGBSS基因的序列，根據(jù)TAIL-PCR方法的要求設(shè)計(jì)3個(gè)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò) 增到一條長(zhǎng)約600bp左右的產(chǎn)物，擴(kuò)增片段與pGEM-T Easy Vecter連接，于上海生工測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果為長(zhǎng)606bp，序列參照序列表中<400>。通過(guò)Promoter predictions等軟件進(jìn)行 基礎(chǔ)啟動(dòng)子的分析，結(jié)果表明在93-138和182-227bp存在三處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。該啟動(dòng)子具 有高等植物啟動(dòng)子應(yīng)具有的調(diào)控元件，如TATA盒、CAAT盒、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及其他調(diào)控元件 (見(jiàn)表1)。表1 :MaGBSS基因啟動(dòng)子元件分析
2.果實(shí)特異表達(dá)載體pl304PGBSS構(gòu)建根據(jù)已測(cè)序的MaGBSS基因啟動(dòng)子序列，在其兩端加上EcoR I和Spe I酶切位點(diǎn)
設(shè)計(jì)5’和3’端引物。通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增啟動(dòng)子目的片段，回收PCR產(chǎn)物，用EcoR I和Spe I雙酶切該產(chǎn)物和植物表達(dá)載體PCAMBIA1304，將酶切獲得的含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子 片段和pCAMBIA1304載體大片段連接獲得含有MaGBSS基因啟動(dòng)子表達(dá)載體pl304PGBSS。二、MaGBSS基因啟動(dòng)子的功能鑒定1.基因槍法對(duì)香蕉不同器官轉(zhuǎn)化pl304PGBSS及GFP顯微觀察、⑶S基因的組織化 學(xué)染色定位將香蕉果實(shí)用1%。氯化汞溶液消毒lOmin，用滅菌蒸餾水沖洗數(shù)次再將其徒手切 成薄片；縱剖香蕉組培苗的根并將葉切為1 2cm小塊。置上述材料于1/2MS培養(yǎng)基上， 室溫放置3h.。參照王關(guān)林的方法以pl304PGBSS、pCAMBIA1304兩種表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA 和H2O包被金粉制備微彈，按廠商提供的使用手冊(cè)用基因槍轟擊香蕉材料。轟擊后的香蕉 材料于26°C暗培養(yǎng)。然后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和GUS組織化學(xué)染色。顯微鏡觀察顯示， P1304GBSS載體包被的微彈轟擊的材料，葉片、根在顯微鏡下沒(méi)有觀察到藍(lán)色，而果實(shí)薄片 在果肉中觀察到藍(lán)色；PCAMBIA1304載體包被的微彈轟擊的葉片、根、果實(shí)均在顯微鏡下觀 察到藍(lán)色(

圖1，圖中藍(lán)色、黑色)。取基因槍轉(zhuǎn)化24h香蕉葉、根、果在熒光顯微鏡下觀察， P1304GBSS載體轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體香蕉材料的根、葉均未發(fā)現(xiàn)熒光，而只在果實(shí)中特異表 達(dá)，轉(zhuǎn)化含有35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1304植物表達(dá)載體香蕉材料根、葉、果實(shí)均有熒光(圖 2，圖中綠色)。2.轉(zhuǎn)化材料的⑶S酶活性檢測(cè)方法參照王關(guān)林“分子克隆原理”中提供的方法。(1) pl304PGBSS和pCAMBIA1304載體轉(zhuǎn)化香蕉⑶S活性測(cè)得各轉(zhuǎn)化材料⑶S提取 液的A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量如下(表3)。表3 轉(zhuǎn)化24小時(shí)各器官GUS提取液中蛋白含量 根據(jù)表1可以看出，pl304PGBSS轉(zhuǎn)化的果實(shí)中⑶S蛋白明顯高于pCAMBIA1304。 PCAMBIA1304轉(zhuǎn)化的各器官中⑶S含量差別不大，而pl304PGBSS轉(zhuǎn)化的各香蕉果實(shí)高出其 他器官35-300倍左右。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，MaGBSS基因啟動(dòng)子的活性很高，在香蕉果實(shí)中略高 于目前常用的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子35S(圖3)，而且是果實(shí)特異性的。(2)轉(zhuǎn)化24小時(shí)后一定時(shí)間內(nèi)GUS酶活力變化與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系基因槍轉(zhuǎn)化后數(shù) 十小時(shí)取相同重量的基因搶轟擊的果實(shí)薄片制備GUS提取液，酶反應(yīng)后測(cè)得415nm處兩種 果實(shí)轉(zhuǎn)化材料Gus提取液不同反應(yīng)時(shí)間的光吸收值，按0. 