本發(fā)明涉及于基因生物工程領(lǐng)域，尤其是及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用MG TM-1基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雞慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)是由雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的接觸性、慢性呼吸道傳染病。CRD主要引起產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降，蛋的品質(zhì)降低，飼料轉(zhuǎn)化率降低，常給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前市場(chǎng)上的疫苗以弱毒苗和滅活苗為主，雖然它們?cè)谝欢ǔ潭壬峡梢灶A(yù)防和控制上述兩種疫病，但其各自都存在著一定的缺陷?；蚬こ袒钶d體疫苗同時(shí)具備弱毒苗和滅活苗的優(yōu)勢(shì)，又能克服二者不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種TM-1基因重組腺病毒構(gòu)建的方法及重組腺病毒和應(yīng)用，將MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來，構(gòu)建出能夠表達(dá)該基因的重組腺病毒，檢測(cè)免疫雞后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平，通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)其免疫保護(hù)效果，評(píng)價(jià)研制的預(yù)防CRD的基因工程活載體疫苗。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種TM-1基因構(gòu)建重組腺病毒的方法，包括以下步驟：

1)從MG S6株中擴(kuò)增出TM-1基因序列GI：S65869.1；

所述的TM-1基因的擴(kuò)增包括：以TM-1-F SEQ ID NO.1和TM-1-R SEQ ID NO.2為引物，以MG的DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TM-1基因；

2)將TM-1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pDC₃₁₅-MCS-EGFP上，獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP；

3)將重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP。

所述的TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。

所述的TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在預(yù)防雞慢性呼吸道疾病疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：將MG的免疫保護(hù)性基因TM-1基因與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來，構(gòu)建出能夠表達(dá)該基因的重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP，籍此研制預(yù)防CRD的基因工程活載體疫苗。通過對(duì)免疫雞的抗體水平檢測(cè)和免疫攻毒試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了重組腺病毒的免疫效果。研究結(jié)果表明，免疫重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP的雛雞，21日齡后免疫雞的平均抗體可達(dá)到有效抗體水平(OD₄₀₅＞0.49)，且免疫保護(hù)效果與市場(chǎng)弱毒疫苗相當(dāng)。

附圖說明

圖1是TM-1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖(M:DL2502DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:TM-1基因PCR產(chǎn)物；2:pMD-TM-1質(zhì)粒PCR產(chǎn)物)。

圖2是pDC₃₁₅-TM-1-EGFP質(zhì)粒雙酶切結(jié)果圖(M:DL2502DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:pDC₃₁₅-TM-1-EGFP經(jīng)Sal I和Xmal I的雙酶切產(chǎn)物)。

圖3是重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞(×100)圖(A：正常HEK293細(xì)胞圖；B：熒光顯微鏡下正常HEK293細(xì)胞圖；C：重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP感染HEK293細(xì)胞圖；D：重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP感染HEK293細(xì)胞熒光圖)。

圖4是重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP的TM-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖(M:DL2502DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2:TM-1基因PCR產(chǎn)物)。

圖5是Western Blot檢測(cè)在重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞后TM-1蛋白的表達(dá)情況圖。

圖6是ELISA檢測(cè)雞免疫M(jìn)G疫苗后的抗體水平情況圖(從14日齡開始，免疫pBH-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫pBH-EGFP對(duì)照組雞抗體水平差異極顯著；自28日齡開始，免疫pBH-TM-1-EGFP的雞抗體水平與MG弱毒疫苗免疫的雞抗體水平差異極顯著)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：

雞慢性呼吸道病(CRD)是嚴(yán)重威脅養(yǎng)雞業(yè)的雞的重要的呼吸道傳染病。目前市場(chǎng)上的疫苗以弱毒苗和滅活苗為主，雖然它們?cè)谝欢ǔ潭壬峡梢灶A(yù)防和控制該疫病，但其各自都存在著一定的缺陷。基因工程苗同時(shí)具備弱毒苗和滅活苗的優(yōu)勢(shì)，又能克服二者不足。腺病毒載體相比其他載體具有明顯的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外均有很多以腺病毒為載體制備疫苗的報(bào)道，目前腺病毒載體系統(tǒng)已經(jīng)相當(dāng)成熟。對(duì)MG的研究也已較為清晰，有報(bào)道利用其它活載體研制CRD的基因工程疫苗，且免疫攻毒試驗(yàn)證實(shí)對(duì)雞有一定的保護(hù)作用，因此，本發(fā)明利用雞毒支原體TM-1基因構(gòu)建重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP，籍此研制預(yù)防CRD的基因工程活載體疫苗。

