本發(fā)明涉及基因調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)及其基因調(diào)節(jié)方法和用途。

背景技術(shù)：

核酸開關(guān)，常被定義為“具有功能性的非編碼RNA區(qū)域”，通過選擇性結(jié)合代謝產(chǎn)物來控制相關(guān)基因表達(dá)，出現(xiàn)在多種類型細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)上。一系列對核酸開關(guān)的開發(fā)應(yīng)運(yùn)而生，包括基因治療方面。受益于合成生物學(xué)的進(jìn)步，這些天然的核酸開關(guān)可被改造成可識別任何指定信號來調(diào)節(jié)任何指定相關(guān)基因表達(dá)的工具。

人工核酸開關(guān)的多功能性拓展了基因研究的開展方式，其中茶堿適體是最常見最被廣泛應(yīng)用的調(diào)節(jié)基因表達(dá)裝置之一，在不同的平臺中充當(dāng)開啟或關(guān)閉的開關(guān)裝置調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。茶堿誘導(dǎo)性的miRNA或shRNA同樣在以往的研究中強(qiáng)調(diào)過。然而，現(xiàn)在仍未開發(fā)茶堿誘導(dǎo)性的“RNAi-ON”開關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)及其基因調(diào)節(jié)方法和用途，該RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)根據(jù)茶堿濃度依賴性能夠激活或抑制RNA干擾通路來控制靶基因的表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)，該RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)至少包括一RNA干擾關(guān)閉器件，該RNA干擾關(guān)閉器件本身是一人工miRNA前體或者經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為一人工miRNA前體，上述人工miRNA前體包括miRNA前體部分以及融合到上述miRNA前體部分的環(huán)狀區(qū)域的茶堿RNA適體部分，上述茶堿RNA適體部分可以被茶堿結(jié)合以阻礙RNA干擾作用的發(fā)生。

進(jìn)一步地，上述RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)還包括一RNA干擾開啟器件，該RNA干擾開啟器件包括上述RNA干擾關(guān)閉器件和靶向靶基因的shRNA，上述RNA干擾關(guān)閉器件中的miRNA的成熟體能夠與上述shRNA骨架的環(huán)狀區(qū)域匹配結(jié)合使得shRNA前體轉(zhuǎn)錄被抑制，以便通過添加茶堿來激活RNA干擾作用的發(fā)生。

進(jìn)一步地，上述靶基因是與癌癥發(fā)生相關(guān)的基因。

進(jìn)一步地，上述與癌癥發(fā)生相關(guān)的基因是TINCR基因。

進(jìn)一步地，上述人工miRNA前體對應(yīng)的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：5所示的序列。

進(jìn)一步地，上述shRNA對應(yīng)的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：9所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種基于茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)的基因調(diào)節(jié)方法，該基因調(diào)節(jié)方法包括將第一方面的茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在茶堿的存在下，激活或抑制RNA干擾作用的發(fā)生，從而控制靶基因的表達(dá)。

進(jìn)一步地，上述方法對RNA干擾作用的激活或抑制作用具有茶堿濃度依賴性。

進(jìn)一步地，上述方法中，上述人工miRNA前體對應(yīng)的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：5所示的序列；上述shRNA對應(yīng)的DNA序列本身是或者包括SEQ ID NO：9所示的序列。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供第一方面的茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)在制備由癌癥發(fā)生相關(guān)的靶基因引起的疾病的藥物中的用途。

本發(fā)明提供一種新穎的RNA調(diào)節(jié)器(茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng))，根據(jù)茶堿濃度依賴性它能夠激活或抑制RNA干擾通路來控制靶基因的表達(dá)。申請人尤其是以新發(fā)現(xiàn)的膀胱癌相關(guān)非編碼RNA TINCR作為靶基因，驗(yàn)證茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)的功能，發(fā)現(xiàn)該開關(guān)系統(tǒng)在膀胱癌細(xì)胞中能夠定量控制非編碼RNA TINCR的表達(dá)量來抑制膀胱癌細(xì)胞的進(jìn)展。

附圖說明

圖1顯示si-TINCR轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞5637和SW780后，TINCR表達(dá)水平被顯著性抑制。