0170標(biāo)樣OD為Inmol產(chǎn)物/ml 的標(biāo)準(zhǔn)將其換算成消光產(chǎn)物量后對(duì)時(shí)間作圖(圖4)。Gus酶活力曲線圖表明，pl304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片在15-60min Gus活性與 PCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片基本相同，60min后pl304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片的Gus活性 高于pCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片。說(shuō)明MaGBSS基因啟動(dòng)子在果實(shí)中的啟動(dòng)活性稍高于 35S啟動(dòng)子，而且持續(xù)的時(shí)間較長(zhǎng)，證明了 MaGBSS基因啟動(dòng)子是一個(gè)果實(shí)特異性的高效啟 動(dòng)子，本研究從MaGBSS基因啟動(dòng)子的分離、測(cè)序、植物表達(dá)載體的構(gòu)建、基因槍法轉(zhuǎn)化香蕉各組織(根、莖、葉)、GFP熒光顯微觀察、⑶S基因染色定位、⑶S基因活性測(cè)定等作了 系統(tǒng)研究，獲得了一個(gè)香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)DNA調(diào)控元件，以此啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化香蕉及番茄 等果用型植物是可行的。以下結(jié)合實(shí)例應(yīng)用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1.啟動(dòng)子序列的克隆根據(jù)MaGBSS基因啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5’、3’引物，并分別 加上EcoR I和Spe I酶切位點(diǎn)(下劃線處)5’ Primer CGGAATTCTCGAGTATGGTGTTCTTTTTG 3’ Primer GGACTAGTCCACTCACGTCACTTCAGC目的片段PCR擴(kuò)增在PCRlf中依次加入
滅菌水18. 9ul
香蕉基因組DNA1. Oul
緩沖液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_總體積25ul輕輕混勻，瞬時(shí)離心，將Eppendorf管置PCR擴(kuò)增儀中，蓋上加熱帽。反應(yīng)程序 940C 2S、72°C 3min 7 個(gè)循環(huán)；94°C 2s ;67°C 3min. 37 個(gè)循環(huán) 67V 4min.取5. O μ 1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行1. O %瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳 30min后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。2.目的片段的回收用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收，方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3.回收PCR產(chǎn)物和pCAMBIA1304植物表達(dá)載體用EcoR I、Spe I雙酶切?；厥?PCR 產(chǎn)物IOulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ulBSA(IOOx)0. 5ulH2024. 5ul_總體積50ulpBI121 質(zhì)粒 DNA5ulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ul
7
BSA(IOOx)0. 5ulH2029. 5ul_總體積50ul37°C 水浴，3.5h。4.回收MaGBSS基因啟動(dòng)子和pCAMBIA1304雙酶切載體片段并連接用QlAquick Gel Extraction Kit (50)回收兩個(gè)目的片段(方法同2)，1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。啟動(dòng)子雙酶切片段與pBI121雙酶切載體連接反應(yīng)606bp 目的片段 DNA7. OulpCAMBIA1304 雙酶切載體1. OulIOx 連接酶 buffer2ulT4DNA 連接酶Iul_總體積IOul16°C, 16h05.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒鑒定方法參照分子克隆手冊(cè)中。6. MaGBSS基因啟動(dòng)子連接芪合酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建1)芪合酶基因PCR擴(kuò)增根據(jù)已發(fā)表的芪合酶基因序列設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，分別在5’和3’加上Bgl II和SpeI 酶切位點(diǎn)5' Primer CC kGATCTi GCTTCAATTTCATTACGT 3’ Primer CC ACTAGT CTCCTATTTGATACATTA利用葡萄葉片的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)
