本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種小麥轉(zhuǎn)化三T超毒載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1.小麥的育種目標(biāo)

小麥(Triticum aestivum)是世界主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)關(guān)系到社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活。隨著人口增加以及國(guó)家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，需要更多的糧食滿足人們的生活需求。但是水土流失導(dǎo)致農(nóng)田不斷減少以及全球氣候變暖使得近幾年的糧食產(chǎn)量增長(zhǎng)并不明顯。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)分析，分析近幾年的全球小麥單產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)小麥單產(chǎn)不穩(wěn)定，且增幅較小，小麥的增產(chǎn)已經(jīng)成為人們關(guān)注的問題之一。

面對(duì)如此大的挑戰(zhàn)，任何可以提高糧食產(chǎn)量的方法都值得去利用。針對(duì)糧食作物品種改良，人們主要采取傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因的方式。兩者的本質(zhì)區(qū)別是：前者通過去雄雜交促進(jìn)親本基因組的變異，后期以優(yōu)良性狀為指標(biāo)，利用田間試驗(yàn)，篩選獲得所需優(yōu)良性狀的小麥品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)引起植物基因定向變異并產(chǎn)生優(yōu)良性狀，相比于傳統(tǒng)雜交育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，進(jìn)一步擴(kuò)大植物基因變異的范圍。植物組織培養(yǎng)是小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵，傳統(tǒng)育種在自然條件下進(jìn)行，所以周期長(zhǎng)、受氣候環(huán)境影響大。轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用組織培養(yǎng)，整個(gè)過程可在培養(yǎng)箱和溫室進(jìn)行，有效避免環(huán)境因素的影響。轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括：基因克隆、目的基因功能鑒定、目的基因插入植物基因組并通過生理鑒定獲得品種改良并具有商業(yè)價(jià)值的植株。植物基因組插入外源基因的方法有基因槍法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等。

2.小麥轉(zhuǎn)化方法

小麥為異源六倍體植物、基因組大、基因調(diào)控困難，同時(shí)小麥外植體所誘導(dǎo)的愈傷組織普遍存在愈傷胚性差、分化率低、轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生困難等問題，是舉世公認(rèn)的最難轉(zhuǎn)化的栽培作物?？茖W(xué)家通過各種方法實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥的轉(zhuǎn)化，但目前最主要的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)是基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)。世界第一株轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荲asil在1992年通過基因槍法將gus、bar基因?qū)胄←溒贩NPavon。1997年Cheng首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS和nptⅡ轉(zhuǎn)入了小麥。除了基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，花粉管通道法、顯微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和電擊法等也受到越來越多的關(guān)注。

3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)原理

農(nóng)桿菌具有天然基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，是生存在土壤中革蘭氏陰性細(xì)菌，包括根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。發(fā)根農(nóng)桿菌中含有Ri質(zhì)粒，可以導(dǎo)致受傷部位產(chǎn)生毛發(fā)狀根。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)主要利用根癌農(nóng)桿菌，根癌農(nóng)桿菌含有能誘發(fā)冠癭瘤的Ti質(zhì)粒，質(zhì)粒主要是由可轉(zhuǎn)移T區(qū)、毒性基因和冠癭堿代謝基因編碼區(qū)。T區(qū)主要特征是左右兩邊分別是長(zhǎng)度為25bp的重復(fù)序列，左右邊界內(nèi)是合成生長(zhǎng)激素、細(xì)胞分裂素和冠癭堿相關(guān)的基因。毒性基因是多段毒性基因組成的：VirA、VirB、VirC、VirD等。天然條件下，雙子葉植物細(xì)胞受到傷害后會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)，一方面誘導(dǎo)農(nóng)桿菌附著植物細(xì)胞表面；另一方面與植物細(xì)胞壁表面的單糖一起誘導(dǎo)Vir區(qū)基因表達(dá)，通過與virA蛋白相互作用(Toyoda-Yamamoto et al.，2000)，激活virA蛋白，具有跨膜組氨酸蛋白激酶功能的virA自磷酸化后將virG蛋白激活，磷酸化的virG作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活vir區(qū)的virB、virC、virD、virE等基因的表達(dá)。virD1是拓?fù)洚悩?gòu)蛋白，可以使DNA結(jié)構(gòu)變得松弛。virD1蛋白識(shí)別并且結(jié)合在T-DNA的左右邊界處，具有特異剪切單鏈DNA內(nèi)切酶作用的virD2，將T-DNA右邊界處切開。在DNA解旋酸的幫助下，virD2蛋白與T一鏈的5’端共價(jià)結(jié)合，避免T-DNA被核酸外切酶降解。DNA復(fù)制酶將單鏈模板從右向左復(fù)制合成新的T-DNA，新鏈代替舊鏈，舊鏈被釋放出來(Dombek et al.，1997)。為防止T-DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，virE2蛋白與游離的核酸蛋白復(fù)合物結(jié)合形成T-復(fù)合體。植物細(xì)胞壁上由virB蛋白組成的通道幫助T-復(fù)合體穿過農(nóng)桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。virD2和virE2的核定位信號(hào)被識(shí)別后，T-復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核并整合進(jìn)植物基因組內(nèi)。