圖2顯示(A,B)轉(zhuǎn)染siRNA TINCR后EdU檢測膀胱癌細(xì)胞增殖的代表性圖片。(C)分別在轉(zhuǎn)染si-TINCR后，發(fā)現(xiàn)5637及SW780膀胱癌細(xì)胞增殖受到顯著性地抑制。(D,E)轉(zhuǎn)染si-TINCR后0，24，48，72小時(shí)，膀胱癌細(xì)胞T24、5637顯著抑制癌細(xì)胞的生長。(F)轉(zhuǎn)染siRNA TINCR后，ELISA法檢測細(xì)胞凋亡法發(fā)現(xiàn)膀胱5637和SW780癌細(xì)胞中caspase 3酶的活性顯著性提高。(G,H)siRNA TINCR后流式細(xì)胞儀檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡的代表性圖片。(I)轉(zhuǎn)染siRNA TINCR后，膀胱癌細(xì)胞中早期凋亡細(xì)胞數(shù)顯著性提高。

圖3顯示茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與描述。(A)關(guān)閉器件：茶堿的RNA適體被整合到人工miRNA的環(huán)狀區(qū)域，當(dāng)結(jié)合茶堿時(shí)RNA干擾將會被抑制。RNA轉(zhuǎn)錄的二級結(jié)構(gòu)、適體結(jié)構(gòu)域、miRNA成熟體結(jié)構(gòu)域和分階段的公式如圖所示。(B)開啟器件：由茶堿調(diào)控的人工miRNA能夠抑制shRNA對TINCR沉默作用。miRNA前體、shRNA前體、適體結(jié)構(gòu)域、miRNA成熟體結(jié)構(gòu)域和分階段的公式如圖所示。s表示miRNA或shRNA在正常生理?xiàng)l件下正常表達(dá)率；n表示RNA干擾的抑制參數(shù)，即miRNA或shRNA在細(xì)胞內(nèi)降解率；λ表示miRNA或shRNA靶位點(diǎn)與RISC復(fù)合體的親和力；K表示lncRNA結(jié)合RISC復(fù)合體后降解率；[x]表示茶堿濃度x。

圖4顯示體外驗(yàn)證茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)。(A)0-4mM茶堿下TINCR在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)量。(B,C)CCK8結(jié)果提示在0-2mM茶堿對膀胱癌細(xì)胞生長具有很小的影響。(D)轉(zhuǎn)染人工miRNA之后TINCR在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)量，amiRNA-TINCR在5637和SW780中能夠有效地敲低TINCR。(E,F)轉(zhuǎn)染突變茶堿適體的RNA干擾開關(guān)對照系統(tǒng)后，在0/2mM茶堿下膀胱癌細(xì)胞TINCR的表達(dá)量。(G-J)轉(zhuǎn)染茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)對照系統(tǒng)后，在不同茶堿濃度下膀胱癌細(xì)胞TINCR的表達(dá)量。

圖5顯示體外茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾關(guān)閉器件對膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。(A,B)轉(zhuǎn)染關(guān)閉器件后EdU檢測膀胱癌細(xì)胞增殖的代表性圖片。(C)EdU試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，關(guān)閉器件可抑制由沉默TINCR引起的膀胱癌細(xì)胞增殖抑制。(D,E)CCK8試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，關(guān)閉器件可抑制由沉默TINCR引起的細(xì)胞生長抑制。(F)ELISA試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，關(guān)閉器件可抑制由沉默TINCR引起的caspase 3酶活性的提高。(G,H)轉(zhuǎn)染關(guān)閉器件后流式細(xì)胞儀檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡的代表性圖片。(I)流式凋亡細(xì)胞試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，關(guān)閉器件可抑制由沉默TINCR引起的細(xì)胞早期凋亡。

圖6顯示體外茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開啟器件對膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。(A,B)轉(zhuǎn)染開啟器件后EdU檢測膀胱癌細(xì)胞增殖的代表性圖片。(C)EdU試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的膀胱癌細(xì)胞增殖抑制。(D,E)CCK8試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的細(xì)胞生長抑制。(F)ELISA試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，關(guān)開啟器件可激活由沉默TINCR引起的caspase 3酶活性的提高。(G,H)轉(zhuǎn)染關(guān)閉器件后流式細(xì)胞儀檢測膀胱癌細(xì)胞凋亡的代表性圖片。(I)流式凋亡細(xì)胞試驗(yàn)提示在2mM茶堿情況下，開啟器件可激活由沉默TINCR引起的細(xì)胞早期凋亡。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

