本發(fā)明屬于真核細胞轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域,更具體地,涉及基于非整合型慢病毒載體的附加體及其用于建立穩(wěn)定表達感興趣的異源基因的細胞系的用途。
背景技術(shù):
整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)是在病毒整合酶的催化結(jié)構(gòu)域中包含突變的非復(fù)制型慢病毒。因此,名為1-LTR和2-LTR的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)狀cDNA外產(chǎn)物(off-product)在細胞核中聚積,但是不能整合到宿主基因組中(圖1)(RJ et al.,Nat.Med.2006,12:348–353)。作為任何其他外源性DNA,那些中間體能夠以相同頻率整合到細胞內(nèi)的DNA(103至105/細胞)中。
源自IDLV的cDNA的染色體外(附加體)特性已被避免典型慢病毒的一些不利缺點。附加型載體展示了對細胞基因組最小程度的干擾,因此最小化了由病毒傳遞的轉(zhuǎn)基因的位置依賴性表達譜以及因插入突變造成的潛在傷害。盡管早期熱衷獲得這些新型載體,但是主要問題是源于它們不能自主復(fù)制。然后,連續(xù)的細胞分裂通過稀釋帶有附加體的細胞,導(dǎo)致慢病毒載體序列消失,從而將它們的適用性限制于一組作為神經(jīng)系統(tǒng)的很窄的低至沒有核分裂能力的組織和細胞。由此得出結(jié)論,基于這些載體的基因療法受限于具有非常低的細胞分裂速率的靶標衰老組織或細胞,以確保由轉(zhuǎn)基因驅(qū)動矯正的表型的持久性。不幸的是,許多潛在的通過基因療法可治療的疾病依賴于進行生命細胞分裂的修飾高度分裂的細胞或組織(如造血或上皮干細胞)以及基于干/iPS細胞的不是這些載體靶標的治療。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
在第一方面,本發(fā)明涉及一種多核苷酸,其包括
(i)源自慢病毒的第一長末端重復(fù)序列,
(ii)真核復(fù)制起點,其選自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3序列及其功能等價變體的復(fù)制起點組成的群組,
(iii)支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)(scaffold/matrix attachment region),其選自具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6序列及其功能等價變體的支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)組成的群組,以及
(iv)源自所述慢病毒的第二長末端重復(fù)序列,
其中所述真核復(fù)制起點和所述支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)位于所述第一和第二長末端重復(fù)序列之間。
在第二個方面,本發(fā)明涉及一種包括根據(jù)第一方面的多核苷酸的載體。
在第三個方面,本發(fā)明涉及一種包括根據(jù)第一方面的多核苷酸或根據(jù)第二方面的載體的細胞。
在第四個方面,本發(fā)明涉及一種包括根據(jù)第一方面的多核苷酸和慢病毒整合酶的重組慢病毒,所述慢病毒整合酶包括引起所述整合酶無法催化病毒基因組整合到細胞基因組中的突變。
在第五個方面,本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生根據(jù)第四方面的重組慢病毒的體外方法,包括
(i)將真核細胞與根據(jù)第一方面的多核苷酸或根據(jù)第二方面的載體接觸,其中所述細胞在足以使多核苷酸或載體進入所述細胞的條件下表達慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的產(chǎn)物,以及
(ii)使細胞維持在足以組裝慢病毒的條件下。
在第六個方面,本發(fā)明涉及能夠表達感興趣的多核苷酸的穩(wěn)定細胞群,所述感興趣的多核苷酸包括根據(jù)第一方面的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸序列,其中
-所述啟動子位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及相對于復(fù)制起點的5’端并且位于相對于第一長末端重復(fù)序列的3’端,并且
-所述感興趣的多核苷酸位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)的5’端或3’端并且位于相對于復(fù)制起點的5’端或3’端。
在第七個方面,本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生第六個方面的穩(wěn)定細胞群的體外方法,包括以下步驟:
(i)使細胞與根據(jù)第四個方面的重組慢病毒接觸,其中所述重組慢病毒包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸序列,其中
-所述啟動子位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū),并且相對于復(fù)制起點的5’端并且位于相對于第一長末端重復(fù)序列的3’端,以及
-所述感興趣的多核苷酸位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)的5’端或3’端,并且位于相對于復(fù)制起點的5’端或3’端,
(ii)生長并維護所述細胞。
在第八個方面,本發(fā)明涉及根據(jù)第六方面的穩(wěn)定細胞群的用途,所述穩(wěn)定細胞群用于在體外生產(chǎn)感興趣的產(chǎn)物。
在第九個方面,本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)感興趣的產(chǎn)物的體外方法,包括在能夠使感興趣的多核苷酸表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)第六個方面的穩(wěn)定細胞群。
附圖說明
圖1.慢病毒周期中的相關(guān)步驟的圖示。(上面)顯示了慢病毒感染的早期步驟(進入、脫衣殼化和逆轉(zhuǎn)錄)。逆轉(zhuǎn)錄的抑制通過IDLV限制的叉號標注。(下面)在右側(cè)示意性地顯示了線性、1-LTR和2-LTR的逆轉(zhuǎn)錄外產(chǎn)物。后兩個沒有用于被病毒酶整合的共同底物,但是分別由NHEJ和HR產(chǎn)生。
圖2.慢病毒體(LentiSome)質(zhì)粒和載體的示意性設(shè)計。(A)描繪了包含在穿梭pLS質(zhì)粒中的基本元件。除保持在載體中的慢病毒元件外,轉(zhuǎn)錄單元還包含CMV/p5啟動子(eC/p5)和報告盒,分別由三角和陰影盒表示。相對于轉(zhuǎn)錄單元,復(fù)制起點(ori)和S/MAR序列顯示在載體的3’端。S/MAR根據(jù)它們的Kbp大小來命名(具體參見文本)
圖3.附加體復(fù)制所需的元件結(jié)構(gòu)分析。該圖顯示了在pLS質(zhì)粒上沿著沒有原核生物序列的質(zhì)粒序列運行的SIDD分析,以Kcal/mol表示G(x)(參見文本)?;液腥Χ税诖┧舐《举|(zhì)粒中的元件,在上面顯示了所述質(zhì)粒的對照構(gòu)建體示意圖(缺少Ori/SMAR)。與S/MAR序列相對應(yīng)的區(qū)被涂以深藍色的陰影。Ori序列為黑色。每個結(jié)構(gòu)中具有最小值G(X)的區(qū)已用陰影區(qū)突出顯示。
圖4.由FAC分選儀(FACsorter)富集eGFP表達細胞之后,在HEK293A細胞中復(fù)制的慢病毒體的長期表達。在每個板中對成套的慢病毒體進行分析。在建立附加體的時候,在沒有選擇壓的情況下連續(xù)培養(yǎng)(轉(zhuǎn)導(dǎo)5天之后),并且在指示的時間點保持培養(yǎng)物,通過FACS分析對eGFP+細胞的數(shù)目進行評分。參考圖2對在每種情況下組合的數(shù)字和組分的分配。圖表中的數(shù)字與LS號碼對應(yīng)(參見說明)。
圖5.在HEK293A細胞中附加型復(fù)制漫病毒體的Southern印跡雜交分析。(A)用來自指示的LS轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的基因組DNA與特異性的neo探針(左)和AAVS1基因座探針雜交獲得的代表性圖像。(B)轉(zhuǎn)導(dǎo)5天后的Hirt提取物與指示克隆的Southern印跡雜交。右側(cè)的用pLS(白色圓圈)探針的FISH圖像顯示了用LS 5轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中存在大量的質(zhì)粒和中間體。Southern印跡雜交在足夠發(fā)展為陽性條帶的敏感條件下進行。
圖6.附加型復(fù)制慢病毒體的PCR分析。在用指示的LS轉(zhuǎn)導(dǎo)后,在69個群體倍增下的eGFP+培養(yǎng)物的基因組DNA通過使用特異性引物用來進行2-LTR qPCR。2LTR的拷貝數(shù)由基因組DNA的qPCR來檢測并進行相對于白蛋白基因的歸一化,其在HEK293A細胞中是單拷貝基因。背景水平用來自未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本細胞(HEK293A)的樣品獲得,陽性PCR對照用能夠整合的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的樣品獲得。用于分析每種培養(yǎng)物的細胞的數(shù)目平均為104。三個獨立的實驗中代表性的實驗被表示出來,數(shù)值是反應(yīng)中的三個重復(fù)的平均值。
圖7.在轉(zhuǎn)導(dǎo)后54天,LS轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293A細胞的FISH分析。攜帶附加型復(fù)制慢病毒體的eGFP+細胞的中期涂片的代表性區(qū)域。大部分雙白點是陽性著絲粒對照探針4q13.3的信號,然而LS序列被檢測到為非雙點(放大圖由數(shù)字表示)。
具體實施方式
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種用于真核細胞的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng),其基于攜帶阻止整合酶介導(dǎo)的整合到基因組中的突變的慢病毒載體,通過將真核復(fù)制起點和支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)(S/MAR)整合到這些載體中以與核基質(zhì)結(jié)合。通過將這些元件整合到載體中,本發(fā)明的作者制得了能夠復(fù)制和分離為子細胞的慢病毒附加體,因而實現(xiàn)了在休眠細胞和活躍的分裂細胞中轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達,同時沒有病毒蛋白的干擾(參見圖4和表1)。相比現(xiàn)有技術(shù)的相似系統(tǒng),該策略獲得了具有較高生物安全性的表達系統(tǒng)。
在包裝載體所需的蛋白存在的情況下,將含有發(fā)明人設(shè)計的慢病毒載體的細胞系共轉(zhuǎn)染到有傳染性的非整合型慢病毒顆粒中,讓適合于轉(zhuǎn)基因在靶細胞中穩(wěn)定表達的新型非整合型慢病毒產(chǎn)生。
此外,發(fā)明人已經(jīng)觀察到不是所有已知的真核復(fù)制起點和S/MAR的組合對慢病毒附加體的穩(wěn)定建立都同等有效。因此,一些組合產(chǎn)生了不能產(chǎn)生感興趣的基因顯著穩(wěn)定表達的慢病毒(參見圖4中的LS 4、8和12)。
基于上述發(fā)現(xiàn),以下發(fā)明方面已被開發(fā)。
本發(fā)明的多核苷酸
在第一方面,本發(fā)明涉及一種多核苷酸,下文中的本發(fā)明的多核苷酸,包括
(i)源自慢病毒的第一長末端重復(fù)序列,
(ii)真核復(fù)制起點,其選自于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3序列及其功能等價變體的復(fù)制起點組成的群組,
(iii)支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū),其選自于具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6序列及其功能等價變體的支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)組成的群組,以及
(iv)源自所述慢病毒的第二長末端重復(fù)序列,
其中所述真核復(fù)制起點和所述支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)位于所述第一和第二長末端重復(fù)序列之間。
如在此所使用的術(shù)語“多核苷酸”,指的是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單或雙鏈聚合物。
第一長末端重復(fù)序列
本發(fā)明的多核苷酸的第一元件是第一長末端重復(fù)序列。在反轉(zhuǎn)錄的自然過程中,來自逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA的5’(R-U5)和3’(U3-R)末端的序列通過直接重復(fù)序列R融合,并復(fù)制以形成帶有長末端重復(fù)序列的線性雙鏈分子。該分子后續(xù)插入到受感染的宿主的染色體DNA內(nèi)的位點使得病毒DNA對新病毒RNA分子的轉(zhuǎn)錄起到模板的作用。
如在此所使用的,術(shù)語“長末端重復(fù)序列”或“LTR”,指的是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄合成的DNA的每個末端的數(shù)百個堿基對的序列,所述逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA控制病毒DNA整合到宿主DNA中,并表達病毒基因。如在此所使用的,LTR指的是在通過逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄合成的DNA中發(fā)現(xiàn)的LTR的DNA序列和與LTR的所述DNA序列互補的RNA序列。5’LTR和3’LTR用于促進病毒的RNA的轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷酸化。LTR包含病毒復(fù)制所必需的所有其它順式作用的序列。每種LTR都包括U3、R和U5區(qū)。
