專利名稱：MaGCS蛋白在香蕉果實(shí)成熟中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種MaGCS蛋白在香蕉果實(shí)成熟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉是一種典型的呼吸躍變型果實(shí)，對(duì)香蕉果實(shí)成熟機(jī)理的分子生物學(xué)研究將有助于發(fā)展建立在基因表達(dá)調(diào)控基礎(chǔ)上的采后保鮮新技術(shù)，完善對(duì)果實(shí)成熟調(diào)控研究的深入，這些研究在香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有重要的理論和實(shí)踐意義。乙烯是香蕉采后成熟的核心，與大多數(shù)的躍變型果實(shí)不同，香蕉果實(shí)在呼吸躍變的過程中乙烯的釋放速率的升高和降低是劇烈的，因此認(rèn)為香蕉中乙烯生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與其它躍變型果實(shí)不同。氨基環(huán)丙烷羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC),氧化酶基因(1-aminocyclopropane-l-carboxylicacid oxidase, ACO) (Huang et al. ,1997)是在成熟度II開始表達(dá)并持續(xù)到隨后的成熟度，該ACO基因可以被外源乙烯所誘導(dǎo)。Liu等對(duì)香蕉成熟過程中的ACS、AC0基因表達(dá)及與成熟之間的關(guān)系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究(Liu et al.，1985)。他們的研究結(jié)果表明，在自然成熟果實(shí)的躍變啟動(dòng)期，其中一個(gè)ACS (MA-ACSl)的表達(dá)增強(qiáng)，伴隨著乙烯的迅速增長，而隨后就迅速降低。而在躍變啟動(dòng)時(shí)期，ACO活性被大量激活，隨后也迅速降低。在躍起變前可以檢測(cè)到ACO基因的表達(dá) (MA-ACOl)，而且隨后的成熟過程中仍然維持著高水平的表達(dá)，盡管此時(shí)AGO的活性已經(jīng)降低了。這種結(jié)果的差異是由于ACO活性所需的各種因子含量降低。他們的結(jié)果說明，香蕉成熟過程中的乙烯生物合成在躍變上升之前是受MA-ACSl轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的。檸檬酸合成酶(citratesynthase, CS, EC2. 3. 3. 1)催化草酰乙酸(oxaloacetic acid, OA)合成檸檬酸(citrate acid，CA)，是三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。CS屬于調(diào)控酶，它的活性受ATP、NADH、琥珀酰_CoA、CA、長鏈脂肪酸所抑制，又能受 AMP 禾口 OA 的促進(jìn)(Caggiano et al. , 1979 ；Mitchell et al. , 1995 ；Tabrett et al.， 2000)。根據(jù)作用位置的不同，CS在植物中大致分為兩類即線粒體中的檸檬酸合酶 (mitochondrial citrate synthase,MCS)禾口非線粒體中的檸檬酸合酶(nonmitochondrial
citrate synthase, non-MCS)-包括乙醛酸循環(huán)體中的檸檬酸合酶(Glyoxysomal
citrate synthase, GCS)，兩者在提純方法、酶動(dòng)力學(xué)、穩(wěn)定性以及與線粒體內(nèi)膜的結(jié)合率上均存在差異(Kispal et al.，1991)。khnarrenberger (2002)對(duì)已知序列的檸檬酸合酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，植物中MGCS與酵母、豬、大鼠等真核生物較為接近，是同一來源的，而乙醛酸循環(huán)體中的檸檬酸合酶則與原核生物的進(jìn)化距離較近，屬同一來源。隨著CS研究的深入，關(guān)于其在植物生理中作用的報(bào)道越來越多。Grzemski (2005) 發(fā)現(xiàn)MCS與植物根瘤固氮有關(guān)，酶活的降低會(huì)顯著降低根瘤固氮酶的活性； Landschuetze (1995)發(fā)現(xiàn)MCS與花藥或花粉發(fā)育相關(guān)，且與光合作用相關(guān)，在光合作用的組織中表達(dá)較高，但在非光合作用的組織中表達(dá)量普遍偏低；在油菜、水稻、胡蘿卜等植物中GCS與耐鋁、耐鹽、耐磷等脅迫相關(guān)(Larsen et al.，1998 ；Koyama et al.，2000)；此外，GCS還影響能影響種子的萌發(fā)(Pracharoenwattana et al.，2005)。CS催化的產(chǎn)物CA在許多果實(shí)中存在，影響果實(shí)的酸度和口感，所以果實(shí)中CS酶活與CA含量的關(guān)系成為果實(shí)品質(zhì)研究者們感興趣的熱點(diǎn)。檸檬酸合酶基因已從南瓜(Cucurbita maxima)、水稻(Oryza sativa)和擬南芥 (Arabidopsis thaliana)等植物中被克隆，但對(duì)這些基因的更進(jìn)一步的研究未見報(bào)道。