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法發(fā)展：

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原理被研究清楚后，越來越多的單子葉通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因苗。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷(Hieietal.,1994)、轉(zhuǎn)化玉米幼胚(Ishidaetal.,1996)，被侵染的愈傷組織比率在1到30％之間。1984年,Shaw等的試驗(yàn)表明,農(nóng)桿菌對(duì)酚類化合物具有趨化性,而且這種趨化性依賴于virA和virG基因。Potrykus(1990)提到谷類植物很難轉(zhuǎn)化的主要原因不是因?yàn)楸旧聿皇请p子葉，而是因?yàn)樗鼈儾荒墚a(chǎn)生酚類化學(xué)物質(zhì)作為信號(hào)分子。但是1996年許東暉和李寶健通過對(duì)水稻信號(hào)分子研究，提出單子葉植物天然狀態(tài)下不能被農(nóng)桿菌侵染，不是因?yàn)椴荒墚a(chǎn)生酚類誘導(dǎo)物質(zhì)，而是因?yàn)閱巫尤~植物只在生長(zhǎng)過程中的某個(gè)階段特定部位產(chǎn)生酚類物質(zhì)。研究者通過轉(zhuǎn)化過程中單獨(dú)添加乙酰丁香酮大大提高了轉(zhuǎn)化效率，但是成功獲得轉(zhuǎn)基因苗還需要再生能力強(qiáng)的細(xì)胞。1987年christy發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷分為3類，其中胚性愈傷組織的再生能力最強(qiáng),而且胚性愈傷組織易于長(zhǎng)期保存。Hieietal.(1994)和Ishidaetal(1996)不僅指出具有較強(qiáng)分化能力和再生能力的細(xì)胞是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，同時(shí)提出培養(yǎng)基的成分、載體、農(nóng)桿菌特性、篩選標(biāo)記以及植株的基因型都對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響。

5.農(nóng)桿菌菌株和載體

農(nóng)桿菌的天然宿主是雙子葉植物，所以絕大部分農(nóng)桿菌菌株、載體和標(biāo)記基因是針對(duì)雙子葉植物的。大部分的農(nóng)桿菌用于雙子葉植物侵染，少數(shù)一部分菌株既適合雙子葉又可用于單子葉轉(zhuǎn)化：LBA4404菌株和A281菌株的受體范圍廣而且轉(zhuǎn)化效率高(Komari,1989)。早期水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，Hiei在1994年用LBA4404和EHA101轉(zhuǎn)化水稻成功；2014年Ishida用EHA101和EHA105轉(zhuǎn)化小麥；2008年Hensel發(fā)現(xiàn)在大麥AGL1轉(zhuǎn)化率比LBA4404高。

