專利名稱：基于i型膠原凝膠的細胞微球制備與成絲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，涉及一種細胞微球體外擴增制備與成絲的方法。
背景技術(shù)：
在組織工程和再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用中，需要大量的種子細胞，并且需要將這些種子細胞接種到特定的生物材料上進行塑形，由于傳統(tǒng)的方法是通過傳代進行細胞的大規(guī)模擴增，手工收獲的種子細胞也是通過手工接種與生物材料進行復(fù)合，操作簡單繁瑣、容易污染、細胞接種不均勻，無法滿足組織工程產(chǎn)業(yè)化的要求。目前對種子細胞的擴增通常的方法仍是采用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或者多層細胞培養(yǎng)裝置進行手工培養(yǎng)，種子細胞的搜集與接種仍是通過離心手工完成，無法滿足組織工程構(gòu)建形態(tài)復(fù)雜的組織的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種采用I型膠原凝膠顆粒為載體，將培養(yǎng)液流動形成動態(tài)托舉硫化層，懸浮培養(yǎng)擴增細胞微球的方法，達到大量擴增組織工程種子細胞的目的； 目的之二是提供一種將細胞微球包被I型膠原凝膠制備細胞微球活性絲線的方法，能夠獲得基于I型膠原凝膠的細胞微球活性單絲，能對細胞微球進行位置控制。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為
基于I型膠原凝膠的細胞微球制備與成絲的方法包括以下步驟 1、將細胞與2-20ml含50%-80%1型膠原凝膠顆粒的培養(yǎng)液通過材料入口注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，將培養(yǎng)液經(jīng)培養(yǎng)液入口注入，培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)液流入管流經(jīng)層流發(fā)生板，在錐形細胞微球培養(yǎng)室內(nèi)形成流化床層流托舉層，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液流量的大小，控制培養(yǎng)液流托舉層的形狀與強弱，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上進行粘附培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，促進細胞與I型膠原凝膠顆粒的粘附與培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液形成穩(wěn)定托舉層后將通過錐形細胞微球培養(yǎng)室的邊緣流出，經(jīng)過培養(yǎng)液流出管和培養(yǎng)液出口流出，形成一個循環(huán)的回路，保證了培養(yǎng)液形成的流化床托舉層的穩(wěn)定。2、當細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上粘附培養(yǎng)時，細胞數(shù)量不斷增加， 為此，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒在流化托舉層相互接觸粘附，形成更多新的細胞微球，新的細胞在I型膠原凝膠顆粒上不斷擴增形成細胞基質(zhì)含量豐富的細胞微球，這樣循環(huán)往復(fù)的培養(yǎng)，使得細胞不斷擴增，細胞微球的數(shù)量也不斷增多；這樣連續(xù)培養(yǎng)6-20天，達到一定的細胞數(shù)量，結(jié)束細胞微球的制備。3、當細胞微球制備完成后，停止培養(yǎng)液注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，開啟電機旋轉(zhuǎn)， 電機轉(zhuǎn)軸通過傳動軸帶動細胞微球擴增培養(yǎng)裝置旋轉(zhuǎn)，使得錐形細胞微球培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)液產(chǎn)生動旋流運動，將細胞微球聚集在培養(yǎng)液的中心表面位置，采用吸管沿材料入口伸入錐形細胞微球培養(yǎng)室即可將細胞微球取出。
