本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(iOPC)的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子或具有引入其中的所述核酸分子的載體作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2，并且涉及用于使用以上的組合物將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法。另外，本發(fā)明涉及藥物組合物、細(xì)胞治療劑、藥物篩選組合物、或用于制造人工組織的3D打印生物材料組合物，其的每個(gè)包含通過以上用于將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，因此適合用于在預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病中使用。

背景技術(shù)：

少突膠質(zhì)細(xì)胞起源于在膠質(zhì)限制前體(被稱為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞)的分化期間的神經(jīng)上皮。少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞是一類對(duì)于產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的髓鞘必需的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。髓鞘形成使神經(jīng)元能夠保持電脈沖通過切斷的軸突的動(dòng)作電位。

少突膠質(zhì)細(xì)胞的功能異常是由喪失髓鞘產(chǎn)生的紊亂，并且引起許多神經(jīng)退化性疾病，包括多發(fā)性硬化癥、腦性癱瘓、腦白質(zhì)病變、神經(jīng)病變、腦橋中央髓鞘溶解癥和髓鞘形成減少。為了治療受損的少突膠質(zhì)細(xì)胞，將發(fā)揮功能以恢復(fù)內(nèi)源細(xì)胞或以產(chǎn)生髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞移植進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是用于治療髓鞘損傷的基本方法。

在這方面，移植少突膠質(zhì)細(xì)胞已被用于治療髓鞘損傷，但是由于分化少突膠質(zhì)細(xì)胞的有效方法不易得到并且由于難以獲得大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，是有問題的。

此外，盡管已經(jīng)設(shè)計(jì)了用于分化胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)的多能(pluripotent)干細(xì)胞成為少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，這些方法苦于形成感興趣的細(xì)胞的低的誘導(dǎo)效率和從胚胎干細(xì)胞或多能干細(xì)胞分化成為特定細(xì)胞后形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

為了消除形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，研究繼續(xù)進(jìn)行到直接轉(zhuǎn)分化體細(xì)胞成為其他類型的體細(xì)胞或多潛能(multipotent)干細(xì)胞，而不經(jīng)由多能干細(xì)胞。然而，此類細(xì)胞重編程機(jī)制是難以具體地證明的，歸因于過于大量的參與誘導(dǎo)過程的基因，并且因此至今已展現(xiàn)的技術(shù)水平是微不足道的。盡管建立了去分化策略，為了其的現(xiàn)實(shí)世界治療應(yīng)用，必須繼續(xù)開發(fā)技術(shù)簡(jiǎn)單并且高效的方法。此外，因此當(dāng)在效率和安全性方面評(píng)價(jià)開發(fā)的技術(shù)時(shí)，它們是不令人滿意的。而且，通過表達(dá)來自體細(xì)胞的僅單一基因制備少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法仍是未知的。

為了回應(yīng)此類情況，本發(fā)明人已確定，可以通過使用選自直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2的至少一種基因的直接轉(zhuǎn)分化，從體細(xì)胞制備少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，而無形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此在本發(fā)明中達(dá)到頂點(diǎn)。

公開內(nèi)容

技術(shù)問題

因此，本發(fā)明的目的是提供用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子，或具有引入到其中的所述核酸分子的載體作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物組合物，用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的細(xì)胞治療劑，用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物篩選組合物，或用于制造用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，其每個(gè)包括至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有引入到其中的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

本發(fā)明的還另一個(gè)目標(biāo)是提供用于直接轉(zhuǎn)分化體細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法。

技術(shù)方案

為了完成以上的目標(biāo)，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，所述直接轉(zhuǎn)分化通過將至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入體細(xì)胞，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的細(xì)胞治療劑，所述細(xì)胞治療劑包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了用于篩選用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子，包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了用于制造用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物(用于3D打印的生物材料組合物)，所述3D打印生物材料組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提供了用于直接轉(zhuǎn)分化體細(xì)胞為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法，所述方法包括將至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入到所述體細(xì)胞，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于使用選自以下的至少一種基因誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。另外，可以有效地利用以上的組合物來從體細(xì)胞制備少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，從而治療脊髓損傷和脫髓鞘疾病。

附圖描述

遍及附圖，“iOPC-C1”和“iOPC-C2”分別表示根據(jù)本發(fā)明制備的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的克隆1和克隆2。

圖1a是從成纖維細(xì)胞產(chǎn)生OCT4誘導(dǎo)的iOPC的方法的示意性圖解；

圖1b是圖解在成纖維細(xì)胞逐漸分化成為iOPC期間的變化的相差顯微鏡圖像，其中“B”示出了未感染的成纖維細(xì)胞，“C”示出了對(duì)照，“D”示出了在第25天的成纖維細(xì)胞-OCT4，“E”示出了OCT4誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞聚集體，“F”示出了iOPC樣集落，及“G”示出了iOPC的雙極形態(tài)，并且E和F的比例尺是500μm，B到D的比例尺是200μm，及G的比例尺是100μm；