農(nóng)桿菌菌株的選擇除了要考慮到轉(zhuǎn)化效率，還要重視對(duì)植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響。劉鵬等2015年通過EHA105、LBA4404和C58C1將HCP1的RNAi載體導(dǎo)入小麥葉片細(xì)胞中,利用Rohringer染色分析,分析農(nóng)桿菌對(duì)葉片侵染的能力,選擇最適的侵染菌株。Rohringer染色結(jié)果顯示不同農(nóng)桿菌菌株侵染過的葉片,EHA105侵染后對(duì)植物細(xì)胞的傷害比其他兩種菌株明顯,說明EHA105具有較高毒性,會(huì)引起受體防衛(wèi)反應(yīng)。C58C1菌株不僅具有較高的目的基因表達(dá)效率，而且對(duì)葉片的毒性較小,所有選取C58C1作為最適的試驗(yàn)菌株。隨著人們對(duì)T區(qū)轉(zhuǎn)化原理的研究，2013年Someya發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌內(nèi)氨基環(huán)丙烷羧酸脫氨酶的表達(dá)可以減少植物細(xì)胞產(chǎn)生乙烯從而提高T區(qū)轉(zhuǎn)化。值得提出的是農(nóng)桿菌侵染時(shí)的菌液濃度和共培養(yǎng)時(shí)間也是小麥轉(zhuǎn)化過程中需要注意的方面。

同樣針對(duì)單子葉農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的載體也相應(yīng)做了改善。A281的農(nóng)桿菌具有很強(qiáng)的侵染能力，人們從A281克隆出毒性基因的一部分并構(gòu)建到轉(zhuǎn)化載體上獲得具有更強(qiáng)轉(zhuǎn)化力的“超級(jí)雙元載體”(Komari et al.,1996)。Ishida在2007年將含有“超級(jí)雙元載體”的LBA4404轉(zhuǎn)化玉米，并獲得成功。

6.同源重組法

早期人們主要利用酶切連接技術(shù)實(shí)現(xiàn)載體的構(gòu)建，該過程要經(jīng)歷多次目的片段的PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶選擇受限、酶切效率低等問題，所以越來越多的研究者開始尋找新的構(gòu)建載體的途徑。同源重組在載體構(gòu)建的使用受到廣泛的關(guān)注，自然條件下，同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂四分體時(shí)期，非姐妹染色單體之間含有同源序列的DNA片段交叉互換，實(shí)現(xiàn)基因水平的重組。體外同源重組主要是利用目的片段兩端添加15bp左右同源序列，在RecA和RecB、RecC、RecD等蛋白質(zhì)的作用下與線性化的載體發(fā)生同源重組(Dubin et al.，2004)。該技術(shù)只需一次PCR擴(kuò)增，直接使用PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組，大大減小基因突變的概率以及擴(kuò)增酶的使用；酶切反應(yīng)只需要針對(duì)載體進(jìn)行，不僅利用單酶切提高了酶切效率、降低非特異片段，同時(shí)去除了目的基因?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶選擇的限制。該構(gòu)建載體的策略，克服了傳統(tǒng)酶切連接的效率低、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，極大的提高載體構(gòu)建的成功率(馬先勇等，1996)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決目前小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化存在目的基因插入到受體內(nèi)，基因表達(dá)沉默、以及單個(gè)基因?qū)π←溞誀罡牧疾幻黠@等問題，本發(fā)明將現(xiàn)有的用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的載體以及用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的雙T超毒載體通過同源重組(Homologous Recombination)技術(shù)進(jìn)行載體改造，構(gòu)建出一個(gè)新的載體，具有多基因、多位點(diǎn)、一次轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)。使用該載體進(jìn)行的一次小麥遺傳轉(zhuǎn)化，可以在獲得插入多個(gè)目的基因轉(zhuǎn)基因小麥，不僅能實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記基因與目的基因的分離，同時(shí)可以利用一次轉(zhuǎn)化在小麥不同位置插入多個(gè)目的基因。

本發(fā)明所述的小麥轉(zhuǎn)化3T超毒載體3T-v，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，其序列如SEQ ID NO.2。所述的3T-v是以p1011-V為骨架，在SacII酶切位點(diǎn)插入含有可用多克隆位點(diǎn)的新T區(qū)獲得的，獲得了用于小麥轉(zhuǎn)基因的含有三段T-DNA的超毒載體1個(gè)。