本發(fā)明雞MG TM-1基因構(gòu)建重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP的方法，包括以下步驟：

1)MG TM-1基因片段的擴(kuò)增與T-A克隆；

2)構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP；

3)在HEK293細(xì)胞中重組和包裝病毒pBH-TM-1-EGFP。

具體包括步驟如下：

1)從MG S6株中擴(kuò)增出TM-1基因序列GI：S65869.1；

所述的TM-1基因的擴(kuò)增包括：以TM-1-F SEQ ID NO.1和TM-1-R SEQ ID NO.2為引物，以MG的DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TM-1基因；

2)將TM-1基因亞克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pDC₃₁₅-MCS-EGFP上，獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP；

3)將重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，重組并包裝獲得重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP。

如所述的MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒。

如所述的MG TM-1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒在預(yù)防雞慢性呼吸道疾病疫苗中的應(yīng)用。

也就是說：從MG S6株中擴(kuò)增出目的基因；將目的基因經(jīng)T-A克隆至pMD19-T載體上；經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后與穿梭載體pDC₃₁₅-MCS-EGFP連接；利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP與腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)PCR、Western blot鑒定重組腺病毒；重組腺病毒純化后，經(jīng)TCID₅₀方法測(cè)定重組腺病毒的滴度；將重組腺病毒和市場(chǎng)弱毒疫苗分別免疫雞，ELISA檢測(cè)免疫雞抗體，免疫攻毒檢測(cè)免疫雞的發(fā)病率和死亡率，評(píng)價(jià)研制二聯(lián)疫苗免疫雞的效果。

下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：

1材料與方法

1.1TM-1基因的擴(kuò)增

收集接種到PPLO液體培養(yǎng)基中的MG S6株菌體，利用飽和酚-氯仿抽提法提取MG的DNA；根據(jù)GenBank中MG TM-1基因序列(S65869.1)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。TM-1基因引物見表1(劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為Kozak序列，加粗部分為6×His)，TM-1基因的PCR反應(yīng)體系見表2。

表1擴(kuò)增TM-1基因片段的引物序列

表2TM-1基因PCR反應(yīng)體系

注：反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5min；{94℃，變性30s；55℃，退火35s；72℃，延伸1min}共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2重組穿梭腺病毒載體的構(gòu)建

將獲得的TM-1基因與穿梭載體pDC₃₁₅-MCS-EGFP用相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切(酶切反應(yīng)體系見表3)，再將其用T₄連接酶16℃連接12h(反應(yīng)體系見表4)。經(jīng)菌液PCR、酶切及測(cè)序鑒定，篩選出正確的重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP。

表3酶切反應(yīng)體系

表4T4連接酶連接體系

1.3腺病毒的重組與包裝

取脂質(zhì)體12.0μL，并將其與2μg腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP和4μg腺病毒大骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre混勻，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使其在HEK293細(xì)胞中重組與包裝14d左右，收集CPE細(xì)胞，反復(fù)凍融并收集病毒，凍存-80℃。

將收集的重組腺病毒接種到正常的HEK293細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況。通過提取病毒基因組試劑盒提取重組腺病毒的DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)目的基因；收集重組腺病毒感染48h后的HEK293細(xì)胞，然后通過western blot檢測(cè)TM-1蛋白的表達(dá)情況。

1.4重組腺病毒滴度的測(cè)定

利用腺病毒純化試劑盒，將重組腺病毒純化，再根據(jù)TCID₅₀法檢測(cè)重組腺病毒的滴度。

1.5ELISA檢測(cè)免疫雞的抗體水平

選取SPF雞60只，隨機(jī)分組3組，20只/組；分別設(shè)置pBH-TM-1-EGFP組、MG弱毒疫苗組、pBH-EGFP組。7日齡進(jìn)行首免，21日齡二免，滴鼻點(diǎn)眼免疫接種10⁶TCID₅₀，期間，每7天進(jìn)行一次翅下靜脈采集血并分離血清。利用ELISA試劑盒檢測(cè)免疫雞不同時(shí)間的抗體水平。

1.6免疫保護(hù)試驗(yàn)

分別對(duì)pBH-TM-1-EGFP組、MG弱毒疫苗組、pBH-EGFP組進(jìn)行接種強(qiáng)毒MG；統(tǒng)計(jì)雞的發(fā)病率與死亡率。