我們(Jin. et al. 2009)利用cDNA微陣列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成啟動(dòng)時(shí) (采后IOd)基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與其他植物同源的檸檬酸合酶基因明顯上調(diào)表達(dá)。 推測(cè)該基因可能和香蕉過實(shí)采后成熟過程中乙烯生物合成相關(guān)，可能調(diào)控或影響香蕉果實(shí)采后成熟過程。因此，GCS基因的開發(fā)利用，將有助于更加深入了解香蕉果實(shí)采后成熟機(jī)理， 建立更加安全、廉價(jià)、有效的果實(shí)采后保鮮新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種建立在基因表達(dá)調(diào)控基礎(chǔ)上的采后保鮮新技術(shù)。本發(fā)明提供的保鮮新技術(shù)為將采后的香蕉果實(shí)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡2h， 獲得具有如下1)-2)中至少一種特征的香蕉果實(shí)1)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促進(jìn)香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；2)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡池，促進(jìn)香蕉果實(shí)成熟；將采后的香蕉果實(shí)用(w/v)檸檬酸溶液浸泡lh，獲得具有如下3)-4)中至少一種特征的香蕉果實(shí)3)用1 % (w/v)的檸檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；4)用(w/v)的檸檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果實(shí)成熟；所述MaGCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述MaGCS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為如下1)或2):1)序列表中的序列1;2)序列表中序列1自5’末端第1-1737位核苷酸。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為熒光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯誘導(dǎo)成熟和 I-MCP (1-methyl cyclopropene)抑制成熟的條件下，MaGCS在香蕉果實(shí)采后不同成熟階段的表達(dá)情況。通過體外誘導(dǎo)、抑制MaGCS的表達(dá)，研究果實(shí)成熟特性。1.熒光定量研究MaGCS與果實(shí)采后成熟的關(guān)系采后香蕉果實(shí)分設(shè)乙烯處理、I-MCP處理和正常成熟3組，提取3組中不同成熟階段的果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量研究3種不同處理?xiàng)l件下MaGCS表達(dá)與成熟的關(guān)系。 2. MaGCS誘導(dǎo)劑草酰乙酸(OA)和抑制劑檸檬酸(CA)處理果實(shí)，研究體外調(diào)控基因表達(dá)對(duì)果實(shí)成熟的影響將采后的香蕉果實(shí)用IOOmM的草酰乙酸溶液中浸泡池和1 % (w/v)檸檬酸溶液中浸泡Ih分別處理，觀察處理果實(shí)成熟變化，乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因ACC氧化酶基因ACOl 表達(dá)分析，測(cè)定果實(shí)成熟相關(guān)的生理指標(biāo)，分析通過采后體外調(diào)控MaGCS的表達(dá)對(duì)果實(shí)成熟的影響。[結(jié)果分析]1. MaGCS在香蕉果實(shí)采后被乙烯誘導(dǎo)表達(dá)，并可調(diào)節(jié)成熟乙烯生物合成=MaGCS在香蕉果實(shí)正常成熟時(shí)基因表達(dá)量的變化與內(nèi)源乙烯的釋放相一致，而外源乙烯處理，MaGCS 被誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量明顯增加且提前。I-MCP處理后MaGCS的表達(dá)被明顯抑制(圖1)。以上結(jié)果顯示，MaGCS與果實(shí)采后成熟過程中乙烯生物合成密切相關(guān)，促進(jìn)香蕉果實(shí)采后成熟中的乙烯合成可以顯著促進(jìn)MaGCS的表達(dá)，抑制香蕉果實(shí)成熟中的乙烯合成可以顯著抑制 MaGCS的表達(dá)。因此，推測(cè)該基因與香蕉果實(shí)采后成熟相關(guān)，對(duì)該基因的調(diào)控將達(dá)到調(diào)控香蕉采后成熟的目的。2. MaGCS誘導(dǎo)劑和抑制劑顯著促進(jìn)和抑制該基因的表達(dá)，進(jìn)而影響果實(shí)的成熟過程和品質(zhì)研究結(jié)果證明，IOOmM的草酰乙酸(OA)溶液中浸泡池和(w/v)檸檬酸(CA) 溶液中浸泡Ih分別能誘導(dǎo)和抑制香蕉果實(shí)成熟，通過生理學(xué)分析顯示這種影響改變了果實(shí)顏色、硬度、芳香物質(zhì)、淀粉含量等。