本發(fā)明所獲得的小麥轉(zhuǎn)化用載體，不僅可以通過篩選標(biāo)記和目的基因分別插入不同的T-DNA中，成功的去除掉篩選標(biāo)記帶來的轉(zhuǎn)基因安全問題。同時(shí)本載體含有三段可轉(zhuǎn)移基因的T區(qū)，其中一段已經(jīng)連接潮霉素篩選基因，另外兩段T區(qū)均含有可用多克隆位點(diǎn)，可分別插入多個(gè)外源基因，極大擴(kuò)大了載體可連接的目的基因數(shù)目、同時(shí)不同T區(qū)的外源基因插入到受體基因組中的不同位置，極大降低外源基因由于位置效應(yīng)導(dǎo)致外源基因表達(dá)沉默的機(jī)率、以及多基因控制性狀表現(xiàn)不明顯等問題。3T-v載體含有毒性基因G，可以促進(jìn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥。

附圖說明

圖1 3T超毒載體結(jié)構(gòu)圖。

圖2 P1011-V T區(qū)克隆

M:Marker2504；1至4:T區(qū)克隆的T區(qū)片段。

圖3 合成第三段T區(qū)與P1011-V原T區(qū)比對(duì)。

圖4 3T-V菌落PCR

M:Marker2504；1至4:3T-v第三段T區(qū)的PCR鑒定。

圖5 連接GUS和GFP的3T-V轉(zhuǎn)化小麥后愈傷組織GUS染色

A：(3T-v)+GUS+GFP農(nóng)桿菌侵染的小麥愈傷組織GUS染色

B：P1011-V農(nóng)桿菌侵染的小麥愈傷組織GUS染色。

圖6 連接GUS和GFP的3T-V轉(zhuǎn)化小麥后愈傷組織GFP熒光觀察

A：白光光源下(3T-V)+GUS+GFP轉(zhuǎn)化愈傷組織；B：激發(fā)光下圖A的愈傷組織；

C：白光光源下P1011-V轉(zhuǎn)化愈傷組織；D：激發(fā)光下圖C的愈傷組織。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

一、實(shí)驗(yàn)材料

雙T超毒載體p1011-V(CN104388462A)、新多克隆片段(華大基因合成)、DH5α大腸桿菌感受態(tài)、同源重組酶：CloneExpress^TMⅡone step cloning kit(Vazyme公司)。

二、質(zhì)粒DNA的提取

(1)分別挑取實(shí)驗(yàn)過程中的陽性菌落接種于含有卡那霉素的2ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌12～16h。

(2)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中加入500ul的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中

(3)取1-5ml菌液，加入離心管中，4℃，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。

(4)向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液P1，使用移液器徹底懸浮菌液。

(5)向離心管中加入250ul溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

(6)向離心管中加入350ul溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。

(7)取上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重復(fù)操作步驟8。

(10)將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心2min,將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

(12)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100ul洗脫緩沖液EB，室溫放置2min,12000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到1.5ml的離心管中。

三、分析序列，設(shè)計(jì)同源引物

根據(jù)p1011-V載體設(shè)計(jì)克隆引物：

3T-2T-Clone-F5:CATTTGTATGTGGGCCGCG(SEQ ID NO.3)、3T-2T-Clone-R5:ATAGCAGCGGAGGGGTTGG(SEQ ID NO.4)，其從p1011-v上擴(kuò)增長(zhǎng)度為3344bp的載體，其序列如SEQ ID NO.5所示。

根據(jù)p1011-V載體自身酶切位點(diǎn)分析，選擇新T區(qū)含有的可用多克隆位點(diǎn)(MluI、SacI、SmaI)，并且在多克隆位點(diǎn)兩端添加載體同源序列(新MCS)的序列：

TGAACGATCGGGGAAATTCGACGCGTCCGCGGCCCGGGCTCTAGAGTCGACCTGCAGA(SEQ ID NO.6)，片段由華大基因合成；

根據(jù)同源重組技術(shù)的要求，針對(duì)載體和新合成T區(qū)兩端的序列分別設(shè)計(jì)引物?？寺∫铮和?新T區(qū)-F1:GAGCCGATTTTGAAATGGCAGGATATATTGTGG(SEQ ID NO.7)