術(shù)語“第一長末端重復(fù)序列”或“第一LTR”或“5’LTR”指的是5'慢病毒LTR,其可或不可從其相應(yīng)的天然5'LTR通過缺失和/或突變內(nèi)生序列和/或添加異源序列被修飾。5'LTR可以是天然或合成的。
本發(fā)明的多核苷酸的第一和第二LTR都源自慢病毒。如在此所使用的術(shù)語“慢病毒”,指的是由于它們整合到宿主基因組中的能力因此在自然界中引起緩慢發(fā)展的疾病的一群(或科學上的屬)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。這些病毒尤其包括人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人類免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、綿羊髓鞘脫落病毒(VISNA)和山羊關(guān)節(jié)腦炎病毒(CAEV)。在一個優(yōu)選實施方式中,所述慢病毒是HIV。因此在一個特定實施方式中,第一和第二LTR源自HIV。
如在此所使用的術(shù)語“人類免疫缺陷病毒”或“HIV”,意在包括HIV-1和HIV-2?!癏IV-1”指人類免疫缺陷病毒1型。HIV-1包括,但不限于,細胞外病毒顆粒,以及與HIV-1感染的細胞有關(guān)的HIV-1形式?!癏IV-2”指人類免疫缺陷病毒2型。HIV-2包括,但不限于,細胞外病毒顆粒,以及與HIV-2感染的細胞有關(guān)的HIV-2形式。優(yōu)選地,HIV是HIV-1。
在一個優(yōu)選實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸的第一LTR包括顯示于SEQ ID NO:7中的序列。在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸的第一LTR由顯示于SEQ ID NO:7中的序列組成。
真核復(fù)制起點
本發(fā)明的多核苷酸包括真核復(fù)制起點。如在此所使用的術(shù)語“真核復(fù)制起點”(eukaryotic origin of replication,eukaryotic replication origin,或eukaryotic ori),指的是在真核生物中起始復(fù)制的特定基因組序列。如在此所使用的術(shù)語“真核生物”,包括原生生物界、真菌界、植物界和動物界。
真核復(fù)制起點是本發(fā)明的多核苷酸的一部分,其選自于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及其功能等價變體的復(fù)制起點組成的群組。
具有SEQ ID NO:1序列的復(fù)制起點相對應(yīng)于如已被Aladjem等人描述的β-球蛋白基因的復(fù)制起點(Science,1995,270:815-819)。
具有SEQ ID NO:2序列的復(fù)制起點來自于自主復(fù)制序列的共有序列,所述自主復(fù)制序列與以前從猴CV-1細胞和人皮膚成纖維細胞中分離的阿爾法-衛(wèi)星序列有關(guān),如Price et al Journal of Biological Chemistry,2003,278(22):19649-59所描述的。
具有SEQ ID NO:3序列的復(fù)制起點相對應(yīng)于,如McWinney和Leffak所描述的人類c-myc啟動子區(qū)的復(fù)制起點(McWinney C.and Leffak M.,Nucleic AcidResearch 1990,18(5):1233-42)。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列及其功能等價變體的復(fù)制起點。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列及其功能等價變體的復(fù)制起點。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列及其功能等價變體的復(fù)制起點。
如在此所使用的術(shù)語“功能等價變體”,指的是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的復(fù)制起點的任何變體,其與其來源序列實質(zhì)相同并且行使實質(zhì)相同的功能。如在此所使用的,“實質(zhì)相同”的意思是核酸序列與其來源序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性的程度。兩種多核苷酸之間的序列一致性的程度可通過常規(guī)方法確定,例如,通過現(xiàn)有技術(shù)公知的標準比對算法例如,例如BLASTAltschul S.F.et al.Basic Local Alignment Search Tool.J Mol.Biol.1990Oct 5;215:403-10)。在一個優(yōu)選實施方式中,序列一致性的程度通過多核苷酸的整個長度來確定。
在一個優(yōu)選實施方式中,具有SEQ ID NO:2序列的復(fù)制起點的變體包括以下共有序列
CCTMDAWKSGBYTSMAAWTWBCMYTTRSCAAATTCC(SEQ ID NO:25)
其中M是A或C;D是A、G或T;W是A或T;K是G或T;S是C或G;B是C、G或T;Y是C或T;R是A或G,以及H是A、C或T。
在另一個實施方式中,具有SEQ ID NO:2序列的復(fù)制起點的變體包括選自于顯示于表I中的A6、A7、A15、A16、A1、A5和A39組成的群組的序列,如Price等人(J.Biol.Chem.,2003,278:19649-19659)的描述。
如在此所使用的術(shù)語“實質(zhì)上相同的功能”,意思是變體實質(zhì)上保持在真核生物中起始復(fù)制的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定特定變體是否能夠在真核生物中起始復(fù)制,并因此是否功能上等價于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的復(fù)制的起點。特定序列起始復(fù)制的能力可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何適合方法測定,例如,通過DpnI的抗消化法(Frappier L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:6668-72)、通過最早的標記片段試驗(Pearson et al,Somat.Cell Mol.genet.1994,20:147-152)以及基于溴脫氧尿苷摻入和密度變化的自主復(fù)制試驗(AraujoF.D.et al.,supra;Frappier L.et al.,supra)。
支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)
本發(fā)明的多核苷酸包括支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)。如在此所使用的術(shù)語“支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)”或“S/MAR”,指的是有非一致特征的富含AT的數(shù)百個堿基對長度的DNA元件,其通過周期性的附著到蛋白支架或細胞核的基質(zhì)將真核基因組的核DNA組織到一些60,000個染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)域中。它們通常被發(fā)現(xiàn)于非編碼區(qū)例如側(cè)翼區(qū)、染色質(zhì)邊界區(qū)和內(nèi)含子中。
形成本發(fā)明的多核苷酸的部分的S/MAR選自于具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6序列及其功能等價變體的S/MAR組成的群組。
具有SEQ ID NO:4序列的S/MAR對應(yīng)于人類IFN-γ基因(hIFN-γlarge)的1.8kbp的S/MAR,已被Bode等人(Bode J.et al.,Science,1992,255:195-7)描述。
具有SEQ ID NO:5序列的S/MAR對應(yīng)于人類IFN-γ基因(hIFN-γshort)的S/MAR的0.7Kbp最小區(qū),已被Ramezani(Ramezani A.et al.,Blood 2003,101:4717-24)描述。
具有SEQ ID NO:6序列的S/MAR對應(yīng)于人類脫氫葉酸還原酶基因(hDHFR)的S/MAR的0.2Kbp最小區(qū),已被Mesner L.D.et al.,ProcNatlAcadSci USA,2003,100:3281-86描述。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:4序列的S/MAR或其功能等價變體。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:5序列的S/MAR或其功能等價變體。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:6序列的S/MAR或其功能等價變體。
如在此所使用的術(shù)語“功能等價變體”,是指任何與其來源S/MAR實質(zhì)上同源并且行使實質(zhì)上相同功能的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6序列的S/MAR的變體。如在此所使用的,“實質(zhì)上同源”意思是核酸序列與其來源序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性的程度。
在一個優(yōu)選實施方式中,S/MAR的功能等價變體是基于設(shè)定的六條規(guī)則選擇的序列,已經(jīng)表明這六條規(guī)則共同或單獨有助于S/MAR功能(Kramer et al(1996)Genomics 33,305;Singh et al(1997)Nucl.Acids Res 25,1419)。這些規(guī)則已被合并到MAR-Wiz計算機程序中,可在http;//genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz免費獲取。
如在此所使用的術(shù)語“實質(zhì)上相同功能”,意思是變體實質(zhì)上與其來源S/MAR保持相同功能,特別是,與核基質(zhì)特異性結(jié)合的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定特定變體是否能夠與核基質(zhì)特異性結(jié)合,例如通過由Mesner等人(Mesner L.D.et al,supra)描述的體外或體內(nèi)MAR試驗。在另一個實施方式中,如果特定變體顯示了DNA鏈分離的傾向,特異序列可以被視為根據(jù)本發(fā)明的S/MAR的變體。該特性可使用專用程序根據(jù)平衡統(tǒng)計力學方法確定。應(yīng)力誘導(dǎo)型復(fù)式脫穩(wěn)(SIDD)分析技術(shù)”[…]計算超螺旋應(yīng)力的施加水平減少打開沿著DNA序列上的每個位點的雙鏈所需的自由能的程度。結(jié)果作為SIDD曲線顯示,其中強失穩(wěn)的位點作為深的最小值出現(xiàn)[…],如“在Bode et al(2005)J.Mol.Biol.358,597中定義。從SIDD分析(輸出表示中最小)中獲得的數(shù)據(jù)已被實驗證實用實驗確定的未配對區(qū)的堿基或與S/MAR的功能作用有關(guān),同樣與結(jié)合活性或質(zhì)粒載體的保留有關(guān)??偟膩碚f,這些數(shù)據(jù)表明SIDD特性可被摻入到任何計算策略中,從而為位點尋找具有作為S/MAR行使功能的特征的基因組序列,盡管當前可獲得的數(shù)據(jù)并不足以支持估計它們的相對結(jié)合強度。SIDD算法和數(shù)學基礎(chǔ)(Bi and Benham(2004)Bioinformatics 20,1477)以及SIDD曲線分析可采用在WebSIDD(http://www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)免費獲得的因特網(wǎng)資源實施。因此,在另一個實施方式中,多核苷酸被視為S/MAR序列的變體,如果其顯示了與S/MAR相似的SIDD曲線。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等價變體S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:2序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括有SEQ ID NO:3序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:4序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:5序列或其功能等價變體的S/MAR。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:3序列或其功能等價變體的復(fù)制起點和具有SEQ ID NO:6序列或其功能等價變體的S/MAR。
某些S/MAR包含富含腺嘌呤區(qū)。富含腺嘌呤區(qū)在多核苷酸中的存在對多核苷酸的轉(zhuǎn)錄(如果多核苷酸是DNA)或?qū)Χ嗪塑账岬膹?fù)制(如果多核苷酸是RNA)是不利的,因為它可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄/復(fù)制的提前終止以及不完全的轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。因此,由于S/MAR是可在任何方向執(zhí)行其活性的區(qū),即它們是可逆的,所以本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在S/MAR包含富含腺嘌呤區(qū)的那些情況中,所述S/MAR以一個方向被插入到本發(fā)明的多聚核苷酸中,這樣在S/MAR的一個鏈中的富含腺嘌呤區(qū)不會負面影響多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。因此,如果本發(fā)明的多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA),則多核苷酸包括與S/MAR鏈反向互補的序列,所述S/MAR鏈包括富含腺嘌呤區(qū)。如果本發(fā)明的多核苷酸是雙鏈的DNA(dsDNA),則S/MAR被插入到多核苷酸中,以便包括富含腺嘌呤區(qū)的S/MAR鏈不形成所述dsDNA的編碼鏈部分。