4、將培養(yǎng)好的細胞微球經(jīng)細胞微球入口注入，同時，將I型膠原凝膠溶液通過右蠕動泵和左蠕動泵注入，并經(jīng)過I型膠原-培養(yǎng)液右入口和I型膠原-培養(yǎng)液左入口流入位于細胞微球成絲平臺上的混合容器，形成螺旋向下的流動，并與細胞微球會合流入細胞微球-I型膠原成絲管，由于形成了下螺旋運動，能夠?qū)⒓毎⑶蚬潭ㄔ诩毎⑶?I型膠原成絲管的中央位置并均勻向下運動進入37 °C潔凈空氣定型室。5、將37°C恒溫潔凈空氣經(jīng)過37°C恒溫潔凈空氣右入口和37°C恒溫潔凈空氣左入口流入位于支承桿內(nèi)的37°C潔凈空氣定型室，最后，通過37°C恒溫潔凈空氣出口豎直向下流出，對整個細胞微球-I型膠原成絲管進行保溫的作用，使得I型膠原包被的細胞微球活性絲線定型流出。6、流出的細胞微球活性絲線進入位于底座上并裝滿培養(yǎng)液的細胞微球絲線收集容器，獲得了具有細胞微球活性的絲線。本發(fā)明的有益效果改變了傳統(tǒng)的細胞擴增的傳代模式，采用培養(yǎng)液流動形成流化床托舉層懸浮培養(yǎng)擴增細胞微球，增加了細胞外基質(zhì)的含量，制備的I型膠原包被的細胞微球活性絲線克服了細胞懸液在細胞接種和細胞治療中無法控制細胞位置的狀態(tài)，為精確構(gòu)建復(fù)雜組織和器官提供了大量的不同種類的細胞微球絲線。


圖1是本發(fā)明關(guān)于細胞微球擴增制備與收集裝置結(jié)構(gòu)圖； 圖2是本發(fā)明關(guān)于細胞微球成絲裝置結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖中所涉及的裝置對本發(fā)明作進一步描述。如圖1，一種基于I型膠原凝膠顆粒的細胞微球擴增培養(yǎng)與自動收集的裝置包括細胞微球擴增培養(yǎng)室、培養(yǎng)液硫化床托舉層流動循環(huán)機構(gòu)、細胞微球自動收集機構(gòu)三部分組成。細胞微球擴增培養(yǎng)室包括密封蓋1、上固定端蓋板2、細胞微球培養(yǎng)裝置3、培養(yǎng)室緊固螺釘4、材料入口 11、固定螺釘12、錐形細胞微球培養(yǎng)室13等部件。密封蓋與上固定端蓋板連接形成一個封閉的環(huán)境，細胞微球培養(yǎng)裝置中的錐形細胞微球培養(yǎng)室進行細胞微球的培養(yǎng)與制備，I型膠原凝膠和細胞通過材料入口進行添加。培養(yǎng)液硫化床托舉層流動循環(huán)機構(gòu)包括傳動軸密封固定架5、培養(yǎng)液入口 6、傳動軸7、層流發(fā)生板14、培養(yǎng)液流出管15、培養(yǎng)液出口 16、培養(yǎng)液流入管17、緊固螺栓18、電機固定板螺栓19等部件組成。培養(yǎng)液硫化床托舉層流動循環(huán)機構(gòu)為細胞微球擴增培養(yǎng)室提供穩(wěn)定的培養(yǎng)液硫化床托舉層，使細胞微球懸浮培養(yǎng)。細胞微球自動收集機構(gòu)包括錐形細胞微球擴增培養(yǎng)室13、傳動軸密封固定架5、 傳動軸7、電機固定板8、電機9、電機箱10、材料入口 11、固定螺釘12、電機固定板螺栓19、 電機緊固螺栓20等部件組成。當細胞微球擴增培養(yǎng)完成后，啟動電機，通過培養(yǎng)液形成動旋流的作用收集細胞微球。如圖2，是一種基于I型膠原凝膠包被的細胞微球成絲裝置，包括細胞微球與I型膠原凝膠混合定位機構(gòu)、細胞微球絲線定型機構(gòu)和細胞微球絲線收集機構(gòu)三部分組成。細胞微球與I型膠原凝膠混合定位機構(gòu)包括混合容器上蓋22、I型膠原-培養(yǎng)液
4右入口 23、I型膠原-培養(yǎng)液左入口 32、細胞微球成絲平臺24、支承桿沈、細胞微球-I型膠原成絲管27、細胞微球入口 30、混合容器31、右蠕動泵21、左蠕動泵四等部件構(gòu)成。將 I型膠原凝膠溶液形成下螺旋流動，對細胞微球進行中心定位。細胞微球絲線定型機構(gòu)包括37°C恒溫潔凈空氣右入口 25、37°C恒溫潔凈空氣左入口 34、支承桿沈、細胞微球-I型膠原成絲管27、37°C潔凈空氣定型室33、37°C恒溫潔凈空氣出口 35等部件組成。形成基于I型膠原凝膠包被的細胞微球活性絲線。細胞微球絲線收集機構(gòu)包括底座觀、細胞微球-I型膠原成絲管27、細胞微球絲線收集容器36等部件組成。 結(jié)合上述裝置對本發(fā)明方法作進一步說明?；贗型膠原凝膠的細胞微球制備與成絲的方法包括以下步驟