同源+新T區(qū)-R1:TGCTGCCTGTGATCAGTTTACCCGCC(SEQ ID NO.8)

其從構(gòu)建過程中的中間載體擴(kuò)增得到新T區(qū)長(zhǎng)度為2888bp的片段(新合成T區(qū)),其序列如SEQ ID NO.1所示。

三、PCR擴(kuò)展以及同源重組

(一).新T區(qū)合成

1、PCR擴(kuò)增：

用Phanta^TM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P501-01)，3T-2T-Clone-F5、3T-2T-Clone-R5為引物，從質(zhì)粒p1011-V上擴(kuò)增3344bp的原T區(qū)片段，其擴(kuò)增后片段序列如SEQ ID NO.5，電泳圖見圖2，膠回收后連接T-Vector pMDTM19(Simple)，獲得P19S-T質(zhì)粒。其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序見表1和表2。

表1原T區(qū)PCR反應(yīng)體系

表2原T區(qū)PCR反應(yīng)程序

2、同源重組：

根據(jù)表3配制同源重組反應(yīng)體系，37℃，30分鐘。然后置于冰水浴中5分鐘。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液離心濃縮后全部涂板。37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)過夜。挑23個(gè)單菌落分別溶于20μl LB培養(yǎng)液中，各取1μl菌液作為菌落PCR鑒定的模板，菌落PCR鑒定的程序同表2，鑒定得到的陽性菌液就是含有新合成的T區(qū)質(zhì)粒的菌液，新T區(qū)與p1011-V的原T區(qū)序列比對(duì)見圖3，提取質(zhì)粒獲得P19S-3T。

表3新T區(qū)同源重組體系

(二).3T超毒載體(3T-v)合成

1、PCR擴(kuò)增：

用PhantaTM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P501-01)，同源+新T區(qū)-F1、同源+新T區(qū)-R1為引物從P19S-3T擴(kuò)增得到新T區(qū)片段，膠回收備用。其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參考表4和表5。

表4從P19S-3T擴(kuò)增新T區(qū)的PCR反應(yīng)體系

表5從P19S-3T擴(kuò)增新T區(qū)的PCR反應(yīng)程序

2、同源重組：

參照表6配制同源重組反應(yīng)體系，37℃，30分鐘。然后置于冰水浴中5分鐘。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液離心濃縮后全部涂板。37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)過夜。挑23個(gè)單菌落分別溶于20μl LB培養(yǎng)液中，各取1μl菌液作為菌落PCR鑒定的模板，菌落PCR鑒定的程序同表4、表5，鑒定得到的陽性菌液就是含有新合成的T區(qū)質(zhì)粒的菌液，提取質(zhì)粒獲得3T-v載體，3T-V菌落PCR見圖4。所得到的3T-v載體結(jié)構(gòu)如圖1，其序列如SEQ ID NO.2。

表6 3T-v同源重組體系

其中，步驟三中用到的感受態(tài)DH5α的制備和轉(zhuǎn)化如下：

氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞(Bio Basic,No.BS525)

(1)取少量?jī)龃婢甏竽c桿菌(E.coli)DH5α，在LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)16～20h。

(2)挑取一個(gè)單菌落，接種于含2ml SOB培養(yǎng)液中，恒溫?fù)u床(37℃,250rpm/min)上培養(yǎng)12～16h。

(3)接種1ml的培養(yǎng)物到500ml錐形瓶中(內(nèi)含100ml SOC培養(yǎng)液)，恒溫?fù)u床(37℃,250rpm/min)上培養(yǎng)至OD600≈0.35。

(4)迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中20min，期間緩慢搖勻使內(nèi)容物充分均勻冷卻。同時(shí)將2個(gè)50ml離心管置于冰上預(yù)冷，為下一步做準(zhǔn)備。

(5)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃，4000rpm離心15min，棄去上清。

(6)用16ml的溶液A小心的懸浮細(xì)菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm離心15min，收集菌體。