如在此所使用的術(shù)語“單鏈DNA”或“ssDNA”,指的是僅包括一條鏈的DNA多核苷酸。
如在此所使用的術(shù)語“單鏈RNA”或“ssRNA”,指的是僅包括一條鏈的RNA多核苷酸。
如在此所使用的術(shù)語“雙鏈DNA”或“dsDNA”,指的是包括通過氫鍵結(jié)合的兩條反平行的或?qū)嵸|(zhì)上互補的DNA鏈的DNA多核苷酸。
如在此所使用的術(shù)語“富含腺嘌呤區(qū)”,指的是在多核苷酸中腺嘌呤是最豐富的核苷酸的區(qū)。在一個優(yōu)選實施方式中,所述富含腺嘌呤區(qū)是多聚腺嘌呤序列。如在此所使用的術(shù)語“多聚腺嘌呤序列”或“polyA序列”,指的是包括多個連續(xù)的單磷酸腺苷的多核苷酸序列。
如在此所使用的術(shù)語“編碼鏈”,指的是與模板鏈互補的DNA鏈。該編碼鏈具有與mRNA相同的堿基序列(雖然胸腺嘧啶被尿嘧啶替換)并與被翻譯為蛋白的密碼子相對應(yīng)。
在更具體的實施方式中,當本發(fā)明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:6序列或其功能等價變體的S/MAR時,如果所述多核苷酸是ssDNA或ssRNA,那么所述多核苷酸包括與包括polyA序列的S/MAR鏈反向互補的序列。
在另外更具體的實施方式中,當本發(fā)明的多核苷酸包括具有序列SEQ ID NO:6或其功能等價變體的S/MAR時,如果所述多核苷酸是dsDNA,那么S/MAR被插入到多核苷酸中,這樣包括富含腺嘌呤區(qū)的S/MAR鏈不會形成所述dsDNA的編碼鏈部分。
第二長末端重復(fù)序列
術(shù)語“第二長末端重復(fù)序列”或”第二LTR”或“3'LTR”指的是3'慢病毒LTR,其可或不可由其相應(yīng)的天然的3'LTR通過缺失和/或突變內(nèi)源序列和/或添加異源序列被修飾。3'LTR可以是天然的或合成的。
本發(fā)明的多核苷酸第二LTR來源于與作為第一LTR相同的慢病毒。在一個特定實施方式中,所述第二LTR源自HIV。
在一個優(yōu)選實施方式中,所述第二LTR包括自滅活突變。如在此所使用的術(shù)語“突變”,指的是核酸序列中的改變。所述突變包括,但不限于,替換(即交換一個或多個核苷酸為其他的核苷酸)、倒位(即基因內(nèi)的DNA片段被倒置,到末端兩個180°旋轉(zhuǎn)是必要的,一個用于使序列反向,另一個用于以保持DNA的極性)、易位(即基因片段改變位置為相同基因的另外的不同位點或基因組的另外的位點)、核苷酸插入或缺失(即一個或多個核苷酸(插入或添加)的添加或一個或多個核苷酸的減少(缺失)作為在閱讀框中的結(jié)果變化,在翻譯期間,發(fā)生從形成非功能蛋白到缺失所述蛋白的閱讀錯誤)。如在此所使用的術(shù)語“自失活突變”,指的是引起LTR具有與其相應(yīng)的天然LTR相比降低的促進轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄能力的突變。LTR促進轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄的能力可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適合分析LTR的啟動子活性的任何技術(shù)確定,例如通過用Zufferey等人描述的試驗(Zuffereyet al.,Journal of Virology,1998,72:9873-80)測定源自LTR內(nèi)部啟動子的RNA產(chǎn)生量。術(shù)語“降低的促進轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄的能力”意思是與其天然對應(yīng)物相比,在突變的LTR的啟動子活性方面的任何顯著的降低,例如,與其相應(yīng)的天然LTR相比,在突變的LTR的啟動子活性方面降低了至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。對自滅活(SIN)慢病毒載體的產(chǎn)生有用的慢病毒的LTR中的突變在現(xiàn)有技術(shù)中(Zufferey R et al.,J.Virol.1998,72:9873–9880)已被描述。
在一個優(yōu)選實施方式中,當本發(fā)明的多核苷酸被整合到慢病毒載體中時,與包括相應(yīng)的天然LTR的等效的載體相比,在第二LTR上存在的自失活突變不會影響所述載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,即載體被轉(zhuǎn)移到靶標細胞中的能力保持基本上不受影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)測定慢病毒載的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,例如,通過Zufferey等人(Zuffereyet al.,supra)描述的方法測定載體在靶標細胞中的滴度。
在一個特定實施方式中,所述突變是缺失。
在另一個特定的實施方式中,所述突變影響LTR的U3區(qū)。如在此所使用的術(shù)語“LTR的U3區(qū)”,指的是包括增強子和啟動子元件的LTR的區(qū)域。在HIV-1LTR的特定情況中,U3區(qū)包括負責調(diào)控HIV-1LTR啟動子活性的所有主要的決定因素,像所謂的負應(yīng)答元件、NFκB和NF-ATc結(jié)合位點、Sp1結(jié)合位點和TATA框。
在一個優(yōu)選實施方式中,所述突變是在第二LTR的U3區(qū)中的缺失。U3區(qū)中的能夠降低LTR促進轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄的能力的任何缺失都適合本發(fā)明的多核苷酸,例如,TATA盒的缺失和/或轉(zhuǎn)錄因子的一個或多個結(jié)合位點的的缺失。在一個更優(yōu)選的實施方式中,第二LTR的U3區(qū)中的缺失包括包含在-418(5’)和-18(3’)位之間的序列的缺失,編號表明相對于在R起點,在+1位的帽位點的核苷酸位置。在一個特定實施方式中,在U3區(qū)中包括缺失的第二LTR包括SEQ ID NO:8序列。在一個更具體的實施方式中,包括U3區(qū)中的缺失的第二LTR由SEQ ID NO:8序列構(gòu)成。
在本發(fā)明的多核苷酸中,真核復(fù)制起點和S/MAR位于第一和第二LTR之間。在一個優(yōu)選實施方式中,復(fù)制起點位于相對于S/MAR的5’端,多核苷酸元件從5’至3’的順序為:
-第一LTR
-復(fù)制起點
-S/MAR
-第二LTR
在另一個特定實施方式中,所述S/MAR位于相對于復(fù)制起點的5’端,多核苷酸元件從5’至3’的順序為:
-第一LTR
-S/MAR
-復(fù)制起點
-第二LTR
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括選自
-多克隆位點
-與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸,其中所述啟動子位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū),并且相對于復(fù)制起點的5’端并且相對于第一長末端重復(fù)序列的3’位,以及
所述感興趣的多核苷酸位于相對于支架/基質(zhì)結(jié)合區(qū)的5’端或3’端,并且相對于復(fù)制起點的5’端或3’端,以及
-其組合
的多核苷酸序列。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括多克隆位點。如在此所使用的術(shù)語“多克隆位點”,指的是包括多個彼此接近的限制性內(nèi)切酶靶標位點,從而在單一位點中將多核苷酸切開的DNA片段。因此,在多核苷酸用所述內(nèi)切酶處理后,有可能插入具有可相容的末端的感興趣的基因,所述末端是鈍性的、5’-突出的或3′-突出的。原則上,有可能使用本領(lǐng)域已知的任何多克隆位點例如可從pUC18、pUC19等類型的載體中獲得的多克隆位點。感興趣的多核苷酸的插入通過采用例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);“DNA Cloning:A Practical Approach,”Volumes l and II)所述的標準分子生物學方法進行。多克隆位點優(yōu)選包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個限制性內(nèi)切核酸酶的靶標位點,每個靶標位點均由至少4、至少5或至少6個核苷酸組成。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸。
如在此所使用的術(shù)語“啟動子”,指的是作用為控制一種或多種多核苷酸的轉(zhuǎn)錄,位于多核苷酸序列上游的核酸片段,其通過依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點以及任何其它DNA序列的存在在結(jié)構(gòu)上被確定,所述其它DNA序列包括,但不限于,轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、抑制因子和激活蛋白結(jié)合位點,以及本領(lǐng)域公知的直接或間接作用以調(diào)控來自啟動子的轉(zhuǎn)錄的量的核苷酸的任何其它序列。所述啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的?!敖M成型啟動子”是在大部分生理和發(fā)育條件下活躍的啟動子。“誘導(dǎo)型“啟動子是依賴于生理或發(fā)育條件被調(diào)節(jié)的啟動子。“組織特異性”啟動子僅僅在特定類型的分化的細胞/組織中是活躍的。在一個優(yōu)選實施方式中,所述啟動子是病毒啟動子,更優(yōu)選所述啟動子源自腺相關(guān)的病毒(AAV)。術(shù)語“腺相關(guān)的病毒”或“AAV”指的是屬于細小病毒科(Parvoviridae)的依賴病毒屬(Dependovirus)的病毒。在一個更特定的實施方式中,源自AAV的啟動子是p5啟動子或其功能等價變體。如在此所使用的術(shù)語“p5啟動子”,指的是控制Rep68和Rep78的表達的AAV的啟動子(YueY.B.et al.,Humgene Ther 2010,21(6):728-38)。在一個更特定的實施方式中,源自AAV的啟動子包括SEQ ID NO:9序列。在一個甚至更特定的實施方式中,源自AAV的啟動子由SEQ ID NO:9序列組成。在一個特定實施方式中,啟動子是p5啟動子的功能性等價變體。如在p5啟動子的語境中使用的術(shù)語“功能性等價變體”,指的是與p5啟動子實質(zhì)上同源并且行使實質(zhì)上相同功能的變體。術(shù)語“實質(zhì)上同源”在上文已被定義。與p5啟動子行使實質(zhì)上相同功能的變體是能夠控制位于所述變體的下游的感興趣的多核苷酸表達的變體。
如在此所使用的術(shù)語“”可操縱地連接的”,指的是啟動子序列相對于感興趣的多核苷酸的功能關(guān)系和位置(例如啟動子或增強子與編碼序列是可操縱地連接的,如果其影響所述序列的轉(zhuǎn)錄)。通常,可操縱地連接的啟動子與感興趣的序列相鄰。然而,增強子并不必須與感興趣的序列相鄰以控制其表達。當本發(fā)明的多核苷酸包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸時,多核苷酸的組分具有以下配置:
-所述啟動子位于
S/MAR和復(fù)制起點的上游,即,在相對于S/MAR和相對于復(fù)制起點的5’端,
以及
第一LTR的下游,即,在相對于第一LTR的3’端;以及
-所述感興趣的多核苷酸位于
S/MAR的上游或下游,即,在相對于S/MAR的5’端或在3’端以及
復(fù)制起點的上游或下游,即,在相對于復(fù)制起點的5’端或3’端。
在一個特定實施方式中,包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸的本發(fā)明的多核苷酸進一步包括與啟動子可操縱地連接的增強子區(qū)。如在此所使用的術(shù)語“增強子”,指的是轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合以提高基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列元件。在一個更特定的實施方式中,增強子區(qū)是巨細胞病毒啟動子的增強子區(qū)。在一個甚至更特定實施方式,巨細胞病毒啟動子的增強子區(qū),包括SEQ ID NO:10序列。在另一個進一步更特定實施方式,巨細胞病毒啟動子的增強子區(qū)由SEQ ID NO:10序列組成。
如在此所使用的術(shù)語“感興趣的多核苷酸”,指的是其在細胞中具有所需要的表達的多核苷酸。感興趣的多核苷酸可以是編碼多肽或蛋白的基因,或一旦轉(zhuǎn)錄就產(chǎn)生能夠與抑制其表達的mRNA(如microRNA、siRNA或shRNA)雜交的RNA的多核苷酸。在一個特定實施方式中,感興趣的多核苷酸選自于篩選基因、編碼感興趣的蛋白的多核苷酸及其組合。
術(shù)語“篩選基因”,如在此所使用的,指的是表達賦予了抗生素抗性的基因,允許合成培養(yǎng)基中所缺乏的必需營養(yǎng)的基因,或?qū)σ呀?jīng)整合所述篩選基因的細胞提供選擇性優(yōu)勢的基因。
在一個優(yōu)選實施方式中,所述篩選基因是編碼賦予了抗生素抗性的蛋白質(zhì)的基因,例如編碼賦予了潮霉素抗性的蛋白質(zhì)的基因、編碼賦予了新霉素抗性的蛋白質(zhì)的基因、編碼賦予了嘌呤霉素抗性的蛋白質(zhì)的基因嘌呤霉素等。在一個更優(yōu)選的實施方式中,所述篩選基因編碼賦予了新霉素抗性的蛋白質(zhì)。
作為一種選擇,所述篩選基因是允許合成培養(yǎng)基中沒有的必需營養(yǎng)的基因。一個示例包括大腸桿菌(Escherichia coli)的trpB基因,其編碼色氨酸合酶的β亞基。該基因允許哺乳類細胞在含有吲哚而不是色氨酸的培養(yǎng)基中存活和增殖。第二個示例包括鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)的hisD基因,其編碼組氨醇脫氫酶,組氨醇脫氫酶在兩個階段中催化L-組氨醇+組氨酸的NAD依賴性氧化。只有表達hisD產(chǎn)物的哺乳類細胞才可以在缺乏組氨酸并含有組氨醇的培養(yǎng)基中存活(Hartman SC and RC Mulligan,Proc.Natl.Acad Sci.USA.1988,85(21):8047-51。