2結(jié)果與分析

2.1TM-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用根據(jù)GenBank中TM-1基因序列設(shè)計(jì)的TM-1基因引物對(duì)提取MG的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期片段；T-A克隆獲得PMD-TM-1質(zhì)粒，同樣利用設(shè)計(jì)的TM-1基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期目的片段(見圖1)。

2.2擴(kuò)增的TM-1基因測(cè)序結(jié)果分析

將測(cè)序后TM-1基因的核苷酸序列與GenBank中TM-1基因核苷酸序列(S65869.1)進(jìn)行Blast對(duì)比分析，TM-1基因序列的同源性達(dá)100％，且均無堿基缺失和插入。

2.3腺病毒重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP雙酶切結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶Sal I和Xmal I對(duì)腺病毒重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)測(cè)序，獲得大小為804bp左右的預(yù)期片段(見圖2)。

2.4腺病毒骨架和穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞結(jié)果

利用脂質(zhì)體將腺病毒大骨架分別與重組穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)過14d左右培養(yǎng)后，對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)腫大、變圓，呈葡萄串狀，脫離細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞病變，在熒光顯微鏡下經(jīng)過藍(lán)光激發(fā)，可看到細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，證明分別包裝出重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP。

2.5包裝完成的重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞結(jié)果

將包裝完成的原代(P₀代)重組腺病毒感染正常HEK293細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞腫大、變圓，呈葡萄串狀，脫離細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞病變，在熒光顯微鏡下通過藍(lán)光激發(fā)，可看到細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光；未感染細(xì)胞狀態(tài)正常，且在熒光顯微鏡下觀察不到細(xì)胞及綠色熒光(見圖3)。

2.6重組病毒的目的基因檢測(cè)

對(duì)包裝好的重組腺病毒提取DNA，利用設(shè)計(jì)的TM-1基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)目的基因序列進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示：在804bp左右處出現(xiàn)與預(yù)期片段大小一致的目的條帶(見圖4)。

2.7Western blot檢測(cè)TM-1蛋白表達(dá)的結(jié)果

Western Blot結(jié)果顯示：重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP在約29KDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期TM-1蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)；pBH-TM-1-EGFP和pBH-EGFP在約43KDa處均出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期內(nèi)參β-actin蛋白分子質(zhì)量大小相當(dāng)(見圖5)。

2.8重組病毒的滴度測(cè)定結(jié)果

對(duì)純化濃縮后的重組腺病毒作倍比稀釋后感染HEK293細(xì)胞，感染7d后，根據(jù)KaBer法進(jìn)行計(jì)算陽性孔比率，測(cè)定其滴度為10^10.625TCID₅₀/mL。

2.9ELISA檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)ELISA試劑盒說明書，利用分離的血清檢測(cè)其抗體OD₄₀₅。

從14日齡開始，免疫pBH-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的雞抗體水平分別與免疫pBH-EGFP的對(duì)照組雞抗體水平差異極顯著；自從28日齡開始，免疫pBH-TM-1-EGFP的雞抗體水平與MG弱毒疫苗免疫的雞抗體水平差異極顯著(圖6)。

2.10免疫保護(hù)結(jié)果

攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示：強(qiáng)毒MG攻毒后，pBH-TM-1-EGFP免疫組保護(hù)率為85％，弱毒MG疫苗組保護(hù)率為85％(見表5)。

表5強(qiáng)毒MG攻毒雞的免疫保護(hù)結(jié)果

3結(jié)論

3.1從MG S6株中擴(kuò)增出TM-1基因，并成功連接到pMD19-T載體上，獲得pMD-TM-1克隆質(zhì)粒。

3.2成功獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC₃₁₅-TM-1-EGFP。

3.3成功獲得重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP；且重組腺病毒能夠很好的表達(dá)TM-1蛋白。

3.4收獲的重組腺病毒pBH-TM-1-EGFP滴度為：10^10.625TCID₅₀/mL，符合后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)的所需的滴度要求。

3.5構(gòu)建的重組腺病毒免疫雞的抗體水平相對(duì)高于弱毒疫苗免疫雞的抗體水平，而免疫保護(hù)效果與弱毒疫苗相當(dāng)。

本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，首次將MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)與腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的特性結(jié)合起來，構(gòu)建出能夠表達(dá)上述基因的重組腺病毒，檢測(cè)免疫雞后機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平，并通過免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)了其免疫保護(hù)效果，成功研制了預(yù)防CRD的基因工程活載體疫苗。

以上所述的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。