證實(shí)對(duì)MaGCS表達(dá)的調(diào)控可以調(diào)節(jié)果實(shí)采后成熟(圖 2、圖幻。進(jìn)一步研究顯示，MaGCS調(diào)控果實(shí)成熟是通過調(diào)控MaACOl基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的， 而MaACOl是香蕉果實(shí)采后成熟過程中啟動(dòng)MaACSl基因表達(dá)和成熟乙烯生物合成的關(guān)鍵酶基因。因此，我們推測(cè)香蕉MaGCS是香蕉果實(shí)采后成熟過程中成熟乙烯生物合成的上游調(diào)節(jié)者，它通過調(diào)控MaACOl的表達(dá)控制果實(shí)的成熟過程和品質(zhì)形成(圖4)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將香蕉果實(shí)(Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian)分別用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡濁和(w/v)檸檬酸溶液浸泡lh，通過影響MaGCS表達(dá)進(jìn)而調(diào)控乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因ACC氧化酶MaACOl基因的表達(dá)水平， 最終調(diào)控香蕉果實(shí)的成熟品質(zhì)，從而建立了通過調(diào)控基因表達(dá)而控制果實(shí)成熟的保鮮新技術(shù)。


圖1是I-MCP處理和乙烯處理?xiàng)l件下，利用熒光定量PCR分析MaGCS在香蕉采后不同時(shí)期的表達(dá)圖2是OA (上)和CA (下)處理對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟的影響圖3是OA和CA處理后熒光定量PCR分析MaGCS的表達(dá)
圖4是OA和CA處理后熒光定量PCR分析MaACOl的表達(dá)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。1、材料來源巴西香蕉(M.AAA Group Cavendish)果實(shí)，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地。2. MaGCS基因的發(fā)現(xiàn)從香蕉果實(shí)成熟早期階段的抑制差減雜交文庫(SSH)中獲得一個(gè)檸檬酸合成酶基因的cDNA片段，并用RACE技術(shù)在香蕉果實(shí)中克隆到了該檸檬酸合成酶基因的全長，命名為MaGCS，其核苷酸序列為序列表中的序列1。其編碼的蛋白的氨基酸的序列為序列表中的序列2，該蛋白命名為MaGCS。序列表中的序列1由1737個(gè)核苷酸組成，序列表中的序列2 由513個(gè)氨基酸組成。
3.方法(1)熒光定量研究MaGCS與果實(shí)采后成熟的關(guān)系提取乙烯處理、I-MCP處理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄 cDNA用作熒光定量PCR的模板。用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析軟件分析MaGCS、Ma-act in 12個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)，確保所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增片段位于非保守區(qū)；然后根據(jù)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則，用primer premier5設(shè)計(jì)弓I物。MaGCS 上游引物5，-GAGTTCTTTCCTGTTCTGTTTG-3，MaGCS 下游引物5，-CTATGCTTATTGTTCCACGC-3，Ma-act in 1 上游引物5 ‘ -CGAGGCTCAATCAAAGA-3 ‘Ma-act in 1 下游引物5 ‘ -ACCAGCAAGGTCCAAAC-3 ‘在Mratagene的Mx3000P儀器上進(jìn)行熒光定量PCR。在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入 SYBR Premix Ex Taq (2 X) (TAKARA) 12. 5 μ L, Rox reference Dye II (50 Χ) (TAKARA) 0. 5 μ L、5 μ M的一對(duì)引物各0. 75 μ L，cDNA樣品1 μ L，然后用水補(bǔ)足至25 μ L。每個(gè)樣品既要用于擴(kuò)增目的基因又要擴(kuò)增內(nèi)參基因Ma-actinl，各個(gè)基因的擴(kuò)增都做三個(gè)重復(fù)。按照94°C預(yù)變性3min，94°C變性7s，55°C退火15s，72°C延伸20s，共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增(四個(gè)基因的反應(yīng)程序是一致的)，并于每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。 反應(yīng)結(jié)束后做94°C _55°C的融解曲線分析。