對已經(jīng)整合所述基因的細胞提供選擇性優(yōu)勢的篩選基因的示例包括在DHFR缺陷型基因工程的細胞中編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因。DHFR蛋白催化5,6-二氫葉酸還原為5,6,7,8-四氫葉酸,這是嘌呤代謝中關(guān)鍵的步驟。通過使DHFR缺陷型細胞在缺乏嘌呤前體次黃嘌呤和胸腺嘧啶(HT)的條件下生長,使用DHFR能使DHFR缺陷型細胞的遺傳選擇成為可能(RJ Kaufman and PA Sharp,J.Mol.Biol,1982,159:601-21)。
如在此所使用的術(shù)語“感興趣的蛋白”,指的是其在細胞中所期望的表達的任何蛋白。在一個特定實施方式中,感興趣的蛋白是熒光蛋白,優(yōu)選綠色熒光蛋白或GFP。如在此所使用的術(shù)語“熒光蛋白”,指的是當在合適的波長下用電磁輻射激發(fā)時具有內(nèi)在熒光的蛋白。代表性的熒光蛋白可包括,但不限于,sgGFP、sgBFP、BFP藍移GFP(Y66H)、藍色熒光蛋白、CFP—青色熒光蛋白、青色GFP、DsRed、單體RFP、EBFP、ECFP、EGFP、GFP(S65T)、紅移GFP(rsGFP)、野生型GFP、非-UV激發(fā)(wtGFP)、野生型GFP、UV激發(fā)(wtGFP)、GFPuv、HcRed、rsGFP、天藍色GFP、sgBFP.TM.、sgBFP.TM.(超級輝光BFP)、sgGFP.TM.、sgGFP.TM.(超級輝光GFP)、wtGFP、黃色GFP和YFP。在一個優(yōu)選實施方式中,所述熒光蛋白是GFP。
如在此使用的術(shù)語“綠色熒光蛋白”或“GFP”指的是具有26.9kDa的分子量并且當暴露于紫外藍光時發(fā)出亮綠色熒光的239氨基酸的蛋白。雖然許多其他海洋生物具有類似的綠色熒光蛋白,但是習慣上GFP是指首先從維多利亞多管發(fā)光水母(A.victoria)中分離出來的蛋白。來自維多利亞多管發(fā)光水母的GFP具有在395nm的波長下的主要的最強激發(fā)光和在475nm下的次級激發(fā)光。其發(fā)射最大值是在509nm。GFP的熒光量子產(chǎn)率(quantic fluorescence yield)是0.79。在維多利亞多管發(fā)光水母中,GFP通過能量轉(zhuǎn)移將水母素的藍色化學發(fā)光轉(zhuǎn)化為綠色熒光。
又或者,所述感興趣的蛋白可以是治療上感興趣的蛋白,這樣本發(fā)明的多核苷酸可被用于在體外表達所述蛋白或用于需要所述表達的蛋白的的疾病治療。因此,本發(fā)明提供了包括編碼治療上感興趣的蛋白的一種或多種感興趣的多核苷酸的多核苷酸,所述治療上感興趣的蛋白包括,不限于,促紅細胞生成素(EPO),瘦蛋白,促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH),生長激素釋放激素(GHRH),促性腺激素釋放激素(GnRH),促甲狀腺激素釋放激素(TRH),催乳激素釋放激素(PRH),褪黑激素釋放激素(MRH),催乳素抑制激素(PIH),生長激素抑制素,促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),生長激素(somatotropin)或生長素(growth hormone,GH),黃體化激素(LH),促卵泡激素(FSH),促甲狀腺素(TSH或促甲狀腺刺激激素),催乳素,后葉催產(chǎn)素,抗利尿激素(ADH或后葉加壓素),褪黑激素,副中腎管抑制因子(Müllerian inhibiting factor),降鈣素,甲狀旁腺素,胃泌素,膽囊收縮素(CCK),分泌素,I型胰島素樣生長因子(IGF-I),II型胰島素樣生長因子(IGF-II),心房鈉尿肽(ANP),人絨毛促性腺激素(hCG),胰島素,胰高血糖素,生長抑素,胰多肽(PP),瘦蛋白,神經(jīng)肽Y,腎素,血管緊縮素I,血管緊縮素II,第八因子,第九因子,組織因子,第七因子,第十因子,凝血酶,第五因子,第十一因子,第十三因子,白介素1(IL-1),白介素2(IL-2),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素6(IL-6),白介素8(IL-8和趨化因子),白介素12(IL-12),白介素16(IL-16),白介素15(IL-15),白介素24(IL-24),α、β、γ干擾素,CD3,ICAM-1,LFA-1,LFA-3,包括RANTES 1α的趨化因子,MIP-1α,MIP-1β,神經(jīng)生長因子(NGF),血小板衍生生長因子(PDGF),轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β),骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs),成纖維細胞生長因子(FGF和KGF),表皮生長因子(EGF等等),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),粒細胞集落刺激因子(G-CSF),膠質(zhì)細胞生長因子,角質(zhì)化細胞生長因子,內(nèi)皮生長因子,α-1抗胰蛋白酶,腫瘤壞死因子,粒細胞和小噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),心肌營養(yǎng)素1(CT-1),抑瘤素M(OSM),雙調(diào)蛋白(AR),環(huán)孢霉素,纖維蛋白原,乳鐵蛋白,組織型纖溶酶原激活物(tPA),胰凝乳蛋白酶,免疫球蛋白,水蛭素,超氧化物歧化酶,伊米苷酶,β-葡糖腦苷脂酶,α-L-糖苷酶-α,α-L-艾杜糖醛酸酶,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,加硫酶,人α-半乳糖苷酶A,α-1蛋白酶抑制劑,乳糖酶,胰腺酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶),腺甙脫氨酶,免疫球蛋白,白蛋白,A和B型肉毒桿菌毒素,膠原酶,人脫氧核糖核酸酶I,透明質(zhì)酸酶,木瓜蛋白酶,L-天冬酰胺酶,重組水蛭素,鏈激酶,諸如WO0331155、WO200519244和WO0393293中描述的那些貝塔細胞轉(zhuǎn)化因子(TGF-β)抑制肽,其內(nèi)容通過引用并入本文,以及適合干擾RNA分子轉(zhuǎn)錄的表達盒(shRNA、siRNA、miRNA、修飾的U1核糖核蛋白RNA)。
在一個特定實施方式中,感興趣的多核苷酸是篩選基因,優(yōu)選編碼賦予了抗生素抗性的蛋白質(zhì)的篩選基因,更優(yōu)選編碼賦予了新霉素抗性的蛋白質(zhì)的基因。
在另一個特定實施方式中,感興趣的多核苷酸是編碼感興趣的蛋白,更優(yōu)選綠色熒光蛋白(GFP)。
在一個實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括第一感興趣的多核苷酸和第二感興趣的多核苷酸。在該情況中,第一和第二感興趣的多核苷酸可與相同啟動子可操縱地連接或每個感興趣的多核苷酸與單獨的啟動子可操縱地連接,其可以相同或不同。上述任何啟動子可有利于調(diào)節(jié)感興趣的第一多核苷酸和第二多核苷酸的表達。
在一個更優(yōu)選的實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括第一感興趣的多核苷酸和第二感興趣的多核苷酸,其中第二感興趣的多核苷酸通過編碼共翻譯自處理序列的序列與第一感興趣的多核苷酸可操縱地連接。術(shù)語“可操縱地連接”已在上文定義。如在此所使用的術(shù)語“共翻譯自處理序列”,指的是在翻譯期間將自己從從生長的蛋白中直接分離的多肽序列。在一個特定實施方式中,共翻譯自處理序列序列是“順式水解酶元件”或“chysel元件”。術(shù)語“順式水解酶元件”或“chysel元件”指的是一段小肽(通常在19至33個氨基酸之間),在其翻譯期間,其與核糖體的出口通道相互作用以誘導(dǎo)在該肽的C端最后的肽鍵的“跳躍”。chysel元件被發(fā)現(xiàn)于類似FMDV的某些細小核糖核酸病毒(picornavirus)中,其中它們能快速的共翻譯自處理序列多聚蛋白。當插入到兩個基因之間時,chysel元件在其翻譯期間誘導(dǎo)了“跳躍”,之后核糖體繼續(xù)翻譯第二基因從而產(chǎn)生兩個分離的蛋白。chysel元件說明性的非限制性實施例包括明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asignavirus)的T2A、豬捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1)的P2A、馬甲型鼻炎病毒(Equine rhinitis A virus)的F2A或E2A)。在一個特定實施方式中,順式水解酶元件源自豬捷申病毒。在一個更特定的實施方式中,編碼共翻譯自處理序列的序列包括序列SEQ ID NO:11。在一個甚至更特定實施方式中,編碼共翻譯自處理序列的序列由序列SEQ ID NO:11構(gòu)成。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括第一感興趣的多核苷酸和第二感興趣的多核苷酸,所述第一感興趣的多核苷酸優(yōu)選編碼感興趣的蛋白的多核苷酸,更優(yōu)選編碼GFP的多核苷酸,所述第二感興趣的多核苷酸優(yōu)選篩選基因,更優(yōu)選編碼賦予了抗生素抗性的蛋白的基因,甚至更優(yōu)選編碼賦予了嘌呤霉素基因抗性的蛋白的基因,其中第一和第二感興趣的多核苷酸通過共翻譯自處理序列,優(yōu)選源自豬捷申病毒的順式水解酶元件,更優(yōu)選SEQ ID NO:11的序列可操縱地連接。
本發(fā)明的多核苷酸可用于構(gòu)建作為產(chǎn)生重組慢病毒的第三代系統(tǒng)的一部分的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。因此,本發(fā)明的多核苷酸可包括產(chǎn)生沒有復(fù)制能力的慢病毒所必需的所有病毒處理元件,以及提高病毒滴度的元件和全部載體功能元件。
因此,在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括源自慢病毒的引物結(jié)合位點序列,其中所述引物結(jié)合位點序列位于相對于第一LTR的3’端以及相對于復(fù)制起點和S/MAR的5’端,其中如果所述多核苷酸進一步包括選自
-多克隆位點
-與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸,其中所述啟動子位于相對于S/MAR,并且相對于復(fù)制起點的5’端以及相對于第一LTR的3’端,以及
-所述感興趣的多核苷酸位于相對于S/MAR的5’端或3’端,并且相對于復(fù)制起點的5’端或3’端,以及
-其組合
的多核苷酸序列,
則所述引物結(jié)合位點位于相對于該多核苷酸序列的5’端。
如在此所使用的術(shù)語“引物結(jié)合位點序列”或“PBS序列”,指的是結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄的tRNA引物的多核苷酸序列。在一個特定實施方式中,PBS序列源自HIV。在一個更特定的實施方式中,源自HIV的PBS序列包括SEQ ID NO:12序列。在一個甚至更特定實施方式,源自HIV的PBS序列由SEQ ID NO:12序列構(gòu)成。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括源自定位于第一和第二LTR之間的慢病毒的包裝信號序列。如在此所使用的術(shù)語“包裝信號序列”,指的是能夠使病毒RNA包裝到病毒體中的多核苷酸序列。在一個特定實施方式中,包裝信號序列是源自HIV的ψ序列。在一個更特定的實施方式中,源自HIV的包裝信號序列包括SEQ ID NO:13序列。在一個甚至更特定實施方式中,源自HIV的包裝信號序列由SEQ ID NO:13序列構(gòu)成。在一個優(yōu)選實施方式中,包裝信號序列位于第一LTR的附近。在另一個優(yōu)選實施方式中,包裝信號序列位于第二LTR的附近。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括源自位于第一和第二LTR之間的慢病毒的Rev應(yīng)答元件(RRE)。如在此所使用的術(shù)語“rev應(yīng)答元件”或“RRE”,指的是提高從細胞核中轉(zhuǎn)運出未剪接的病毒RNA的多核苷酸序列,所述細胞核提了病毒滴度。在一個特定實施方式中,RRE源自HIV。在一個更特定的實施方式中,源自HIV的RRE包括SEQ ID NO:14序列。在一個甚至更特定實施方式中,源自HIV的RRE由SEQ ID NO:14序列構(gòu)成。在一個特定實施方式中,RRE位于剪接供體位點和剪接接受位點之間。如在此所使用的術(shù)語“剪接供體位點”或“SD”,指的是存在于內(nèi)含子的5'末端和核酸序列或結(jié)構(gòu)域,所述內(nèi)含子用前述編碼序列或外顯子標記了內(nèi)含子起始和其邊界。如在此所使用的術(shù)語“剪接接受位點”或“SA”,指的是存在于內(nèi)含子的3'末端的核酸序列或結(jié)構(gòu)域,所述內(nèi)含子用下面的編碼序列(外顯子)標記了內(nèi)含子起始和其邊界。在一個特定實施方式中,SD是HIV-1基因組中g(shù)ag基因的5’剪接位點。在一個特定實施方式中,AD是HIV-1基因組中pol基因的3’剪接位點。關(guān)于HIV-1基因組SD和AD的具體描述參見例如,Kammler et al.,Retrovirology 2006,3:89。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括源自慢病毒的中央多嘌呤區(qū)(central polypurine tract,cPPT),其中所述中央多嘌呤區(qū)位于相對于第一LTR的3’端和相對于復(fù)制起點和S/MAR的5’端,其中如果多核苷酸進一步包括選自
-多克隆位點
-與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸,其中
所述啟動子位于相對于S/MAR和復(fù)制起點的5’端,并且位于相對于第一LTR的3’端,并且
所述感興趣的多核苷酸位于相對于S/MAR的5’端或3’端,并且相對于復(fù)制起點的5’端或3’端,以及
-其組合
的多核苷酸序列,
則所述中央多嘌呤區(qū)位于相對于所述多核苷酸序列的5’端。如在此所使用的術(shù)語“中央多嘌呤區(qū)”或“cPPT”,指的是一種核苷酸序列,細胞感染期間,其產(chǎn)生增加病毒基因組進入細胞核的中央DNA折疊片(central DNA flap),導(dǎo)致更有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)的核苷酸序列。在一個特定實施方式中,cPPT源自HIV。在一個更特定的實施方式中,來自HIV的cPPT包括SEID NO:15序列。在一個甚至更特定實施方式中,來自HIV的cPPT包括SEQID NO:15序列。
在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括PBS序列、包裝信號序列、RRE和cPPT,優(yōu)選SEQ ID NO:12的PBS序列、SEQ ID NO:13的包裝信號序列、SEQ ID NO:14的RRE以及SEQ ID NO:15的cPPT。