圖1c圖解了用iOPC特異的標(biāo)志物諸如PDGFR-α、NG2、A2B5和Olig2雙染色的OCT4誘導(dǎo)的iOPC克隆的免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定的結(jié)果，其中比例尺是125μm；

圖1d圖解自我更新的iOPC的相差顯微鏡圖像，其中比例尺是100μm；

圖1e圖解iOPC隨著時(shí)間在起始代次(P3)和后期代次(P31)中的增殖率，其中數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；

圖2a圖解未分化的iOPC的免疫細(xì)胞化學(xué)圖像，其中“A”示出了用PDGFR-α和GFAP染色的圖像，“B”示出了用NG2和Tuj1染色的圖像，及“C”示出了用A2B5和RIP染色的圖像，并且比例尺是250μm；

圖2b是圖解在iOPC的體外分化期間形態(tài)變化的相差顯微鏡圖像，其中“D”示出了在第1天的結(jié)果，“E”示出了在第5天的結(jié)果，“F”示出了在第16天的結(jié)果，綠色箭頭表示少突膠質(zhì)細(xì)胞，紅色箭頭表示星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且比例尺是100μm；

圖2c圖解O4+少突膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)和GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞(紅色)的共存，示出了iOPC分化后的多能性，其中比例尺是125μm；

圖2d圖解分化后30天，表達(dá)成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)圖像，其中“M”和“P”示出了RIP表達(dá)，“N”和“Q”示出了GalC表達(dá)，“O”和“R”示出了MBP表達(dá)，并且比例尺是125μm；

圖3a圖解對(duì)于OCT4誘導(dǎo)的iOPC的總基因表達(dá)的微陣列分析的熱圖結(jié)果，其中“成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)”示出了成纖維細(xì)胞，“Fib-OCT4D3”示出了在通過OCT4的分化誘導(dǎo)期間在第3天的成纖維細(xì)胞，“Fib-OCT4D10”示出了在通過OCT4的分化誘導(dǎo)期間在第10天的成纖維細(xì)胞，“模擬物(Mock)”示出了對(duì)照，且“wtOPC”示出了源自多能干細(xì)胞的OPC；

圖3b圖解比較總基因表達(dá)的散點(diǎn)圖，示出了在成纖維細(xì)胞和OPC、成纖維細(xì)胞和iOPC-C1、成纖維細(xì)胞和iOPC-C2、iOPC-C1和OPC、iOPC-C2和OPC、以及iOPC-C1和iOPC-C2間的關(guān)聯(lián)，其中黑色線表示在成對(duì)的樣品間具有兩倍基因表達(dá)變化的分界線，并且基因表達(dá)水平由log2值表示；

圖3c圖解OCT4-誘導(dǎo)的OPC對(duì)于基于OPC的標(biāo)志物和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)的定量RT-PCR的結(jié)果，其中圖以對(duì)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化的log2變化倍數(shù)示出；

圖3d圖解主成分的3D分析結(jié)果，其中第一主成分(PC1)組成基因表達(dá)變化性的64％，第二主成分(PC2)組成變化性的14％，并且第三主成分(PC3)組成變化性的8.3％；

圖3e圖解總基因表達(dá)的分層聚類結(jié)果，其中OCT4誘導(dǎo)后，基于微陣列分析的結(jié)果檢驗(yàn)基因表達(dá)的變化，并且少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的發(fā)育與相比于成纖維細(xì)胞在iOPC中高度表達(dá)的基因相關(guān)；

圖4a圖解移植進(jìn)入損傷的部分后12周，經(jīng)H&E染色的大鼠的脊髓的圖像，其中比例尺是200μm；

圖4b圖解損傷的脊髓的免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果，其中“C”和“F”用O4染色，“D”和“G”用MBP染色，及“E和H”用GFAP染色；

圖4c圖解移植進(jìn)入大鼠的脊髓的iOPC分化成為O4、MBP和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)果，及未分化的iOPC的A2B5不成熟標(biāo)志物表達(dá)(I和I’),其中J’中的白色箭頭指示O4陽(yáng)性和MBP陽(yáng)性細(xì)胞，并且比例尺是100μm和50μm；

圖5圖解pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的裂解圖；和

圖6圖解由SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2或NKX6.2誘導(dǎo)的iOPC對(duì)于基于OPC的標(biāo)志物和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)的定量RT-PCR的結(jié)果，其中圖以對(duì)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化的log2變化倍數(shù)示出。

最佳方式

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，為了確定使用選自直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2的至少一種基因，是否可以產(chǎn)生誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(iOPC)，分離體細(xì)胞并且用編碼用于直接轉(zhuǎn)分化因子的基因轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，從而產(chǎn)生iOPC(測(cè)試結(jié)果1)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和雙染色驗(yàn)證了制備的iPOC作為前體的不成熟狀態(tài)。因此，驗(yàn)證了前體的自我更新能力和31代或更高代的生長(zhǎng)率(測(cè)試結(jié)果2)。

