專利名稱：苯妥因免疫原、抗苯妥因特異性抗體和苯妥因檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及苯妥因免疫原、抗苯妥因特異性抗體和苯妥因檢測試劑。
背景技術(shù)：
苯妥因(5,5-Diphenyl_2,4-imidazolidinedione),其結(jié)構(gòu)式如式(II)所不。
權(quán)利要求
1.一種苯妥因免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯妥因免疫原，其特征在于載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)， 選自血清蛋白，血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白中的一種，優(yōu)選為牛血清蛋白。
3.—種如權(quán)利要求1-2中任一項所述的苯妥因免疫原的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)用50-200ml有機溶劑A溶解1.0-10.Og的羥基ニ苯酮和1.0-5. Og的碳酸鹽，得到 溶液1；將1.0-10. Og的5-溴戊酸乙酯加入到溶液1中，反應(yīng)完成后用5-20ml的有機溶劑 A溶解反應(yīng)物，經(jīng)有機溶劑B萃取、干燥、濃縮得到白色固體狀化合物3 ；(2)用50-200ml有機溶劑C溶解1.0-10.Og的化學(xué)物3，加入強堿溶液反應(yīng)，得到白色 固體；將此白色固體經(jīng)有機溶劑C萃取、無機酸溶液酸化、干燥、濃縮、純化等步驟得到白色 固體狀化學(xué)物4 ；(3)用10-50ml的有機溶劑A溶解下列化合物1.0-5.Og化學(xué)物4,0. 1-2. Og氰化鉀， 1.0-10. Og碳酸銨和I-IOml水。經(jīng)加熱反應(yīng)得到的物質(zhì)用強堿溶液溶解，經(jīng)無機酸中和、有 機溶劑B萃取、干燥、濃縮和純化等步驟得到白色固體粉末狀苯妥因衍生物；(4)將具有免疫原性的蛋白質(zhì)100-300mg溶于IO-IOOml的0.2M，pH 8. 5磷酸鹽緩沖 液中；(5)用1.0-5.Oml的有機溶劑A溶解50-500mg的苯妥因衍生物，通過1_乙 基-3-(-3- ニ甲氨丙基)碳ニ亞胺(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide, EDAC)的方法[1]進(jìn)行活化并與載體溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)透析純化后得到具有免疫原性的 苯妥因免疫原；所述的有機溶劑A選自ニ甲基亞砜、ニ甲基甲酰胺、甲醇或乙醇中的一種，優(yōu)選為ニ甲 基甲酰胺；所述的有機溶劑B選自乙酸乙酷，乙醚或氯仿中的一種，優(yōu)選為乙酸乙酯；所述的有機 溶劑C為乙酸乙酷，乙醚，甲基叔丁基醚或氯仿，優(yōu)選為甲基叔丁基醚；所述的無機酸溶液為鹽酸溶液或硫酸溶液，優(yōu)選為鹽酸溶液。
4.ー種抗苯妥因特異性抗體，由權(quán)利要求1 2任意一項所述的苯妥因免疫原免疫宿 主動物后生產(chǎn)得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗苯妥因特異性抗體，其特征在于所述的抗體為多克隆抗體 或單克隆抗體，優(yōu)選為多克隆抗體，所述的宿主動物選自家兔，山羊，小鼠，綿羊，豚鼠或馬 中的一種，優(yōu)選為家兔。
6.—種如權(quán)利要求4-5中任一項所述的抗苯妥因特異性抗體的制備方法，其特征在于 包含以下步驟(1)用磷酸鹽緩沖液將合成的苯妥因免疫原稀釋至0.5-5. Omg/mL ；(2)經(jīng)常規(guī)弗氏佐劑法對動物進(jìn)行注射，注射后抽取動物特異抗血清，得到有效的抗體。上述步驟(1)中，優(yōu)選地用磷酸鹽緩沖液將苯妥因免疫原稀釋至1. 0-2. Omg/mL。
7.一種苯妥因檢測試劑，含有權(quán)利要求4-5所述的抗苯妥因特異性抗體和指示試劑， 所述的指不試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、突光試劑或化學(xué)發(fā)光試劑中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的苯妥因檢測試劑，其特征在于所述的指示試劑為酶試劑，由 苯妥因酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶底物所組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的苯妥因檢測試劑，其特征在于所述的苯妥因酶標(biāo)偶聯(lián)物的制 備方法包含以下步驟(1)稱取酶，在室溫條件下溶解于磷酸緩沖液中，終濃度為2-6mg/mL；(2)用有機溶劑溶解苯妥因衍生物，使其終濃度為l_50mg/mL，通過EDAC的方法進(jìn)行活 化，并與酶溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)純化和透析后得到苯妥因酶標(biāo)偶聯(lián)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的苯妥因檢測試劑，其特征在于所述的苯妥因酶標(biāo)偶聯(lián)物的 制備方法還可以通過以下優(yōu)選的方案實現(xiàn)(1)稱取酶，在室溫條件下溶解于磷酸緩沖液中，終濃度為3-5mg/mL；(2)用有機溶劑溶解苯妥因衍生物，使其終濃度為l_20mg/mL，通過EDAC的方法進(jìn)行活 化，并與酶溶液進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)純化和透析后得到苯妥因酶標(biāo)偶聯(lián)物，所述的酶標(biāo)偶聯(lián)物的酶選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶中 的一種，優(yōu)選為辣根過氧化物酶；所述的有機溶劑選自二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇或 乙醇中的一種，優(yōu)選為二甲基甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苯妥因免疫原及其合成方法，以及由該免疫原獲得的抗苯妥因特異性抗體、檢測試劑及其制備方法。本發(fā)明由高效價的抗苯妥因特異性抗體研制的免疫試劑可精確的測定血清中苯妥因的濃度。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明提供的免疫檢測試劑靈敏度高、特異性強，并具有操作簡單、速度快、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等特點，對臨床疾病的診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號C07K14/47GK102659939SQ20121012553
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者孟雷, 田軍, 蔡江麗, 虞留明, 袁紅霞 申請人:嘉興九七九生物技術(shù)有限公司