本發(fā)明的多核苷酸還可以包括對其在原核生物中的增殖所必需的元件。因此,在一個特定實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸進一步包括原核復(fù)制起點和篩選標記物。如在此所使用的術(shù)語“原核復(fù)制起點”,指的是在原核生物中起始復(fù)制的特定序列。原核生物中的復(fù)制起點的示意的非限制性實施例是源自大腸桿菌中pBR322的pUC的起點;源自沙門氏菌(Salmonella)的pSC101和源自p15A的15A起點。如在此所使用的術(shù)語“原核生物”,包括細菌域和古生菌域。在一個特定實施方式中,原核復(fù)制起點是pUC載體的起點。在一個更特定的實施方式中,原核起點包括SEQ ID NO:16序列。在一個甚至更特定的實施方式中,原核起點由SEQ ID NO:16序列組成。術(shù)語“篩選標記”在上文已詳細說明并且同樣適用。在一個特定實施方式中,篩選標記是編碼賦予了抗生素抗性的蛋白的基因。在一個更特定的實施方式中,編碼賦予了抗生素抗性的蛋白的篩選標記是編碼賦予了氨芐青霉素抗性的蛋白的基因。
本發(fā)明的載體
在另一方面,本發(fā)明涉及一種載體,在下文中本發(fā)明的載體,包括本發(fā)明的多核苷酸。如在此所使用的術(shù)語“載體”,指的是能夠?qū)⒁环N或多種感興趣的多核苷酸輸送到宿主細胞中并任選表達的構(gòu)建體。載體的示例包括,但不限于,病毒載體,裸DNA或RNA表達載體,質(zhì)粒,粘?;蚴删w載體,與陽離子縮合劑有關(guān)的DNA或RNA表達載體,包裹在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達載體和某些真核細胞,例如生產(chǎn)細胞。所述載體可以是克隆載體或表達載體。如在此所使用的術(shù)語“克隆載體”,指的是適合增殖的載體,以在適合載體純化的不同的異源生物體中獲得大量的多核苷酸或基因構(gòu)建體或表達載體。如在此所使用的術(shù)語“表達載體”,指的是適合在靶標細胞中表達多核苷酸的載體。本發(fā)明的表達載體是慢病毒載體。如在此所使用的術(shù)語“慢病毒載體”,指的是包括必需序列的核酸序列,這樣在細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯所述序列以及表達慢病毒基因gag、pol、rev和編碼包膜病毒蛋白的基因之后,產(chǎn)生有感染新細胞的能力的病毒顆粒。
本發(fā)明的載體可通過本領(lǐng)域普遍公知的技術(shù)獲得。參見Brown T,“Gene Cloning”(Chapman&Hall,London,GB,1995);Watson R,et al.,“Recombinant DNA”,2nd Ed.(Scientific American Books,New York,NY,US,1992);Alberts B,et al.,“Molecular Biology of the Cell”(Garland Publishing Inc.,New York,NY,US,2008);Innis M,et al.,Eds.,“PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications”(Academic Press Inc.,San Diego,CA,US,1990);Erlich H,Ed.,“PCRTechnology.Principles and Applications for DNA Amplification”(Stockton Press,New York,NY,US,1989);Sambrook J,et al.,“Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,US,1989);Bishop T,et al.,“Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach”(IRL Press,Oxford,GB,1987);Reznikoff W,Ed.,“Maximizing Gene Expression”(Butterworths Publishers,Stoneham,MA,US,1987);Davis L,et al.,“Basic Methods in Molecular Biology”(Elsevier Science Publishing Co.,New York,NY,US,1986),Schleef M,Ed.,“Plasmid for Therapy and Vaccination”(Wiley-VCH Verlag GmbH,Weinheim,DE,2001)。
本發(fā)明的細胞
本發(fā)明的多核苷酸以及包括所述多核苷酸的表達載體可被用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染細胞,所述細胞可被所述多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染。因此,在另一方面,本發(fā)明涉及一種細胞,在本發(fā)明下文中的細胞,包括本發(fā)明的多核苷酸或包括本發(fā)明的核苷酸的載體。
本發(fā)明的細胞可通過由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)(例如感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、電穿孔和轉(zhuǎn)化)使用被分離并整合到人工脂質(zhì)體中的本發(fā)明多核苷酸或形成本發(fā)明的載體的部分導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體到細胞中獲得。
本發(fā)明的細胞可以是原核的或真核的細胞。術(shù)語“原核的”和“真核”已在上文定義。在一個具體實施方式中,本發(fā)明的細胞是真核的細胞。在一個更特定的實施方式中,所述真核是包裝細胞,即允許通過轉(zhuǎn)染本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的慢病毒載體產(chǎn)生重組病毒載體的細胞。在一個具體實施方式中,所述包裝細胞是人胚胎腎細胞系293(HEK293)。在一個更特定的實施方式中,所述包裝細胞是包含SV40大T-抗原的人胚胎腎細胞系293(HEK293T)。
本發(fā)明的重組慢病毒和產(chǎn)生其的體外方法
本發(fā)明的多核苷酸或包括所述多核苷酸的載體可用于產(chǎn)生重組慢病毒,在表達慢病毒基因gag、pol、rev和包膜病毒蛋白的產(chǎn)物的細胞中通過所述多核苷酸或包括所述多核苷酸的載體的轉(zhuǎn)染獲得。
因此,在另一方面,本發(fā)明涉及一種重組慢病毒,在本發(fā)明下文中的重組慢病毒,包括本發(fā)明的多核苷酸和慢病毒整合酶,所述慢病毒整合酶包括引起所述整合酶無法催化病毒基因組整合到細胞基因組中的突變。
如在此所使用的術(shù)語“重組慢病毒”,指的是包括至少一種異源多核苷酸的慢病毒。術(shù)語“慢病毒”在上文已被定義。
如在此所使用的術(shù)語“慢病毒整合酶”,指的是慢病毒特別是HIV-1病毒int區(qū)的基因產(chǎn)物,特征是具有三個明顯可識別的結(jié)構(gòu)域:兩側(cè)為N-末端和C-末端區(qū)域的中心催化核心結(jié)構(gòu)域,后者參與DNA結(jié)合。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶的單一多肽鏈包括大約290個殘基。然而,存在一些重要的變體。例如,PFV整合酶明顯更長,包括392個殘基,ASV整合酶被編碼為323個氨基酸長的蛋白,其在轉(zhuǎn)譯后被加工為由286個殘基組成的最終多肽,其是具有全酶活性。特別地,所述HIV-1病毒的整合酶是病毒int區(qū)的基因產(chǎn)物,具有288氨基酸并被命名為IN。在一個具體實施方式中,慢病毒整合酶是包括突變的HIV-1整合酶,所述突變引起所述整合酶無法催化病毒基因組整合到細胞基因組中。術(shù)語“HIV-1整合酶”,如在此所使用的,指的是HIV-1整合酶多肽的成熟處理形式,在Uniprot數(shù)據(jù)庫(2013年10月16日發(fā)行,第26版)中的登錄號為C7B8I1。術(shù)語HIV-1整合酶也被用于指來自病毒的其他株或分離株的HIV-1整合酶。公眾可容易地獲得大量的HIV-1整合酶的核酸和氨基酸序列。參見HIV序列數(shù)據(jù)庫,http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html;Los Alamos HIV Databases and Compendia,http://www.hiv.lanl.gov/。
本發(fā)明的重組慢病毒的慢病毒整合酶包括導(dǎo)致所述整合酶不能催化病毒基因組整合到細胞基因組中的突變。在一個優(yōu)選實施方式中,所述突變是I型突變,即,與II型突變截然不同,直接影響整合的突變,所述II型突變引起影響病毒體形態(tài)和/或反轉(zhuǎn)錄多效性缺陷。I型突變的說明性的非限制性的實施例是影響三個殘基中任何一個的那些突變,所述三個殘基參與所述整合酶催化核心結(jié)構(gòu)域:DX39-58DX35E(HIV-1的整合酶的D64、D116和E152殘基)。在一個特定實施方式中,所述突變引起所述整合酶無法催化病毒基因組整合到細胞基因組中,其是所述整合酶的催化核心結(jié)構(gòu)域的DDE模序的一個或多個氨基酸的替換,優(yōu)選所述DEE模序的第一天冬氨酸殘基被天冬酰胺殘基的替換。在一個特定的實施方式中,所述整合酶包括SEQ ID NO:17序列。在一個更特定的實施方式中,所述整合酶由序列SEQ ID NO:17組成。
在一個特定的實施方式中,本發(fā)明的重組慢病毒包括來自水泡性口炎病毒(VSV)的包膜糖蛋白G。如在此所使用的術(shù)語“糖蛋白G”,指的是來自VSV包膜的蛋白,所述VSV包膜由于介導(dǎo)病毒附著到宿主細胞上,從而使病毒進入,其中,所述病毒被吞噬,然后介導(dǎo)病毒包膜與核內(nèi)體膜(例如Uniprot KB數(shù)據(jù)庫登錄號Q6EH37)融合。術(shù)語糖蛋白G也用于指來自其他株或分離株病毒的VSV糖蛋白G并且也指其功能性等價變體。如在此使用的,“VSV糖蛋白G的功能性等價變體”被理解為在非許可的溫度下能與VSV tsO45的熱敏型G突變互補,并且在氨基酸序列中具有與VSV糖蛋白G序列最低一致性的多肽。參見Lefkowitz E,et al.,Virology 1990;178(2):373-383。VSV糖蛋白G的功能性等價變包括顯示與上述糖蛋白G的不同天然變體具有至少60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、95%、97%、99%的相似性或一致性的多肽。VSV糖蛋白G的變體可以是天然的和人工的。表達“天然變體”指的是在其他株中天然發(fā)生的如上定義的VSV糖蛋白G的所有那些變體。表達“人工變體”指的是重組的或合成的多肽。如在此所使用的術(shù)語“VSV”或“水泡性口炎病毒”,指的是彈狀病毒科(rhabdoviridae)的大約11kb大小的負鏈RNA病毒。VSV也被稱為“水泡性口炎印第安納病毒”或“VSIV”。目前,八個VSV亞型已被現(xiàn)有技術(shù)描述。參見http://viralzone.expasy.org/complete_by_species/21.html#tab6,October 2013。
在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的重組慢病毒的體外方法,包括
(i)將真核細胞與本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體接觸,其中所述細胞在足以使多核苷酸或載體進入所述細胞的條件下表達慢病毒基因gag、pol、rev和病毒包膜蛋白的產(chǎn)物,
(ii)使細胞維持在足以組裝慢病毒的條件下。
術(shù)語“體外方法”意味著所述方法沒有在主體(人或動物)的身體上實施,而是在從所述主體中分離的細胞上實施。
術(shù)語“重組慢病毒”和“真核細胞”。在一個特定實施方式中,真核相比為包裝細胞,即允許通過轉(zhuǎn)染本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的慢病毒載體產(chǎn)生重組病毒載體的細胞。在一個特定實施方式中,所述包裝細胞是人類胚胎腎細胞系293(HEK293)。在一個更特定的實施方式中,所述包裝細胞是包括SV40大T-抗原的人胚胎腎細胞系293(HEK293T),SV40大T-抗原(HEK293T)允許含有SV40復(fù)制起點的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的附加體復(fù)制。
如在此所使用的術(shù)語“gag”,指的是編碼衣殼p55蛋白的基因,所述衣殼由3個蛋白亞基(MA、CA和NC)形成。在一個特定實施方式中,所述gag基因源自HIV-1。
如在此所使用的術(shù)語“pol”,指的是編碼病毒復(fù)制過程所必需的病毒酶的基因:蛋白酶(PRO)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(INT)。在特定實施方式中,所述pol基因源自HIV-1。
如在此所使用的術(shù)語“rev”,指的是編碼負責處理信使RNA并將其運送到細胞質(zhì)的Rev蛋白的基因。在一個特定實施方式,所述rev基因源自HIV-1。
如在此所使用的術(shù)語“包裝”或“病毒包膜”,涉及覆蓋通常源自宿主細胞膜部分的病毒衣殼的病毒結(jié)構(gòu)。所述病毒包膜包括來自宿主細胞膜的磷脂和蛋白,還可包括病毒糖蛋白。如在此所使用的術(shù)語“病毒包膜蛋白”,涉及病毒包膜的蛋白成分。在一個優(yōu)選實施方式中,包膜病毒蛋白是來自水泡性口炎病毒(VSV)的糖蛋白G。術(shù)語“糖蛋白G”和“水泡性口炎病毒”已被上文定義。
如在此所使用的術(shù)語“適合于進入的條件”,意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些條件,通過那些條件多核苷酸或載體能夠進入真核細胞??捎糜趯⒍嗪塑账峄蜉d體引入到真核細胞中的說明性的非限制性的技術(shù)示例包括使用本發(fā)明的多核苷酸(單獨的或整合到人工脂質(zhì)體中作為前述載體的一部分)的感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、電穿孔和轉(zhuǎn)化。