而且，誘導(dǎo)了分化來評(píng)價(jià)產(chǎn)生的iOPC的分化能力。結(jié)果，產(chǎn)生的iOPC能夠分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞(測(cè)試結(jié)果3)。

仍在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，比較了產(chǎn)生的iPOC和OPC的總基因表達(dá)譜。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)iOPC和OPC的總基因表達(dá)譜是類似的，指示產(chǎn)生的iOPC對(duì)OPC的功能負(fù)責(zé)(測(cè)試結(jié)果4)。

此外，本發(fā)明中將iOPC移植進(jìn)入體內(nèi)脊髓損傷的大鼠，以評(píng)價(jià)其對(duì)此類脊髓損傷的作用。結(jié)果，損傷的脊髓組織被顯著緩解，并且恢復(fù)了髓鞘形成，而不產(chǎn)生腫瘤。

在下文中，將給出本發(fā)明的詳述。

因此，本發(fā)明提出用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物，所述組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有引入到其中的所述核酸分子的載體作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子諸如OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

已知OCT4(八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4)蛋白是POU5F1蛋白，并且由POU5F1基因編碼。OCT4是POU家族中的同源域轉(zhuǎn)錄因子。盡管已知OCT4蛋白與未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新相關(guān)，關(guān)于體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的內(nèi)容是一無所知的。OCT4的基因序列以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_014209和NM_013633.3注冊(cè)。

SOX1是SOX蛋白家族中的轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_005986.2和NM_009233.3注冊(cè)。

SOX2是SOX蛋白家族中的轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_003106.3和NM_011443.3注冊(cè)。

SOX10是SOX蛋白家族中的轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_006941.3和NM_011437.1注冊(cè)。

OLIG2是OLIG蛋白家族中的轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_005806.3和NM_016967.2注冊(cè)。

NKX2.2是NK2家族中的同源域轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_002509.3和NM_001077632.1注冊(cè)。

NKX6.2是NK2家族中的同源域轉(zhuǎn)錄因子，并且以NCBI注冊(cè)號(hào)NM_177400.2和NM_183248.3注冊(cè)。

本發(fā)明中，可以以蛋白或編碼蛋白的核酸的形式提供OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2基因，并且蛋白可以包括源自人類或動(dòng)物，諸如小鼠、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊和狗的任何蛋白。并且，本發(fā)明中使用的OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2蛋白，不僅包括具有野生型氨基酸序列的蛋白，而且包括單獨(dú)基因的蛋白變體。

術(shù)語(yǔ)“蛋白變體”指由缺失、插入、非保守的或保守的取代或其組合造成的至少一個(gè)氨基酸殘基與天然的氨基酸序列不同的蛋白。變體可以是顯示與天然的蛋白相同的生物活性的功能等價(jià)物，可以是蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)按需要被修飾的變體，或可以是在某種物理或化學(xué)條件下，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加或其生理活性增加的變體。

而且，編碼蛋白的核酸可以具有編碼野生型蛋白或變體類型蛋白的堿基序列，并且可以通過使至少一個(gè)堿基經(jīng)歷取代、缺失、插入或其組合被突變。而且，編碼蛋白的核酸可以經(jīng)由從天然提取或使用化學(xué)合成的方法被制備。具有編碼蛋白的堿基序列的核酸可以是單鏈或雙鏈，并且可以是DNA分子(基因組DNA、cDNA)或RNA分子。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2或NKX6.2蛋白的核酸分子可以是通過包括編碼各個(gè)蛋白的核酸表達(dá)蛋白的載體。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)感興趣的蛋白的表達(dá)載體，并且可以指示包括被可操作地連接以表達(dá)基因插入物的必需的調(diào)節(jié)元件的基因構(gòu)建體。

本發(fā)明中，除了表達(dá)調(diào)節(jié)元件，諸如啟動(dòng)子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號(hào)、或增強(qiáng)子之外，載體可以包括用于膜靶向或分泌的信號(hào)序列或讀取序列，并且可以被多樣地制造以使得對(duì)若干目的適用。載體的啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。此外，表達(dá)載體包括用于選擇含有載體的宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)志物，并且可復(fù)制的表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)。載體可以自我復(fù)制，或可以整合進(jìn)入宿主DNA。

載體可以包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、病毒載體和附加型載體。優(yōu)選地有用的是病毒載體。病毒載體的實(shí)例可以包括但不限于慢病毒載體和源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體、例如HIV(人類免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/禽白血病)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純性皰疹病毒等。此類載體系統(tǒng)通過與遞送到體細(xì)胞的載體中的特定的細(xì)胞相關(guān)的基因的過表達(dá)，被用于誘導(dǎo)直接的轉(zhuǎn)分化。無論使用的載體系統(tǒng)如何，本發(fā)明的效果可被證明。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，可以使用基于pMX的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于表達(dá)OCT4(圖5)。