滅菌水18.9ul
葡萄基因組DNA1. Oul
緩沖液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_總體積25ul輕輕混勻，瞬時(shí)離心，將Eppendorf管置PCR擴(kuò)增儀中，蓋上加熱帽。反應(yīng)程序 95°C變性1分鐘94°C變性30秒55°C退火30秒72°C延伸2分鐘35個(gè)循環(huán)72°C延伸10分 鐘取5. 0 μ IPCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳 30min后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。獲得一條長(zhǎng)約1500bp的條帶，測(cè)序證明是葡萄芪合酶基因。總體積10. Oul37°C 水浴，3h。經(jīng)酶切鑒定，含有MaGBSS基因啟動(dòng)子及葡萄芪合酶基因的植物表達(dá)載體 P1304PGBSSH已構(gòu)建成功。7.轉(zhuǎn)化香蕉1)材料與試劑巴西香蕉未成熟雄花愈傷組培由我研究室培育?？敲顾?Kanamycin)，利福平(Rifampicin)、鏈霉素(Str印tomycin)、噻孢霉素 (Cefotaxime)、潮霉素(Hygromrycin Rif)均購(gòu)自寶生物公司。2)香蕉材料的準(zhǔn)備及抗性梯度實(shí)驗(yàn)①香蕉材料的準(zhǔn)備將巴西香蕉未成熟雄花愈傷組織接種于MS附加6-BA 2. 0mg/L、NAA 0. 2mg/L的培 養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。②抗性梯度實(shí)驗(yàn)將取自香蕉未成熟雄花愈傷組織分別接種于含有潮霉素5mg/L、10mg/L、30mg/L、 50mg/L、100mg/L的MS附加6-BA 2. Omg/L、NAA 0. 2mg/L培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘芽培養(yǎng)，測(cè)定外 植體對(duì)潮霉素的敏感性及最適選擇濃度。篩選的最適潮霉素濃度為50mg/L。3)質(zhì)粒 pl304PGBSSH 導(dǎo)入農(nóng)桿菌 EHA105三親交配法將載體pl304PGBSSH導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105 ①接種受體農(nóng)桿菌EHA105在含有Rif50mg/L、str 100mg/L的YEP固體培養(yǎng)基上， 28°C培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后，挑選一個(gè)單菌落接種在液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。②接種帶有“協(xié)助”質(zhì)粒PRK2013的大腸桿菌在含有Kan 50mg/L的固體培養(yǎng)基上， 37°C培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后挑選一個(gè)單菌落接種在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。③挑帶有中間質(zhì)粒載體pBIL2的大腸桿菌的單菌落在含有Kan 50mg/L的液體LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。④三種菌生長(zhǎng)到OD6tltl為0. 5左右時(shí)，等體積混勻，涂布于不含抗生素的YEP固體 培養(yǎng)基上，28 °C過(guò)夜培養(yǎng)。⑤用接種針將長(zhǎng)出的菌苔轉(zhuǎn)接至含有Rif 50mg/L、Str 100mg/L、Kan 50mg/L的 固體YEP培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-3天，長(zhǎng)出單菌落。同時(shí)設(shè)三個(gè)對(duì)照EHA105、pRK2013、 P1304PGBSSH。⑥將長(zhǎng)出的單菌落再次轉(zhuǎn)接到含有上述三種抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上，28°C培 養(yǎng)。YEP培養(yǎng)基蛋白胨10g/L pH 7.0、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/LLB培養(yǎng)基蛋白胨IOg/ L pH 7.0、酵母提取物10g/L、氯化鈉5g/L(配制固體培養(yǎng)基時(shí)，需加入15g/L瓊脂粉)挑菌苔涂三抗平板后，三個(gè)對(duì)照pl304PGBSSH、EHA105、pRK 2013都未長(zhǎng)出菌苔或 菌落，只有三親交配產(chǎn)物長(zhǎng)出菌苔及菌落，說(shuō)PBIL2已導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化香蕉未成熟雄花愈傷組織取培養(yǎng)好的香蕉未成熟雄花愈傷組織作為受體材料。從平板上挑取含有目的載 體P1304PGBSSH的農(nóng)桿菌單菌落，接種于三抗YEP液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24小時(shí)以上，至 OD600 為 0. 6-0. 8。