根據(jù)產(chǎn)生本發(fā)明的重組慢病毒的方法的第一步驟,本發(fā)明的多核苷酸或載體與真核細胞接觸,所述真核細胞表達慢病毒基因gag、pol、rev的產(chǎn)物和編碼來自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G的基因的產(chǎn)物。所述細胞可通過使真核與一種或多種多核苷酸接觸來獲得,所述多核苷酸包括慢病毒基因gag、pol和rev以及編碼來自VSV的包膜糖蛋白G的基因。將多核苷酸引入到真核細胞中的任何上述技術(shù)都可用來獲得包括慢病毒基因gag、pol和rev的產(chǎn)物以及編碼來自VSV的包膜糖蛋白G的基因的產(chǎn)物的真核細胞。在一個特定的實施方式中,所述細胞通過轉(zhuǎn)染一種或多種多核苷酸,優(yōu)選一種或多種載體獲得,包括慢病毒基因gag、pol和rev以及來自VSV的包膜糖蛋白G的基因。在一個具體實施方式中,所述細胞通過轉(zhuǎn)染以下多核苷酸獲得:
-包括rev基因的多核苷酸或載體
-包括來自VSV的包膜糖蛋白G的基因的多核苷酸或載體,以及
-包括gag和pol基因的多核苷酸或載體。
在一個特定的實施方式中,所述多核苷酸或載體包括gag和pol基因,其進一步包括rev應(yīng)答元件(RRE)。術(shù)語“rev應(yīng)答元件”已在上文定義。
在一個特定的實施方式中,所述真核細胞包括慢病毒基因gag、pol和rev的產(chǎn)物和病毒包膜蛋白,其通過共轉(zhuǎn)染上述多核苷酸或載體獲得。所述細胞可用于實施產(chǎn)生本發(fā)明的重組慢病毒的體外方法。因此,在一個特定的實施方式中,所述細胞表達慢病毒基因gag、pol、rev的產(chǎn)物和病毒包膜蛋白,其在與本發(fā)明的多核苷酸或載體接觸之前,已被編碼gag基因、pol基因、rev基因的一種或多種多核苷酸和編碼病毒包膜蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)染。
在另一個特定的實施方式,所述細胞與本發(fā)明的多核苷酸或載體和一種或多種多核苷酸同時接觸,優(yōu)選一種或多種載體,包括慢病毒基因gag、pol和rev和編碼病毒包膜蛋白的基因。在一個更特定的實施方式中,所述細胞被本發(fā)明的多核苷酸或載體和一種或多種多核苷酸共轉(zhuǎn)染,優(yōu)選一種或多種載體,包括慢病毒基因gag、pol和rev和編碼病毒包膜蛋白的基因。在一個甚至更特定的實施方式,所述細胞共轉(zhuǎn)染以下多核苷酸:
-本發(fā)明的多核苷酸或載體,
-包括rev基因的多核苷酸或載體,
-包括編碼病毒包膜蛋白的基因多核苷酸或載體以及
-包括gag和pol基因的多核苷酸或載體。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組慢病毒的體外方法的步驟(ii)包括在足以組裝慢病毒的條件下維持由步驟(i)獲得的細胞。術(shù)語“足以組裝慢病毒的條件”意思是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的允許病毒蛋白表達并組裝釋放到細胞的培養(yǎng)基中的新病毒顆粒的那些條件。這些條件根據(jù)細胞的類型變化。促進重組慢病毒釋放到培養(yǎng)基中的示例性的條件可按照本發(fā)明實施例中的條件進行。使生產(chǎn)細胞生長適當?shù)臅r間段以促進病毒載體釋放到媒介中。通常,可使細胞生長約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時。當所述細胞為HEK293T時,組裝慢病毒充足的條件包括轉(zhuǎn)染后將細胞在新鮮培養(yǎng)基中在標準培養(yǎng)條件下培育數(shù)小時,優(yōu)選轉(zhuǎn)染后約24至約48小時之間,更優(yōu)選轉(zhuǎn)染后約48小時。
在一個特定的實施方式中,用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組慢病毒的體外方法進一步包括純化由所述細胞產(chǎn)生的重組慢病毒。所述純化可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)進行。說明性地,重組慢病毒的純化可通過收集所述體外方法的步驟(ii)之后獲得的細胞的培養(yǎng)物以及將所述培養(yǎng)物的低速離心和過濾來進行。任選地,病毒留存物(viral stock)可通過超速離心濃縮。
本發(fā)明的穩(wěn)定細胞和細胞群,產(chǎn)生其的體外方法及用來體外生產(chǎn)感興趣的產(chǎn)物的其用途
當本發(fā)明的重組慢病毒包括本發(fā)明的多核苷酸(所述多核苷酸包括感興趣的多核苷酸)時,所述重組慢病毒可用于獲得穩(wěn)定表達所述感興趣的多核苷酸的細胞系。因此,在另一方面本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定細胞,在本發(fā)明下文中的穩(wěn)定細胞,其可表達包括本發(fā)明的多核苷酸的感興趣的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸的序列,其中
-所述啟動子位于相對于S/MAR和相對于復(fù)制起點的5’端,并且相對于第一LTR的3’端,并且
-所述感興趣的多核苷酸位于相對于S/MAR的5’端或3’端,并且相對于復(fù)制起點的5’端或3’端。
如在此所使用的術(shù)語“穩(wěn)定細胞”,涉及顯示出沿著連續(xù)的通道表達感興趣的多核苷酸的細胞。在優(yōu)選實施方式中,用本發(fā)明的重組慢病毒細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天,所述細胞顯示感興趣的多核苷酸的表達。在優(yōu)選實施方式中,在至少2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、5000、10000個或更多通道的含有本發(fā)明的重組慢病毒的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后,所述細胞顯示出感興趣的多核苷酸的表達。
在另一方面,本發(fā)明涉及一種包括多種本發(fā)明的細胞的穩(wěn)定細胞群。在一個具體實施方式中,本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群包含至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、多達100%的穩(wěn)定表達感興趣的多核苷酸的細胞。
在一個特定的實施方式中,所述穩(wěn)定細胞是真核細胞,優(yōu)選哺乳動物細胞。在一個更特定的實施方式中,所述哺乳動物細胞是包括SV40大T-抗原的人胚胎腎細胞系293(HEK293T),其允許包含SV40復(fù)制起點的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的附加型復(fù)制。
術(shù)語“啟動子”、“可操縱地連接的”、“S/MAR”、“復(fù)制起點”和“第一LTR”已在上文定義。
在另一方面,本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群的體外方法,包括以下步驟:
(i)使細胞與本發(fā)明的重組慢病毒接觸,其中重組慢病毒包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸的序列,其中
-所述啟動子位于相對于S/MAR和相對于復(fù)制起點的5’端以及相對于第一LTR的3’端,并且
-所述感興趣的多核苷酸位于相對于S/MAR的5’端或3’端以及相對于復(fù)制起點的5’端或3’端,和
(ii)生長并維護所述細胞。
術(shù)語“體外方法”、“穩(wěn)定細胞群”、“重組慢病毒”、“感興趣的多核苷酸”、“啟動子”、“可操縱地連接的”、“S/MAR”、“復(fù)制起點”和“第一LTR”已在上文定義。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群的體外方法的步驟(i)包括使細胞與本發(fā)明的重組慢病毒接觸,以便細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo),所述重組慢病毒包括與啟動子可操縱地連接的感興趣的多核苷酸。如在此所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”,指的是憑借外源多核苷酸序列通過病毒載體被引入到細胞中的過程。用重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的適合的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。舉例說明,可以通過例如在細胞培養(yǎng)箱中,在37℃、在8μg/mL聚凝胺TM存在的條件下,用慢病毒上清液孵育細胞4-6小時來進行,如在本申請實施例中說明的。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群的體外方法的步驟(ii)包括使細胞生長并維持。生長和維持細胞的條件根據(jù)細胞類型而變化,并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
雖然對于穩(wěn)定細胞群的產(chǎn)生不是嚴格必需的,但是有可能選擇已轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明的重組慢病毒的那些細胞。因此,在一個特定實施方式中,用于產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群的方法進一步包括篩選產(chǎn)生于步驟(i)的細胞。所述篩選可通本領(lǐng)域公知的過適合表達特定多核苷酸的細胞的篩選的任何技術(shù)完成。例如,克隆可從用于產(chǎn)生穩(wěn)定細胞群的步驟(i)的方法的產(chǎn)生的細胞獲得,通過例如細胞的限制性稀釋。這樣的克隆可通過適合多核苷酸的特異序列檢測的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)進行分析以檢測本發(fā)明的多核苷酸的整合,例如通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),或可以通過適合蛋白檢測的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù),例如,熒光免疫檢驗法、流式細胞術(shù)、免疫印跡法等分析由本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白的存在。
當本發(fā)明的多核苷酸包括篩選基因時,根據(jù)篩選基因類型,篩選可通過將細胞放置在限制性條件下進行,即,假設(shè)對細胞有選擇優(yōu)勢的基因表達的條件。例如,如果本發(fā)明的多核苷酸包括能夠合成營養(yǎng)的篩選基因,則所述篩選包括將細胞放置在缺少所述營養(yǎng)的培養(yǎng)基中。當本發(fā)明的多核苷酸包括其表達賦予了抗生素抗性的篩選基因時,所述篩選包括將細胞放置在包括所述抗生素的培養(yǎng)基中。
在一個特定的實施方式中,本發(fā)明的多核苷酸包括賦予了抗生素,優(yōu)選新霉素抗性的篩選基因,以便所述篩選包括將細胞放置在含有新霉素的培養(yǎng)基中。當本發(fā)明的多核苷酸包括編碼熒光蛋白的基因時,所述篩選可通過熒光激活細胞分選(FACS)完成。
在另一方面,本發(fā)明涉及本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群用于體外產(chǎn)生感興趣的產(chǎn)物的用途或涉及用于產(chǎn)生感興趣的產(chǎn)物的體外方法,包括在允許感興趣的多核苷酸表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的穩(wěn)定細胞群。
術(shù)語“穩(wěn)定細胞群”和“體外方法”已在上文定義。術(shù)語“感興趣的產(chǎn)物”,如在此所使用的,指的是其在細胞中的期望表達的任何多核苷酸的產(chǎn)物。感興趣的產(chǎn)物可以是感興趣的多肽或蛋白或一旦轉(zhuǎn)錄就產(chǎn)生能夠與抑制其表達的mRNA雜交的RNA(例如microRNA、siRNA或shRNA)的多核苷酸。在一個特定的實施方式中,感興趣的產(chǎn)物是感興趣的蛋白。在一個更特定的實施方式中,感興趣的蛋白是熒光蛋白。在一個甚至更特定實施方式中,感興趣的產(chǎn)物是綠色熒光蛋白(GFP)。術(shù)語“感興趣的蛋白”、“熒光蛋白”和“GFP”已在上文定義。
通過以下實施例對本發(fā)明進行描述,這些實施例僅是說明性的,對本發(fā)明的范圍不構(gòu)成限制。
實施例
材料和方法
哺乳動物細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
將人胚胎腎細胞系HEK293A(CRL-1573,ATCC)在標準條件下,在補充1%Glutamax(Invitrogen,Prat del Llobregat,巴塞羅那,西班牙)、10mg/ml抗生素(青霉素和鏈霉素)和10%胎牛血清(Gibco,Invitrogen)的DMEM(Lonza,LonzaIbérica SA,巴塞羅那,西班牙)中進行培養(yǎng)。當細胞在篩選條件下培養(yǎng)時,將培養(yǎng)基替換為含有450μg/ml G418(遺傳霉素,Invitrogen,LifeTechnologies)的DMEM。
由轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的慢病毒
根據(jù)磷酸鈣法通過將四質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中產(chǎn)生病毒。轉(zhuǎn)染前一天將細胞在15-cm皿中以1.1×107細胞/皿進行接種。將細胞轉(zhuǎn)染無內(nèi)毒素的DNA(Qiagen,Las Matas,馬德里,西班牙)。轉(zhuǎn)染混合物為1xHBS、含3μg pRSV-Rev、3.75μg pMD.2G(VSV-G)、用于產(chǎn)生非整合型慢病毒載體的13μg pMDLg/pRRE或13μg pMDLg/pD64VRRE的0.125CaCl2以及35μg的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(pLS系列)。該混合物用82μL質(zhì)粒DNA、476μL CaCl2 2.5M和3343μL milliQ水制備,并與3900μL2xHBS pH7.02逐滴混合。將轉(zhuǎn)染混合物逐滴滴加到細胞中。在培養(yǎng)箱中將細胞與轉(zhuǎn)染混合物孵育4-6h,然后洗滌,并更換培養(yǎng)基。48h后收集培養(yǎng)基,通過低速離心分離清除,并通過0.45-mm-孔大小的PVDF過濾器進行過濾。將病毒留存物在4℃下在SW28Beckman轉(zhuǎn)子中以90.000g(26.000rpm)的速度通過超速離心濃縮2h。包含慢病毒的沉淀物在空氣中干燥,并在400-600μl介質(zhì)中在4℃重懸過夜。慢病毒的滴定和轉(zhuǎn)導(dǎo)