在本發(fā)明中，所謂的“RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)”是指特別設(shè)計(jì)的核苷酸序列，其結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為，包括一RNA干擾關(guān)閉器件，該RNA干擾關(guān)閉器件本身是一人工miRNA前體或者經(jīng)轉(zhuǎn)錄成為一人工miRNA前體，上述人工miRNA前體包括miRNA前體部分以及融合到上述miRNA前體部分的環(huán)狀區(qū)域的茶堿RNA適體部分，上述茶堿RNA適體部分可以被茶堿結(jié)合以阻礙RNA干擾作用的發(fā)生。

同時(shí)，本發(fā)明的RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)還可以包括一RNA干擾開啟器件，該RNA干擾開啟器件包括上述RNA干擾關(guān)閉器件和靶向靶基因的shRNA，上述RNA干擾關(guān)閉器件中的miRNA的成熟體能夠與上述shRNA骨架的環(huán)狀區(qū)域匹配結(jié)合使得shRNA前體轉(zhuǎn)錄被抑制，以便通過添加茶堿來激活RNA干擾作用的發(fā)生。

需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，本發(fā)明的RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)并不局限于實(shí)施例中給出的具體核苷酸序列，而是只要具有本發(fā)明中所描述的結(jié)構(gòu)特征就能夠廣泛地適用于各種RNA干擾的關(guān)閉和開啟。

本發(fā)明中，靶基因可以是與癌癥發(fā)生相關(guān)的基因，例如TINCR基因。因此，通過本發(fā)明的RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)能夠關(guān)閉或開啟與TINCR基因相關(guān)的RNA干擾。因此，本發(fā)明的RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)在制備由癌癥發(fā)生相關(guān)的靶基因(例如TINCR基因)引起的疾病的藥物中有重要用途。

以下通過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅是示例性的，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

I.技術(shù)與方法

1.siRNA、質(zhì)粒構(gòu)建

本次實(shí)驗(yàn)中所有的siRNA和質(zhì)粒由中國上海吉瑪有限公司合成。siRNA的序列如下：si-TINCRB(正義鏈):5'-GAUCCCGAGUGAGUCAGAAUU-3'(SEQ ID NO：1)；si-NC(正義鏈，陰性對照):5'-UUCUCCGACGUGUCACGUTT-3'(SEQ ID NO：2)。茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)序列和對照系統(tǒng)序列設(shè)計(jì)后通過化學(xué)合成得到，表1所示的序列插入到siCHECK^TM-2載體的Xhol/Notl位點(diǎn)，表2所示的序列插入到pGPU6-GFP-Neo載體的BbsI/BamHI位點(diǎn)。

表1

表2

注：本發(fā)明中所涉及的核苷酸序列以表1和表2中的記載為準(zhǔn)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

膀胱癌細(xì)胞(5637，SW780)和SV40永生化人尿路上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)購自中國上海市中國科學(xué)院細(xì)胞研究中心。5637細(xì)胞系用1640培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)，SW780細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)，SV-HUC-1用F12K培養(yǎng)基(Invitrogen,CA)，以上培養(yǎng)基均加入10％的胎牛血清(Invitrogen)和1％的雙抗，貼壁生長，37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，0.05％胰酶消化傳代。對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Lipofectamine3000說明書，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80％后，使用Lipofectamin3000試劑及質(zhì)粒的混合液處理細(xì)胞。

3.RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

總RNA提取按照TRIzol RNA提取試劑(Life Technologies)操作說明進(jìn)行，Nanodrop測定總RNA的含量和濃度。總RNA按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq II(Takara)試劑操作說明利用ABI VIVI7熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)執(zhí)行。

相關(guān)引物如下：

TINCR正向引物:5’-TGTGGCCCAAACTCAGGGATACAT-3’(SEQ ID NO：11),反向引物:5’-AGATGACAGTGGCTGGAGTTGTCA-3’(SEQ ID NO：12)；

GAPDH正向引物:5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'(SEQ ID NO：13),反向引物:5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’(SEQ ID NO：14)。