1、將細胞與2-20ml含50%-80%1型膠原凝膠顆粒的培養(yǎng)液通過材料入口注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，將培養(yǎng)液經(jīng)培養(yǎng)液入口注入，培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)液流入管流經(jīng)層流發(fā)生板，在錐形細胞微球培養(yǎng)室內(nèi)形成流化床層流托舉層，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液流量的大小，控制培養(yǎng)液流托舉層的形狀與強弱，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上進行粘附培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，促進細胞與I型膠原凝膠顆粒的粘附與培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液形成穩(wěn)定托舉層后將通過錐形細胞微球培養(yǎng)室的邊緣流出，經(jīng)過培養(yǎng)液流出管和培養(yǎng)液出口流出，形成一個循環(huán)的回路，保證了培養(yǎng)液形成的流化床托舉層的穩(wěn)定。2、當細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上粘附培養(yǎng)時，細胞數(shù)量不斷增加， 為此，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒在流化托舉層相互接觸粘附，形成更多新的細胞微球，新的細胞在I型膠原凝膠顆粒上不斷擴增形成細胞基質(zhì)含量豐富的細胞微球，這樣循環(huán)往復(fù)的培養(yǎng)，使得細胞不斷擴增，細胞微球的數(shù)量也不斷增多；這樣連續(xù)培養(yǎng)6-20天，達到一定的細胞數(shù)量，結(jié)束細胞微球的制備。3、當細胞微球制備完成后，停止培養(yǎng)液注入錐形細胞微球培養(yǎng)室，開啟電機旋轉(zhuǎn)， 電機轉(zhuǎn)軸通過傳動軸帶動細胞微球擴增培養(yǎng)裝置旋轉(zhuǎn)，使得錐形細胞微球培養(yǎng)室內(nèi)的培養(yǎng)液產(chǎn)生動旋流運動，將細胞微球聚集在培養(yǎng)液的中心表面位置，采用吸管沿材料入口伸入錐形細胞微球培養(yǎng)室即可將細胞微球取出。4、將培養(yǎng)好的細胞微球經(jīng)細胞微球入口注入，同時，將I型膠原凝膠溶液通過右蠕動泵和左蠕動泵注入，并經(jīng)過I型膠原-培養(yǎng)液右入口和I型膠原-培養(yǎng)液左入口流入位于細胞微球成絲平臺上的混合容器，形成螺旋向下的流動，并與細胞微球會合流入細胞微球-I型膠原成絲管，由于形成了下螺旋運動，能夠?qū)⒓毎⑶蚬潭ㄔ诩毎⑶?I型膠原成絲管的中央位置并均勻向下運動進入37°c潔凈空氣定型室。5、將37°C恒溫潔凈空氣經(jīng)過37°C恒溫潔凈空氣右入口和37°C恒溫潔凈空氣左入口流入位于支承桿內(nèi)的37°C潔凈空氣定型室，最后，通過37°C恒溫潔凈空氣出口豎直向下流出，對整個細胞微球-I型膠原成絲管進行保溫的作用，使得I型膠原包被的細胞微球活性絲線定型流出。6、流出的細胞微球活性絲線進入位于底座上并裝滿培養(yǎng)液的細胞微球絲線收集容器，獲得了具有細胞微球活性的絲線。
權(quán)利要求
1.基于I型膠原凝膠的細胞微球制備與成絲的方法，其特征在于該方法包括以下步驟步驟1、將細胞與2-20ml含50%-80% I型膠原凝膠顆粒的培養(yǎng)液通過材料入口(11)注入錐形細胞微球培養(yǎng)室(13)，將培養(yǎng)液經(jīng)培養(yǎng)液入口(6)注入，培養(yǎng)液經(jīng)過培養(yǎng)液流入管 (17)流經(jīng)層流發(fā)生板(14)，在錐形細胞微球培養(yǎng)室(1 