生物病毒滴度通過參照HEK293T細胞在幾個稀釋度下轉(zhuǎn)導(dǎo)來計算并通過FACS分析(轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/ml,T.U./mL)如下。轉(zhuǎn)導(dǎo)的前一天,將2x105參照細胞接種到6-孔的多孔板上,并在培培養(yǎng)箱在37℃通過用1mL的慢病毒上清液替換培養(yǎng)基孵育4-6h,所述慢病毒上清液在含有8μg/mL聚凝胺TM的培養(yǎng)基中以1/10、1/100和1/1000定期稀釋。用正常培養(yǎng)基代替接種物,在FACS之前將細胞培養(yǎng)48h。
通過對上清液(顆粒/mL)的qPCR定量測定含有全基因組的顆粒。稀釋度為1/10至1/1000的變性顆粒被用作qPCR反應(yīng)的模板(見以下引物和所用的具體條件)。在1ng至1pg范圍的稀釋度下運行質(zhì)粒模板,獲得標準曲線,并繪制參照值。測試的原始數(shù)據(jù)被插入到曲線中并轉(zhuǎn)換為拷貝/細胞。
正則值在1:100的顆粒與T.U.的比中約為107-108T.U./ml。
基因組DNA的提取
將細胞(5-10x106)受胰蛋白酶化或者將其刮下并轉(zhuǎn)移到13mL-PE圓錐管中在PBS中洗滌,在臺式離心機中低速(1500rpm)離心沉淀。將沉淀物重懸于裂解緩沖液中(100mM NaCl、Tris pH8.0 50mM、EDTA100mM和1%SDS),轉(zhuǎn)移到微型管中,用蛋白酶K(0.5μg/mL)在56℃下伴以緩慢攪拌消化過夜。然后加入250μL飽和的NaCl,混合并在微型離心機中以13000rpm速度離心之前,在室溫下放置5min。在不擾動沉淀物的情況下,提取750μL上清液,并用500μL異丙醇沉淀,混合,在室溫下在13000rpm離心下來,用70%乙醇洗滌,風干并在室溫下重懸于1xTE中過夜,使用NanoDrop ND 1000分光光度計(NanoDropTechnologies,Bonsai Tecnologies Group SL,Alcobendas,馬德里,西班牙)定量測定連續(xù)稀釋的重懸DNA。
Hirt提取物
將胰蛋白酶化的細胞(通常5-10x106細胞)轉(zhuǎn)移到13mL-PE圓錐管中,并在室溫下在臺式離心機中以低速(1000-1500rpm)離心沉淀3-5min。將沉淀物用冷的PBS洗滌,并進行如之前所述的離心。重懸的沉淀物被轉(zhuǎn)移到微型離心管中,在4℃ 13.000rpm離心5分鐘。將沉淀物重懸于Hirt′s裂解緩沖液中(0.6%SDS和10mM EDTA),但不進行吹吸和渦旋,室溫孵育15min。通過加入5M NaCl至終濃度1.4M使基因組DNA沉淀,通過顛倒緩慢混合,然后4℃儲存過夜。將蛋白和基因組DNA在微型離心機中4℃、13.000rpm離心30-60min。含低分子量DNA的上清液用苯酚提取,乙醇沉淀,然后重懸于100-200μL水中。
Southern印跡雜交
將消化后的樣品負載到1xTAE中的0.8%瓊脂糖膠上,并通過在70-100V恒壓下運行進行分離,直到染料的前端距離膠的末端1-3cm。負載包含待檢測序列的對照的、定量的質(zhì)粒以提供大小和數(shù)量(20pg、200pg和2ng)的參照。在300nm紫外光下對凝膠進行拍照。在蒸餾水中洗滌凝膠,然后在2xSSC中室溫下平衡15min。用NaOH 0.5N,在室溫下過夜,使凝膠通過毛細管作用在尼龍薄膜Hybond-Nplus(GE Healthcare)上形成印跡。薄膜通過在Stratalinker(Stratagene)中照射被固定,并用于進一步雜交。
用來檢測neo的探針為質(zhì)粒pcDNA3.1(Xmai-BstBI,0.8Kpb)(Invitrogen)的限制性內(nèi)切核酸酶消化的純化產(chǎn)物,用來檢測AAVS1的探針為pZDonorAAVS1(KpnI-XmaI,0.7Kpb)(Sigma Aldrich)的限制性內(nèi)切核酸酶消化的純化產(chǎn)物。使用商購試劑盒RediPrime II(GE Healthcare)按照制造說明使用100μCi/反應(yīng)的32P-alpha CTP進行標記。使用Micro Bio-Spin P-30(BioRad)柱根據(jù)制造說明除去沒有整合的核苷酸,并通過閃爍計數(shù)來定量。膜在2xSSC濕潤,在25cm管中用10-20mL PerfectHybTM Plus(SigmaAldrich)進行預(yù)雜交和雜交。含1-2x107cpm/mL的雜交液進行66℃過夜。然后將膜在65℃在0.1x SSC 0.5%SDS中通過連續(xù)的20分鐘洗滌來進行洗滌。濕薄膜被暴露于磷屏成像系統(tǒng)的屏幕下,并使用STORM掃描儀顯影。
實時熒光定量PCR
使用描述于Butler,SL et al.,J.Virol.2002,76(8):3739.DOI:10.1128/JVI.76.8.3739-3747.2002中的SYBR Green法測定源自用慢病毒體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物的非整合型的2-LTR的附加體形式的定量PCR。HEK293A細胞中白蛋白的拷貝數(shù)采用經(jīng)過一些改良的前面描述的進行測定。在所有試驗中,用系列稀釋度的標準化DNA測定PCR的效率,單獨的基因引物的特異性通過在每個qPCR試驗結(jié)束時的熔解曲線來驗證。標準曲線用范圍在0.01pg至100ng的稀釋量的pRRl.sin18.CMV.eGFP.Wpe質(zhì)粒(Addgene)獲得,其對應(yīng)102-109個拷貝數(shù)。插入在使用下文所列的特異性引物擴增時獲得的Ct值,并計算試驗樣品中的絕對拷貝數(shù)。使用與在基因組DNA和標準化的基因組DNA的稀釋測試樣品上的白蛋白單拷貝基因相似的Ct值計算細胞當量。2-LTR qPCR的陽性對照是包含被合成并并克隆到常規(guī)質(zhì)粒中的LTR-LTR元件的片段。
所使用的引物是:
qLTRFw:TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT(SEQ ID NO:18)
qLTRRv:GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC(SEQ ID NO:19)
擴增子大?。?5bp
qhAlbFw:GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT(SEQ ID NO:20)
qhAlbRv:ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC(SEQ ID NO:21)
擴增子大?。?24bp
q2LTR R Rv2:TGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATT(SEQ ID NO:22)
q2LTR U5Fw2:GTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACT(SEQ ID NO:23)
擴增子大?。?31bp
細胞儀分析
在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時進行流式細胞儀分析。將細胞胰蛋白酶化并進行收集,在培養(yǎng)級1X PBS中洗滌兩次,然后在FACSDIVA(Becton Dickinson,San Agustín de Guadalix,馬德里,西班牙)分類器中用適合Cherry FP激發(fā)的激光進行分析。在每種情況中,對10,000個事件進行計數(shù),重復(fù)三次。
核型分析
細胞系在培養(yǎng)瓶中在5%CO2的空氣氣氛中在37℃孵育。中期細胞通過標準的細胞遺傳學方法制備。用秋水仙酰胺(0.1μg/mL,1.5小時,37℃;GIBCO,Strachclyde,UK)進行絲分裂阻滯,然后進行低滲處理(75mm KCl,15分鐘,37℃),在涂到載玻片上之前用甲醇/乙酸(3:1)固定。
熒光原位雜交分析(FISH)
對于FISH分析,細胞首先用秋水仙酰胺(Invitrogen)進行處理,然后用低滲鹽溶液進行處理,之后收獲。
一組探針被用于定位病毒的整合位點。使用來自載體質(zhì)粒的DNA檢測慢病毒體的整合位點。4q13.3染色體區(qū)帶(cytoband)圖譜的細菌人工染色體(BAC),RP11-49L9,被用作對照。BAC從人BAC克隆文庫RPCI-11(Children's Hospital Oakland Research Institute,奧克蘭,CA)中獲得。1μg質(zhì)?;駼AC DNA直接使用Nick Translation試劑盒((Cat#:07J00-001,Vysis)標記。該試劑盒被設(shè)計為使用熒光標記的dUTP(綠色光譜–或橙色光譜)進行DNA的熒光標記。標記后的DNA與Cot-1DNA和剪切的鮭魚精DNA(Vysis,DowersGrove,IL,USA)共沉淀,以避免在基因組的重復(fù)DNA序列中非特異性雜交。沉淀后的DNA混合物重懸于雜交混合物中。
為了進行FISH反應(yīng),將探針和中期的涂片加熱,共変性并在37℃下雜交過夜。雜交之后用0.4xSSC/0,3%NP40和2xSSC/0,1%NP40進行兩次洗滌,然后在抗褪色溶液中(Abbott Molecular)用DAPI進行染色體復(fù)染。
使用運行Chromofluor圖像分析系統(tǒng)的計算機(Cytovision,Applied ImagingLtd,Newcastle,UK)連接的冷卻的電荷耦合器件(CCD)照相機(PhotometricsSenSys camera)捕捉細胞圖像。
結(jié)果
實施例1:維持在高度循環(huán)的細胞中的慢病毒-附加體(慢病毒體)
方法描述
我們已經(jīng)系統(tǒng)地分析了哺乳動物的ori和S/MAR序列的一系列組合對在以指數(shù)方式生長的細胞中的附加體1-、2-LTR的維持和分離的效果,所述細胞伴隨著在培養(yǎng)物中在跨度兩個月的時間里很多群體的倍增。
從被證明為ori或S/MAR的很短但是非常有特點的序列收集中,我們挑選了幾個共享的兩個主要特征。第一,兩個序列的長度必須限定為能夠被容納于慢病毒載體中的大小,因為其他感興趣的序列將會進一步被克隆入慢病毒載體,第二,ori/SMAR元件的真核非病毒源的特性。最有特點的ori序列源自DNA病毒;用于臨床的主要缺點是它們對作為SV40大T抗原、乳頭瘤病毒E1/E2蛋白或皰疹病毒EBNA的功能激活的病毒蛋白的嚴格要求。然而,它們均不可避免地有助于表達這些基因的細胞的細胞轉(zhuǎn)化。這一真核的特性意味著它們已經(jīng)證實在哺乳動物細胞中發(fā)揮作用并對被引發(fā)的細胞信號響應(yīng),從而以每個細胞周期一個(one-per-cell-cycle)的速率復(fù)制。
我們已篩選到符合所述特征的三個ori序列,其繪制在人β-球蛋白基因座(Kitsberg D et al.,Nature,1993,366(6455):588–590),人c-myc啟動子區(qū)(McWhinney C.andLeffak M.,Nucleic Acids Res.1990,18(5):1233–1242)和A34上,源自人DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(dnmt)的36bp共有序列(Araujo F.D.et al.,J.Biol.Chem.,1999,274(14):9335–9341)。此外,篩選了四個S/MAR序列,并已證明了在附加體的維持中有活性、有絲分裂穩(wěn)定以及含有用于甲基化作用的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)域。所選擇的錨定元件為1.8Kbp的人IFN-γ基因(hIFN-γ大)(Bode J.et al.,Science,1992,255(5041):195-7);相同基因的0.7Kpb最小區(qū)(hIFN-γShort)(Ramezani A.et al.,Blood,2003,101(12):4717–4724);包含在倉鼠脫氫葉酸還原酶基因(hDHFR)中的0.2Kbp最小區(qū)(Mesner L.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2003,100(6):3281–3286)以及最后繪制在小鼠免疫球蛋白κ基因(mIgΚ)的0.4Kbp區(qū)(Cockerill P.N.and GarrardW.T.,Cell,1986,44(2):273–282)。
為了研究所選擇的元件是否能夠在慢病毒格式中勝任提高1-/2-LTR附加體的持久性,我們制備了含有使病毒整合酶活性失活的pol基因突變(D64N)的自滅活慢病毒[al,supra]。共同命名為pLS1的質(zhì)粒(圖2,SEQ ID NO:24)包含轉(zhuǎn)錄單元,以在隨著重復(fù)細胞的分裂進行pLS-derivedLentiSomeTM的轉(zhuǎn)導(dǎo)時簡單地提出其維持。報告盒攜帶了由脊髓灰質(zhì)炎病毒T2A CHYSEL序列分離的eGFP/neoRORF,允許分別通過FACSorter或抗生素的選擇獲得結(jié)果。所述報告盒已被放置在弱的但是無處不在的啟動子的控制下,所述啟動子包括CMV增強子和來自腺相關(guān)的病毒2(eC/p5)的早期轉(zhuǎn)錄單元的p5啟動子。為了確保包含在ori(ARS)中的自主復(fù)制序列的激活,將ori和S/MAR序列二者定位于轉(zhuǎn)錄方向的下游。在圖2中顯示了一組構(gòu)建體。所述構(gòu)建體的平均大小是9Kbp,以確保達4Kbp cDNA的進一步克隆。將每種質(zhì)粒用于與輔助質(zhì)粒組合以產(chǎn)生如在材料和方法部分所述的慢病毒批次。
結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的計算機模擬(in silico)評估
為了預(yù)測在計算機模擬中攜帶ori/SMAR序列的pLS質(zhì)粒的序列相對穩(wěn)定性,我們進行了應(yīng)力誘導(dǎo)型DNA脫穩(wěn)(SIDD)分析。該研究的讀數(shù)是沿任何核苷酸序列分離鏈所需的預(yù)測能量(由ΔG°表示)的理論曲線,允許在開放構(gòu)造中測定特定的區(qū)域并具有分離鏈(脫穩(wěn)的)的高傾向性,如在轉(zhuǎn)錄終點證明的,也為了假定的復(fù)制起點。