(8)用4ml溶液B重新懸浮細(xì)菌，分裝，80μl/管，液氮速凍，-70℃保存。

(9)用于轉(zhuǎn)化時(shí)，將100pg到10ng DNA加到感受態(tài)細(xì)胞(冰上溶解)中。

(10)細(xì)胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培養(yǎng)5min或42℃培養(yǎng)90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培養(yǎng)基，37℃溫和搖動(dòng)培養(yǎng)1h。

(12)在選擇性培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)12～16h。

實(shí)施例2：本發(fā)明載體的應(yīng)用

一、實(shí)驗(yàn)材料

pEGAD和pFGUS3(購(gòu)買于中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心)、3T-v、大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌EHA105,同源重組酶：CloneExpressTMⅡone step cloning kit(Vazyme公司)

二、PCR擴(kuò)增GUS和GFP基因

使用同源GFP-F2：CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ ID NO.11)、同源GFP-R2：TACTAGTCGACGTCAGGATCCTCAGGCCGCTGCCGCA(SEQ ID NO.12)；同源GUS-F2:

GACTCTAGACCCGGGCCGCGGATGGTAGATCTGAGGGTAAA(SEQ ID NO.13)、同源

GUS-R2:GGGAAATTCACGCGTCCGCGGTCACACGTGGTGGTGG(SEQ ID NO.14)分別從pEGAD和pFGUS3分別擴(kuò)增出兩端含有載體同源序列的GFP(SEQ ID NO.9)和GUS(SEQ ID NO.10)。

三、同源重組

使用兩端含有同源序列的GUS和GFP，分別于3T-v載體同源重組，同源重組的體系參照表6。37℃，30分鐘。然后置于冰水浴中5分鐘。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，菌液離心濃縮后全部涂板。37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)過夜。挑23個(gè)單菌落分別溶于20μl LB培養(yǎng)液中，各取1μl菌液作為菌落PCR鑒定的模板，菌落PCR鑒定的程序同表4和表5，鑒定得到的陽性菌液就是含有GUS和GFP的3T-v質(zhì)粒的菌液，提取質(zhì)粒。

四、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)制備以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、農(nóng)桿菌感受態(tài)制備：

(1)挑取單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)16h；

(2)擴(kuò)大培養(yǎng)于50ml LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6(約6h)；

(3)50ml離心管冰浴30min，4℃，5000rpm離心5min，回收細(xì)胞，輕輕倒掉上清；

(4)5ml預(yù)冷的TE重懸，4℃，5000rpm離心5min，回收細(xì)胞，輕輕倒掉上清；

(5)5ml新鮮的液體LB重懸；

(6)200μl每管分裝，若不立即使用，液氮速凍1min，-70℃冰箱保存。

2：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

(1)取感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞200μl，加入質(zhì)粒2-5μl；

(2)冰上10min；

(3)液氮10min；

(4)37℃，10min，300rpm(提前準(zhǔn)備)；

(5)加入800μl LB液體培養(yǎng)基，28℃，3h，350rpm；

(6)6000rpm離心，吸去上清800μl，涂板；

(7)28℃，培養(yǎng)48h；

(8)挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用同源GUS-F2/R2、同源GFP-F2/R2進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽性的可直接用于小麥的轉(zhuǎn)化。

五、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織以及GUS和GFP鑒定：

將含有質(zhì)粒3T-v+GUS+GFP的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600的值在0.5的濃度，與培養(yǎng)10天的揚(yáng)麥14成熟胚的愈傷組織共培養(yǎng)30min。

GUS染色：轉(zhuǎn)化后小麥愈傷組織300個(gè)、陰性對(duì)照愈傷組織300個(gè)與X-Gluc染色反應(yīng)液(0.5mM K4[Fe(CN)6；50mM NaH2PO4，PH7.0]，20％甲醇、0.1％Triton X-100，0.5mg/ml X-Gluc[X-glucuronide])于37℃保溫過夜后，用75％乙醇脫色觀察(圖5)；GFP：采用熒光顯微鏡對(duì)所有轉(zhuǎn)化的待鑒定的愈傷組織、陰性愈傷組織進(jìn)行觀察。(圖6)。