而且，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，例如，使用載體類型的裸露DNA、或使用脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物等將編碼蛋白的核酸轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體是通過與陽(yáng)離子磷脂諸如DOTMA或DOTAP混合獲得的用于基因遞送的磷脂膜。當(dāng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陰離子核酸以預(yù)定的比例混合時(shí)，可以形成核酸脂質(zhì)體復(fù)合體，并且因此可被誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。

具體地本發(fā)明中，編碼蛋白的核酸分子被包含在載體和病毒中，所述載體和病毒為了表達(dá)每個(gè)基因，通過轉(zhuǎn)化和感染包括編碼蛋白的核酸的病毒載體被制造，進(jìn)入包裝細(xì)胞，并且因此可被引入體細(xì)胞。病毒的實(shí)例可以包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純性皰疹病毒等。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“體細(xì)胞”指除了生殖細(xì)胞之外的任何細(xì)胞。體細(xì)胞的實(shí)例可以是選自由以下組成的組的一種：成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、G細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、B細(xì)胞、血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞等。然而，無論組織細(xì)胞的特定種類如何，只要從體細(xì)胞開始，就可以應(yīng)用直接轉(zhuǎn)分化，并且本發(fā)明不限于體細(xì)胞的以上實(shí)例。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用皮膚成纖維細(xì)胞。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞”指中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞的亞型。此類細(xì)胞是少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體，并且能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。而且，本發(fā)明中，“iOPC”表示誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，例如，根據(jù)本發(fā)明的方法通過直接轉(zhuǎn)分化從體細(xì)胞制備的誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。

另外，本發(fā)明提出了通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，所述直接轉(zhuǎn)分化通過將至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有引入到其中的所述核酸分子的載體引入體細(xì)胞進(jìn)行，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提出了用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有引入到其中的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提出了用于預(yù)防或治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的細(xì)胞治療劑，所述細(xì)胞治療劑包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有引入到其中的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

另外，本發(fā)明提出了用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的藥物篩選組合物，所述藥物組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有引入到其中的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

脊髓損傷包括作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分的脊髓由于外部或內(nèi)部原因被損傷，并且因此不發(fā)揮其的功能的任何情況，并且可以由例如外部損傷諸如震蕩、壓迫或挫傷引起，但本發(fā)明不限于其。此外，當(dāng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分的脊髓不能發(fā)揮其的功能時(shí)，可以出現(xiàn)多種癥狀，諸如體溫調(diào)節(jié)功能異常、膈肌麻痹、肋間神經(jīng)麻痹、出汗、運(yùn)動(dòng)麻痹、感覺麻痹、排尿困難、壓瘡、異位性骨化、肌束震顫等。

而且，脫髓鞘疾病意指與神經(jīng)的髓鞘相關(guān)的任何疾病，并且其的實(shí)例包括但不限于多發(fā)性硬化癥、腦性癱瘓、腦白質(zhì)病變、神經(jīng)病變、腦橋中央髓鞘溶解癥和髓鞘形成減少。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞治療劑”指用于治療、診斷或預(yù)防疾病目的的利用細(xì)胞和組織的藥物(美國(guó)食品和藥物管理局管理的(US FDA-regulated))，其中細(xì)胞和組織通過培養(yǎng)和在從人類分離后的特化任務(wù)制造，特別是通過體外增殖或篩選自體、同種異體或異種的活細(xì)胞，或以其他方式改變細(xì)胞的生物特征以恢復(fù)細(xì)胞或組織的功能的用于治療、診斷或預(yù)防疾病的目的的藥物。

在用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的治療候選物材料存在和不存在下確定根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的反應(yīng)性的方法，在篩選用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的治療劑中可以被有效地采用。例如，根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞，其在治療脫髓鞘疾病和從脫髓鞘疾病恢復(fù)中被認(rèn)為是重要的，并且可被用于評(píng)價(jià)候選物材料的毒性或效價(jià)。

可以基于本領(lǐng)域中通常使用的確定毒性的方法評(píng)價(jià)毒性，諸如測(cè)量根據(jù)本發(fā)明誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的IC₅₀的方法，或取決于在本發(fā)明的治療候選物材料的存在和不存在下，根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化是否被抑制。而且，可以基于本領(lǐng)域中確定對(duì)脫髓鞘疾病的治療效果的方法評(píng)價(jià)效價(jià)，諸如促進(jìn)髓鞘形成的方法，或取決于在本發(fā)明的治療候選物材料的存在和不存在下，根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化是否被促進(jìn)。

另外，本發(fā)明提出了用于制造用于治療脊髓損傷或脫髓鞘疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，所述3D打印生物材料組合物包含至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有引入到其中的所述核酸分子的載體、或通過直接轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞作為活性成分，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

因此，本發(fā)明提出誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的方法，所述方法包括用至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有引入到其中的所述核酸分子的載體誘導(dǎo)體細(xì)胞，所述至少一種蛋白選自由以下組成的組：直接轉(zhuǎn)分化因子諸如OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2。

更具體地，方法包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)體細(xì)胞，用基因插入的載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的體細(xì)胞，和在用于誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)感染的體細(xì)胞。