將菌液分裝于IOmL離心管中，4°C，4000rpm，離心lOmin，棄上清。將菌體重懸于2 倍體積，附加500uM乙酰丁香酮(Acetosyringone AS)的MS液體培養(yǎng)基中。將菌液倒入無(wú) 菌小燒杯內(nèi)，將受體材料放入菌液中，分別浸泡10min、20min、30min，取出薄片放于無(wú)菌濾 紙上吸去多余菌液。將侵染過(guò)的薄片接種于MS附加6-BA 2. Omg/L、NAAO. 2mg/L的培養(yǎng)基 上，在28°C暗培養(yǎng)4-6天。將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有50mg/L Rif及300mg/L Cef 的脫菌分化培養(yǎng)基上，在光照為5000LX，25-28°C條件下進(jìn)行誘芽選擇培養(yǎng)。待吸芽長(zhǎng)到0. 5cm以上時(shí)切下來(lái)轉(zhuǎn)入含有50mg/L Rif的生根培養(yǎng)基(MS+O. 5mg/ LKT+1. Omg/L NAA)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
圖1是基因槍轉(zhuǎn)化香蕉不同器官⑶S瞬時(shí)表達(dá)圖，其中A是從左至右pCAMBIA1304質(zhì) 粒轟擊香蕉根、果、葉⑶S瞬時(shí)表達(dá)圖；B是從左至右pl304BR47質(zhì)粒轟擊香蕉根、果、葉⑶S 瞬時(shí)表達(dá)圖2是基因槍轉(zhuǎn)化香蕉不同器官綠色熒光蛋白(GFP)瞬時(shí)表達(dá)圖，其中A是從左至右 PCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊香蕉根、果、葉GFP瞬時(shí)表達(dá)圖；B是從左至右pl304BR47質(zhì)粒轟擊香 蕉根、果、葉GFP瞬時(shí)表達(dá)圖3是MaGBSS基因啟動(dòng)子與35S啟動(dòng)子相對(duì)酶活對(duì)比圖； 圖4是瞬間表達(dá)的轉(zhuǎn)化果實(shí)中GUS酶活性變化曲線圖。
權(quán)利要求
一種分離的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于具有序列表中<400>1項(xiàng)下的序列。
2.一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求1所述的分離的香蕉 果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體，其特征在于用權(quán)利要求1所述 的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子置換植物表達(dá)載體PCAMBIA1304上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu) 建成在啟動(dòng)子下游含有GFP和GUS基因的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)DNA調(diào)控元件及其植物表達(dá)載體，該啟動(dòng)子長(zhǎng)606bp，以其取代植物表達(dá)載體pCAMBIA1304上的組成型35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成為一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pCSS1。用GFP基因和GUS基因瞬時(shí)表達(dá)方法檢測(cè)了含有該段啟動(dòng)子及pCAMBIA1304啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，綠色熒光蛋白(GFP)顯微鏡觀察和GUS組織染色顯示該啟動(dòng)子具有表達(dá)組織特異性，且略高于35S啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子的獲得，為香蕉的轉(zhuǎn)基因及對(duì)香蕉果實(shí)的分子生物學(xué)研究提供了一個(gè)有力的工具，特別是為利用香蕉作為生物反應(yīng)器的研究和開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了條件。因此，該啟動(dòng)子的獲得，具有重要理論和實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101928708SQ201010237890
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 王紀(jì), 譚光蘭, 賈彩紅, 金志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所;農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站