本發(fā)明涉及檳榔柯無性繁殖技術，尤其是一種檳榔柯初代培養(yǎng)芽誘導方法。

背景技術：

檳榔柯（Lithocarpus areca (Hick. et A. Camus) A. Camus），系殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）喬木，高10～15米，小枝灰白色，無毛，有皮孔。葉紙質，倒披針形或狹長橢圓形，長13～25厘米，寬3.5～5.5厘米，兩端狹尖，基部下延，葉緣上部有少數(shù)淺裂的銳齒或兼有全緣，中脈在葉面微凸起，側脈每邊9～15條，在葉面微凹陷，支脈明顯，兩面同色，無毛或脈腋上有叢毛；葉柄長0.5～1.5厘米。雄穗狀花序單穗腋生，稀有短分枝而成圓錐狀，長5～8厘米，花多而密集，花絲纖細，頗長，花序軸纖細；雌花序長4～10厘米，常雌雄同序，雌花生于花序軸的下中，故果序甚短；雌花每3～5朵一簇，通常1花結實，雌蕊卵狀三角形；殼斗幼嫩時小苞片短線狀，長2～4 毫米，成熟時延長至8毫米；堅果橄欖狀橢圓形，或長圓錐形，高40～50毫米，寬20～35毫米，上部有3條縱向略呈鈍角的脊棱，頂端尖，栗褐色，無毛，果壁厚2～3毫米，基部平坦，果臍凹陷，深2～3毫米，口徑8～15毫米?；ㄆ?0月，果次年11月成熟。檳榔柯產于中國廣西壯族自治區(qū)的西部（那坡、龍州）、云南省東南部（麻栗坡），生長于海拔800米至1,500米的地區(qū)，多生長于常綠闊葉林中，越南北部也有分布。

目前，檳榔柯資源仍處于野生分布狀態(tài)，但隨著保護植物多樣性的需求，規(guī)模化人工栽培檳榔柯資源勢在必行。組織培養(yǎng)技術是一種快速無性繁殖技術，選擇檳榔柯優(yōu)良家系或者無性系為材料，通過組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿足生產上的數(shù)量要求，又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過程中，初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進行的關鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導過程中外植體褐變以及玻璃化等問題，提高芽誘導率，出芽指數(shù)以及萌芽生長狀況，獲取數(shù)量多、質量好的萌芽，從而滿足增殖培養(yǎng)的需要，促進檳榔柯組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的檳榔柯初代培養(yǎng)芽誘導方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種檳榔柯初代培養(yǎng)芽誘導方法，采用檳榔柯基部萌條為外植體，通過外植體無菌處理后，將外植體接種于優(yōu)質初代培養(yǎng)芽誘導培養(yǎng)基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強度條件下進行培養(yǎng)，誘導芽的萌發(fā)；其操作步驟為，

（1）外植體選擇：選擇檳榔柯基部萌發(fā)的半木質化的萌條為外植體；

（2）外植體消毒及接種：將檳榔柯萌條經過洗潔精清洗，流水沖洗和化學試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導培養(yǎng)基中；

（3）芽誘導培養(yǎng)：將接種后的外植體置于適宜室內條件下培養(yǎng)。

以上所述的芽誘導培養(yǎng)基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.0～2.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。

以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 290 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

以上所述的萌條是長為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質化的萌條。

以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將檳榔柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5~4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種2個莖段。

以上步驟（3）所述的適宜室內條件為：暗培養(yǎng)10d后轉為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養(yǎng)溫度20±1℃，濕度為50~55 %。

本發(fā)明具有的優(yōu)點及有益效果如下：

1、本發(fā)明采用1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，同時重點調整了與檳榔柯出芽相關的微量元素和有機成分，使得培養(yǎng)基更科學，更有針對性，有效的克服了檳榔柯組織培養(yǎng)芽誘導過程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，更易促使檳榔柯芽誘導的發(fā)生，促進了萌芽的生長速度和健壯度。

2、本發(fā)明以基部長6~9 cm長的半木質化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強的分生能力，促進芽的誘導；本發(fā)明在外植體采集后進行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。

3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養(yǎng)后轉到強度為500～1000 lx的室內條件下培養(yǎng)，溫度和濕度偏低，光照強度也不高的室內條件，有利于減少芽誘導過程中玻璃化的發(fā)生。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1：

選擇檳榔柯基部萌發(fā)、長為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質化的萌條作為外植體。將檳榔柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種2個莖段。

所述的芽誘導培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 290 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內暗培養(yǎng)10d后轉為光照500 lx，光照12h/d的條件下進行培養(yǎng)，誘導芽的萌發(fā)。

實施例2：

選擇檳榔柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質化的萌條作為外植體。將檳榔柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種2個莖段。

所述的芽誘導培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.5mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 290 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內暗培養(yǎng)10d后轉為光照500lx，光照10h/d的條件下進行培養(yǎng)，誘導芽的萌發(fā)。

實施例3：

選擇檳榔柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質化的萌條作為外植體。將檳榔柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種2個莖段。

所述的芽誘導培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 1.5mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 290 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內暗培養(yǎng)10d后轉為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進行培養(yǎng)，誘導芽的萌發(fā)。

實施例4：

選擇檳榔柯基部萌發(fā)、長為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質化的萌條作為外植體。將檳榔柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養(yǎng)基中，每瓶接種2個莖段。

所述的芽誘導培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-KT 2.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 850 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 290 mg/L，KH₂PO₄ 250 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內暗培養(yǎng)10d后轉為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進行培養(yǎng)，誘導芽的萌發(fā)。