用于培養(yǎng)體細(xì)胞的培養(yǎng)基包括本領(lǐng)域中培養(yǎng)體細(xì)胞通常使用的任何培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源和小量的元素。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用含有魚精蛋白硫酸鹽的培養(yǎng)基。

而且，用于誘導(dǎo)體細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)條件可以包括本領(lǐng)域中通常用于誘導(dǎo)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化的任何培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用含有N2補(bǔ)充的DMEM/F12、青霉素/鏈霉素、20ng/ml PDGF-α、和10ng/ml FGF-2的培養(yǎng)基。

通過用根據(jù)本發(fā)明用于誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化的組合物誘導(dǎo)體細(xì)胞，可以誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化因子的異位表達(dá)。這里，異位表達(dá)是基因在其通常不表達(dá)的組織或細(xì)胞中的表達(dá)，或是基因在其通常不表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將用于誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化的組合物引入體細(xì)胞，因此誘導(dǎo)直接轉(zhuǎn)分化因子在體細(xì)胞中的表達(dá)。因此，可以從體細(xì)胞制備少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明制備的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成中發(fā)揮必需的作用，并且能夠分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且因此可被應(yīng)用于預(yù)防或治療由髓鞘喪失引起的疾病。

發(fā)明的模式

本發(fā)明的較好的理解可以通過以下的實(shí)施例獲得，實(shí)施例被陳述用于闡明，但不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。提供本發(fā)明的實(shí)施例以向具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通知識(shí)的那些技術(shù)人員充分描述本發(fā)明。

測(cè)試實(shí)施例1.iOPC的產(chǎn)生

在具有10％FBS培養(yǎng)基的涂覆明膠的6孔板上，以3x10⁴細(xì)胞的量將皮膚成纖維細(xì)胞分成小份。一天后，在含有6μg/ml魚精蛋白硫酸鹽的培養(yǎng)基中，以用于表達(dá)OCT4的pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染成纖維細(xì)胞。感染后24小時(shí)，去除病毒上清液，并且將培養(yǎng)基用新的培養(yǎng)基替換。在感染后第3天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入化學(xué)修飾的OPC培養(yǎng)基中(N2補(bǔ)充的DMEM/F12、青霉素/鏈霉素、20ng/ml PDGF-α(Peprotech)、10ng/ml FGF-2(Peprotech))。OPC培養(yǎng)基中另外培養(yǎng)12天后，機(jī)械分離OPC樣聚集體，并且在涂覆凝膠的板中通過胰蛋白酶消化挑選或繼代培養(yǎng)成熟的iOPC。

測(cè)試實(shí)施例2.iOPC的分化(體外)

為了制備成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，將iOPC放置到具有OPC培養(yǎng)基的PDL/層粘連蛋白涂覆的4孔板上。第二天，將培養(yǎng)基用少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基1(N2-補(bǔ)充的DMEM/F12、青霉素/鏈霉素、10ng/ml FGF-2(Peprotech)、10mM毛喉素(forskolin，Sigma))替換，并且然后保持四到五天。第一分化階段后，用少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基2(30ng/ml 3,3,5-三-碘化甲狀腺氨酸(T3；Sigma)、20ng/ml抗壞血酸(AA；Sigma))處理細(xì)胞。

測(cè)試實(shí)施例3.產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒

使用X-tremeGENE9DNA轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將用于表達(dá)OCT4的基于pMX的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞(ATCC,CAT#.CRL-3216)，作為VSV-G-樣病毒包裝。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集含有病毒的上清液，并且用0.45μm注射過濾器過濾，如此獲得病毒。

測(cè)試實(shí)施例4.定量實(shí)時(shí)PCR

使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)提取無DNA的總RNA。將每個(gè)反應(yīng)的總共500ng的RNA用于以III逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA。合成的cDNA具有20μL的總體積，并且被LightCycler 480SYBR Green I Mastermix(Roche)用作模板。測(cè)試OPC標(biāo)志物基因、多能干細(xì)胞和神經(jīng)標(biāo)志物三次，并且將其對(duì)持家基因Gapdh標(biāo)準(zhǔn)化。通過Ct值計(jì)算測(cè)量基因表達(dá)。根據(jù)制造商的描述進(jìn)行所有的測(cè)試。

測(cè)試實(shí)施例5.免疫細(xì)胞化學(xué)

將細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定持續(xù)10min，并且用0.1％Triton X-100處理持續(xù)10min以使得細(xì)胞是可滲透的。將細(xì)胞在4％FBS封閉溶液中孵育持續(xù)30min，并且然后進(jìn)一步在用封閉溶液稀釋的一抗中在室溫孵育持續(xù)1小時(shí)：Oligo2(Santacruz,1:200)、PDGF-α(Abcam,1:500)、A2B5(Millipore,1:500)、NG2(Millipore,1:200)、O4(Millipore,1:400)、RIP(DSHB,1:200)、GalC(Chemicon,1:200)、GFAP(Sigma,1:500)。一抗處理后，將細(xì)胞用PBST(0.05％tween20)洗滌三次。用PBS稀釋二抗(Alexa Fluor 488/568抗小鼠IgG1、IgG3、IgM、抗山羊IgG(Invitrogen,1:1000))，并且與細(xì)胞一起孵育持續(xù)1小時(shí)。使用Hoechst 33342(Thermo)，將細(xì)胞核染色持續(xù)10sec。測(cè)試中使用的一抗總結(jié)在下面的表1中。