在圖3中顯示了以在該研究中使用的12種質(zhì)粒獲得的數(shù)據(jù)。該圖表示缺乏原核生物序列的每種轉(zhuǎn)移慢病毒質(zhì)粒的序列使用WebSIDD程序(www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)的脫穩(wěn)曲線。上述每個曲線是包含在每種構(gòu)建體中的元件的示意圖,基礎(chǔ)慢病毒結(jié)構(gòu)圖表示上述對照構(gòu)建體(缺少Ori/SMAR)的示意圖。與S/MAR序列對應(yīng)的區(qū)域涂以深藍色陰影。Ori序列為黑色。所有的質(zhì)粒均包含最高概率的開放結(jié)構(gòu),表示為在橫跨S/MAR序列區(qū)(圖標中的陰影區(qū))的負的G(x)(以Kcal/mol為單位)。這些數(shù)據(jù)支持了慢病毒骨架中克隆的所有S/MAR序列中的活性開放區(qū)域的想法,并與目前描述的S/MAR序列(Benham et al J.Mol.Biol.274,181-196 1997)一致。
轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達動力學的穩(wěn)定性
將攜帶所述的ori/SMAR組合的IDLV用于在低MOI(2T.U./cel)下的人癌細胞系HEK293A細胞的指數(shù)生長培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)導(dǎo)。FACSorting純化eGFP+細胞之后,將培養(yǎng)物維持五個群體倍增數(shù)(PD,1PD等于在用于兩倍通道/周的培養(yǎng)條件下18小時)以允許建立附加體。之后培養(yǎng)物在G418存在或不存在的條件下維持,每8-10PDs(6至7.5天)評分存在的eGFP+細胞。
我們首先評估攜帶九個組合中的一個的慢病毒體TM的持久性,所述九個組合為前面提及的源自hIFNγ(LS 1、2、5、6、9和10)的或源自mIgΚ(LS 4、8和12)ori和S/MAR(圖4,上面的圖)在沒有選擇壓的條件下培養(yǎng)到70PDs之后(大約附加體建立后1.7月),eGFP+細胞的百分比基于每種轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒體TM是可變的。明顯地,大部分含有hIFNγ基因S/MAR的附加體(LS 2、5、6、9和10)顯示了伴隨細胞分裂的穩(wěn)定增殖,然而含有mIgΚsmall 0.4Kbp S/MAR(LS4、8、12)的那些則不然。同樣明顯的是,這些慢病毒體TM總是難以產(chǎn)生是因為還沒有解決。正如所預(yù)期的,在存在G418選擇壓的條件下維持的培養(yǎng)物產(chǎn)生了對抗生素有抗性的細胞的同類培養(yǎng)物,含有G418的選擇壓(數(shù)據(jù)未顯示)。
通過檢測的結(jié)束時間點,用含有ori或S/MAR序列的IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞獲得的對照值失去了eGFP+細胞,如預(yù)期(圖4中十字符號)。LS 5、6或10轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示功能性附加體被留在50%的細胞中,然而在轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 1、4、8或12的培養(yǎng)物中,附加體在70PDs以少于5%的細胞群體繼續(xù)存在。重要的是,在該研究中,附加體LS 2和9通過顯示的高達70%的eGFP+細胞維持和有效地區(qū)分。轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 5、9和10的培養(yǎng)物堅持更長直到120PDs(轉(zhuǎn)導(dǎo)后三個月),獲得了幾乎相同的結(jié)果,因為在培養(yǎng)物中的eGFP+細胞的比例為大約細胞培養(yǎng)物的40-55%。
我們用在前述實驗中出現(xiàn)較好結(jié)果和包含另外一組慢病毒的那些慢病毒體TM進行了第二次試驗。這些包含不同選擇的符合實驗設(shè)計中提到的標準之一的小尺寸元件。該新元件是小的0.2Kbp的倉鼠脫氫葉酸還原酶(DHFR)的S/MAR。然后我們構(gòu)建并獲得了分別與β-球蛋白、A34或c-myc ori組合的LS 3、7和11,然后按照相同方法比較LS 1、2、3、5、7、9、10和11,因此丟棄含0.4Kbp S/MAR元件的LS。
在轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS9、10和11在70PDs的培養(yǎng)物(附加體建立后54天)中,維持在90%的細胞中的附加體顯示高效的復(fù)制、放電和分離(圖4,下面的圖),尤其是當c-myc ori序列與測試的所有的S/MAR序列結(jié)合時獲得的持久性。表1顯示了圖4中表示的數(shù)據(jù)的簡介。
表1.來自HEK293A中復(fù)制慢病毒體的長期表達的終點數(shù)據(jù)
(*)在試驗結(jié)束時的eGFP+細胞的百分數(shù)(dpt)
(**)108PD的數(shù)據(jù)與第一欄試驗的終點值相對應(yīng)
(***)僅來自69PD的試驗的數(shù)據(jù)被考慮進行該計算
結(jié)論
從之前的實驗可以得出以下結(jié)論:(i)我們的方法在慢病毒骨架中的可行性和(ii)很明顯,在慢病毒背景中必須遵從反復(fù)實驗(trial and error)策略,因為不是所有組合都能同樣有良好的耐受性或理論上的預(yù)測。
顯然,沒有預(yù)測的一般性規(guī)則來找到包含在允許高效持久性的慢病毒骨架中的元件的最優(yōu)組合。然而有一些顯示出值得注意的特征的序列,即含有mIgΚ0.4KbpS/MAR的LS,不論與ori序列組合與否,看似不能勝任分離;然而人c-myc和β-球蛋白基因中的ori。不論與S/MAR序列共存與否,看似有效地繼續(xù)存在。顯而易見的,無論哪個測試的S/MAR序列被放置在一起,系列的具有人c-myc ori序列的慢病毒體TM繼續(xù)存在,事實對立面與用S/MARmIgΚ獲得的結(jié)果相比。
總之,盡管當通過DNA病毒、質(zhì)粒和微環(huán)輸送時很好地表征了ori和S/MAR序列(Nehlsen K.et al.,Gene Therapy and Molcular Biology,2006,10:233),但是我們已經(jīng)證明被慢病毒復(fù)制的中間體強加的基因特征排除了關(guān)于在分裂細胞中的持久性的任何預(yù)測。
實施例2:轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中的慢病毒體TM基因分析
轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中的慢病毒體TM的染色體外狀態(tài)分析
哺乳動物的ori功能依賴于后成原理是當前公知的,例如存在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或核定位。很少知道除了需要錨定蛋白之外,對發(fā)揮作用的S/MAR序列的要求。
據(jù)我們所知,沒有數(shù)據(jù)說明在經(jīng)典慢病毒或IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染期間,1-/2-LTR外產(chǎn)物的狀態(tài),然后我們想知道當存在于慢病毒基因結(jié)構(gòu)中時,ori/SMAR序列是否有生理學作用。我們首先提出LS是否運輸整合形式或到什么程度以及是否所有組合都同等有效。我們根據(jù)在文獻中(參見Nehlsen K.et al.,supra)描述的標準步驟采用了旨在揭示這一點的一組技術(shù)。
Southern印跡雜交研究
連續(xù)培養(yǎng)(>70PDs)后,基因組和低分子量DNA(Hirt提取物)均從由轉(zhuǎn)導(dǎo)了一組LS的細胞中純化出來,樣品首先通過Southern印跡雜交進行研究。將在所有的LS的3’端進行一次切割的酶消化的基因組被印跡,并用特異性neo探針雜交,所述neo探針針對的是內(nèi)源性基因座AAVS1,其表示每個HEK293細胞的三倍。當膜與特異性的neo探針雜交時(圖5A,左邊),通過這種技術(shù)在研究的樣品中沒有獲得的任何特異性的信號。AAVS1探針與所有的樣品雜交,表明在加載于每個孔的細胞等價物中最高2倍變化(圖5A,右)。在實驗條件下,neo探針的靈敏度比AAVS1探針高10倍,所述AAVS1探針檢測到3個拷貝數(shù)/細胞,并且在每個孔中相當于1百萬細胞等價物,然后可以得出結(jié)論慢病毒體的整合拷貝數(shù)目低于低于0,3/細胞。當Hirt提取物通過Southern印跡雜交進行研究時,獲得了相似的陰性結(jié)果,雖然在該情況中實現(xiàn)了較低靈敏性,并限制于大于50拷貝數(shù)每細胞的檢測。的確,當高拷貝數(shù)存在時,即附加體建立結(jié)束時,來自轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 1、2、5和10的培養(yǎng)物的Hirt提取物在Southern印跡雜交中顯示了特異性的條帶(圖5B,左)。重要的是,在該時間點對那些培養(yǎng)物進行的FISH研究顯示在所有評分的細胞(與通過Southern印跡雜交檢測相關(guān)的數(shù)據(jù)(圖5B,右))中有大量的斑點。
這些結(jié)果可共同地被解釋為,如果慢病毒體在培養(yǎng)物中以低數(shù)目地繼續(xù)存在,并且支持不能通過Southern印跡雜交檢測它們。的確,來自其他作者的附加體微環(huán)質(zhì)粒pEPI的數(shù)據(jù)(Nehlsen,Broll and Bode,2006)表明在不加選擇壓連續(xù)培養(yǎng)后,如我們的情況那樣建立附加體后,在CHO培養(yǎng)物中維持10-15個拷貝數(shù),并且僅在早期通過Southern印跡雜交檢測出所述拷貝數(shù)。
PCR分析
盡管Southern印跡雜交分析提供的信息對檢測探針序列的特定位置是必需的,但是當在一小部分細胞中尋找低拷貝數(shù)的序列時,該技術(shù)給出的信息很少。因為附加體有可能以低拷貝數(shù)存在,并且可能在一小部分細胞中,所以具有持久性性表型的培養(yǎng)物中的IDLV序列進一步通過qPCR表征。
對基因組DNA樣品進行高度靈敏的定量qPCR,以檢測2-LTR附加體形式序列的相對豐富,所述序列在69PD時留在轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 2、3、5、7、9、10和11的培養(yǎng)物中,并與用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的或用整合型慢病毒或用沒有ori和S/MAR序列的IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本HEK293A DNA獲得的信號相比。通過特異性qPCR將細胞等價物歸一化以檢測單拷貝白蛋白基因。圖6顯示了通過qPCR使用HIV LTR引物獲得的數(shù)值在1個拷貝數(shù)/細胞(LS 3、5、7)、2-3個拷貝數(shù)/細胞(LS 2、9以及10)或大于9個拷貝數(shù)/細胞(LS11)之間。這樣的數(shù)值支持了只有少數(shù)附加體拷貝數(shù)存在于培養(yǎng)物中的觀點。缺少IDLV-ori/SMAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞獲得的數(shù)值在檢測極限以下,并被認為等于用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細胞獲得的那些數(shù)值(圖6,HEK293通道),因此落入背景值。
總之,來自qPCR分析的數(shù)據(jù)表明被2-LTR PCR特異檢測到的附加體形式維持在頻率低下,并且在穩(wěn)定時在不同轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)物之間是可變的。
慢病毒體的染色體外狀態(tài)
如前述數(shù)據(jù)所顯示的,雖然LS-類型載體的拷貝數(shù)低,但是某些組合在細胞分裂期間保持穩(wěn)定,而其他的可能沒有。我們進行了FISH分析作為確定的證據(jù)證明與LS衍生的中間體的染色體的聯(lián)系。圖7顯示了在70PD時轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 5、6、9、10或11的細胞的中期的涂片。如在轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 5、6、10或11的細胞中所示的,我們一直能找到與中期染色體有關(guān)的強烈的熒光運動,但不是在染色體臂中的等同位置的復(fù)制信號。雖然對于大部分轉(zhuǎn)導(dǎo)了LS 9的細胞來說,這也是正確的,但是又很少的例外(參見圖7中的插入),其中,在兩個染色體臂上觀察到強的雙重信號,表明環(huán)狀構(gòu)建體的整合事件。這樣的結(jié)果,而不是其他的,能夠認同某些通過常規(guī)的qPCR和PCR(圖6)獲得的數(shù)據(jù)。
當比較這些不同技術(shù)獲得的結(jié)果時,明顯的矛盾支持了其他作者揭露的基本原理。確實,F(xiàn)ISH分析與qPCR產(chǎn)生的數(shù)據(jù)高度相關(guān),并支持前者應(yīng)當是選擇程序的理念。因此,由于不同技術(shù)獲得的結(jié)果存在不一致性,我們同意其他作者強調(diào)的中期涂片中轉(zhuǎn)基因的FISH可視化的數(shù)據(jù)的爭辯。然而,與整合時發(fā)生的染色單體的雙重信號對比,單強度信號表明典型的染色體外拷貝。
結(jié)論
我們已經(jīng)證明有可能通過在病毒基因組中插入ori和S/MAR序列將自主復(fù)制和分離能力轉(zhuǎn)移給慢病毒逆轉(zhuǎn)錄的外產(chǎn)物(1-/2-LTR)。有助于本發(fā)明功能的主要因素有可能在外產(chǎn)物的細胞核販運;研究的哺乳動物的性質(zhì)的序列;以及慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)時對細胞生理機能最小程度的干擾之中。
我們也已經(jīng)將位于復(fù)制調(diào)控單元(ori/SMAR)的轉(zhuǎn)錄單元(報告子)作為文獻中的主要問題。明顯的是,獲得了不可預(yù)見的結(jié)果,因為若干但不是所有組合都同樣有效,在這個背景下,幾乎沒有是無效的,如來自mIgΚ的0.4Kbp S/MAR,盡管在其他非病毒體系中的元件已很好地表征了,例如用質(zhì)粒和微環(huán)的方法。因此,需要反復(fù)實驗(trial and error)的方法來證明附加體的全部功能,所述附加體在慢病毒遺傳學的背景中保持著不能檢測到整合。
此類新型的源自慢病毒的附加體載體(慢病毒體)可利用臨床前和臨床試驗中常規(guī)慢病毒載體的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài),并成為更安全的下一代基因治療方法的載體選擇。