PCR循環(huán)參數(shù)如以下所示：95℃保持15分鐘,接著40個循環(huán)：94℃保持15秒，55℃保持30秒和72℃保持 30秒。每次試驗(yàn)至少重復(fù)三次。內(nèi)參對照基因?yàn)镚APDH基因，所有數(shù)據(jù)均參照GPADH的表達(dá)作歸一化處理。

4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)根據(jù)Cell Counting Kit-8,CCK-8試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnologya)和ethynyl-2-deoxyuridine,EdU試劑盒(Ribobio)操作說明進(jìn)行。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液后標(biāo)記為0H，向其中加入培養(yǎng)基體積1/10的CCK-8；(2)將孔培養(yǎng)板繼續(xù)放置于5％CO2和37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)約1-4小時(shí)，取出孔板用Multiscan GO在450nm波長處檢測OD值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)24H、48H和72H時(shí)CCK-8處理方法同上，注意CCK-8孵育時(shí)間一致。EdU法檢測細(xì)胞增殖：(1)用細(xì)胞培養(yǎng)基按 1000：1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量 50μM EdU培養(yǎng)基；(2)每孔加入 500μl50μM EdU培養(yǎng)基孵育 2小時(shí)，棄培養(yǎng)基；(3)PBS清洗細(xì)胞 1～2次，每次 5分鐘；(4)細(xì)胞固定化；(5)Apollo染色；(6)DNA染色。每次試驗(yàn)至少重復(fù)三次。

5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)根據(jù)按照Caspase-3酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Cusabio)和Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Transdetect)操作說明進(jìn)行。Caspase-3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：(1)配液；(2)溫育；(3)加酶標(biāo)工作液；(4)顯色；(5)檢測OD值。流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液后48h，根據(jù)操作說明，收集細(xì)胞，使用FITC-Annexin V和PI染料雙重顏色，再通過流式流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少三次。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)到數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì),多組間比較均采用獨(dú)立樣本方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì),檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P<0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

II.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.靶向TINCR的siRNAs對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

為了驗(yàn)證TINCR在膀胱癌的功能，我們利用siRNA敲低兩個膀胱癌細(xì)胞系的內(nèi)源性TINCR表達(dá)水平進(jìn)行檢測。分別在膀胱癌細(xì)胞5637和SW780兩個細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染si-TINCR和si-NC,轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后,采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中TINCR基因的mRNA表達(dá)量。圖1顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組TINCR的表達(dá)量在SW780和 5637細(xì)胞中均顯著地降低,差異均具有顯著差異。然后我們分別用CCK-8及EdU細(xì)胞增殖法檢測TINCRsiRNA對膀胱癌細(xì)胞生長的影響。圖2A-F結(jié)果顯示,敲低TINCR過后兩個膀胱癌細(xì)胞系生長均受到抑制。與此同時(shí)我們分別用caspase3酶ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測膀胱癌細(xì)胞的凋亡情況。圖2G-I結(jié)果顯示，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組的caspase 3酶的活性和早期凋亡細(xì)胞均顯著地升高。以上數(shù)據(jù)說明了敲低TINCR表達(dá)水平能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其發(fā)生凋亡。

2.茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾系統(tǒng)的構(gòu)建

第一步我們先構(gòu)建出茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾關(guān)閉器件，該器件能夠轉(zhuǎn)錄出人工miRNA的前體，而茶堿適體將插入到miRNA前體的骨架的環(huán)狀區(qū)域，而前體配體調(diào)控子能夠選擇性識別miRNA前體的末端環(huán)狀區(qū)，從而阻止剪切復(fù)合體的加工，令miRNA的成熟體生成受到抑制。依據(jù)此，我們將茶堿RNA適體融合到miRNA前體環(huán)狀區(qū)域。在茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾關(guān)閉器件中，通過添加茶堿能夠阻礙RNA干擾作用同時(shí)去除其對TINCR的抑制作用(圖3A)。

然后我們通過組合RNA干擾關(guān)閉器件和靶向TINCR的shRNA來構(gòu)建茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開啟器件，器件中的miRNA成熟體能夠與shRNA骨架的環(huán)狀區(qū)域匹配結(jié)合。開啟器件的設(shè)計(jì)是依據(jù)空間位阻效應(yīng)，被miRNA結(jié)合后的shRNA前體轉(zhuǎn)錄將被抑制。因此在茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開啟器件中，通過添加茶堿能夠激活RNA干擾作用同時(shí)產(chǎn)生對TINCR的抑制作用(圖3B)。