表1

測(cè)試實(shí)施例6.制備皮膚成纖維細(xì)胞

分離皮膚成纖維細(xì)胞并且在37℃在5％CO₂培養(yǎng)箱中在MEF培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％FBS、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、巰基乙醇的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。

測(cè)試實(shí)施例7.通過RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)得到的成纖維細(xì)胞特征

使用Taq DNA聚合酶重組物(Invitrogen)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的RT-PCR。為了免疫細(xì)胞化學(xué)，將細(xì)胞在4％PBS中的多聚甲醛(pH 7.4)中固定持續(xù)10min，并且用0.1％Triton X-100處理持續(xù)10min以使得細(xì)胞是可滲透的。將細(xì)胞在4％FBS封閉溶液中孵育持續(xù)30min，并且然后進(jìn)一步在用封閉溶液稀釋的一抗中在室溫孵育持續(xù)1小時(shí)：Oct4(Santacruz,1:200)、Sox2(Santacruz,1:400)、Olig2(Santacruz,1:200)、Pax6(DSHB,1:200)、O4(Millipore,1:400)、RIP(DSHB,1:200)、GFAP(Sigma,1:500)。一抗處理后，洗滌細(xì)胞并且在二抗(Alexa Fluor 488/568抗小鼠IgG1、IgG3、IgM、抗山羊IgG(Invitrogen,1:1000))中孵育持續(xù)1小時(shí)。使用Hoechst 33342(Thermo)，將細(xì)胞核染色持續(xù)10sec。

測(cè)試實(shí)施例8.依據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR的OCT4轉(zhuǎn)基因的沉默

使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)提取總RNA。將每個(gè)反應(yīng)的總共500ng的RNA用III逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成為cDNA。合成的cDNA具有20μL的總體積，并且使用LightCycler 480SYBR Green I Mastermix(Roche)通過實(shí)時(shí)PCR分析。將測(cè)試重復(fù)三次，并且進(jìn)行對(duì)持家基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。通過Ct值計(jì)算測(cè)量基因表達(dá)。

測(cè)試實(shí)施例9.微陣列分析技術(shù)

通過微陣列分析技術(shù)，描繪成纖維細(xì)胞、OCT4感染后第3天的成纖維細(xì)胞(成纖維細(xì)胞-第3天)、OCT4感染后第10天的成纖維細(xì)胞(成纖維細(xì)胞-第10天)、對(duì)照(OPC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未感染的成纖維細(xì)胞)、iOPC-C1和iOPC-C2的總基因表達(dá)，并且真實(shí)地與之前發(fā)表的數(shù)據(jù)的OPC樣品比較。使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明分離總RNA。將樣品與Affymetrix陣列雜交并且通過使用RMA(穩(wěn)健的多陣列分析)算法的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化。使用內(nèi)部開發(fā)的MATLAB應(yīng)用程序執(zhí)行數(shù)據(jù)加工和制圖。通過一個(gè)減法關(guān)聯(lián)度量和不加權(quán)的平均距離(UPGMA)關(guān)聯(lián)方法進(jìn)行基因和樣品的分層聚類。

測(cè)試實(shí)施例10.脊髓損傷和移植

使用6周齡雄性大鼠作為脊髓損傷的模型，并且使用空氣打孔裝置使其的脊髓的胸部脊柱節(jié)段9(T9)損傷。損傷后一周，用DiI標(biāo)記獲得的iOPC，并且通過立體定位方法以1x10⁵iOPC/大鼠的濃度注射進(jìn)入脊髓的胸部脊柱節(jié)段8(T8)和胸部脊柱節(jié)段10(T10)。用水和食物定期地喂養(yǎng)大鼠，并且按摩大鼠的膀胱用于排尿。動(dòng)物測(cè)試被蔚山韓國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物設(shè)施和IBR委員會(huì)(Animal Facility and the IBR Committee of the Ulsan National Institute of Science and Technology)批準(zhǔn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程是基于韓國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所(National Institute of Health)用于動(dòng)物研究的指南。

測(cè)試實(shí)施例11.組織處理和免疫組織化學(xué)