熒光定量PCR結(jié)果證明，MaGCS表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)、I-MCP抑制，在香蕉果實(shí)采后成熟過程中起著調(diào)控乙烯生物合成、果實(shí)成熟的作用。(2)不同濃度的OA和CA分別在不同處理時(shí)間條件下處理香蕉果實(shí)將采收的果實(shí)切割成單蕉指，用0. 次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒lOmin，同時(shí)把果實(shí)頂部的干花抹掉，放置一個(gè)晚上晾干，隨機(jī)選取果實(shí)分為13個(gè)處理，每個(gè)處理選取9個(gè)果實(shí)，每3個(gè)裝進(jìn)一個(gè)保鮮盒中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。正常成熟的果實(shí)置于22°C恒溫條件下成熟；檸檬酸處理的果實(shí)于1^^5% (w/v)檸檬酸溶液中分別浸泡10min、30min、lh，晾干后22°C恒溫條件下成熟；草酰乙酸處理的果實(shí)于40mM、100mM草酰乙酸溶液中分別浸泡 30min，lh，2h，晾干后在22°C恒溫條件下成熟。以22°C恒溫條件下未經(jīng)任何處理的香蕉果實(shí)為對(duì)照(CK)。檸檬酸溶液處理的香蕉果實(shí)于處理后第15天觀察不同處理對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟時(shí)期的影響，草酰乙酸處理的香蕉果實(shí)于處理后第10天觀察不同處理對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟時(shí)期的影響，結(jié)果顯示香蕉果實(shí)于(w/v)檸檬酸溶液中浸泡Ih明顯能延長達(dá)到每個(gè)成熟度的時(shí)間，延緩成熟；香蕉果實(shí)于IOOmM的草酰乙酸溶液中浸泡池處理明顯能縮短達(dá)到每個(gè)成熟度的時(shí)間，促進(jìn)成熟(圖2)。
權(quán)利要求
1.一種建立在基因表達(dá)調(diào)控基礎(chǔ)上的采后保鮮新技術(shù)，為將采后的香蕉果實(shí)用IOOmM 的草酰乙酸溶液浸泡2h，獲得具有如下1)-2)中至少一種特征的香蕉果實(shí)1)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡池，促進(jìn)香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；2)用IOOmM的草酰乙酸溶液浸泡池，促進(jìn)香蕉果實(shí)成熟；將采后的香蕉果實(shí)用(w/v)檸檬酸溶液浸泡lh，獲得具有如下3)-4)中至少一種特征的香蕉果實(shí)3)用(w/v)的檸檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；4)用(w/v)的檸檬酸溶液浸泡lh，抑制香蕉果實(shí)成熟； 所述MaGCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述MaGCS蛋白的編碼基因的核苷酸序列為如下1)或2):1)序列表中的序列1；2)序列表中序列1自5’末端第1-1737位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MaGCS蛋白在香蕉果實(shí)成熟中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種建立在基因表達(dá)調(diào)控基礎(chǔ)上的采后保鮮新技術(shù)，為將采后的香蕉果實(shí)用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，獲得具有如下1)-2)中至少一種特征的香蕉果實(shí)1)用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促進(jìn)香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；2)用100mM的草酰乙酸溶液浸泡2h，促進(jìn)香蕉果實(shí)成熟；將采后的香蕉果實(shí)用1％(w/v)檸檬酸溶液浸泡1h，獲得具有如下3)-4)中至少一種特征的香蕉果實(shí)3)用1％(w/v)的檸檬酸溶液浸泡1h，抑制香蕉果實(shí)MaGCS的表達(dá)；4)用1％(w/v)的檸檬酸溶液浸泡1h，抑制香蕉果實(shí)成熟；所述MaGCS蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，MaGCS可被草酰乙酸(OA)和檸檬酸(CA)分別誘導(dǎo)和抑制表達(dá)，從而調(diào)控采后香蕉果實(shí)成熟度的變化。該基因的應(yīng)用對(duì)于建立香蕉采后果實(shí)成熟調(diào)控新技術(shù)和培育優(yōu)良品種具有重要的理論及實(shí)際意義。
文檔編號(hào)A23B7/154GK102487994SQ201110377239
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 賈彩紅, 遲光紅, 金志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站, 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所