最后我們?yōu)榱岁U明兩個器件功能的重要參數(shù)，我們建立了相關(guān)數(shù)學(xué)模型。通過一系列不同的公式來闡述茶堿濃度與lncRNA敲低效率之間的關(guān)系，盡可能細(xì)化到每個進(jìn)程。該模型指出隨著濃度輸入提高，基因的表達(dá)量將大幅度改變，而兩者關(guān)系體現(xiàn)出非線性和飽和性，正是多種生物學(xué)現(xiàn)象的重要特點(diǎn)。

3.體外茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)對TINCR表達(dá)量的作用

為了驗(yàn)證開關(guān)系統(tǒng)的有效性，根據(jù)相關(guān)研究我們設(shè)置了一系列的茶堿濃度梯度對系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。首先通過CCK8試驗(yàn)檢測不同茶堿濃度對細(xì)胞生存的影響，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測不同茶堿濃度對TINCR表達(dá)的影響。結(jié)果提示在0-2mM濃度范圍內(nèi)，茶堿對細(xì)胞生存和TINCR表達(dá)影響很小。當(dāng)茶堿濃度達(dá)到4mM，TINCR表達(dá)量仍未收影響，但此時(shí)膀胱癌細(xì)胞生長受一定限制(圖4A-C)。接著我們通過實(shí)時(shí)定量qPCR驗(yàn)證靶向TINCR的人工miRNA的功能，與對照組相比，amiRNA-TINCR能夠有效地敲低TINCR(圖4D)。分別轉(zhuǎn)染開啟、關(guān)閉及相關(guān)對照器件之后，如果圖4G-J所示，在0-2mM茶堿誘導(dǎo)下，茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開啟和關(guān)閉器件均能夠定量調(diào)節(jié)TINCR的表達(dá)企且在2mM達(dá)到最大誘導(dǎo)效果。因此后續(xù)驗(yàn)證工作我們將采用2mM茶堿為工作濃度。為了進(jìn)一步確定系統(tǒng)是通過茶堿適體發(fā)揮作用，我們構(gòu)建了另一套突變茶堿適體的誘導(dǎo)RNA干擾開關(guān)對照系統(tǒng)，如圖4E-F突變茶堿適體的誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)對照系統(tǒng)不具備與茶堿的應(yīng)答功能。

4.體外驗(yàn)證茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)對膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用

膀胱癌細(xì)胞5637和SW780分別轉(zhuǎn)染茶堿系統(tǒng)后，在含有0或2mM茶堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染關(guān)閉器件后，兩種濃度處理對比下，EdU試驗(yàn)和CCK8試驗(yàn)顯示0mM茶堿下膀胱癌細(xì)胞生長被顯著抑制，流式細(xì)胞凋亡試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)顯示0mM茶堿下膀胱癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增多(圖5)。再次驗(yàn)證敲低TINCR能夠抑制膀胱癌細(xì)胞生長和促進(jìn)其發(fā)生凋亡，同時(shí)說明RNA干擾能夠被器件所抑制。與此相反，轉(zhuǎn)染開啟器件后，EdU試驗(yàn)和CCK8試驗(yàn)顯示2mM茶堿下膀胱癌細(xì)胞生長被顯著抑制，流式細(xì)胞凋亡試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)顯示2mM茶堿下膀胱癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增多(圖6)，證實(shí)RNA干擾能夠被器件所激活?？傮w而言，茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)提供了一個具有精確濃度依賴性的平臺來調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡。

結(jié)論

在本次研究中，我們的結(jié)果證實(shí)了茶堿誘導(dǎo)性RNA干擾開關(guān)系統(tǒng)能夠根據(jù)茶堿的濃度開啟或者關(guān)閉RNA干擾的作用，可對靶基因進(jìn)行精確且定量調(diào)控。通過這種方法我們能夠更全面地更簡便地對基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，受益于合生生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，各種強(qiáng)大的應(yīng)用將會陸續(xù)呈現(xiàn)在基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域中。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。