移植后12周，使大鼠麻醉并用PBS灌注。將脊髓用4％多聚甲醛固定過夜，并且在乙醇和二甲苯中以梯度濃度脫水。將組織放置在石蠟塊中，并且在矢狀方向和冠狀方向連續(xù)切成4μm厚度。用0.25％Triton X-100使切片的部分可滲透，并且用10％封閉溶液封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。為了免疫組織化學(xué)分析，將切片的部分與一抗孵育：PDGF-α(Abcam,1:100)、O4(Millipore,1:100)、RIP(DSHB,1:100)、GFAP(Sigma,1:100)、MBP(Millipore,1:100)。此后，將脊髓用二抗染色。使用Olympus顯微鏡，型號(hào)IX81-ZDC使熒光圖像顯像。

測(cè)試結(jié)果

1.僅使用OCT4從成人成纖維細(xì)胞制備iOPC

在圖1a的誘導(dǎo)分化的過程中，為了誘導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變成為OPC，用編碼OCT4轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染皮膚成纖維細(xì)胞。如圖1b中圖解的，誘導(dǎo)前未感染的成纖維細(xì)胞具有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。單獨(dú)的成纖維細(xì)胞不表達(dá)多能細(xì)胞基因或神經(jīng)系統(tǒng)基因，并且甚至通過免疫染色不能確定多能干細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞聚簇。從將OCT4引入膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基后第25天，成纖維細(xì)胞在尺寸上減小并且變成神經(jīng)細(xì)胞樣形狀，但不具有OCT4的對(duì)照細(xì)胞不變(圖1b的D和C)。為了增加細(xì)胞諸如iOPC的產(chǎn)生，將細(xì)胞培養(yǎng)在用對(duì)于OPC必需的生長(zhǎng)因子PDGF-AA補(bǔ)充的特定的培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)后30天，機(jī)械地分離具有神經(jīng)細(xì)胞樣形狀的細(xì)胞，并且在特定OPC培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞。因此，在OPC培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后觀察到iOPC聚集體(iOPC-Ag)(圖1b的E)。下一步，當(dāng)將iOPC-Ag轉(zhuǎn)移到明膠涂覆的板中后，形成iOPC樣簇(圖1b的F)，并且附著后OPC樣細(xì)胞離開以上的簇(圖1b的G)。使用PCR證實(shí)，OCT4基因被轉(zhuǎn)移到并且與iOPC的宿主DNA整合。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)移的基因的沉默，使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)量OCT4的mRNA水平。此外，iOPC通過病毒誘導(dǎo)經(jīng)歷細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變，其后保持其的染色體的核型。藉此，OCT4被證明適合用于從成纖維細(xì)胞成為iOPC的初始命運(yùn)轉(zhuǎn)變。

2.通過OCT4誘導(dǎo)的iOPC的自我更新和OPC的特征

為了評(píng)價(jià)通過OCT4誘導(dǎo)的iOPC的譜系和其作為前體的不成熟狀態(tài)，使用OPC標(biāo)志物諸如PDGFR-α、NG2、A2B5和Olig2進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。這些標(biāo)志物在所有的iOPC中表達(dá)，并且通過雙免疫染色證實(shí)了標(biāo)志物的共同表達(dá)。

獲得了兩個(gè)穩(wěn)定地一致地增殖的iOPC克隆。兩個(gè)克隆可以延伸到31代或更多，而無其的特征或形態(tài)的變化(圖1d)。通過測(cè)量iOPC的平均倍增時(shí)間評(píng)價(jià)生長(zhǎng)特征(圖1e)。生長(zhǎng)曲線示出了iOPC的自我更新能力。生長(zhǎng)率被保持直到后期代數(shù)諸如31代或更高。

3.多潛能iOPC如膠質(zhì)限制的干細(xì)胞分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞

為了評(píng)價(jià)是膠質(zhì)限制的一致前體的iOPC克隆，檢查了iOPC中GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞)、Tuj1(不成熟的神經(jīng)元)和RIP(成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞)標(biāo)志物的表達(dá)。GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在未分化的iOPC中未被檢測(cè)到，或很少存在(圖2a的A)。為了評(píng)價(jià)iOPC是否被限制到膠質(zhì)譜系，用神經(jīng)標(biāo)志物Tuj1染色細(xì)胞，Tuj1在未分化的iOPC中不表達(dá)(圖2a的B)。此外，在未分化的iOPC中未檢測(cè)到充當(dāng)晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的RIP。因此，確定iOPC是同質(zhì)群體(圖2a的C)。