內(nèi)形成流化床層流托舉層，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液流量的大小，控制培養(yǎng)液流托舉層的形狀與強弱，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上進行粘附培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口(11)將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室(13)，促進細胞與I型膠原凝膠顆粒的粘附與培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中， 培養(yǎng)液形成穩(wěn)定托舉層后將通過錐形細胞微球培養(yǎng)室(1 的邊緣流出，經(jīng)過培養(yǎng)液流出管(1 和培養(yǎng)液出口(16)流出，形成一個循環(huán)的回路，保證了培養(yǎng)液形成的流化床托舉層的穩(wěn)定；步驟2、當細胞與I型膠原凝膠顆粒懸浮在托舉層上粘附培養(yǎng)時，細胞數(shù)量不斷增加， 為此，在培養(yǎng)過程中，定期通過材料入口(11)將I型膠原凝膠顆粒注入錐形細胞微球培養(yǎng)室(13)，使得細胞與I型膠原凝膠顆粒在流化托舉層相互接觸粘附，形成更多新的細胞微球，新的細胞在I型膠原凝膠顆粒上不斷擴增形成細胞基質(zhì)含量豐富的細胞微球，這樣循環(huán)往復(fù)的培養(yǎng)，使得細胞不斷擴增，細胞微球的數(shù)量也不斷增多；這樣連續(xù)培養(yǎng)6-20天，結(jié)束細胞微球的制備；步驟3、當細胞微球制備完成后，停止培養(yǎng)液注入錐形細胞微球培養(yǎng)室(1 ，開啟電機 (9)旋轉(zhuǎn)，電機轉(zhuǎn)軸通過傳動軸(7)帶動細胞微球擴增培養(yǎng)裝置旋轉(zhuǎn)，使得錐形細胞微球培養(yǎng)室(1 內(nèi)的培養(yǎng)液產(chǎn)生動旋流運動，將細胞微球聚集在培養(yǎng)液的中心表面位置，采用吸管沿材料入口(11)伸入錐形細胞微球培養(yǎng)室(1 即可將細胞微球取出；步驟4、將培養(yǎng)好的細胞微球經(jīng)細胞微球入口(30)注入，同時，將I型膠原凝膠溶液通過蠕動泵(21)和蠕動泵(29)注入，并經(jīng)過I型膠原-培養(yǎng)液右入口 03)和I型膠原-培養(yǎng)液左入口(32)流入位于細胞微球成絲平臺(24)上的混合容器(31)，形成螺旋向下的流動，并與細胞微球會合流入細胞微球-I型膠原成絲管(27)，由于形成了下螺旋運動，能夠?qū)⒓毎⑶蚬潭ㄔ诩毎⑶?I型膠原成絲管(27)的中央位置并均勻向下運動進入37°C潔凈空氣定型室(33)；步驟5、將37°C恒溫潔凈空氣經(jīng)過37°C恒溫潔凈空氣右入口(25)和37°C恒溫潔凈空氣左入口(34)流入位于支承桿(26)內(nèi)的37°C潔凈空氣定型室(33)，最后，通過37°C恒溫潔凈空氣出口(35)豎直向下流出，對整個細胞微球-I型膠原成絲管(27)進行保溫的作用， 使得I型膠原包被的細胞微球活性絲線定型流出；步驟6、流出的細胞微球活性絲線進入位于底座(28)上并裝滿培養(yǎng)液的細胞微球絲線收集容器(36 )，獲得了具有細胞微球活性的絲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于I型膠原凝膠的細胞微球制備與成絲的方法。目前對種子細胞的擴增通常的方法仍是采用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或者多層細胞培養(yǎng)裝置進行手工培養(yǎng)，種子細胞的搜集與接種仍是通過離心手工完成，無法滿足組織工程構(gòu)建形態(tài)復(fù)雜的組織的需求。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的細胞擴增的傳代模式，采用培養(yǎng)液流動形成流化床托舉層懸浮培養(yǎng)擴增細胞微球，增加了細胞外基質(zhì)的含量，制備的I型膠原包被的細胞微球活性絲線克服了細胞懸液在細胞接種和細胞治療中無法控制細胞位置的狀態(tài)，為精確構(gòu)建復(fù)雜組織和器官提供了大量的不同種類的細胞微球絲線。
文檔編號C12N11/04GK102517272SQ20111037708
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者李宏 申請人:杭州電子科技大學(xué)