而且，iOPC是能分化為膠質(zhì)譜系細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。為了評(píng)價(jià)iOPC的多潛能性，誘導(dǎo)了iOPC的分化，并且檢查了iOPC是否能夠分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞或其他膠質(zhì)譜系細(xì)胞。未分化的iOPC被鋪板到具有補(bǔ)充有毛喉素、抗壞血酸和T3的、適于促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟的分化培養(yǎng)基的PDL/層粘連蛋白涂覆的板上，并且然后立即被改變。分化后持續(xù)五天，細(xì)胞的形狀轉(zhuǎn)變成為具有小的分支的逐漸扁平形狀(圖2b的E)。進(jìn)一步觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟形狀直到16天，并且觀察到少突膠質(zhì)細(xì)胞與分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞一起存在(圖2b的F)。分化后，將細(xì)胞用少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物O4和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP染色，借以觀察到少突膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞一起存在(圖2c的G到L)。然而，iOPC分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的可能性可以取決于使用的轉(zhuǎn)錄因子的種類而改變，并且其的效率相對(duì)地低。為了評(píng)價(jià)OCT4-iOPC的分化效率，將OCT4-iOPC用O4、GFAP、Tuj1和A2B5染色，并且測(cè)定了分化后iOPC的比例，且評(píng)價(jià)了成熟期間的分化程度。此外，當(dāng)在適合用于誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的條件下被誘導(dǎo)時(shí)，iOPC表現(xiàn)為被限制到膠質(zhì)細(xì)胞。盡管iOPC有效地分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，iOPC不分化為Tuj1陽(yáng)性神經(jīng)元?；谶@些結(jié)果，證明膠質(zhì)限制的iOPC展現(xiàn)不但分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞而且成為少突膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能性。

當(dāng)iOPC完全地分化成為晚期成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，未分化的iOPC不表達(dá)RIP(圖2a的C)，但表達(dá)蛋白標(biāo)志物諸如RIP、GalC和MBP(圖2d的M到R)。此外，證明同質(zhì)OCT4-iOPC具有分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能性。

4.iOPC和OPC的總基因譜表達(dá)

為了評(píng)價(jià)成纖維細(xì)胞和iOPC的總基因表達(dá)的程度，進(jìn)行了微陣列分析過程。兩個(gè)建立的iOPC克隆的基因表達(dá)模式與從多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的OPC非常類似(圖3a)。與之相比，在成纖維細(xì)胞和對(duì)照(模擬物)(在OPC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無OCT4誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞)中總基因表達(dá)具有相反的模式。此外，僅在OPC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無OCT4誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中不存在特別的變化。因此，OCT4對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變成為iOPC是必需的。通過微陣列數(shù)據(jù)的成對(duì)的散點(diǎn)圖，驗(yàn)證了成纖維細(xì)胞和iOPC之間的相似性以及OPC(真實(shí)的)和iOPC之間的相似性(圖3b)。通過3D PCA分析和分層聚類，證明相比于成纖維細(xì)胞，iOPC和OPC(真實(shí)的)與彼此密切相關(guān)(圖3d和3e)。下一步，使用實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了OPC特異的基因表達(dá)(圖3c)。根據(jù)微陣列數(shù)據(jù)，iOPC表達(dá)OPC特異的基因的高水平的mRNA，該OPC特異的基因諸如PTPRZ1、SIAT8A、OLIG2、OLIG1、SOX10、NKX2.2、MAG、MYRF和CNP的高水平的mRNA。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)變后高度表達(dá)的基因，鑒定了68種與少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育相關(guān)的表達(dá)在iOPC中相比于成纖維細(xì)胞中增加的基因。

5.通過iOPC增強(qiáng)脊髓損傷大鼠的恢復(fù)(體內(nèi))

為了評(píng)價(jià)iOPC在體內(nèi)的功能特征，將細(xì)胞移植進(jìn)入脊髓損傷的成年大鼠。為了這個(gè)目的，將iOPC注射進(jìn)入損傷的脊髓直到脊髓損傷后一周，并且觀察結(jié)果直到12周。為了觀察損傷的部分的恢復(fù)，通過H&E染色脊髓。iOPC注射組中損傷部分中組織損傷的程度比對(duì)照中進(jìn)一步減少(圖4a)。進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，借以證實(shí)了移植的細(xì)胞的植活。移植的骨髓中，大量觀察到O4、MBP和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，但在成纖維細(xì)胞移植的大鼠中很少觀察到O4、MBP和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(圖4b的C到H)。在恢復(fù)的脊髓細(xì)胞中，用少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物A2B5、O4、MBP和GFAP染色損傷的部分(圖4c的I到K’)。A2B5和O4陽(yáng)性細(xì)胞都表達(dá)MBP，但GFAP陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)MBP。因此，證明移植的iOPC分化為髓鞘形成少突膠質(zhì)細(xì)胞或GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。為了排除腫瘤基因的憂慮，將iOPC注射進(jìn)入小鼠，并且檢查是否形成腫瘤直到注射后8個(gè)月。結(jié)果，證明移植的iOPC恢復(fù)脊髓中的髓鞘形成而不產(chǎn)生腫瘤，并且恢復(fù)脊髓損傷大鼠的損傷的部分。

6.僅使用直接轉(zhuǎn)分化因子SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2中的單一基因制造的iOPC的基因表達(dá)

僅使用對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育重要的SOX1、SOX2、SOX10、OLIG2、NKX2.2和NKX6.2基因中的單一基因，誘導(dǎo)iOPC?；趶膯为?dú)的基因制造的iOPC的OPC特異的基因的mRNA表達(dá)的結(jié)果，證明了PTPRZ1、NKX2.2、OLIG2、OLIG1和SOX10高表達(dá)(圖6)。